Elucigene® QST*R-PL (Aborto spontaneo) Istruzioni per l`uso del test

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Elucigene® QST*R-PL (Aborto spontaneo) Istruzioni per l'uso del test
Elucigene® QST*R-PL (Aborto spontaneo)
Istruzioni per l’uso del test
Codice cat.: AN6XYB1 – 25 test
Per uso diagnostico in vitro
Prodotto da:
Elucigene Diagnostics
Citylabs
Nelson Street
Manchester
M13 9NQ
Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica:
Tel.: +44 (0) 161 669 8122
Fax: +44 (0) 161 669 8129
E-mail: [email protected]
E-mail: [email protected]
Elucigene Diagnostics è il nome commerciale di Delta Diagnostics (UK) Limited, una società iscritta in Inghilterra
e nel Galles al numero di iscrizione 8696299.
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Elucigene QST*R-PL
Uso previsto
Per la diagnosi routinaria in vitro delle sei più comuni trisomie autosomiche associate all'aborto
spontaneo: trisomia 13 (sindrome di Patau), trisomia 15, trisomia 16, trisomia 18 (sindrome di Edwards),
trisomia 21 (sindrome di Down) e trisomia 22. Il kit contiene anche i marker per i cromosomi X e Y e il
marker TAF9L per la determinazione dello stato dei cromosomi sessuali. La metodica impiegata dal kit
Elucigene QST*R-PL è la tecnica QFPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in
fluorescenza). Il dispositivo è destinato all'uso su DNA estratto da materiale fetale ottenuto post-aborto
o sangue intero (di origine fetale). La popolazione target di interesse è costituita da soggetti che hanno
subito un aborto spontaneo. I risultati ottenuti con il kit QST*R-PL possono essere d'aiuto per stabilire
lo stato di aneuploidia del feto e sono destinati all'uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche
al fine di supportare o scartare la diagnosi clinica proposta. Il dispositivo è destinato esclusivamente
all’uso professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare.
Riepilogo e spiegazione
Statisticamente, il 10-20% di tutte le gravidanze termina in un aborto spontaneo di cui la maggior parte
si verifica verso la fine del primo trimestre. Di questi, oltre il 50% di casi ha mostrato di essere causato
da un'anomalia cromosomica (1), primariamente da aneuploidia; le più comuni conosciute sono le
trisomie che rappresentano il 60% di tutte le anomalie cromosomiche nell'aborto spontaneo. La trisomia
più frequente trovata in prodotti del concepimento (POC) è la trisomia per il cromosoma 16, tuttavia,
anche le trisomie per i cromosomi 13, 15, 18, 21 e 22 sono tra le più comuni. Altre aneuploidie
comunemente riscontrate includono la monosomia del cromosoma X e la triploidia che rappresentano
ca. il 20% e il 15% di tutte le anomalie rispettivamente. Questi dati sono rappresentati in Figura 1 sotto
(2).
Figura 1: Mostra le individuazioni cromosomiche in prodotti del concepimento con 46N che rappresentano
risultati normali.
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Principi della procedura
La metodica impiegata dai kit Elucigene QST*R è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della
polimerasi quantitativa in fluorescenza) (3-6). Utilizzando l’amplificazione mediante PCR, i primer
marcati con un colorante fluorescente sono diretti a individuare le regioni altamente polimorfiche delle
sequenze di DNA denominate ripetizioni in tandem brevi (short tandem repeat, STR) che sono
localizzate sui cromosomi di interesse. Ogni marker STR individuato è specifico per il cromosoma su
cui si trova, pertanto il numero di copie del marker STR può essere indicativo del numero di copie del
cromosoma. Sono stati selezionati marker STR informativi che mostrano un’elevata eterogeneità, in
modo tale da determinare facilmente il numero di copie. Un campione diploide normale presenta il
normale complemento di due di ciascuno dei cromosomi somatici, pertanto i due alleli di un STR
specifico per un cromosoma vengono determinati dalla tecnica QF-PCR come due picchi in rapporto
1:1. L’osservazione di un allele STR in più come profilo a tre picchi in rapporto 1:1:1 o come profilo a
due picchi in rapporto 2:1 o 1:2 è indicativo della presenza di una sequenza aggiuntiva che a sua volta
rappresenta un cromosoma aggiuntivo, come nel caso di una trisomia.
I prodotti di amplificazione ottenuti con la tecnica QF-PCR vengono analizzati in modo quantitativo con
un analizzatore genetico mediante elettroforesi capillare per determinare il numero di copie dei marker
STR analizzati.
Avvertenze e precauzioni
1. Il DNA normale di controllo fornito all’interno dei kit è stato analizzato a parte ed è risultato
negativo al virus dell’epatite B (HBV), al virus dell’epatite C (HCV) e al virus
dell’immunodeficienza umana (HIV) 1 e 2.
2. Si consiglia di manipolare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono
essere considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza
assoluta dell’assenza dei virus HBV, HCV, HIV o di altri agenti infettivi.
3. La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo
smaltimento devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle linee guida o dai
regolamenti nazionali appropriati in materia di sicurezza e rischio biologico.
4. In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare in
ciascun test i propri campioni di controllo qualità interno di tipo noto, in modo da poter valutare
la validità della procedura.
5. Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non
utilizzare il kit e contattare l’assistenza clienti.
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Simboli usati sulle etichette
I simboli usati su tutte le etichette e le confezioni sono conformi alla norma armonizzata
ISO 15223
Produttore
Numero di test
Vedere le Istruzioni per l'uso
X°C
Conservare al di sotto della temperatura indicata
Utilizzare prima della data indicata
Codice catalogo
Numero di lotto o partita
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
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Materiali forniti
Conservare tutti i componenti a temperature inferiori a -20 °C.
Il kit Elucigene QST*R-PL IVD contiene:
450089 1 x 250µl Miscela di reazione (TA)
404485 1 x 50µl DNA di controllo (DC)
Sufficiente per 25 test.
Preparazione e conservazione del kit
All'apertura del kit si consiglia di dispensare la miscela di reazione in provette per PCR da 0.2ml in
volumi di 10µl e congelare a -20°C. Assicurarsi che il contenuto delle provette sia accuratamente
scongelato e mescolato prima di essere dispensato.
Il DNA di controllo deve essere congelato a -20°C.
Materiali necessari ma non forniti
Generali
Materiali di consumo di laboratorio: guanti, tubi per microcentrifuga con tappo a vite, provette per PCR
da 0.2ml o piastre di microtitolazione raccomandati dal produttore del termociclatore impiegato, puntali
per pipette.
Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la pre-amplificazione e 1 per la postamplificazione, preferibilmente pipette a spostamento positivo), indumenti di protezione, vortex,
microcentrifuga, centrifuga con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
Amplificazione mediante PCR
Termociclatore adatto per piastre di microtitolazione a 96 pozzetti o provette da 0.2ml con accuratezza
di temperatura di +/-1°C tra 33°C e 100°C e uniformità di temperatura statica di +/-1°C. QST*R-21-PL
è stato convalidato e ha mostrato di soddisfare la specifica sulle seguenti piattaforme di termociclatore:





Life Technologies GeneAmp 9700
Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità standard)
Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità di simulazione 9700)
Life Technologies Proflex (funzionamento in modalità standard)
Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità di simulazione 9700)
Nota: Le intensità dei segnali di picco possono aumentare con l'uso di piattaforme di
termociclatore Veriti e Proflex rispetto alla piattaforma GeneAmp 9700.
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Elettroforesi capillare
Elettroforesi capillare: size standard GeneScan 500 LIZ (ABI, n. cat. 4322682), polimero POP-7 (ABI,
n. cat. 4352759), standard per la matrice DS-33 (set di coloranti G5) (ABI n. cat. 4345833), tampone
per analizzatore genetico 10x (ABI, n. cat. 402824) e formammide Hi-Di (ABI, n. cat. 4311320).
Analizzatori genetici Applied Biosystems ABI 3130 e 3500 (con software GeneMapper), array di capillari
di 36 cm (array di capillari di 50 cm per l’analizzatore genetico 3500), piastre ottiche a 96 pozzetti, setti
per 96 pozzetti, cassette per 96 pozzetti.
Analisi dei dati
È richiesto uno dei seguenti pacchetti software per l’analisi dei dati: GeneMapper 4.1 (Applied
Biosystems Inc.) o versione successiva o GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) o versione successiva.
Documentazione aggiuntiva Elucigene QST*R
Queste Istruzioni per l'uso includono una sezione di base sull'interpretazione dei risultati ottenuti in
aggiunta a una guida al software di analisi con i pacchetti GeneMapper e GeneMarker. Una
documentazione aggiuntiva, Guide to interpretation (Guida all’interpretazione) con esempi e un
glossario sono disponibili sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com.
Estrazione del DNA
Una metodica per l'estrazione del DNA per produrre un DNA di qualità amplificabile con la tecnica PCR
alla concentrazione compresa tra 0.5ng/µl e 4ng ng/µl.
Concentrazione del DNA
Utilizzando le condizioni consigliate per la PCR e le impostazioni di iniezione dei campioni* indicate nel
modulo di analisi per le colonne capillari (pag. 9), si ottengono risultati ottimali con un quantitativo di
DNA di input di 2.5ng. Tuttavia, risultati interpretabili si ottengono con la gamma di DNA di input
compresa tra 1.25ng e 10ng.
*Nota: È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di
ampliconi prodotti durante la reazione di PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA
genomico di input aggiunto. Riducendo il tempo di iniezione è possibile applicare una minore quantità
di ampliconi alla colonna di analisi. Aumentando invece il tempo o la tensione di iniezione è possibile
applicare una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. È possibile reiniettare più volte i
campioni precedentemente amplificati per rianalizzarli.
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Protocollo del test
Procedura di amplificazione
Nota: Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, le operazioni descritte ai punti 3 - 5 devono
essere condotte in un’area priva di DNA. Queste operazioni devono essere eseguite anche per evitare
la contaminazione con il prodotto di PCR.
1. Programmare il termociclatore per un ciclo di un unico passaggio a 95 °C per 15 minuti per
attivare la DNA polimerasi seguito da un programma ciclico di amplificazione di 30 secondi a
95 °C (denaturazione), 1 minuto e 30 secondi a 59 °C (annealing) e 1 minuto e 30 secondi a
72 °C (estensione) per 26 cicli. Questo ciclo deve essere collegato ad un file di ritardo di 30
minuti a 72 °C (estensione) sul ciclo finale.
2. Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo (acqua). Può essere opportuno
includere anche altri controlli, ad esempio un controllo positivo normale (DNA di controllo
fornito) e un controllo positivo per la trisomia (DNA non fornito).
3. Scongelare un numero di provette contenenti la miscela di reazione QST*R-PL
precedentemente suddivisa in aliquote, che sia sufficiente per il numero di campioni e controlli
da analizzare (vedere la nota in Materiali forniti) e centrifugarle a 12.000 g per 10 secondi.
4. Utilizzando puntali per pipette diversi, aggiungere 2,5 µl di DNA da analizzare alla provetta del
campione contenente 10 µl di miscela di reazione QST*R-PL e miscelare aspirando e
rilasciando con la pipetta. Ripetere l’operazione per tutti i campioni da analizzare.
5. Nella provetta per PCR che verrà utilizzata per il controllo negativo non aggiungere DNA, ma
aggiungere 2,5 µl di acqua distillata sterile.
6. Centrifugare brevemente le provette fino a quando tutto il liquido si sarà depositato sul fondo
di ciascuna provetta.
7. Posizionare tutte le provette nel blocco del termociclatore in modo che siano ben ferme.
Avviare il programma di attivazione a 95° C seguito dal programma di amplificazione (vedere il
punto 1).
8. Al termine del programma di amplificazione, i campioni possono essere conservati a
temperatura ambiente per tutta la notte oppure a 2° C - 8° C per un massimo di 7 giorni prima
dell’analisi con elettroforesi capillare.
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Elettroforesi capillare
Si raccomanda a ciascun utilizzatore di assicurarsi che l’apparecchiatura selezionata sia usata secondo
le istruzioni della ditta produttrice e che sia compatibile con questo test. In questo contesto, i parametri
chiave sono il polimero e l’array di capillari. Risultati ottimali si possono ottenere utilizzando le seguenti
condizioni per l’elettroforesi capillare sull’analizzatore genetico ABI3130 o ABI3500.
1. Combinare 6,85 µl di size standard con 250 µl di formammide Hi-Di e miscelare con cura
(miscela sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 µl di miscela nel numero di pozzetti
necessario su una piastra ottica a 96 pozzetti*.
2. Aggiungere 3 µl di prodotto di PCR del campione di analisi alla miscela di size standard
(preparata come indicato al punto 1) precedentemente dispensata nella piastra e miscelare con
la pipetta. Sigillare la piastra.
3. Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra ottica in un termociclatore utilizzando i
seguenti parametri: 94 °C per 3 minuti e a seguire 4 °C per 30 secondi.
4. Centrifugare la piastra a 1.000 g per 10 secondi per rimuovere eventuali bolle nei pozzetti e
caricarla sull’analizzatore genetico.
*Nota: È essenziale che i pozzetti non utilizzati (cioè i pozzetti in cui è caricato il campione di DNA)
siano sempre caricati con formammide Hi-Di per garantire che i capillari non si asciughino.
