Diapositiva 1

19° Corso Nazionale
per Tecnici di Laboratorio Biomedico
Riccione, 22-25 maggio 2012
HPV metodiche molecolari e considerazioni su
una casistica eterogenea
Sara Galastri, Michela Donatelli
SOD Istologia Patologica e Diagnostica Molecolare, DAI Biomedicina, AOU-Careggi
AOU-CAREGGI Firenze
HPV
Virus a DNA (Fam. Papovaviridae)
DNA circolare (~7900 bp in lunghezza) circondato
da capside
Specie-specifici
Tropismo cellule epitelio-squamoso (epiteliotropi)
> 100 tipi HPV sono stati caratterizzati
HPV
I papillomavirus sono molto diffusi nella specie umana, con
uno specifico tropismo per le cellule dell’epitelio squamoso,
replicandosi solo nelle cellule epiteliali della cute e delle
mucose;
E’ la più comune delle infezioni a trasmissione sessuale e la
trasmissione può avvenire anche tramite semplice contatto
nell’area genitale;
Il 50-80% dei soggetti sessualmente attivi si infetta nel
corso della vita con un virus HPV e fino al 50% si infetta con
un tipo oncogeno.
HPV
La storia naturale dell’infezione è fortemente condizionata
dall’equilibrio che si instaura fra ospite ed agente infettante;
L’infezione può regredire, persistere o progredire:
La maggior parte (70-90%) delle infezioni da HPV è transitoria,
asintomatica e guarisce spontaneamente.
La persistenza dell’infezione è condizione necessaria, ma non
sufficiente per la trasformazione neoplastica
La probabilità di progressione delle lesioni è correlata anche ad
altri fattori: elevato numero di partner sessuali,
fumo di sigaretta
uso prolungato di contraccettivi orali
co-infezione con altri virus
HPV
HPV e lesioni cliniche
Genotipo
1
2, 4, 29
3,10,28,49
6, 11, 42
16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56
58, 59, 68
Patologia associata
Verruche plantari
Verruche volgari
Verruche piane
Condilomi genitali, papillomi laringei
Displasie anogenitali, carcinomi
Patogenesi
Sexual Exposure
HPV Infection
Cervical Transformation Zone
Squamous Ep
Low Risk-6,11
Columnar Ep
High Risk Types (16,18)
Smoking, Hormone, Oral contr. parity,
Altered immune response etc.
Condyloma
Squamous Ca
Adeno Ca
Lesioni preneoplastiche cervice uterina
La maggior parte dei carcinomi della cervice è preceduta da una lesione
precancerosa che può persistere in uno stadio non invasivo per molti anni.
ISTOLOGIA
• Displasia:
– lieve/condiloma
– moderata
– grave/carcinoma in situ
• Neoplasia intraepiteliale cervicale
– CIN I/condiloma
– CIN II
– CIN III
CITOLOGIA
Lesione intraepiteliale squamosa:
• Basso grado (L-SIL)
• Alto grado (H-SIL)
HPV test
A fronte di alcune lacune diagnostiche della citologia (falsi
negativi dall’ 1.6% al 28%), si è reso necessario individuare un
test diagnostico aggiuntivo, capace di incrementare la
specificità e la sensibiltà dell’esame citologico nel
riconoscimento delle displasie di basso ed alto grado e dei
carcinomi, riducendo così il rischio di falsi negativi;
Il razionale per l’introduzione e la diffusione dell’HPV test si
fonda soprattutto sul suo elevato valore predittivo negativo;
L’associazione HPV test-Pap test ha una sensibilità maggiore a
quella del test da solo, con un valore predittivo negativo del
100%.
HPV test:
possibili applicazioni
1. Test primario di screening, da solo o
con la citologia (pap test)
2. Triage nelle lesioni dubbie (ASC-US)
3. Follow-up delle pazienti trattate per
lesioni di alto grado
1 - HPV test: test primario
L’infezione da HPV è molto frequente, specie
nelle fasce di età più giovanili (28%-46%, sotto i
25 anni).
Il test evidenzia infezioni che nella maggior
parte dei casi saranno destinate a risolversi
spontaneamente (infezioni transienti).
Il costo elevato e le diverse realtà locali dei
programmi di screening non rendono utilizzabile
l’HPV-test come test di screening.
2 - HPV test: Triage nelle lesioni dubbie (ASC-US)
Diversi studi hanno
dimostrato che la sensibilità
(96.3%) e la specificità (49%)
dell’HPV test per CIN II-III
sono superiori a quelle della
ripetizione citologica (85.3%
e 45%).
