lezione - microbiologia generale

“MICROBIOLOGIA GENERALE”
Prof. C. Mazzoni
Corso
di
Laurea
Triennale
Biotecnologie Agro- Industriali
Università di Roma “La Sapienza”
Appunti della lezione 8
Diapositive della lezione 8
Paragrafo 5.3, capitolo 14
in
Colture Pure
I microrganismi quando crescono su un terreno
di laboratorio sono chiamati coltura.
Una coltura pura è costituita da una
popolazione di cellule derivate da un’unica
cellula madre. La coltura pura rappresenta una
condizione artificiale per l’accrescimento di
batteri ed altri microrganismi ed è una
condizione imposta ai microrganismi da
manipolare in laboratorio.
Metodi di isolamento di colture pure
Piastra per striscio
La popolazione microbica mista viene
seminata sulla superficie dell’agar, in
vicinanza dei margini della piastra, per mezzo
di un ansa di platino; il materiale depositato
viene disteso mediante una serie di strisci non
sovrapposti secondo varie tecniche (diap. 3 e
figura 5.4 del libro). A questo punto le singole
cellule batteriche passano dall’ansa strofinata
sulla superficie dell’agar, sviluppandosi in
colonie isolate.
Piastra per diffusione
1. Il campione d’origine viene diluito più volte,
quindi piccole quantità del campione diluito
vengono miscelate con agar a 45°C. Queste
miscele vengono versate immediatamente su
piastre sterili (diap. 4). Poiché alcuni dei
microrganismi restano intrappolati al di sotto
della superficie del terreno quando esso
gelifica, la piastra presenterà colonie sia in
superficie che sotto la superficie.
2. Nel centro di una piastra contenente agar si
semina una piccola quantità di una miscela
microbica diluita, composta da circa 100-200
cellule; quindi, per mezzo di una spatolina
sterile, si stende uniformemente il materiale
sulla superficie del terreno (diap. 5). In tal
modo
dalle
cellule
disseminate
si
svilupperanno colonie isolate.
Colture di arricchimento
I metodi di piastramento sopra descritti
risultano più efficaci per ottenere colture pure
se vengono impiegati con terreni selettivi o
differenziali.
Es.1. Isolamento batteri sporigeni: poiché le
spore sono molto resistenti al calore, si può
esporre il campione ad una temperatura di
circa 85°C per 5’ prima di seminarlo su piastra.
Il trattamento termico distruggerà la totalità, o
la maggior parte delle forme asporigene e
qualunque colonia che si svilupperà sarà
probabilmente una specie sporigena.
Es. 2 Isolamento batteri capaci di utilizzare
una sostanza chimica complessa come
l’erbicida 2,3-acido diclorofenossiacetico. Se
si inocula una campione di suolo direttamente
in agar nutritizio, la probabilità di trovare
batteri che utilizzano sostanze chimiche
complesse sarà molto bassa. Infatti, sono
presenti un numero di batteri a crescita rapida
talmente elevato che i tipi desiderati saranno
superati nell’accrescimento. Si impiega perciò
la tecnica della coltura di arricchimento, dove
viene utilizzato un terreno contenente
l’erbicida come unica fonte di carbonio, oltre
all’azoto, fosforo, zolfo ed altri sali minerali.
Aggiungendo al terreno così allestito un
campione di suolo, si assisterà alla crescita dei
soli batteri in grado di utilizzare l’erbicida.
Dopo l’incubazione, un campione della coltura
iniziale viene trasferito in un terreno selettivo
fresco (diap. 6). Dopo una serie di passaggi di
questo tipo, si otterrà una popolazione di
batteri in grado di metabolizzare l’erbicida.
Questi potranno essere isolati in coltura pura
tramite il piastramento in un terreno solido con
la stessa composizione del terreno usato per
l’arricchimento.
Isolamento di una singola cellula
Un apparecchio speciale, micromanipolatore,
usato insieme ad un microscopio, consente di
prelevare un singolo microrganismo da un
preparato a goccia pendente (diap. 7). Il
micromanipolatore permette all’operatore di
controllare il movimento di una micropipetta o
di una microsonda (un ago sottile che può
essere una fibra ottica) nella goccia depositata
su una piastra e trasferirla in un altro punto
isolato della piastra o in un altro terreno.