Analisi dei dati post-PCR
ABI3130 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)
Creare una scheda campione utilizzando il software di raccolta dati 3130 con le seguenti impostazioni:
• Nome campione: deve essere lo stesso nome o numero specifico del campione.
• Responsabile analisi: selezionare il responsabile predefinito del laboratorio.
• Protocollo di analisi: QSTR (contiene il modulo di analisi QST*R 3130 – vedere sotto)*.
*Nota: È necessario creare un modulo di analisi elencando le impostazioni dello strumento e
successivamente assegnare questo modulo a un protocollo di analisi in cui sia stato selezionato il set
di coloranti G5. Per ulteriori informazioni sulla creazione dei moduli di analisi, consultare il manuale
d’uso dello strumento in dotazione.
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3130 RUN MODULE (MODULO DI ANALISI)
PER IL POLIMERO POP7
Modulo per capillare da 36 cm: QSTR
#
1.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Nome del parametro
Temperatura forno
Poly_fill_Vol.
Stabilità corrente
PreRun_Voltage
Pre_Run_Time
Injection_Voltage
Injection_Time
Voltage_Number_of_Steps
Voltage_Step_Interval
Data_Delay_Time
Run_Voltage
Run_Time
Valore
60
6500
5.0
15.0
180
3,0
15
20
15
60
15,0
1200
Intervallo
int 18…65 gradi C
6500…38000 fasi
int 0…2000 uAmp
0 …15 kvolt
1…1000 s
1 …15 kvolt
1…600 s
1…100 nk
1…60 s
1…3600 s
0 …15 kvolt
300…14000 s.
ABI3500 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)
È necessario creare un protocollo dello strumento per QST*R che può essere usato
successivamente per ciascuna analisi QST*R. Creare il protocollo dello strumento per QST*R
mediante la libreria dei protocolli dello strumento 3500.
Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci:
• Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7
• Immettere le impostazioni illustrate nell’immagine qui sotto:
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Per analizzare i campioni, creare una piastra del campione facendo clic su "Create Plate from
Template" (Crea piastra da modello) nel "Dashboard", assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo
dello strumento corretto per QST*R (vedere sopra).
Analisi e interpretazione dei risultati
È consigliabile che ogni laboratorio sviluppi le proprie procedure e i propri criteri di interpretazione e
refertazione dei risultati. Le linee guida di miglior pratica per la QF-PCR sono state documentate dalla
Association for Clinical Genetic Science del Regno Unito e sono disponibili sul sito:
www.acgs.uk.com
I prodotti di PCR vengono osservati in un sistema marcato con 5 coloranti utilizzando il set di filtri G5.
Il set di filtri G5 permette di rilevare i frammenti marcati con 6-FAM (blu), VIC (verde), NED (giallo) e
PET (rosso) più il marker size standard marcato con LIZ (arancione) su un elettroferogramma con il
programma GeneMapper o GeneMarker.
Una guida all'interpretazione QST*R è disponibile sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com.
Nota importante: Le diverse combinazioni di strumenti, polimeri e size standard possono causare lievi
variazioni nell’assegnazione delle dimensioni. Durante la convalida del kit, l’utente deve verificare che
le impostazioni del file bin predefinite consentano un’etichettatura accurata dei picchi e, se necessario,
deve regolarle. In caso di difficoltà, contattare l’assistenza tecnica. ([email protected]).
Linee guida generali per QST*R-PL
1. Il controllo negativo non deve mostrare picchi alti e stretti nell’intervallo di valori compreso tra 100
bp e 510 bp.
2. Il controllo positivo deve mostrare i risultati attesi e tutti i picchi devono soddisfare i criteri riportati
di seguito.
3. Per l’analisi dei campioni di DNA si deve osservare almeno 1 picco per ogni marker analizzato.
L’intervallo accettabile per i picchi dei marker analizzati con l’analizzatore genetico 3130 è
compreso tra 50 e 6000 unità di fluorescenza relativa (rfu), mentre per i marker analizzati con gli
analizzatori genetici 3500 è compreso tra 175 e 32000 rfu. Le altezze dei picchi che non rientrano
in questo intervallo non devono essere analizzate.
4. Gli elettroferogrammi di scarsa qualità dovuta ad eccessivo spargimento (bleedthrough) tra i
coloranti (fenomeno noto anche col termine di "pull-up") o "spikes elettroforetici" (picchi alti e stretti
presenti in più di un colorante) non devono essere interpretati. I prodotti di PCR devono essere
reiniettati e rianalizzati.
5. L’analisi viene eseguita valutando il rapporto tra i picchi (A1/A2), dove A1 è l’area del picco del
frammento più corto e A2 è l’area del picco del frammento più lungo. Il rapporto che ne deriva è
indicativo del numero di copie dei loci. Per le disomie cromosomiche, i marker eterozigoti devono
mostrare due picchi con altezze simili. Un’analisi completa dello stato del numero di copie dei
cromosomi viene eseguita dal confronto tra i rapporti dell’area dei picchi.
6. I marker eterozigoti diallelici (cioè due alleli) devono rientrare in un intervallo di rapporti compreso
tra 0,8 e 1,4. Tuttavia, per due alleli le cui dimensioni si discostano di più di 24 bp, è accettabile un
rapporto non superiore a 1,5. Qualunque valore che cade all'interno di questo intervallo viene
considerato rientrante nel rapporto 1:1. Se il bilanciamento dei rapporti non rientra in questo
intervallo, la causa potrebbe essere attribuita a vari fattori, tra cui:
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 Trisomia cromosomica completa
 Trisomia cromosomica parziale (incluse le duplicazioni submicroscopiche)
 Mosaicismo
 Secondo genotipo contaminante (ad es., materno, gemello, esterno)
 Stutter che causano "skewing" (deviazioni significative del rapporto 1:1);
 Amplificazione preferenziale di un allele che causa "skewing"
 Polimorfismo in corrispondenza dei siti di legame dei primer
 Mutazioni somatiche nelle regioni microsatelliti.
La Guide to Interpretation (Guida all’interpretazione) contiene degli esempi di profili tipici per molti
di questi casi. I marker omozigoti risultano non informativi perché non può essere determinato un
rapporto.
7. Per poter interpretare un risultato come anomalo (ossia, presenza di una trisomia), è necessario
individuare almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli mentre tutti gli altri
marker possono risultare non informativi. Non è consigliabile interpretare un risultato come
anomalo basandosi sulle informazioni ottenute da un unico marker. Se necessario, i test di controllo
effettuati con i kit per singoli cromosomi (ossia, Elucigene QST*R-13, Elucigene QST*R-18,
Elucigene QST*R-21) possono fornire informazioni sufficienti per l’interpretazione.
