Greco G. et al.

1
ANTIBIOTICORESISTENZA IN STIPITI DI PASTEURELLA MULTOCIDA E MANNHEIMIA
HAEMOLYTICA ISOLATI IN ALLEVAMENTI DI RUMINANTI
ANTIMICROBIAL RESISTANCE DATA FOR PASTEURELLA MULTOCIDA AND MANNHEIMIA
HAEMOLYTICA ISOLATES FROM RUMINANTS
*Greco G., Totaro M., Lucente M.S., Buonavoglia D.
Department of Animal Health and Wellbeing, Faculty of Veterinary Medicine, University of Bari, 70010
Valenzano, Italy, [email protected]
Parole chiave: M. haemolytica, P. multocida, pasteurellosi, antibiotico-resistenza, ruminanti
RIASSUNTO
Batteri appartenenti ai generi Pasteurella e Mannheimia sono spesso coinvolti in focolai di mastite e di malattie
respiratorie e setticemiche dei ruminanti. Gli antimicrobici sono il mezzo di scelta per controllare tali infezioni.
L’uso imprudente di antimicrobici favorisce la selezione di batteri antibioticoresistenti riducendo drasticamente
l’efficacia di molte molecole correntemente utilizzate negli animali da reddito.
Scopo del presente studio è stato quello di monitorare la sensibilità a diverse categorie di antibiotici di 13 stipiti
di Mannheimia haemolytica (precedentemente nota come Pasteurella haemolytica) e 7 stipiti di Pasteurella
multocida isolati da allevamenti di ovini dell’Italia Meridionale (Puglia) nel corso di focolai di malattia. I test
sono stati eseguiti secondo le linee guida NCCLS. Per l’interpretazione dei risultati sono state seguite le norme
DIN (Deutsche Industrienorm-Germania) e NCCLS.
I risultati della presente indagine evidenziano una costante resistenza, sia nei ceppi di M. haemolytica che nei
ceppi di P. multocida, nei confronti di streptomicina, sulfametoxazolo, acido fusidico e talvolta verso
tetracicline, cloranfenicolo e ampicillina.
SUMMARY
Isolates of the genera Pasteurella and Mannheimia represent pathogens which are involved in mastitis,
septicemia and respiratory disease in ruminants. Antimicrobials are the tools of choice for the prevention and
control of infections due to Pasteurella and Mannheimia. However, imprudent use of antimicrobials bears a high
risk of selecting resistant bacteria, reducing the efficacy of the antimicrobial agents currently available for the
treatment of food producing animals.
The aim of this study was analyze the antimicrobial susceptibility of 13 Mannheimia haemolytica (formerly
known as Pasteurella haemolytica) and of 7 Pasteurella multocida strains isolated from ill animals belonged to
different ruminant herd of the southern Italy (Puglia). The methodologies of resistance testing were performed
according to the guidelines of NCCLS. Evaluation of the diameters of the zones of growth inhibition followed
the DIN (Deutsche Industrienorm-Germany) recommendations and NCCLS guidelines. In the present study the
M. haemolytica and P. multocida isolates had shown resistance to streptomycin, sulfonamides, fusidic acid and
in some cases to tetracycline, chloramphenicol and ampicillin.
INTRODUZIONE
Mannheimia (M.) haemolytica e Pasteurella (P.) multocida sono responsabili di infezioni dell’apparato
respiratorio dei ruminanti comunemente note come pasteurellosi. Tali patologie sono frequenti negli allevamenti
intensivi dove provocano inevitabili perdite di natura economica derivanti dalla conseguente riduzione delle
produzioni ma anche dall’elevata mortalità.
M. haemolytica (Angen et al., 1999), in precedenza nota come P. haemolytica è spesso commensale del
rinofaringe dei ruminanti (Biberstein et al., 1960).
P. multocida è commensale delle prime vie respiratorie di molte specie animali ma è anche agente causale
d’infezioni primarie come la setticemia emorragica del bovino, il colera aviare e può essere coagente nella
broncopolmonite enzootica e nella rinite atrofica del suino.
