Rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi

50 anni
Rilevazione strumentale dei fitoplasmi
agenti degli scopazzi: metodologie
di laboratorio a confronto
Sanja BARIC, Luis LINDNER, Josef DALLA VIA,
Centro di Sperimentazione Agraria di Laimburg
Negli ultimi anni si è assistito, nei frutteti altoatesini, ad
una progressiva diffusione degli scopazzi. Poiché la fitoplasmosi non si è manifestata esclusivamente negli impianti
più datati, ma ha colpito anche le piante più giovani, grande è l’incertezza che si è manifestata relativamente al materiale vivaistico. Per questo sono comprensibili le richieste di
praticare test massali per la certificazione. Una tale modalità di procedere è però praticabile?
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li scopazzi sono stati descritti per la prima volta nel
1950 come una virosi del melo. Oggi sappiamo che la patologia è provocata da un batterio appartenente
al gruppo dei fitoplasmi. A livello internazionale diverse centinaia di patologie vengono associate a questo
gruppo di batteri. Tutti gli agenti
patogeni mostrano alcune caratteristiche comuni, tra le quali l’impossibilità di sopravvivere all’esterno
della cellula dell’ospite e di essere
coltivati su substrati artificiali. Di
conseguenza la loro rilevazione strumentale può essere praticata esclusivamente all’interno del tessuto vegetale o dell’insetto vettore, il che
rappresenta un grave ostacolo per lo
studio delle fitoplasmosi.
PRELIEVO
DEI CAMPIONI
Per una corretta rilevazione strumentale del patogeno agente degli
scopazzi, la fase del prelievo dei
campioni è di pari importanza ri128
spetto alla scelta del più adeguato
metodo di test. La distribuzione del
fitoplasma nel tronco e nei rami è
spesso irregolare e la probabilità di
reperirlo non dipende soltanto dal
periodo dell’anno, ma anche dal caso. Può così accadere che in rami o
foglie prelevate da una pianta infetta e sintomatica non si rilevi la
presenza di fitoplasmi (nemmeno
con le metodologie più sofisticate
e sensibili) soltanto perché si sono
scelte foglie o rami senza patogeno. Per contro, il patogeno è regolarmente presente nell’apparato radicale, dove può essere reperito durante tutto l’arco dell’anno sia su
piante sintomatiche che su piante
con un’infezione latente. Una “lacuna diagnostica” (= spazio temporale durante il quale l’agente non
può essere diagnosticato) si presenta immediatamente dopo l’infezione e perdura fino a che il patogeno non ha colonizzato l’apparato
radicale. Nonostante il prelievo di
radici sia oggettivamente più impe-
gnativo rispetto a quello
di getti o foglie, questa
strategia appare giustificata e necessaria a
motivo della maggiore
affidabilità degli esiti delle analisi.
METODOLOGIE
MICROSCOPICHE
La prima scoperta dei fitoplasmi
avvenne, nel 1967, da parte di un
gruppo di ricerca giapponese che
utilizzò il microscopio elettronico. A
causa della loro somiglianza con altri batteri privi di parete cellulare,
noti patogeni dell’uomo e degli animali, vennero definiti, fino al 1994,
come MLO (mycoplasma-like organisms). La microscopia elettronica
consentì in seguito di ottenere importanti informazioni sulla natura e
sullo spettro delle piante ospiti di
questi organismi. A motivo però degli elevatissimi costi delle apparecchiature necessarie e del considere-
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vole impegno lavorativo per la preparazione delle sezioni ultrasottili
dei campioni, questa tecnica non è
mai stata proposta per la diagnostica di routine.
Negli anni ‘70 venne infine adottato il metodo DAPI, che consentì la
rilevazione strumentale dei
fitopla-
Inoltre i diversi ceppi o le differenti specie di fitoplasmi non possono
essere identificati né differenziati
tra loro. Ciò risulta di fondamentale importanza quando una specie
vegetale può essere infettata da diversi fitoplasmi con differente epidemiologia (come per la vite, che
può essere colpita dal legno nero e
dalla flavescenza dorata). Anche se
il problema della specificità può essere risolto con l’immunofluorescenza, per questo metodo rimangono tutti gli altri svantaggi già
descritti per il metodo DAPI.