La trisomia è determinata dalle seguenti condizioni:
7.1. Due picchi di altezza diversa. Tale condizione è dovuta al fatto che uno dei picchi rappresenta
due alleli presenti in uno o in entrambi i genitori. In tal caso, il rapporto tra i due picchi verrà
classificato come 2:1 o 1:2 tale che A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra 1.8
e 2.4 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più grande rispetto al picco
che rappresenta l’allele più lungo, oppure A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa
tra 0.45 e 0.65 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più piccola rispetto
al picco che rappresenta l’allele più lungo.
7.2. Presenza di tre picchi di altezza comparabile. Il rapporto dei picchi verrà classificato come
1:1:1 e i rispettivi valori rientrano nell'intervallo normale 0.8 – 1.4 (sebbene, per gli alleli che si
discostano tra loro di più di 24 bp, si considera accettabile un rapporto con valore fino a 1.5).
Se ciò non si verifica, la causa potrebbe essere attribuita ad uno dei fattori menzionati al punto
6.
8. Per interpretare un risultato come normale, è necessario individuare almeno due marker informativi
coerenti con un genotipo a due alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi.
Un risultato normale indica il normale complemento di due per i cromosomi analizzati.
9. I rapporti dell’area dei picchi che rientrano negli intervalli normale e anomalo vengono classificati
come inconcludenti. I risultati inconcludenti possono essere risolti utilizzando i kit per singoli
cromosomi.
10. Se per un singolo cromosoma si ottengono entrambi i profili allelici normale e anomalo, prima di
trarre qualunque conclusione si consiglia di approfondire le ricerche con test di controllo per
identificare il motivo della discrepanza fra i risultati.
11. In rari casi, gli intervalli delle dimensioni alleliche per i marker possono sovrapporsi. Se si sospetta
tale circostanza, un’analisi con i kit per singoli cromosomi può essere risolutiva.
Analisi di marker di cromosomi sessuali AMEL, TAF9 e SRY:
1. Il marker AMEL amplifica le sequenze non polimorfiche sui cromosomi X (104 bp) e Y (110 bp),
può essere utilizzato per determinare la presenza o l’assenza di un cromosoma Y e rappresenta
la quantità di sequenze X rispetto alle sequenze Y. In rare occasioni è stato segnalato che
l’amplificazione non avviene a causa di una mutazione nella sequenza AMEL-Y.
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2. TAF9L è un marker paralogo invariabile con sequenze sui cromosomi 3 e X. Il picco specifico per
il cromosoma 3 (116 bp, che rappresenta 2 copie del cromosoma 3) può essere quindi usato come
picco di riferimento per determinare il numero di cromosomi X presenti (picco da 121 bp).
Analizzato in combinazione con l’amelogenina e con gli altri marker dei cromosomi sessuali, è
particolarmente utile nella diagnosi dell’aneuploidia dei cromosomi sessuali. In un individuo
normale di sesso femminile i marker devono cadere nell’intervallo di rapporti compreso tra 0.8 e
1.4. In un individuo normale di sesso maschile, i marker devono fornire un rapporto maggiore o
uguale a 1.8. Ulteriori dettagli sull’interpretazione del marker TAF9L sono disponibili nella Guide
to Interpretation (Guida all’interpretazione).
3.
Il marker specifico per il cromosoma Y, SRY, fornirà un singolo picco negli individui normali di
sesso maschile e non verrà amplificato negli individui normali di sesso femminile.
Caratteristiche dell’esecuzione del test
CONVALIDA INTERNA
Sono stati sottoposti a test 125 tessuti di derivazione fetale utilizzando Elucigene QST*R-PL. Di questi,
34 sono risultati normali/XY, 40 normali/XX, 5 T22/XY, 1 T22/XX, 3 T21/XY, 4 T21/ XX, 3 T18/XY, 5
T18/XX, 6 T16/XY, 2 T16/XX, 1 T15/XY, 1 T15/XX, 2 T13/XY, 2 T13/XX, 7 con monosomia del
cromosoma X, 8 sono risultati triploidi per tutti i cromosomi analizzati. Un campione ha fornito un
risultato non informativo a causa di omozigosità all'interno del set di marker. Questo campione è stato
successivamente analizzato con QST*R-18 e si è mostrato T18/XX. Tutti i risultati analizzabili hanno
mostrato una concordanza del 100% con i risultati precedentemente ottenuti con altri metodi già stabiliti.
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Guida all'Analisi GeneMapper
Nota: I seguenti screenshot GeneMapper sono riferiti a GeneMapper v5.0
Importazione e analisi di file QST*R
1. Aprire il file del programma GeneMapper
2. Fare clic su
per aggiungere file di dati a un nuovo progetto. Navigare dove sono
salvati i file di dati raw .fsa, evidenziare i file di dati appropriati e fare clic su "Add to
List>>". (Aggiungi a lista>>)
3. La cartella di analisi apparirà ora nella finestra "Samples to Add" (Campioni da
aggiungere) Facendo doppio clic sull'icona della cartella di analisi in questa finestra
apparirà ogni file .fsa da importare. I campioni vengono poi aggiunti facendo clic su
in basso nello schermo. I file di dati verranno ora visualizzati nello schermo
principale di GeneMapper (figura 2)
Figura 2: Campioni pronti da aggiungere al progetto
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Importazione delle impostazioni di analisi di QST*R GeneMapper in GeneMapper
Manager
È necessario importare le impostazioni QST*R per GeneMapper. Questo processo viene controllato
tramite l’interfaccia "GeneMapper Manager". Le impostazioni QST*R GeneMapper sono disponibili
sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/
1. Aprire il programma "GeneMapper Manager" facendo clic sull'icona
.
2. Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi), quindi fare clic sul pulsante di
importazione
3. Cercare i file delle impostazioni dell’analisi QST*R necessari (3130 o 3500) e importarli.
4. Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per:

• Table Settings (Impostazioni tabelle)

• Plot Settings (Impostazioni grafico)

• Size Standards (Size standard)
Nota: Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set
SNP) e Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l’importazione di file.
Importazione delle impostazioni dei pannelli QST*R-PL in Panel Manager (Gestione
pannelli)
È necessario importare le impostazioni del file bin e dei pannelli QST*R-PL per GeneMapper. Questo
processo viene controllato tramite l’interfaccia "Panel Manager" (Gestione pannelli).
Il pannello GeneMapper specifico per QST*R-PL e le impostazioni del file bin sono disponibili sul sito
web di Elucigene: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/
1. Aprire il programma Panel Manager facendo clic sull’icona
.
2. Fare clic su "Panel Manager" (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione sinistra. La
voce appare ora evidenziata in celeste.
3. Selezionare "File/Import Panels" (File/Importa pannelli). Cercare il file dei pannelli
GeneMapper "QSTRPL Panel.txt" e importarlo (Figure 3).