Entrambe le specie sono microrganismi Gram negativi, di forma cocco-bacillare, immobili, capsulati, asporigeni,
caratterizzati da colorazione bipolare quando colorati con Giemsa, aerobi-microaerofili, ossidasi e catalasi
positivi. M. haemolytica, a differenza di P. multocida, cresce su agar MacConkey e, su agar sangue di pecora, è
in grado di determinare β-emolisi.
Le pasteurellosi sono un tipico esempio di patologia condizionata. M. haemolytica e P. multocida, infatti,
riescono a colonizzare le vie respiratore profonde in seguito all’azione di fattori predisponenti come stress
termici, squilibri alimentari, sovraffollamento associato a cattiva aerazione dei ricoveri (Mackie J.T., et al.,
1995), oltre che nel corso di infezioni da micoplasmi e virus a tropismo respiratorio. A livello polmonare
manifestano il loro potere patogeno, attraverso vari fattori di patogenicità (sintesi di leucotossine, sistema di
captazione del ferro, capsula, lipopolisaccaride, fimbrie, proteasi) provocando l’insorgenza di polmonite
2
fibrinosa (Gilmour, 1980). La trasmissibilità per via aerogena degli agenti eziologici favorisce l’estensione
dell’infezione nell’ambito del gruppo. In tal modo sindromi a carattere sporadico possono assumere connotati
endemici o, addirittura, epidemici.
Il controllo delle pasteurellosi è eseguito in maniera indiretta con interventi di profilassi immunizzante nei
confronti delle infezioni da virus respiratori associati ad un attento controllo del management aziendale. Poco
diffusa è l’applicazione di piani di profilassi immunizzante specifici nei confronti di M. haemolytica e P.
multocida mentre il ricorso alle terapie antibiotiche costituisce la maniera più pratica per ridurre le perdite
economiche conseguenti alle manifestazioni cliniche. L’impiego scorretto di antimicrobici può favorire la
selezione di batteri antibiotico-resistenti con la conseguente riduzione di efficacia di molte delle molecole
utilizzate ai fini terapeutici.
Scopo del presente studio è stato quello di monitorare il profilo di resistenza in vitro a diverse categorie di
antibiotici di 13 stipiti di M. haemolytica e 7 stipiti di P. multocida isolati da allevamenti di ovini dell’Italia
Meridionale (Puglia) nel corso di focolai di malattie respiratorie.
MATERIALI E METODI
Animali. Tra gennaio 2002 e marzo 2005 sono stati esaminati 20 agnelli (01/02, 04/02, 47/02, 48/02, 50/02,
76/02A, 76/02B, 76/02C, 82/02A, 82/05B, 82/05C, PMA/03, PMB/03, PMC/03, 28/03, 68/03, 40/05C 41/05A,
41/05C e 41/05E) d’età compresa tra 2 e 12 settimane. Gli animali appartenevano a 18 differenti allevamenti
dell’Italia meridionale (Puglia) e avevano mostrato segni clinici variabili riconducibili a ridotti accrescimenti
ponderali, dispnea, abbattimento, ipertermia e morte. Per ciascun allevamento l’anamnesi remota e/o recente
faceva riferimento a trattamenti antibiotici e insuccessi terapeutici. All’esame necroscopico tutti i soggetti
presentavano quadri di polmonite fibrinosa a vario stadio evolutivo.
Analisi batteriologica. I polmoni sono stati sottoposti ad esami batteriologici. I campioni sono stati seminati su
Columbia agar sangue di pecora al 5% (Liofilchem, Roseto, Teramo – Italia) e le piastre sono quindi state
incubate a 37°C per 24 ore in condizioni d’aerobiosi. Per ciascuna piastra sono state valutate la carica batterica,
l’aspetto delle colonie e l’attività β-emolitica. La morfologia è stata esaminata mediante la colorazione di Gram;
in seguito sono stati eseguiti i test dell’ossidasi, catalasi e di riduzione dei nitrati; l’identificazione è stata
completata con un sistema biochimico in micrometodo (Api 20 nE, bioMérieux, Roma, Italia).