METODOLOGIE BASATE
SULL’ANALISI DEL DNA
Le metodologie che si fondano sull’analisi del DNA si basano sull’unicità del materiale ereditario proprio
di ciascun organismo vivente. Come
l’impronta digitale viene impiegata
per l’identificazione di persone, è
possibile sfruttare le informazioni
contenute nel materiale ereditario
come “impronta genetica” per l’identificazione ed il riconoscimento
dei diversi organismi (anche patogeni!). In particolare, lo sviluppo
della cosiddetta “reazione a catena
della polimerasi” (PCR), con la quale si riproduce un determinato segmento di DNA (ed indirettamente lo
si può rendere identificabile/visibile; vedi Frutta e Vite 6/2003, pag.
169), condusse, negli anni ‘90, ad
un enorme passo in avanti nella ricerca relativa ai fitoplasmi. Solamente grazie all’impiego delle metodologie basate sull’utilizzo del
DNA o sulla PCR divenne possibile
verificare le relazioni esistenti tra
determinate specie di fitoplasmi, le
loro piante ospiti e gli insetti vettori, oltre che stabilire la loro molteplicità genetica ed i rapporti di
parentela. A motivo della precisione e della loro elevatissima sensibilità strumentale i metodi basati sulla PCR entrarono a pieno titolo nei
laboratori diagnostici.
Negli ultimi anni, presso il Centro di
Sperimentazione Agraria di Laimburg, è stato sviluppato, per la rilevazione strumentale specifica dei fitoplasmi agenti patogeni degli sco-
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Ripresa vegetativa anticipata.
smi con il microscopio ottico. Questo metodo si basa sulla colorazione di sezioni microscopiche di tessuto vegetale con 4,6-DiamidinoPhenylindol (abbreviato: DAPI), che
si lega specificamente al DNA. In
presenza di un’infezione è possibile riconoscere, alla luce di un microscopio, caratteristiche particelle
fluorescenti nelle cellule cribrose.
L’impiego di questa metodologia
richiede però un occhio particolarmente allenato, poiché il
colorante non agisce soltanto sul materiale genetico del
fitoplasma, bensì anche su
quello della pianta (il DNA si
trova, oltre che nel nucleo,
anche nei cloroplasti e nei mitocondri!), ed in tal modo è facile confondere quanto si vede.
L’ausilio del microscopio permette una corretta rilevazione strumentale solo quando la densità dei patogeni è sufficientemente
elevata. A causa dell’irregolare distribuzione dei fitoplasmi
nei tessuti vegetali, è
necessario preparare
e controllare un
gran numero di
sezioni per campione, ottenendo così solo
una ridotta
portata
analitica.
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pazzi, un nuovo procedimento che
si fonda sulla real-time PCR (vedi
Frutta e Vite 2/2005, pagg. 15-16).
Tale metodo di analisi risulta, al
confronto con quello tradizionale di
PCR, il più sensibile e preciso. Sebbene i costi dei reagenti impiegati
siano più elevati, essi vengono compensati dal ridotto impegno lavorativo richiesto per la conduzione dell’analisi (vedi grafico).
Indipendentemente da quale metodologia PCR si decida di seguire,
uno dei passi più impegnativi rimane comunque l’estrazione del DNA.