4. Il file dei pannelli verrà ora visualizzato nella finestra di navigazione sinistra. Fare clic sul file
dei pannelli per accertarsi che sia evidenziato in celeste.
5. Selezionare "File/Import Bin Set" (File/Importa set bin). Cercare il file bin GeneMapper
"QSTRPL Bins.txt" e importarlo (Figura 4).
6. Fare clic su "Apply" (Applica) e poi su "OK".
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7.
Figura 3: Importazione del file dei panelli QST*R-PL
Figura 4: Importazione del file bin QST*R-PL
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Modifica del file dei parametri di analisi
Potrebbe essere necessario modificare la voce predefinita "Analysis Ranges" (Intervalli di Analisi)
nelle impostazioni di analisi QST*R in previsione di variazioni a livello locale delle condizioni di analisi.
L’intervallo minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante l’acquisizione dei
dati.
Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi:
1. Aprire il programma "GeneMapper Manager" facendo clic sull'icona
.
2. Selezionare la scheda "Analysis Methods"(Metodiche di analisi). Il file QST*R importato sarà
elencato come "QSTR Analysis v02" (Analisi v02 QSTR).
3. Fare clic su "QSTR Analysis v02" (Analisi v02 QSTR). La riga appare ora evidenziata.
4. Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) e selezionare la scheda "Peak Detector" (Rivelatore
picco) (Figura 5).
Per impostazione predefinita, gli intervalli di analisi sono impostati in modo da iniziare a 2.000 e finire
a 18.000.
Figura 5: Intervalli di analisi.
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Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio:
1. Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi importata per
visualizzare l'elenco dei file .fsa in essa contenuti.
2. Selezionare un file .fsa.
3. Facendo clic sulla scheda "Raw data" (Dati grezzi) viene visualizzato un elettroferogramma
dei dati grezzi.
4. Utilizzando come guida il primo picco del size standard (ad es., 75 bp di GS500LIZ),
selezionare un punto di dati di circa 100 punti più largo (Figura 6). In questo modo si
determina il punto più basso nell’intervallo analizzabile.
5. Assicurarsi che il massimo intervallo dell'analisi comprende il più grande picco del size
standard (ad es. 500bp di GS500LIZ o 600bp di GS600LIZv2).
6. Inserire i nuovi valori nel file di analisi QST*R (accedendovi come indicato sopra).
Figura 6: Individuazione dell’intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni
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Analisi dei file importati QST*R-PL
1. Nella finestra principale di GeneMapper selezionare "QST*R Table Settings v02"(Figure 7)
Figura 7: Impostazioni impostazione tabella QST*R
2. In "Analysis Method" (Metodica di analisi) selezionare "QSTR Analysis v02". Riempire
ciascuna colonna premendo "Ctrl+D". Ripetere questo processo selezionando "QSTR-PL"
nel titolo "Panel" (Pannello) e "QSTR" nel titolo "Size Standard". Ricordarsi ogni volta di
riempire premendo "Ctrl+D" per garantire che ogni impostazione venga applicata all'intera
lista di campioni.
3. Fare clic su
per avviare l’analisi dei campioni. Assegnare un nome al progetto quando
viene richiesto.
Esame dei dati QST*R
1. Selezionare il campione da analizzare (evidenziare la riga del campione).
2. Fare clic su
per "Display Plots" (Visualizzare i grafici).
3. Selezionare "QST*R Plot settings" (Impostazioni del grafico QST*R) (Figura 8).
Figura 8: Impostazioni del grafico QST*R, menu a discesa.
4. Nella finestra del grafico viene visualizzato il profilo del campione con i dati tabellari (Figura
9).
GeneMapper assegna automaticamente le etichette a non più di due picchi per ciascun
marker. Se per un marker sono presenti tre alleli, il terzo picco non etichettato dovrà essere
etichettato manualmente (vedere: Modifica manuale dei profili, sotto)
Nota: Gli intervalli delle dimensioni alleliche di ciascun marker si basano sui dati precedentemente
osservati. Raro Gli alleli rari potrebbero cadere al di fuori di un dato intervallo dell’entità del marker e
potrebbe essere necessario regolare il set bin di conseguenza.
5. Si consiglia di attivare l’opzione "Single click editing" (Modifica con singolo clic). A tal fine
selezionare "Alleles/set click editing" (Alleli/imposta modifica con clic) e assicurarsi che
questa opzione sia selezionata..
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Figura 9: Finestra dei grafici dei campioni in cui sono visualizzati i dati dei tracciati etichettati
e la relativa tabella dei genotipi
Modifica manuale dei profili
AVVERTENZA!
GeneMapper assegnerà le etichette solo a non più di due picchi per marker. Pertanto, potrebbe
essere necessario modificare i profili manualmente, cioè quando occorre assegnare le etichette ai
terzi picchi (se presenti) o quando occorre rimuovere le etichette dai picchi "stutter".
Per aggiungere l’etichetta a un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco non
etichettato. Viene visualizzata l’opzione che consente di aggiungere un commento ad un allele. Fare
clic su "OK". Il picco viene ora etichettato con le informazioni relative alle dimensioni, espresse in paia
di basi, e all’area del picco. Il picco appena etichettato verrà incorporato automaticamente nella
tabella.
Per rimuovere l’etichetta da un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull’etichetta del
picco. Viene visualizzata l’opzione che consente di eliminare il commento relativo ad un allele. Fare
clic su "OK". L’etichetta del picco viene ora rimossa. I dati eliminati relativi al picco verranno
automaticamente rimossi dalla tabella.
Copiatura dei dati tabellari
1. Evidenziare tutte le righe con la tabella in basso nella finestra dei grafici.
2. Copiare le righe selezionate premendo i tasti "Ctrl+C".
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Modello di rapporto QST*R-PL
Il modello di rapporto associato a QST*R-PL può essere utilizzato per determinare i rapporti dei picchi
per un marker e assistere nell'analisi dei dati. Il modello di rapporto specifico per QST*R-PL è
disponibile sul sito web: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/
1. Aprire il file Modello di rapporto QST*R-PL (QSTR-PL Report Template.xlsm).
2. Se il modello di rapporto visualizza un avvertimento che indica che i macro sono stati
disattivati, fare clic su "Enable Content" (Attivare contenuto) per attivare i macro (Figure 10).
Figura 10: Attivazione della funzione dei macro nel modello di rapporto QST*R-PL
3. Se viene visualizzato un avvertimento di protezione (come illustrato in Figura 11), fare clic su
"Yes" (Si) per procedere.
Figura 11: Consenso all'accesso di sicurezza
4. Incollare i dati copiati dalla tabella di dati GeneMapper (vedere sopra, "Copying Data Table"
- Copiatura tabella dati) usando "Ctrl+V" nella cella in alto a sinistra nell'area con contorno
(vedere Figura 12).