Test di sensibilità in vitro agli antibiotici. Tutti i ceppi identificati come M. haemolytica e P. multocida sono
stati saggiati, in accordo con le linee guida del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
(2002) e del Deutsche Industrienorm-Germania (DIN), con i seguenti antibiotici: ampicillina (10 µg),
ampicillina + sulbactam (10 µg + 10 µg), amoxicillina + acido clavulanico (20 µg + 10 µg), cefotaxime (30 µg),
ceftazidime (30 µg), acido nalidixico (30 µg), norfloxacin (10 µg), eritromicina(15 µg), tilmicosina (15 µg),
cloranfenicolo (30 µg), florfenicolo (30 µg), sulfametoxazolo (25 µg), cotrimossazolo (1,25 µg + 23,75 µg),
tetracicline (30 µg), gentamicina (10 µg), kanamicina (30 µg), spectinomicina (10 µg), streptomicina (10 µg),
neomicina (10 µg) e acido fusidico (10 µg) (Liofilchem, Roseto, Teramo – Italia).
I test sono stati eseguiti secondo la tecnica di Kirby Bauer (NCCLS, 2002) con alcune modificazioni. Gli stipiti
subcoltivati in Muller Hinton (M.H. II) broth II (bioMérieux, Roma, Italia) per 6 ore, sono stati seminati per
striscio su piastre contenenti 20 ml di M.H. II agar (Becton, Dickinson e C., Le Pont de Claix, Francia) alla
concentrazione di 108 CFU, pari allo standard 0,5 di Mc Farland; in ogni piastra da 90 mm sono stati distribuiti 5
antibiotici. La lettura, è stata eseguita dopo 18 h di incubazione a 37°C. I ceppi sono stati classificati come
sensibili (S), intermedi (I) o resistenti (R) sulla base del confronto del diametro degli aloni di inibizione prodotti
dai diversi antibiotici con i valori di breakpoint forniti dal NCCLS (2002); per l’interpretazione degli aloni di
inibizione dell’ampicillina, mancando norme specifiche NCCLS, sono state adottate le norme DIN (tabella 1).
RISULTATI
Complessivamente sono stati isolati 20 ceppi di cui 13 (01/02, 04/02, 47/02, 48/02, 50/02, 76/02A, 76/02B,
76/02C, 82/02A, PMA/03, 41/05A, 41/05C e 41/05E) identificati come M. haemolytica e 7 ceppi (82/05B,
82/05C, PMB/03, PMC/03, 28/03, 68/03 e 40/05C) identificati come P. multocida (tabella 1).
I risultati delle prove di sensibilità in vitro di ciascun ceppo ai diversi antibiotici saggiati sono riportati nella
tabella 1. Per ciò che riguarda M. haemolytica sono state registrate resistenze nei confronti di ampicillina
(69.2%), acido nalidixico (15.5%), eritromicina (30,8%), tilmicosina (23%), sulfametoxazolo (100%),
sulfametoxazolo + trimethoprim (23%), tetracicline (38,5), gentamicina (7,7%), kanamicina (53.8%)
spectinomicina (7,7%), streptomicina (100%), neomicina (53, 8%) e acido fusidico (100%) (grafico 1).
Per quanto riguarda P. multocida sono state registrate resistenze nei confronti di: ampicillina (42.2%),
eritromicina (14,3%), sulfametoxazolo (100%), gentamicina (14,3%), kanamicina (28,6%), streptomicina
(85,7%), neomicina (28,6%) e acido fusidico (100%) (grafico 2).
Nessun isolato nell’ambito delle due specie ha mostrato resistenze nei confronti di: betalattamici in
combinazione con inibitori delle betalattamasi, cefalosporine, fluorochinoloni e fenicoli.
