ConfermaLaboratorio

CORSO REGIONALE SULLA ROSOLIA
CONGENITA E NUOVE STRATEGIE DI
PREVENZIONE
Padova 11 giugno 2007
Conferma di Laboratorio della Rosolia e
Significato del Dosaggio degli Anticorpi
Anna Piazza –Giorgio Palù
Microbiologia e Virologia
Azienda ospedaliera – Università Padova
CONFERMA DI LABORATORIO DELLA
ROSOLIA
DIAGNOSI DIRETTA
entro 4 giorni dalla comparsa del rash cutaneo
da tamponi vie aeree superiori, sangue, urine, LSF, liquido amniotico
Isolamento del virus
Ricerca RNA virale PCR
DIAGNOSI INDIRETTA
Ricerca di IgM specifiche anti-rosolia
Ricerca di IgG specifiche anti-rosolia
Test di avidita’ delle IgG
DIAGNOSI INDIRETTA
RICERCA DI IgM SPECIFICHE ANTI-ROSOLIA
• entro 1 settimana dall’esantema o dopo il contatto
• persistono per 6-8 settimane, ma anche per mesi o anni;
• FP infezioni virali, malattie autoimmuni
RICERCA DI IgG SPECIFICHE ANTI-ROSOLIA
• entro 1 settimana dall’esantema o dopo il contatto e dopo 7-14 giorni
• se ancora negative ripetere dopo 6 settimane dal primo prelievo
TEST DI AVIDITA’ DELLE IgG
L’avidità di un anticorpo nei confronti di un antigene esprime la capacità che ha l’anticorpo
stesso di formare legami stabili con l’antigene
L’avidità delle IgG con test ELISA si ottiene confrontando, ad opportuna diluizione, le
densità ottiche ottenute con e senza lavaggio del campione con soluzioni dissocianti di
urea
La percentuale di IgG residue legate è tanto più bassa quanto maggiore è la percentuale di
IgG giovani, poco avide, rimosse dal lavaggio
BASSA AVIDITÀ < 20% coincide con una infezione acquisita negli ultimi due-tre mesi:
INFEZIONE ACUTA o ACUTA RECENTE
MEDIA- ALTA AVIDITA’ > 20 % coincide con una infezione acquisita prima degli ultimi
tre mesi: INFEZIONE PREGRESSA
METODI SIEROLOGICI PER LA
DETERMINAZIONE DELLE IgM e IgG
INIBIZIONE DELL’EMOAGGLUTINAZIONE
FLUORESCENZA INDIRETTA
RIA
WESTERN BLOT
ELISA
METODI SIEROLOGICI PER LA
DETERMINAZIONE DELLE IgM
Metodica immunoenzimatica su micropiastra
(Enzyme Linked Immunosorbent AssaY )
Antigene inattivato e purificato ottenuto da colture cellulari renali di Baby- Hamster
( cellule BHK 21) infettate con il virus della rosolia
Ricerca di IgM specifiche anti-rosolia a cattura :
Metodo qualitativo : < 0.200 Negativo
0.201 - 0.220 Dubbio
0.221 - 0.300 Deb. Positivo
> 0.301 Positivo
Sensibilità del test : 98 %
Specificità del test : 97.3 %
Variabilità intra-serie : 4.9 %
Variabilità inter-serie : 5.4 %
METODI SIEROLOGICI PER LA
DETERMINAZIONE DELLE IgG
Metodica immunoenzimatica su micropiastra (Enzyme Linked Immunosorbent AssaY )
Antigene inattivato e purificato ottenuto da colture cellulari renali di Baby- Hamster
( cellule BHK 21) infettate con il virus della rosolia
Metodo quantitativo: < 4 UI/ml Negativo
5 – 10 UI/ml Dubbio
11 – 20 UI/ml Deb. Positivo
> 20 UI/ml Positivo
Sensibilità del test : 100 %
Specificità del test : 98.5 %
Variabilità intra-serie : 8.8 %
Variabilità inter-serie : 9.9 %
VPP ?
VPN ?
SIGNIFICATO DEL DOSAGGIO DEGLI
ANTICORPI ANTI- ROSOLIA
IgM
IgG
AVIDITA- IgG
INTERPRETAZIONE
-
-
N.E.
RECETTIVO
+
-
N.E.
INFEZIONE ACUTA
PRIMARIA ?
+
+
BASSA
+
-
+
+
ALTA
ALTA
INFEZIONE ACUTA
PRIMARIA
REINFEZIONE ?
IMMUNE
ROSOLIA: APPROPIATEZZA DELLE
INDAGINI DI LABORATORIO
IN EPOCA PRECONCEZIONALE
IN GRAVIDANZA
NEONATO
PERIODO PRENATALE
IN EPOCA PRECONCEZIONALE
Valutazione dello stato sierologico della donna fertile:
- mancata conoscenza dello stato sierologico
- mancato ricordo anamnestico di eventuale infezione o di vaccinazione in età scolare
conferma di laboratorio
IgM negative, IgG positive
IgM negative , IgG negative 

soggetto immune
soggetto recettivo  vaccinazione
 controllo efficacia vaccinazione
IN GRAVIDANZA
Valutazione dello stato sierologico della donna gravida:
Conferma di laboratorio:
IgM negative
IgG positive
IgM negative , IgG negative