Crescita in colture miste
In diversi ambienti naturali si svolgono
processi microbiologici di grande utilità per
l’uomo dovuti a più specie presenti
contemporaneamente e che si alternano nel
tempo l’una rispetto all’altra. In questo caso si
ha un susseguirsi di popolazioni microbiche:
crescerà per prima quella che si troverà in
condizioni ottimali; esaurita la fonte
nutrizionale (con conseguente variazione delle
condizioni fisiche
ed
ambientali) la
popolazione che si è sviluppata per prima
smetterà di crescere mentre inizierà a
svilupparsi la seconda.
Le colture miste possono essere spontanee e
non richiedere un inoculo di colture pure,
oppure possono essere artificiali e l’inoculo
viene effettuato con due o più colture pure.
Es. 1) La crescita di una forma aerobia
crescendo consuma l’O2 disciolto nel terreno e
crea le condizioni di anaerobiosi adatte alla
crescita di clostridi.
Es. 2) La crescita di una muffa in grado di
idrolizzare
l’amido
seguita
da
una
fermentazione dei prodotti ottenuti da parte di
un lievito.
Es. 3) La crescita di un virus ha bisogno del
suo ospite.
Mantenimento e conservazione delle colture
Allo studio delle colture pure è associato il
problema di mantenerle per vari intervalli di
tempo in una condizione vitale. La maggior
parte dei laboratori di batteriologia mantiene
una grande collezione di queste colture,
chiamata spesso collezione di colture stock.
Questi organismi sono necessari per i corsi di
laboratori e per il lavoro di ricerca o come
agenti di prova per particolari procedimenti.
Per questi e per altri scopi è estremamente
importante disporre di colture pure di batteri
correttamente identificate. Ogni laboratorio
naturalmente, manterrà una collezione di
colture secondo le sue necessità e i suoi
principali interessi, sia d’insegnamento sia di
ricerca. La maggior parte delle industrie che
operano nel settore biologico mantiene grandi
collezioni di colture, le quali sono usate per
selezionare nuovi agenti chemioterapici
potenzialmente efficaci, come colture di
riferimento per studi tassonomici, come agenti
di saggio per antibiotici e vitamine, e come
colture di riferimento citate nei brevetti
industriali.
Metodi di conservazione
Vaste ricerche sono state eseguite per
sviluppare migliori condizioni per la
conservazione dei batteri. Poiché non tutte le
specie reagiscono in maniera analoga a una
particolare condizione o ad un particolare
processo, ciò che è stato appreso per una
coltura non può essere applicabile ad un’altra.
E’ essenziale che il metodo di conservazione e
mantenimento preservi tutte le caratteristiche
della specie quali erano nel momento della
conservazione. Inoltre, occorre tenere presenti
alcune ragioni pratiche quali la quantità di
lavoro richiesto e la quantità di spazio
necessario per le colture. Alcune delle tecniche
usate sono le seguenti:
Trasferimento periodico in terreni freschi
Le colture possono essere mantenute in
provette di terreno dove sono state coltivate
mediante periodici trasferimenti in terreni
freschi. Gli intervalli di tempo a cui sono
eseguiti i trasferimenti variano da organismo a
organismo. Molti dei batteri eterotrofi più
comuni rimangono vitali per parecchie
settimane o per parecchi mesi su un terreno
quale l’agar nutritizio. Quando si adotta questo
procedimento per mantenere una collezione di
colture, si devono accertare in anticipo tre
cose: il terreno corretto da usare per ciascuna
specie,
la
temperatura
corretta
per
l’immagazzinamento
delle
colture
e
l’intervallo di tempo a cui si devono eseguire i
trasferimenti.
Conservazione
delle
colture
mediante
ricoprimento con olio minerale
Si possono conservare con successo molti
batteri ricoprendo con olio minerale sterile la
coltura sviluppatasi su agar solidificato a becco
di clarino. L’olio deve coprire completamente
l’agar; perché ciò avvenga sicuramente, il
livello dell’olio dovrebbe essere circa di un cm
al di sopra della superficie inclinata dell’agar.
Il mantenimento della vitalità di una coltura
sottoposta a questo trattamento varia da specie
a specie, ma è di solito questione di anni:
alcune specie sono state conservate in maniera
soddisfacente per 15-20 anni. Questo metodo
di mantenimento ha l’eccezionale vantaggio
che si può rimuovere una parte della coltura
sviluppatasi sotto l’olio con un ago di platino,
inocularla in un terreno fresco e conservare
ancora la coltura iniziale.
Per la sua semplicità questo metodo è
particolarmente attraente.