3
CONCLUSIONI
I dati acquisiti nel presente studio evidenziano la presenza di fenomeni di resistenza agli antimicrobici nei ceppi
di M. haemolytica e P. multocida isolati in allevamenti di ovini della Puglia. L’analisi delle frequenze di
antibioticoresistenza rivela un alto grado antibioticoresistenza diversificato tra le 2 specie e in particolare una
maggiore frequenza in M. haemolytica, con resistenze verso 13 antimicrobici su 20 saggiati rispetto a P.
multocida resistente a 8 antimicrobici su 20 (grafico 3).
I ceppi isolati hanno evidenziato un profilo di resistenza sovrapponibile a quello della maggior parte dei ceppi di
M. haemolytica e P. multocida isolati nel territorio italiano (ITAVARM, 2003) e in Germania (Trolldenier,
1999). In particolare sono stati confermati livelli critici di resistenza verso gli antimicrobici più vecchi come
sulfonamidi, streptomicina e tetracicline che, a causa del loro basso costo, sono stati ampiamente utilizzati per
diversi decenni in medicina veterinaria. Inoltre, anche nell’ambito della stessa classe di antimicrobici, è stata
osservata resistenza nei confronti delle molecole più datate a fronte di quelle di più recente introduzione che si
sono rivelate efficaci (acido nalidixico/norfloxacin, eritromicina/tilmicosina). Questi dati confermano che
l'acquisizione della resistenza è frutto della pressione selettiva esercitata dall'uso degli stessi antibiotici (Witte,
2000). L’impiego continuato di determinati antibiotici negli allevamenti zootecnici ha selezionato, a scapito di
altre, quelle popolazioni microbiche capaci di neutralizzare l’azione degli stessi antibiotici ovvero quelle dotate
di meccanismi di antibioticoresistenza.
L’antibioticoresistenza ha basi genetiche e ben noti, nei generi Mannheimia e Pasteurella, sono i geni
responsabili della resistenza ai betalattamici (blaROB1), alle tetracicline (tetM), al cloranfenicolo (catAIII), alla
streptomicina (strA) e alle sulfonamidi (sulII). Questi geni sono per lo più sono localizzati su elementi mobili
come plasmidi e trasposoni che ne rendono possibile la trasmissione anche in modo orizzontale. Generalmente
un plasmide o trasposone trasmette un solo gene di resistenza ma, nei generi Mannheimia e Pasteurella, è stato
anche descritto un plasmide di grosse dimensioni veicolante simultaneamente i geni di resistenza a
streptomicina, kanamicina, sulfamidici, tetracicline e cloranfenicolo (Hirsh, et al., 1989). La circolazione di
questa tipologia di plasmidi permette l’insorgenza di resistenze multiple anche quando viene somministrato agli
animali uno solo degli antimicrobici di cui veicola i geni; questo meccanismo spiega come mai sia possibile
tuttora la segnalazione di fenomeni di antibioticoresistenza nei confronti del cloranfenicolo nonostante che il suo
impiego negli allevamenti zootecnici è ormai stato bandito fin dal 1994.
In conclusione, la rapida e continua acquisizione di meccanismi di antibioticoresistenza da parte di batteri
appartenenti ai generi Mannheimia e Pasteurella condiziona la scelta delle terapie antimicrobiche da adottare nei
focolai di malattie respiratorie. Generalmente i veterinari clinici scelgono le molecole da utilizzare in conformità
ad indicazioni fornite da testi di consultazione che normalmente includono l’impiego di streptomicina,
sulfonamidi e tetracicline. Alla luce dei presenti dati, che dimostrano la perdita di efficacia di molte delle
molecole classicamente impiegate nelle infezioni sostenute da questi microrganismi, la scelta della terapia più
appropriata dovrebbe basarsi solo sui risultati della sensibilità in vitro o in conformità con i più recenti piani di
monitoraggio.