Gravida immune
Gravida recettiva


indagare solo se:
- sintomi compatibili
- esposta a caso di rosolia
( reinfezione )
rischio di infezione acuta
primaria – follow-up
GRAVIDA IMMUNE : conferma di laboratorio
Indagare in caso di esposizione ad un caso di rosolia e/o sintomi compatibili
 reinfezione
con rosolia
D D: Isolamento virale
RNA- PCR
D I: IgM positive fugaci
IgG: positive con incremento del titolo ad un secondo prelievo dopo 15 gg
Avidità delle IgG: alta
GRAVIDA RECETTIVA
Conferma di laboratorio di infezione acuta
D D: Isolamento virale
RNA- PCR
DI : Sieroconversione
Positività delle IgM specifiche
Positività delle IgG con incremento del titolo
Test di avidità delle IgG: basso
La conferma di laboratorio in dettaglio/1
• Isolamento virale: da campione biologico (sangue, urine, tampone
faringeo, saliva), raccolto entro 4 giorni dalla comparsa dall’esantema.
Nota: i 4 giorni dall’esantema rappresentano il periodo ottimale, ma il
virus della rosolia può essere isolato da una settimana prima fino a 2
settimane dopo la comparsa dell’esantema.
• PCR: test positivo per RNA virale mediante la metodica di RT-PCR, su un
campione biologico raccolto come sopra.
La conferma di laboratorio in dettaglio/2
• Sieroconversione: comparsa ex novo di anticorpi IgM o IgG virusspecifici
Nota: ci deve essere un precedente test negativo!
• Positività IgM: deve essere associata a sintomi clinici compatibili e/o di a
un test positivo per IgG specifiche a bassa avidità.
• Incremento IgG: Aumento di almeno 4 volte rispetto ai livelli iniziali.
– Il primo campione prelevato entro 7-10 giorni dalla comparsa
dell’esantema o subito dopo il contatto con un soggetto infetto (fase
acuta)
– il secondo almeno 2 settimane dopo (fase convalescente)
– per dimostrare l’incremento, i due campioni devono essere esaminati
nel corso della stessa seduta analitica.
COME DIAGNOSTICARE UN’INFEZIONE
ACUTA IN GRAVIDANZA
Positività delle IgM in gravidanza
Prelievo successivo dopo 20 gg ( sieroconversione, innalzamento delle IgG )
Determinazione dell’avidità delle IgG
Avidita’ inferiore al 20 %
Avidita’ superiore al 20 %


Infezione acuta
( entro 3 mesi precedenti )

Infezione pregressa
( oltre i 3 mesi precedenti )
Diagnostica
prenatale
Scelte
IVG
DIAGNOSI PRENATALE
Conferma di laboratorio
D D: Isolamento virale ( sangue del cordone ombelicale e/o liquido amniotico )
Rna- PCR
D I : Determinazione delle IgM specifiche su sangue del cordone ombelicale e/o
liquido amniotico a partire dalla 20° settimana di gravidanza
NEONATO: DIAGNOSI DI ROSOLIA
CONGENITA
Si esegue in tutti i nati da madre con rosolia in gravidanza e/o i nati che
presentano sintomi o segni suggestivi per rosolia congenita
Conferma di laboratorio
D D: Isolamento virale
RNA- PCR
D I: Positività delle IgM specifiche
Positività delle IgG
La conferma di laboratorio in dettaglio/1
• Isolamento virale: da campioni biologici (sangue, liquor,
urine, biopsie d’organo, etc.)
• Genoma virale identificato mediante la metodica di RT-PCR
da campioni biologici
La conferma di laboratorio in dettaglio/2
Ricerca delle IgM specifiche
• La positività delle IgM entro un mese di vita pone diagnosi di infezione
congenita con una elevata sensibilità e specificità.
• Va tenuto presente che non tutti i neonati con infezione congenita risultano
IgM positivi alla nascita. Quindi, sia i nati da madre con sospetta rosolia in
gravidanza, sia i neonati con sintomi o segni suggestivi per rosolia
congenita che risultino IgM negativi alla nascita, dovranno ripetere il test
all’età di un mese di vita.
La conferma di laboratorio in dettaglio/2
Ricerca delle IgG specifiche
• Dosaggio delle IgG rosolia-specifiche ogni mese per i primi sei mesi di
vita.
• La persistenza delle IgG specifiche a titoli più elevati e per periodi più
lunghi rispetto a quanto atteso in un lattante (cioè, i cui livelli non
diminuiscono del 50% ogni mese) depone per infezione contratta in utero,
anche in assenza di altri dati di laboratorio.
• La scomparsa delle IgG specifiche nel secondo semestre di vita consente
invece di escludere l’infezione congenita.
SIGNIFICATO DEL DOSAGGIO DEGLI
ANTICORPI ANTI- ROSOLIA
CONCLUSIONI
Non si può fare diagnosi e non si può attuare
sorveglianza senza una collaborazione fra
laboratoristi e clinici.
GRAZIE PER L’ATTENZIONE