I risultati dello studio ALTS
(ASCUS Low Sil Triage
Study) dopo 2 anni di followup indicano la superiorità in
termini di sensibilità
dell’HPV-test nei confronti
anche della colposcopia.
Linee guida SICPCV,2006
3 - HPV test: Follow-up
L’utilità dell’HPV test nel follow-up di lesioni di alto
grado (CIN II-III) per determinare il rischio di
persistenza o di recidiva, è riconducibile all’evidenza che
una negatività del test corrisponde a un rischio minimo di
recidiva.
In molti studi, nel 97% dei casi di CIN II-III
identificati al follow-up HPV +, la sensibilità e il NPV
complessivi dell’HPV test sono risultati rispettivamente
del 96,5% e del 98,8%, rivelandosi superiori ai valori
della citologia.
Linee guida SICPCV,2006
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
Controlli ambulatoriali (adolescenti…)
Conferma diagnosi prima del trattamento
Gestione ASCUS
Follow-up dopo trattamento (conizzazione,
vaporizzazione…)
VAPORIZZAZIONE
COLPOSCOPIA
biopsia
CONO
PAP TEST
I diagnosi
+
HPV test
Negativo (ASCUS)
PERDITA
FOLLOW-UP
Pap test + HPV test
TEST HPV:
Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA
Il test Inno-Lipa Genotyping Extra si basa sul principio
dell’ibridazione molecolare inversa: Reverse Dot Blot.
Il test prevede 3 fasi principali:
1. Estrazione del DNA su colonnine di eluizione da campioni di
cellule cervicali;
2. Amplificazione del DNA target mediante primers consensus che
abbiano come bersaglio una regione del genoma virale
conservata tra i vari genotipi (regione L1) e una coppia di
primers per l’amplificazione del gene umano HLA-DPB1;
3. Ibridazione degli amplificati con specifiche sonde nucleotidiche
fissate su striscia di nitrocellulosa.
TEST HPV:
Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA
1. Fase di estrazione DNA
2. Fase di amplificazione DNA
kit inno-lipa HPV
genotyping extra
QIAprep spin Miniprep kit in QIACUBE
TEST HPV:
Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA
3. Fase di ibridazione
Auto-Lipa 48
Inno-Lipa HPV Genotyping Extra : test a
sonde allineate, per uso diagnostico in
vitro, creato per l’identificazione di 28
diversi genotipi dell’HPV.
TEST HPV:
Tecnica INNO-LIPA GENOTYPING EXTRA
Lettura e Interpretazione risultati
Le strisce di nitrocellulosa sono rimosse dall’Auto-Lipa 48, asciugate con carta
assorbente e attaccate su schede Lipa scan reading templat.
Lettura con scanner e interpretazione dei risultati tramite software Liras.
Linea identificazione
Linea controllo coniugato
Linea controllo DNA umano
Linee tipi HPV
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
RISULTATI HPV TEST 2010-2011
TAB 1
RISULTATI
HPV
N°
CASI
POS
1249
NEG
1245
1249
1249
1248
RISULTATI
HPV
N° CASI
HR
780
pHR
139
LR
134
NC
45
HPV X
151
NEG
TOT
1245
2494
HR = alto rischio
LR = basso rischio
1247
1245
1246
1245
1244
1243
pHR = potenzialmente alto rischio
NC = non classificato
pos
neg
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
DISTRIBUZIONE RISULTATI POSITIVI
TAB 2
RISULTATI
HPV POS
N°
%
tot pos
HR
780
62,7
pHR
139
11,1
LR
134
10.7
NC
45
3.6
HPV X
151
12.1
HR = alto rischio
pHR = potenzialmente alto rischio
LR = basso rischio
NC = non classificato
HR
3,6%
pHR
LR
NC
HPV X
12,1%
10,7%
11,1%
62,4%
62.7%
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
HPV ALTO RISCHIO:
DISTRIBUZIONE INFEZIONI A GENOTIPO SINGOLO/ COINFEZIONI
TAB. 3
HR: inf. singole/coinf.
genotipo sing.