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Figura 12: Importazione di dati grezzi GeneMapper nel modello di rapporto QST*R-PL.
5. I rapporti calcolati per ciascun marker saranno ora visualizzati nella tabella di dati a sinistra.
La tabella di dati può essere stampata o salvata come nuovo file per ciascun campione
specifico.
6. Per analizzare i campioni successivi è importante che tutti i dati siano completamente
cancellati dal modello di rapporto. A tale scopo, fare clic sul tasto "CLEAR DATA" (Cancella
dati) ubicato sotto la tabella dei dati grezzi all'interno del modello di rapporto QST*R-PL. A
questo punto è possibile importare nuovi dati di campione seguendo la procedura descritta
sopra.
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Valutazione del rapporto
1. La trisomia è determinata dalle seguenti condizioni:
a. Due picchi di altezza diversa. Tale condizione è dovuta al fatto che uno dei picchi
rappresenta due alleli comuni a entrambi i genitori. In questo caso il rapporto tra i due
picchi sarà classificato come 2:1 o 1:2. Dove A1/A2 fornirà un risultato nella regione
compresa tra 1.8 e 2.4 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area
più grande rispetto al picco che rappresenta l’allele più lungo, oppure dove A1/A2
fornirà un risultato nella regione compresa tra 0.45 e 0.65 quando il picco che
rappresenta l’allele più corto ha un’area più piccola rispetto al picco che rappresenta
l’allele più lungo.
In entrambi i casi nella colonna "Warning" (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "Ratio"
(Rapporto).
b. Presenza di tre picchi di altezza comparabile. Il rapporto dei picchi verrà classificato
come 1:1:1 e i rispettivi valori rientrano nell'intervallo normale 0.8 – 1.4 (sebbene, per
gli alleli che si discostano tra loro di più di 24 bp, si considera accettabile un rapporto
con valore fino a 1.5).
In questo caso, nella colonna "Warning" (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "3 Alleles" (3
alleli).
2. Per poter interpretare un risultato come anomalo (cioè, presenza di una trisomia), è
necessario individuare almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli,
mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Non è consigliabile interpretare
un risultato come anomalo basandosi sulle informazioni ottenute da un unico marker.
3. Per interpretare un risultato come normale, è necessario individuare almeno due marker
informativi coerenti con un genotipo diallelico, mentre tutti gli altri marker possono risultare
non informativi. Un risultato normale indica il normale complemento di due per i cromosomi
analizzati.
4. I rapporti dell’area dei picchi che rientrano negli intervalli normale e anomalo vengono
classificati come inconcludenti. I risultati inconcludenti possono essere risolti utilizzando i kit
per singoli cromosomi.
In assenza di qualunque dato sui picchi relativo a un marker, nella colonna Warning (Avvertimento)
verrà visualizzata la scritta "Absent" (Assente). Questo avvertimento verrà osservato regolarmente in
assenza dei marker del cromosoma Y.
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Guida all'analisi GeneMarker
Nota: I seguenti screenshot sono stati presi da GeneMarker v2.6.3.
Aggiunta di file dei campioni a GeneMarker
Aprire il file del programma GeneMarker e selezionare ‘Open Data’ quando richiesto. Viene
visualizzata la finestra Open Data Files (Apri file di dati).
Fare clic sul pulsante "Add" (Aggiungi). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (Apri). Cercare
la directory contenente i file di dati grezzi.
1. Selezionare tutti i file premendo i tasti CTRL+A o utilizzare i tasti CTRL e/o MAIUSC per
selezionare singoli campioni.
2. Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri).
I file selezionati verranno visualizzati nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 13).
Figura 13: Campioni aggiunti all’elenco dei file di dati.
Fare clic sul pulsante "OK" nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni saranno
caricati in GeneMarker. Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data Analysis
(Analisi dati grezzi) (Figura 14).
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Figura 14: Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi)
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Importazione delle impostazioni dei pannelli QST*R-PL GeneMarker
È necessario importare le impostazioni dei pannelli QST*R per GeneMarker. Questo processo viene
controllato tramite l’interfaccia "Panel Editor" (Editor pannelli).
Le impostazioni dei pannelli QST*R-PL di GeneMarker sono disponibili sul sito web di Elucigene:
www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/
1. Aprire "Panel Editor" (Editor pannelli) dal menu a discesa "Tools" (Strumenti) (Figura 15).
Figura 15: Selezione di Panel Editor (Editor pannelli)
2. Selezionare "Import Panels" (Importa pannelli) dal menu a discesa "File" (figura 16).
Figura 16: Importazione dei pannelli
3. Cercare, ad esempio, il pannello QSTR-PL.xml e importarlo.
4. Ripetere il processo come indicato per gli altri rispettivi file dei pannelli.
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Elaborazione dei dati
Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati. La fase di
elaborazione include l’applicazione di un size standard, l’applicazione di filtri ai picchi che generano
interferenze e, volendo, il confronto con un pannello di alleli noto.
GeneMarker combina tutte queste fasi in un unico semplice strumento denominato "Run Wizard"
(Procedura guidata di analisi) (Figura 17). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta fare
clic sull’icona "Run Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.
Run Wizard (Procedura guidata di analisi) – Creazione di un modello di analisi
Per poter analizzare i dati QST*R-PL, è necessario creare un modello di analisi al primo utilizzo del
software. Tale operazione viene eseguita tramite la Run Wizard (Procedura guidata di analisi).
1. Per accedere alla Run Wizard (Procedura guidata di analisi) basta fare clic sull’icona "Run
Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.
2. Assegnare un nome al modello, ad es. QSTR-PL.
3. Selezionare il Panel (pannello), il Size Standard, lo Standard Colour (colore dello standard) e
il Analysis Type (tipo di analisi) nei rispettivi campi come illustrato sotto nella Figura 17.
4. Fare clic su "Save" (Salva) per memorizzare il modello da utilizzare nelle analisi successive.
5. Fare clic su "Next" (Avanti) per continuare.
Figura 17: Run Wizard (Procedura guidata di analisi) - Finestra Template Selection (Selezione del
modello)
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Run Wizard (Procedura guidata di analisi) - Data Process (Elaborazione dati)
La finestra Data Process (Elaborazione dati) della Run Wizard (Procedura guidata di analisi)
consente di selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi.
1. Selezionare le impostazioni di analisi appropriate nella finestra Data Process (Elaborazione
dati) come illustrato nella figura sotto (Figura 18).
2. Fare clic su "Next" (Avanti) per continuare
Nota: L’impostazione dell’intervallo di analisi nella finestra di analisi dei dati grezzi varia in base al
polimero utilizzato durante la raccolta dei dati. L’operatore deve selezionare un valore di partenza del
punto di dati che includa il picco del size standard di 75 bp..
