Ceci L. et al. - Università di Bologna

SINDROME EMORRAGICA DEL DIGIUNO NELLA BOVINA DA LATTE ASSOCIATA
AD INFEZIONE DA CLOSTRIDI
JEJUNAL HEMORRHAGE SYNDROME IN DAIRY CATTLE ASSOCIATED WITH
CLOSTRIDIA INFECTION
Ceci L., Paradies P., Greco G., Buonavoglia D., Capucchio M.T.*, Guarda F.*, Carelli G.
Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali, Sezione di Clinica Medica, Facoltà di Medicina
Veterinaria, Università degli Studi di Bari
Dipartimento di Patologia Animale, Università degli Studi di Torino *
Riassunto
Sono state oggetto di indagine clinica, anatomo-istopatologica e microbiologica 11 bovine, di razza
bruna italiana, con sintomatologia caratterizzata da insorgenza improvvisa, depressione del
sensorio, anoressia, agalassia, atonia ruminale, distensione addominale e melena. L’esame anatomopatologico ha evidenziato enterite emorragica localizzata al digiuno in 8 bovine. Gli esami
microbiologici hanno permesso l’isolamento di Clostridium perfringens tipo A, talvolta beta2positivo, in 7 bovine. Sulla base di tali dati è stata formulata una diagnosi di “Sindrome Emorragica
del Digiuno”.
Summary
A survey based on clinical, anatomohystophatological observations and microbiological
investigations was performed on 11 italian brown breed dairy cattle affected with depression,
anorexia, agalaxia, ruminal hypomotility, abdominal pain and melaena. Macroscopic lesions of 8
animals consisted of hemorrhagic enteritis in the small intestine. Clostridium perfringens type A
was isolated from the tissues of 7 animals and the beta2-toxin gene was detected in 4 out of 7 type
A isolates. Based on these observations 8 animals were considered affected with Jejunal
Hemorrhage Syndrome.
Parole chiave: bovino, sindrome emorragica del digiuno, sindrome emorragica intestinale,
Clostridium perfrigens, Multiplex PCR, gene tossinotipo, tossina beta 2
Key words: cattle, Jejunal Hemorrhage Syndrome, Hemorragic Bowel Syndrome, Clostridium
perfrigens , Multiplex PCR, toxin genes, beta2-toxin
INTRODUZIONE
La sindrome emorragica del digiuno (SED), nota anche come enterite emorragica fatale del digiuno,
è una patologia delle bovine adulte (generalmente di età superiore ai 3 anni), caratterizzabile e
distinguibile da altre forme di enterite emorragica, per la formazione di voluminosi coaguli di
sangue localizzati prevalentemente nel duodeno (Cantor, 1999).
Nel 1991 Anderson, ha descritto in un allevamento di bovini da latte, situato negli USA (Idaho),
una malattia definita “Point sorgive hemorrhagie” che aveva interessato cinque bovine di razza
frisona ad alta produzione. Il reperto caratterizzante la malattia era costituito da ematomi a livello di
sottomucosa che interessavano ognuno 10-20 centimetri del digiuno. La “Point sorgive hemorragie”
è sovrapponibile alle forme successivamente descritte negli USA come “Sindrome Emorragica del
Digiuno” (SED), “Sindrome Intestinale Emorragica” o “Enterite Acuta Emorragica del Piccolo
Intestino” (Maddox et al., 1999; Dennison et al., 2001; Godden et al., 2001; Kirkpatrick et al. 2001;
Dennison et al. 2002; Usda-Aphis, 2003).
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Casi clinici con le stesse caratteristiche sono stati segnalati in Canada (Abutarbush, 2002;
Abutarbush et al., 2004) ed in Israele (Brenner et al., 2002).
Recentemente quadri clinici sovrapponibili alla SED sono stati descritti anche in Europa. In
Germania, Rademacher et al., (2001; 2002) hanno descritto la patologia in bovine da latte di razza
Simmental. In Sud-Italia, nella Murgia sud-orientale compresa tra le province di Bari e Taranto, è
stata descritta una sindrome gastroenterica iperacuta in bovine da latte, ad esito quasi sempre
infausto, caratterizzata da ulcere digiunali con presenza di coaguli intraluminali ostruenti (Caira et
al., 2002).
Mentre appare abbastanza ben definito il quadro clinico ed anatomo-patologico della malattia, non
sono ancora del tutto chiari i meccanismi patogenetici né i fattori predisponenti e scatenanti.
I ricercatori statunitensi ritengono importante il ruolo di Clostridium perfringens tipo A (Cantor,
1999; Maddox et al. 2000; Kirkpatrick et al. 2001), in alcuni casi beta2-tossigenico (Dennison et al.
2002), nel determinismo della SED.