4
Tabella 1. Sensibilità agli antibiotici di ceppi di M. haemolytica e P. multocida isolati in allevamenti di ovini nel
quadriennio 2002-2005 in Puglia (Italia).
ceppi
R
S
S
S
S
I
S
I
S
S
S
R
S
S
I
I
S
R
I
R
R
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
R
S
S
I
I
S
R
R
R
R
S
S
S
S
I
S
R
S
S
S
R
S
I
I
R
S
R
R
R
R
S
S
S
S
I
S
R
S
S
S
R
R
R
S
R
S
R
R
R
R
S
S
S
S
I
S
R
R
S
S
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
I
S
R
S
S
S
R
R
R
S
R
S
R
R
R
R
S
S
S
S
I
S
I
S
S
S
R
S
I
I
R
S
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
R
S
I
S
I
S
R
I
R
68/03
R
S
S
S
S
I
S
I
S
S
S
R
S
I
R
I
S
R
R
R
40/05C
R
S
S
S
S
R
S
I
S
S
S
R
S
S
S
I
S
R
I
R
28/03
R
S
S
S
S
S
S
I
S
I
S
R
S
I
S
I
S
R
I
R
PMB/03
S
S
S
S
S
R
S
I
R
I
S
R
S
R
S
R
S
R
R
R
82/02B
S
S
S
S
S
I
S
I
S
S
S
R
S
I
S
R
S
R
I
R
82/02C
S
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
R
S
I
S
I
S
R
I
R
41/05E
S
S
S
S
S
I
S
S
R
I
S
R
S
R
S
R
S
R
I
R
41/05A
NF
≤13
≤13
≤14
≤17
≤13
≤16
≤13
≤10
≤12
≤14
≤12
≤10
≤14
≤12
≤13
≤10
≤11
≤12
≤14
41/05C
48/02
NF
12-14
14-17
15-22
18-20
14-18
17-20
14-22
11-13
13-17
15-18
13-16
11-15
15-18
13-14
14-17
11-13
12-14
13-16
15-22
82/02A
47/02
≥22
≥15
≥18
≥23
≥21
≥19
≥21
≥23
≥14
≥18
≥19
≥17
≥16
≥19
≥15
≥18
≥14
≥15
≥17
≥23
Pasteurella multocida
PMA/03
04/02
Ampicillina
#
Amp/sulbact.
Amox/ac. clavul.
Cefotaxime
Ceftazidime
Ac. nalidixico
Norfloxacin
Eritromicina
Tilmicosina
Cloramfenicolo
Florfenicolo
Sulfametoxazolo
Sulf/trimethopr.
Tetracicline
Gentamicina
Kanamicina
Spectinomicina
Streptomicina
Neomicina
Ac. fusidico
76/02B
R¥
76/02C
I°
50/02
S*
76/02A
antibiotici
01/02
Mannheimia haemolytica
PMC/03
Valori di breakpoint
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
R
S
S
S
R
S
R
I
R
R
S
S
S
S
I
S
I
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
R
R
R
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
R
S
S
S
S
S
R
I
R
S
S
S
S
S
I
S
I
S
S
S
R
S
S
S
I
S
R
S
R
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
R
S
S
R
S
S
R
S
R
Legenda: * sensibile, ° intermedio, ¥ resistente. #: valori di breakpoint in accordo con le Deutsche
Industrienorm-Germania (DIN); dove non è espressamente indicato i valori di breakpoint sono in accordo con
NCCLS (2002); NF: dati non forniti.
Grafico 1. Sensibilità/resistenza agli antimicrobici di ceppi di M. haemolytica
Intermedi
Resistenti
lb
.
.
Ce
ac
fo
ta .
x
C
ef ime
ta
zi
N
di
al
m
id
e
ix
ic
a
N
ci
or
d
f
Er loxa
yt
ht cin
om
yc
Ti
C
hl
lm in
or
am icos
ph i n
en
Su Flo ico
l
Tr
lf
r
im am fen
i
c
et
/s
ho ol
ul
fa
m xaz
et
ho ole
T e xa
tra zo
c y le
cl
in
G
en es
ta
m
ic
Ka
in
n
Sp
am
ec
y
tin ci n
o
m
St
y
re
pt cin
om
y
ne cin
om
Fu
si icin
di
c
ac
id
la
v
su
Am
ox
i/c
p/
ci
llin
pi
Am
Am
%
Sensibili
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
5
Grafico 2. Sensibilità/resistenza agli antimicrobici in ceppi di P. multocida
Sensibili
Intermedi
Resistenti
cil
lin
p/
su
ox
lb
i/ c
.
la
v.