Terreno minimo, acqua distillata o acqua e
agar
Una volta lavate, le colture sono conservate in
un refrigeratore; queste colture possono
rimanere vitali per tre o cinque mesi o anche
più a lungo.
Conservazione
delle
colture
mediante
essiccazione
rapida
dello
stato
di
congelamento (liofilizzazione)
La liofilizzazione è il procedimento più
efficace per la conservazione delle colture.
Infatti, molte specie di batteri conservate con
questa tecnica sono rimaste vitali e invariate
per più di venti anni. In questo processo, le
cellule vengono essiccate rapidamente, mentre
sono congelate, mediante le seguenti
operazioni. La sospensione di cellule è
collocata in piccole fiale, che vengono poi
immerse in una miscela di ghiaccio secco e
alcol (-78°C). Le fiale vengono subito
collegate in un impianto per alto vuoto e,
quando l’essiccazione è completa, vengono
sigillate singolarmente sotto vuoto. I notevoli
vantaggi di questa tecnica sono la
sopravvivenza a lungo termine, una minore
possibilità di variazione dei caratteri della
coltura e la piccolezza dei recipienti di
immagazzinamento (fiale). Centinaia di colture
liofilizzate possono essere immagazzinate in
un piccolo volume.
Immagazzinamento a bassissime temperature
La facile reperibilità dell’azoto liquido (196°C) ha offerto al microbiologo un altro
mezzo per mantenere le colture. In questo
procedimento le cellule sono congelate insieme
ad un agente protettivo (glicerina o
dimetilsolfossido). I campioni congelati sono
conservati in refrigeratori ad azoto liquido. Il
mantenimento delle colture con azoto liquido
si è rivelato molto soddisfacente: tutte le
colture che possono essere mantenute in
maniera soddisfacente mediante liofilizzazione
possono essere mantenute altrettanto bene con
l’azoto liquido. Inoltre, il processo di
congelamento in azoto liquido si è dimostrato
efficace con molti campioni che non possono
essere mantenuti mediante liofilizzazione.
Collezioni nazionali di colture
In tutto il mondo esistono parecchie
organizzazioni la cui funzione principale è
mantenere colture pure autentiche sia di batteri
sia di altri microrganismi (lieviti, muffe, alghe
protozoi, virus) e di cellule animali. La prima
collezione nota di colture tipo, la collezione
Kral, fu istituita a Praga intorno al 1900.
L’American Type Culture Collection (ATCC)
è a Rockville, nel Maryland. In Francia una
collezione di colture batteriche è mantenuta
nell’istituto Pasteur a Parigi; La British
National Collection of Type Cultures è a
Londra; la Japanese Type Culture Collection è
nell’istituto Nagao di Tokyo. Esse sono
soltanto alcune delle grandi collezioni
nazionali che sono mantenute in vari paesi.
L’ATCC comprende più di 17000 ceppi di
batteri, funghi, alghe, protozoi, linee di cellule
animali e virus. Più di mezzo milione di
ampolle di campioni liofilizzati o congelati
sono immagazzinate in refrigeratori meccanici
a -60°C in camere fredde a 5°C o in
refrigeratori a azoto liquido a -196°C. Oltre
20000 colture sono distribuite annualmente a
scienziati e docenti negli Stati Uniti e
all’estero. Molte altre collezioni sono
mantenute in varie parti del mondo per
soddisfare varie necessità. Per esempio, negli
Stati Uniti la Northern Utilization Research
and Delevopment Division (USDA), a Peoria
(Illinois), mantiene una collezione di lieviti,
muffe e batteri che sono impiegati soprattutto
nelle fermentazioni; il Quartermaster Research
and Development Center dell’U.S. Army a
Natick
(Massachusetts),
mantiene
una
collezione di colture soprattutto dei tipi
associati ai processi di deterioramento. Inoltre
a Losanna esiste il centro internazionale per
l’informazione e la distribuzione delle colture
tipo finanziato dall’UNESCO, che fornisce un
servizio d’informazioni e servendosi del suo
catalogo delle collezioni mantenute in tutto il
mondo, tenta di localizzare qualunque coltura
venga richiesta. Nel 1966 la International
Association of Microbiological Societies istituì
una sezione di collezioni di colture allo scopo
di migliorare la collaborazione e lo scambio di
informazioni tra le collezioni di colture del
mondo. Le collezioni di colture svolgono un
ruolo indispensabile per i microbiologi
mettendo a loro disposizione una grande
varietà di specie e di ceppi.