C. perfringens può causare patologie enteriche negli animali (Songer, 1996). È un batterio
anaerobio, gram positivo che produce nella fase di crescita esponenziale notevoli quantità di
esotossine dalle quali dipende la sua patogenicità. Tale microrganismo, normalmente presente nel
terreno ricco di humus, ma anche nel contenuto intestinale di animali sani, provoca malattia in
seguito alla concomitante azione di fattori scatenanti.
Nell’ambito della specie C. perfringens si distinguono 5 differenti tossinotipi, definiti
rispettivamente A, B, C, D ed E in base alla capacità di produrre 4 tossine letali maggiori,
denominate alpha, beta, epsilon e iota (α, β, ε, ι) (Daube et al., 1994; Petit et al., 1999; Songer,
1996).
C. perfringens beta2-tossigenico è un altro particolare gruppo di C. perfringens non ancora
assegnato ad un tossinotipo specifico. La tossina prodotta, ben distinta dalla beta e definita beta2,
possiede attività citotossica ed effetti letali nel topo (Gibert et al. 1997). Questa tossina è stata
trovata in diversi stipiti in associazione con la sola tossina α (tipo A), ma anche con le tossine α, β
ed ε (tipi B, C e D).
In diverse aree geografiche molti autori hanno descritto l’associazione di ceppi di C. perfringens
tossinotipo A beta2-positivi e malattie enteriche negli animali domestici, particolarmente nei
suinetti (Klaasen et al., 1999; Garmory et al., 2000), nei cavalli (Herholz et al., 1999; Bacciarini et
al. 2003), nei cani (Thiede et al., 2001), in un elefante africano (Bacciarini et al., 2001), in agnelli e
capretti (Gkiourtzidis et al., 2001), in vitelli e bovini adulti (Maddox et al. 1999; Manteca et al.,
2002; Bueschel et al., 2003). Di recente, C. perfringens tipo A beta2-tossigenico è stato descritto in
Sud-Italia associato ad episodi di enterite emorragica necrosante in due orsi allevati in uno zoo della
provincia di Brindisi (Greco et al,, 2004a) e in agnelli e capretti affetti da dissenteria emorragica
necrosante (Greco et al., 2004b, Greco et al., 2005).
Stipiti di C. perfringens tipo A beta2-positivi sono stati isolati anche dal contenuto intestinale di
renne sane e di merluzzi (Gadus morhua L.) (Aschfalk et al., 2002; Aschfalk e Muller, 2002).
Per approfondire le conoscenze su questa malattia è stato intrapreso uno studio clinico, anatomoisto-patologico e microbiologico su bovine da latte che presentavano sintomi compatibili con la
SED, sottoponendo a controllo gli animali che all’anamnesi presentavano malessere improvviso,
melena, coaguli nelle feci, colica e/o ostruzione intestinale.
MATERIALI E METODI
Animali - Nel periodo compreso tra aprile e luglio 2004 sono state oggetto di studio 11 (1-11)
bovine adulte di razza bruna italiana che, all’improvviso, avevano presentato depressione del
sensorio, anoressia, agalassia, atonia ruminale con distensione addominale, colica e/o stipsi, feci
molli e melena. Due bovine adulte (12 e 13) a fine carriera sono state incluse nello studio come
controllo.
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Gli animali sono stati sottoposti a visita clinica ed a prelievi ematici per la valutazione dell’esame
emocromocitometrico, del profilo biochimico e del protidogramma. È stato anche valutato il livello
di glucosio nelle urine. Le feci di ciascun soggetto sono state sottoposte ad esame parassitologico.
Nove delle 11 bovine sono state sottoposte a macellazione d’urgenza. In sede necroscopica sono
stati prelevati campioni di abomaso, ileo, colon, linfonodi meseraici, fegato, rene, sangue cardiaco e
vescica da sottoporre ad esami microbiologici ed istologici. Tutti i reperti sono stati prelevati entro
tre ore dal decesso per limitare la proliferazione batterica nell’intestino (Philippeau et al. 2003).
Esami istologici - Sezioni di tessuto abomasale, intestinale e linfonodale da sottoporre ad esame
istologico sono state fissate in formalina tamponata al 10% e quindi incluse in paraffina. Su detti
preparati sono state eseguite le colorazioni di Grocott, Giemsa, Gram ed ematossilina-eosina.
Analisi batteriologica - Sui campioni di organo e sangue cardiaco di ciascun animale, sono stati
eseguiti gli esami batteriologici per la ricerca di Salmonella spp. e C. perfringens. Un millilitro delle
colture positive per C. perfringens è stato utilizzato per l’estrazione del DNA totale impiegando il
kit commerciale QIAamp Tissues kit (QIAGEN Gmbh, Germany) secondo le istruzioni del
produttore.