Ce
ac
.
fo
ta
Ce xim
fta
e
Na zid
lid ime
ixi
c
No ac
id
rf
Er lo x
a
yt
ht c i n
om
yc
T
Ch
ilm in
lo
ra icos
m
ph in
en
ic
Su
Fl
ol
o
lf
Tr
r
im a m fen
et
i
/s
h o col
ul
fa
m xa z
et
o
ho le
Te xa
tra zol
cy e
cl
i
G
en nes
ta
m
Ka
ic
i
Sp nam n
ec
y
tin cin
om
St
yc
re
in
pt
om
yc
ne in
o
Fu mic
si
in
di
c
ac
id
Am
Am
Am
pi
%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Grafico 3. Resistenza agli antimicrobici (% ) in M. haemolytica e P. multocida
M. haemolytica
P. multocida
100
90
80
70
%
60
50
40
30
20
10
p/
su
ox
lb
.
i/ c
la
v.
ac
C
.
ef
ot
ax
im
Ce
e
fta
zi
di
Na
m
lid
e
ix
ic
ac
No
id
rfl
ox
Er
ac
yt
in
ht
om
yc
in
Ti
lm
Ch
ic o
lo
ra
si
m
n
ph
en
ic
ol
Fl
S
or
ul
f
fa
en
Tr
m
ic o
im
et
l
ho
/s
ul
x
fa
az
m
o
le
et
ho
xa
Te
zo
tra
le
cy
cl
in
G
es
en
ta
m
ic
Ka
in
na
Sp
m
yc
ec
in
tin
om
yc
St
re
in
pt
om
yc
ne in
om
ic i
Fu
n
si
di
c
ac
id
A
m
Am
A
m
pi
ci
llin
0
BIBLIOGRAFIA
Angen Ø., Mutters R., Caugant D.A., Olsen J.E., et Bisgaard M. (1999). Taxonomic relationships of the
(Pasteurella) haemolytica complex as evaluated by DNA-DNA hybridisations and 16S rRNA sequencing with
proposal of Mannheimia haemolytica gen. nov., comb. nov., Mannheimia granulomatis comb. nov., Mannheimia
glucosidal sp. nov., Mannheimia ruminalis sp. nov., and Mannheimia varigena sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol.49,
67-86.
Biberstein E.L., Gills M.G. et Knight H. (1960). Serological types of Pasteurella haemolytica. Cornell Vet. 50,
283-300.
Gilmour N.J.L. 1980. Pasteurella haemolytica infections in sheep. Veter. Quart. 2, 191-198.
Hirsh D.c, Hansen LM, Dorfman Lc, Snipes KP, Carpenter TE, Hird DV, McCapes RH, (1989). Resistance to
antimicrobial agents and prevalence of R plasmids in Pasteurella multocida from turkeys. Antimicrob. Agents
Chemoter, 33: 670-673.
6
ITAVARM 2003. Monitoraggio dell’antibioticoresistenza in medicina veterinaria in Italia. Istituto
Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana. Primo report: 32-34.
Mackie J.T.,Barton M., Hindmarsh M., Holsworth I., 1995. Pasteurella haemolytica septicoemia in sheep. Aust.
Vet. J. 72, 474.
NCCLS (2002). Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria
isolated from Animals; Approved Standard-Second Edition. NCCLS document M31-A2. NCCLS, Wayne,
Pennsylvania, USA.
Trolldenier H., (1999). Antimikrobielle Tierarzneimittel. Kongresses der Deutschen Veterinärmedizinischen
Gesellchaft, 1-17.
Witte, W. (2000). Selective pressure by antibiotic use in livestock. Int. J. Antimicrob. Agents, 16: 19-24.