Come già detto, per la rilevazione
strumentale dei fitoplasmi agenti
degli scopazzi si utilizzano campioni prelevati dall’apparato radicale,
generalmente tre per pianta, dello
spessore di una matita e della lunghezza di circa 10 cm. In laboratorio si procede alla loro accurata
pulizia, e alla preparazione del tessuto floematico (tubi cribrosi), al
quale si limita la presenza del patogeno. Tale passo è necessario, in
quanto consente di aumentare la
quantità di DNA del patogeno rispetto a quello della pianta e di incrementare la probabilità d’identificazione. Tra la preparazione di un
campione e quella del successivo è
assolutamente necessario pulire accuratamente e sterilizzare tutta la
strumentazione utilizzata per evitarne la contaminazione. Il tessuto
così preparato viene poi sminuzzato con un omogenizzatore. Una serie di successive operazioni permettono l’isolamento del DNA.
A causa dell’impegnativa preparazione descritta presso il laboratorio
di biologia molecolare del Centro di
Sperimentazione Agraria di Laimburg è possibile l’estrazione del DNA
di 15 doppi campionamenti durante una giornata lavorativa. Tenuto
conto di 200 giorni lavorativi in un
anno è possibile dunque ottenere
3000 isolati di DNA - senza aver
condotto alcuna analisi PCR! Appare quindi evidente che a causa dell’elevato impegno per l’estrazione
nessuna metodologia basata sul
DNA è adatta ad effettuare test di
massa diagnostici per gli agenti degli scopazzi.
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METODOLOGIE
SIEROLOGICHE - ELISA
l’estrazione
del DNA
real-time PCR
incubazione
con anticorpo 1
lavaggio
analisi dei dati
incubazione con
anticorpo 2
lavaggio
incubazione su
substrato
analisi dei dati
Confronto tra i procedimenti, rispettivamente, della metodologia real-time
PCR (a sinistra) ed ELISA (a destra)
per la rilevazione strumentale dei fitoplasmi agenti degli scopazzi. Per
effettuare entrambe le analisi è necessario predisporre il prelievo di campioni radicali (A) e la preparazione del
tessuto floematico (B). Quest’ultimo
viene omogeneizzato (C) e da esso,
per la real-time PCR, si isola il materiale genetico - DNA (riquadro rosso).
Per il test ELISA, invece, è possibile
utilizzare direttamente l’estratto
vegetale, sebbene il suo impiego
(riquadro giallo) richieda un maggior
impegno rispetto a quanto avviene
per la real-time PCR. La sensibilità
strumentale del test ELISA risulta
almeno 100 volte inferiore rispetto a
quella della real-time PCR.
Di frequente il test ELISA viene nominato in alternativa alle metodologie basate sul DNA per la rilevazione strumentale degli agenti causali degli scopazzi. Il termine ELISA
deriva dall’inglese Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay e si fonda sul
riconoscimento di proteine che appartengono al patogeno attraverso
specifici anticorpi - analogamente a
quanto avviene durante una reazione immunologica del nostro sistema
di difesa. Un argomento spesso associato al test ELISA è “l’utilizzo
semplice e conveniente” di questo
procedimento. La sua convenienza
economica può in questa occasione
essere senza dubbio confermata sebbene solo in relazione ai reagenti. L’impegno lavorativo che esso richiede per la preparazione dei campioni (estrazione) è però soltanto
leggermente inferiore a quello della PCR, poiché anche per il test ELISA si necessita del tessuto floematico radicale per poter avere la possibilità di individuare un’infezione
latente. Rispetto al procedimento di
preparazione presentato nel paragrafo precedente, per il test ELISA
non viene effettuata solo l’estrazione del DNA dal tessuto vegetale
sminuzzato - il rimanente procedimento rimane invariato (vedi grafico). A ciò si deve aggiungere il fatto che l’analisi vera e propria è costituita da diversi passaggi e richiede per lo meno il doppio del tempo richiesto dal procedimento a
passaggio unico della real-time PCR