2 genotipi (almeno 1 HR)
3 genotipi (almeno 1 HR)
4 genotipi (almeno 1 HR)
> di 4 genot. (almeno 1 HR)
N°
CASI
411
217
101
32
14
% su tot pos
32,9
di cui prevale coinfez. 16-52
17,4
8,1
2,6
1,1
32,9%
500
411
35,0
30,0
25,0
400
217
300
20,0
101
200
17.4%
100
8,1%
15,0
32
14
0
genotipo
2
3
4
> di 4
sing.
genotipi
genotipi
genotipi
genotipi
10,0
5,0
2,6%
1.1%
0,0
genotipo
2
3
4
> di 4
sing.
genotipi
genotipi
genotipi
genotipi
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
HPV ALTO RISCHIO: DISTRIBUZIONE DEI SINGOLI GENOTIPI
T AB . 4
PREVALENZA IN
INFEZ. SINGOLE
PREVALENZA IN INFEZIONI
PREVALENZA IN INFEZIONI
SINGOLE/COINFEZIONI
SINGOLE/COINFEZIONI
Valore assoluto
% su TOT POS
gen 16
114
231
18,5
gen 18
gen 31
19
62
58
131
4,6
10,5
gen 33
20
41
3,3
gen 35
8
22
1,8
gen 39
23
56
4,5
gen 45
gen 51
10
41
29
17
2,3
1,4
gen 52
54
137
11,0
gen 56
26
61
4,9
gen 58
16
38
3,0
gen 59
gen 68
3
9
11
24
0,9
1,9
gen 73
4
9
0,7
gen 82
TOT
2
411
8
873
0,6
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
HPV ALTO RISCHIO:
DISTRIBUZIONE DEI SINGOLI GENOTIPII
T AB . 5
PREVALENZA IN INFEZIONI
SINGOLE/COINFEZIONI
% su TOT POS
G E NO T IP I HR
gen 16
gen 18
%
18,5
4,6
gen 31
10,5
gen 33
3,3
gen 35
1,8
gen 39
gen 45
4,5
2,3
gen 51
1,4
gen 52
11,0
gen 56
4,9
gen 58
gen 59
3,0
0,9
gen 68
1,9
gen 73
gen 82
0,7
0,6
gen gen gen gen gen gen gen gen gen gen gen gen gen gen gen
16
18
31
33
35
39
45
51
52
56
58
59
68
73
82
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
HPV 31 – HPV 52 : FOLLOW-UP
VAPORIZZAZIONE
(≈ 20%)
COLPOSCOPIA
biopsia
CONO
PAP TEST
I diagnosi
+ HPV test
(≈ 10%)
ASCUS (≈ 40%)
FOLLOW-UP
Pap test + HPV test
PERDITA (≈ 30%)
6.7%
6.3%
4.5%
CONO
HPV
+
+
HPV 52
+
-
3.8%
CONO
HPV
+
+
HPV 31
+
-
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
HPV 31 – HPV 52 : FOLLOW-UP
VAPORIZZAZIONE
(≈ 20%)
COLPOSCOPIA
biopsia
PAP TEST + HPV test
I diagnosi
CONO
(≈ 10%)
ASCUS (≈ 40%)
FOLLOW-UP
Pap test + HPV test
PERDITA (≈ 30%)
15.2%
15.4%
5.3%
2.9%
BIOPSIA
HPV
+
+
+
HPV 52
BIOPSIA
HPV
+
+
+
HPV 31
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
HPV 31 – HPV 52 : FOLLOW-UP
VAPORIZZAZIONE
(≈ 20%)
COLPOSCOPIA
biopsia
CONO
(≈ 10%)
PAP TEST
I diagnosi
+
ASCUS (≈ 40%)
HPV test
FOLLOW-UP
Pap test + HPV test
PERDITA (≈ 30%)
27.9%
30.3%
9.6%
6.3%
I° HPV
HPV
+
+
+
HPV 52
I° HPV
HPV
+
+
+
HPV 31
TEST HPV:
SOD Citopatologia Diagnostica – AOU CAREGGI
SUMMARY
Nel biennio 2010-2011, nel nostro laboratorio sono stati eseguiti
circa 2500 test HPV su una casistica molto eterogenea. Il 50% è
risultato HPV positivo.
Nella maggior parte dei casi si tratta di infezione da singolo ceppo
HPV alto rischio e la prevalenza maggiore nelle infezioni è
rappresentata dai genotipi 16, 31 e 52.
Le infezioni da parte di 31 e 52 causano lesioni di alto grado nel
10% circa dei pazienti, nel 20% sono responsabili di lesioni benigne
e nel 40% circa causano alterazioni cellulari di dubbia
interpretazione (ASCUS).
Il 15% delle infezioni virali da parte dei genotipi 31 e 52, va
incontro a remissione al follow-up.
AOU-CAREGGI Firenze
GRAZIE PER L’ATTENZIONE