Figura 18: Run Wizard (Procedura guidata di analisi) - Finestra Data Process (Elaborazione dati)
Nota: Per 3500 dati, aumentare l’intensità minima a 150.
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Run Wizard (Procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)
Quando si esegue l’analisi QST*R, non sono richieste altre impostazioni (Figura 19).
1. Fare clic su "OK" per continuare.
Figura 19: Run Wizard (Procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)
Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
Dopo aver fatto clic su "OK", nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura guidata di
analisi - Altre impostazioni), viene visualizzata la finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
(Figura 20) I dati grezzi vengono elaborati e calibrati, vengono applicati i parametri dei filtri, quindi
viene applicato il pannello QST*R selezionato.
1. Al termine dell’analisi, fare clic su "OK" nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati).
Figura 20: Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
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Finestra di analisi principale
La finestra di analisi principale (Figura 21) di GeneMarker presenta un formato facile da usare.
Questo formato include:




elenco dei file dei campioni: visualizzato a sinistra nella finestra;
immagine gel sintetica: visualizzata nella parte superiore della finestra;
elettroferogrammi dei dati: sotto l’immagine gel;
tabella dei rapporti: visualizzata sul lato destro della finestra.
In questa finestra è importante verificare che tutti i picchi appropriati in ciascun profilo siano stati
assegnati correttamente.
1. Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell’elenco dei file dei campioni sul lato
sinistro della schermata. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in
questione e scegliere tra le opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o
eliminare alleli, confermare o meno come pertinente.
2. Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa "Applications"
(Applicazioni) nella parte superiore della schermata. Selezionare "Analisi trisomia". Verrà
visualizzata la finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) (Figura 22).
Figura 21: Finestra di analisi principale
Figura 22: Finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia)
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Trisomy Analysis Settings (Impostazioni per analisi trisomia)
Nella finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) sono disponibili due schede:
1. Scheda Analysis (Analisi)
2. Scheda Statistics Plot (Grafico statistico)
Scheda Analysis (Analisi)
La scheda Analysis (Analisi) fornisce le opzioni di impostazione soglia per l’analisi della trisomia.
Assicurarsi che nella finestra di analisi sia selezionato "BPG"e che siano visualizzate le seguenti
impostazioni:








Peak Height (Altezza picco) 50: altezza minima di 50 per l’assegnazione dei picchi. (150 se
si usano 3500 dati)
Height Ratio (Rapporto altezze) 30%: massima percentuale del picco principale che il
secondo picco deve raggiungere affinché possano essere identificati due alleli.
Quantification by Peak Area (Quantificazione per Area picco).
Casella di controllo Shorter Length/Longer Length (Lunghezza maggiore/minore) selezionata.
Valori soglia del Trisomy Ratio (Rapporto della trisomia) compresi tra 0.80 e 1.40.
Casella di controllo Apply Linear Correction (Applica correzione lineare) deselezionata.
Fare clic su "OK"
Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)
La finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) (Figura 23) permette all'operatore di esaminare i dati
relativi al campione QST*R e di visualizzare il rapporto dei picchi per ciascun marker nonché di
accedere al rapporto GeneMarker.
Nella finestra vengono visualizzate numerose funzioni che assistono l’operatore nell’analisi dei dati.
Esse sono:




Elenco dei campioni
Elettroferogramma
Grafico dei rapporti
Tabella dei rapporti
Figura 23: Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)
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Per informazioni più dettagliate sulle funzioni di analisi della trisomia e sul loro utilizzo, consultare il
GeneMarker Manual (Manuale GeneMarker).
Rapporto GeneMarker
GeneMarker include un modello di rapporto compatibile con i kit Elucigene QST*R. Per accedere al
rapporto fare clic sull’icona "Print" (Stampa) che si trova in alto a sinistra nella barra degli strumenti
della finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia).
Verrà visualizzata la finestra delle Trisomy Print Settings (Impostazioni di stampa della trisomia)
(Figura 24).
Finestra delle Trisomy Print Settings (Impostazioni di stampa della trisomia)
Nella finestra delle impostazioni di stampa della trisomia sono elencate le opzioni per l’inclusione e la
visualizzazione dei dati dei campioni nel rapporto GeneMarker.
Selezionare le opzioni come illustrato nella Figura 24. Assicurarsi che le impostazioni relative alla
casella "Custom Size Range" (Mostra intervallo dimensioni personalizzate) siano comprese tra 98 bp
(Start [Inizio]) e 510 bp (End [Fine]).
Figura 24: Finestra delle Trisomy Print Settings (Impostazioni di stampa della trisomia)
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Anteprima del rapporto GeneMarker
Fare clic su "Preview" (Anteprima) per visualizzare il rapporto GeneMarker (Figura 25). Da questa
finestra l’operatore può controllare e stampare tutti i dati relativi al picco del campione attraverso tutti i
marker, ottenendo un semplice rapporto del campione di una o due pagine.
Figura 25: Rapporto GeneMarker
Il rapporto GeneMarker include le seguenti funzioni:

Titolo del rapporto: contiene informazioni sull’analisi, sul progetto, sul campione e sui
parametri.

Casella delle firme: data e spazio per le iniziali dei revisori del rapporto.

Elettroferogramma: simile a quello della finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia); in esso
vengono visualizzati tutti i coloranti del tracciato del campione.

Tabella dei rapporti: vengono visualizzati i valori relativi ai picchi e ai marker selezionati per il
campione corrente. I riferimenti alla trisomia sono evidenziati in grigio. La tabella contiene
anche una colonna di controllo per le iniziali dei revisori.

Grafico dei rapporti corretto: contiene i punti del grafico dell’intero set di dati per tutti i marker
presenti nel colorante. Le forme dei simboli rappresentano i diversi marker e possono essere
decifrate dalla riga "Symbol" (Simbolo) nella "Report Table" (Tabella dei rapporti). I simboli
con sfondo giallo rappresentano i punti di dati relativi al campione corrente. I simboli con
contorno rosso rappresentano i riferimenti alla trisomia.
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Nota: Il grafico dei rapporti corretto appare in una seconda pagina per ogni campione solo quando
Ratio Plot (Grafico dei rapporti) è selezionato nella finestra delle impostazioni di Trisomy Print Report
Settings (Stampa del rapporto della trisomia).
APPENDICE 1: Etichette del colorante
I marker sono contrassegnati come segue:
6-FAM
VIC
NED
PET
D16S2624
D16S539
AMEL
FES FPS
D22S683
D15S1515
TAF9L
D15S822
D21S11
D22S685
SRY
D21S1442
D21S1437
D13S325
D22S686
D18S819
D18S1002
D18S386
D22S689
D16S753
D13S634
D13S305
D16S2621
D18S535
D21S1411
D15S659
D13S628
Vedere l’Appendice 2 per ulteriori dettagli sui marker STR inclusi gli intervalli delle dimensioni.