(vedi grafico, riquadro giallo). Un
ulteriore e particolarmente gravoso
svantaggio per una metodologia
diagnostica è rappresentato dalla ridotta sensibilità strumentale: un
confronto diretto tra un metodo
PCR ed un metodo ELISA per la rilevazione strumentale dei fitoplasmi
agenti degli scopazzi eseguito anche dai collaboratori dell’Università
di Udine (Brzin et al. 2003, Journal
of Plant Diseases and Protection
110, 476-483), ha mostrato una
sensibilità del test ELISA di ben 100
volte inferiore. A causa di ciò, in al-
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cune piante colpite da infezione latente, la presenza dei fitoplasmi è
stata disconosciuta ed è stato fornito un esito erroneamente negativo. Sulla base di queste esperienze,
presso il Centro di Sperimentazione
Agraria di Laimburg è stato osservato che, in alcuni casi, nonostante
evidenti manifestazioni sintomatiche, il test ELISA non ha consentito la rilevazione del patogeno (vedi
Frutta e Vite 6/2003, pagg. 172173). Per questo è opportuno dubitare, in generale, degli esiti negativi forniti dal test ELISA. Gli autori
dell’articolo sopra citato propongono quindi di sottoporre ad analisi
PCR (più sensibile) le piante per le
quali l’esito del test ELISA risulta
dubbio o negativo. Questo significherebbe un raddoppio dell’impegno lavorativo e finanziario per l’analisi nel controllo del materiale di
moltiplicazione e vivaistico. Per
evitare questi inutili costi sarebbe
opportuno, sin dall’inizio, seguire
una metodologia analitica affidabile, rappresentata attualmente dalla
real-time PCR sviluppata presso il
Centro di Sperimentazione Agraria
di Laimburg.
CONCLUSIONI
Attualmente non disponiamo di
metodologie analitiche per l’esecuzione di test di massa per la rilevazione strumentale dei patogeni
agenti degli scopazzi. Tale situazione è da addebitare soprattutto all’elevato impegno lavorativo che esse richiedono per la preparazione
dei campioni e ai loro gravosi costi.
Oggigiorno, con una produzione annua di 6 milioni di astoni, il materiale vivaistico altoatesino può essere sottoposto ad analisi solo a
campione ed in occasione di piante
sospette. Con il metodo della realtime PCR, a nostra disposizione, è
comunque possibile garantire lo
stato di salute del materiale di premoltiplicazione, operazione che viene effettuata presso il Centro di
Sperimentazione Agraria di Laimburg (vedi Frutta e Vite 2/2006,
pagg. 41-42).
Fiere
AGRIALP 2007
20ª Fiera Agricola dell’Arco Alpino
Bolzano, 9 – 12 novembre 2007
Nel quartiere fieristico di Bolzano
fervono i preparativi per “Agrialp”,
20ª Fiera Agricola dell‘Arco Alpino.
La rassegna, ampia vetrina per tutti coloro che operano nel settore
dell‘agricoltura, avrà luogo dal 9 al
12 novembre 2007. Saranno in mostra prodotti e novità del settore.
In Alto Adige sono presenti oltre
27.000 aziende agricole e forestali
nelle quali lavorano circa 24.500
persone. La superficie agricola utile
si estende su 272.456 ettari, ossia
sul 37% dell‘intero territorio altoatesino. Questi dati sono eloquenti e
sottolineano l‘importanza che l‘agricoltura riveste, fin dai tempi antichi, nella nostra provincia. La prima
Fiera Agricola dell‘Arco Alpino si
tenne a Bolzano nel 1971; il prossimo novembre gli organizzatori festeggeranno la ventesima edizione.
Nel nutrito ed articolato programma di iniziative che farà da cornice anche alla 20ª Fiera Agricola del-
l’Arco Alpino figura il congresso
“Conto alla rovescia per Interpoma
2008”. L’evento verterà sul tema
della mela e sarà organizzato in collaborazione con la casa editrice “Il
Sole 24 ore – Edagricole”. Sul palco
eventi di “Agrialp” l’Unione Agricol-
tori e Coltivatori Diretti Sudtirolesi
(Bauernbund) terrà numerose manifestazioni e tavole rotonde.
“Agrialp” resterà aperta tutti i giorni dalle ore 8.30 alle 18.00.
Ulteriori informazioni alla pagina
www.agrialp.com