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APPENDICE 2: - Tabella della posizione del marker, eterozigosità osservata, intervallo
delle dimensioni alleliche
Note: Il colorante NED utilizzato nei kit viene identificato a livello spettrale come colorante giallo.
Convenzionalmente per chiarezza viene visualizzato in nero.
Marker
Posizione
Eterozigosità
osservata*
Intervallo
dimensioni alleli
(bp)
Colorante del
marker
D13S305
13q13.3
0.79
453-504.
verde
D13S325
13q14.11
0.80
292-343
verde
D13S634
13q21.33
0.84
396-453
blu
D13S628
13q31.1
0.75
451-499
giallo
D15S822
15q12
0.86
247-308
rosso
D15S659
15q21.1
0.86
395-441
giallo
FESFPS
15q25.2
0.61
202-243
rosso
D15S1515
15q26.3
0.81
181-209
verde
D16S753
16p11.2
0.77
442-477
rosso
D16S2624
16q22.3
0.71
110-140
blu
D16S2621
16q23.2 q24.2
0.79
268-308
giallo
D16S539
16q24.1
0.76
130-166
verde
D18S1002
18q11.2
0.76
343-380
blu
D18S819
18q11.2
0.73
401-435
rosso
D18S535
18q12.3
0.77
462-503
blu
D18S386
18q22.1
0.92
353-440
verde
D21S11
21q21.1
0.82
234-283
blu
D21S1437
21q21.1
0.76
291-332
blu
D21S1442
21q21.3
0.85
328-394
rosso
D21S1411
21q22.3
0.83
319-389
giallo
D22S686
22q11.2
0.69
146-199
giallo
D22S685
22q11.23
0.77
222-264
verde
D22S689
22q12.1
0.74
209-254
giallo
D22S683
22q12.3
0,87
152-223
blu
AMEL
Xp22.22 Yp11.2
n/a
104…110 nk
giallo
TAF9
3p24.2 Xq21.1
n/a
116…121 nk
giallo
SRY
Yp11.31
n/a
124-145
giallo
*Le eterozigosità osservate si basano sul numero di alleli osservati con il pannello di convalida di
Elucigene Diagnostics. Questi numeri potrebbero quindi differire dai dati pubblicati e potrebbero anche
variare in base alla popolazione analizzata.
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APPENDICE 3: Profilo GeneMapper
Profilo normale GeneMapper per un individuo di sesso maschile che mostra le relative posizioni dei
marker rilevati da QST*R-PL
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Limiti della procedura
Questo test è concepito per l’individuazione di specifiche trisomie cromosomiche e aneuploidie dei
cromosomi sessuali come riportato nelle Instructions for Use (Istruzioni per l’uso). Potrebbe non
individuare i riarrangiamenti strutturali che coinvolgono i cromosomi analizzati né le anomalie in ogni
altro cromosoma. Il mosaicismo potrebbe non essere individuato nei cromosomi analizzati. Un risultato
QST*R-PL può essere applicato direttamente solo al tessuto analizzato e potrebbe non rappresentare
il cariotipo fetale. La contaminazione da parte di cellule materne (Maternal cell contamination, MCC)
e il mosaicismo confinato alla placenta (Confined placental mosaicism, CPM) potrebbero dar luogo a
discrepanze tra i risultati QST*R-PL e i risultati del cariotipo.
Nota: Le eterozigosità dei marker utilizzati sono derivate da un set casuale di campioni inviati per le
analisi routinarie ottenuti da una popolazione in prevalenza caucasica dell’Europa settentrionale. Tutti
i calcoli in cui vengono utilizzate queste eterozigosità si applicano strettamente alla popolazione da cui
sono stati prelevati i campioni. Si può condurre un piccolo studio in cui si utilizzano i campioni derivati
dalla popolazione locale come parte di uno studio di convalida per stabilire le eterozigosità nella
popolazione da analizzare. Si ritiene che le variazioni nella popolazione non alterino in modo
significativo il grado di informazione complessivo del test.
Dichiarazione di non responsabilità
I risultati di questo test diagnostico devono essere interpretati congiuntamente agli altri dati clinici e di
laboratorio a disposizione del medico.
Questi reagenti Elucigene vengono forniti per l’esecuzione di test diagnostici In Vitro.
Ulteriori dettagli sui prodotti Elucigene QST*R sono disponibili sul sito:
www.elucigene.com.
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Bibliografia
Goddijn M, Leschot NJ. Genetic aspects of miscarriage. Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol.
2000 (14) 5 855 -65
Gardner RJM, Sutherland GR., (2004). Chromosome Abnormalities and Genetic Counselling. New
York: Oxford University Press. 339-360.
Mansfield E S. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase
chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Human Molecular Genetics 1993 2(1): 43-50
Mann K, Fox SP, Abbs SJ, Yau SC, Scriven PN, Docherty Z, Mackie Ogilvie C. Development and
implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and
implications for the future of prenatal diagnosis. The Lancet 2001 358 (9287): 1057-1061
Mann K, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mackie Ogilvie C. Strategies for the rapid prenatal diagnosis
of chromosome aneuploidy. European Journal of Human Genetics 2004 12: 907-915
Mackie Ogilvie C, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mann K. Rapid prenatal diagnosis of an aneuploidy
using Quantitative Fluorescence-PCR (QF-PCR). Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2005
53(3): 285-288
Deutsch S, Choudhury U, Merla G, Howald C, Sylvan A, Antonarakis SE. Detection of aneuploidies by
paralogous sequence quantification. Journal of Medical Genetics 2004 41: 908-915
ELUCIGENE e QST*R sono marchi commerciali di Delta Diagnostics (UK) Ltd.
GENEMARKER è un marchio commerciale di SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, GENESCAN,
VIC, PET, NED, LIZ, POP-7 e HI-DI sono marchi commerciali di Life Technologies Corporation.
Nota per l’acquirente: Licenza limitata
Questo prodotto è venduto conformemente a un contratto stipulato con Life Technologies Corporation.
L'acquisto del prodotto trasmette all'acquirente il diritto non trasferibile di utilizzare esclusivamente la
quantità acquistata del prodotto e i suoi componenti per uso diagnostico in vitro, unicamente per
l'indicazione descritta nelle istruzioni per l'uso accompagnatorie. Per informazioni relative
all'ottenimento di diritti aggiuntivi per utilizzare il prodotto o i suoi componenti, contattare
[email protected].
Copyright  2016 Delta Diagnostics (UK) Ltd.
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Elucigene® QST*R-PL (Aborto spontaneo) Istruzioni per l`uso del test

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