Tecniche biomolecolari - Il DNA estratto è stato sottoposto a screening diagnostico mediante
multiplex-PCR (Greco et al., 2004a) per la ricerca delle sequenze geniche codificanti le tossine α,
β, β2, ε, ι e dell’enterotossina.
Terapia - A causa della natura iperacuta della sindrome la malattia è stata considerata alla stregua
di una emergenza clinica (Kirkpatrick et al. 2001). Non esistendo un esatto protocollo terapeutico
della SED sono state utilizzate differenti terapie prevalentemente sintomatiche. Quando è stato
possibile intervenire sono stati somministrati sali di calcio per via endovenosa e flunixin meglumine
per controllare il dolore addominale e lo shock. Nel tentativo di rimuovere i coaguli dal lume
intestinale è stato somministrato olio minerale per via orale. Le terapie hanno incluso: antibiotici
(penicillina G procaina, sodio ceftiofur, ossitetraciclina, eritromicina) e terapia fluida elettrolitica
intravenosa. Sono stati utilizzati, inoltre, desametazone, metoclopramide, solfato di magnesio e
neostigmina
RISULTATI
Esame clinico - Le bovine mostravano depressione del sensorio, anoressia, agalassia, atonia
ruminale con distensione addominale, colica, stipsi, melena, feci molli con presenza di coaguli
ematici, vocalizzazioni, brussismo, sudorazione, tremori muscolari, normotermia o ipotermia,
tachicardia, tachisfigmia e shock (vasocostrizione periferica, cute fredda e umida). La succussione
della parete addominale, in basso a destra, ha evidenziato un pronunciato rumore di guazzamento,
dovuto probabilmente al movimento di fluidi e di gas contenuti nel duodeno. Alla esplorazione
rettale sono stati rilevati: distensione delle anse del intestino tenue, il rumine ampio e teso, il ceco
dilatato e distensione del colon. La sindrome, dopo un’insorgenza improvvisa, decorreva
rapidamente inducendo i proprietari a ricorrere alla macellazione d’urgenza.
Esami ematologici e profilo biochimico - Gli esami ematologici hanno evidenziato costantemente
leucocitosi con neutrofilia e linfopenia e, in alcune bovine, monocitosi. Gli esami sierologici hanno
svelato ipoalbuminemia associata ad aumento delle proteine sieriche e, in particolare, delle alfa e
beta globuline. Anche il profilo biochimico è risultato alterato e caratterizzato da iperglicemia,
ipocalcemia, ipermagnesiemia, iperfosfatemia, ipercolesterolemia, ipertrigliceridemia e uremia.
Inoltre, in gran parte degli animali, è stata riscontrata un’aumentata attività sierica della lattico
deidrogenasi (LDH), della creatinfosfochinasi (CK), dell’aspartato aminotransferasi (AST) e della
γ-glutamiltrasferasi (GGT). L’esame delle urine ha registrato glicosuria in 3 bovine. L’esame delle
feci mediante flottazione non ha evidenziato infestazioni parassitarie degne di nota.
In due animali si è avuta remissione della sintomatologia dopo trattamento terapeutico.
Esame anatomo-istopatologico - In sede necroscopica 8 delle 11 bovine oggetto dello studio
presentavano enterite necrotica emorragica del digiuno; la bovina n.9 mostrava un quadro di
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peritonite acuta, secondaria ad ernia intestinale. Il quadro anatomopatologico nei diversi soggetti
appariva diversificato nella gravità pur mantenendo connotazioni sovrapponibili. A livello del
digiuno sono stati evidenziati grossi coaguli ematici nel lume intestinale fortemente adesi alla
mucosa. La regione a monte del coagulo appariva meteorica e ripiena di materiale fluido, mentre la
regione a valle appariva prevalentemente normale. L’asportazione dei coaguli provocava il distacco
della mucosa intestinale. Inoltre, in alcuni soggetti, si osservavano ematomi a livello di mucosa e
sottomucosa del digiuno.
Esami istologici – Costante è stato il reperto di enterite emorragico-necrotizzante a carico del
digiuno. L’enterite rilevata era di grado variabile, ma spesso caratterizzata da grave e totale
distruzione della mucosa e da cospicue emorragie, talora con formazione di cospicui ematomi a
carico di sottomucosa, tonaca muscolare e a volte sierosa. Infiltrato di tipo misto coinvolgeva i tratti
di mucosa integri, la sottomucosa e talora la tonaca muscolare.
Voluminosi trombi venosi nella sottomucosa rappresentavano un’altro reperto caratteristico, seppur
incostante. Le aree intestinali limitrofe e meno colpite mostravano grave enterite catarraleemorragica caratterizzata da flogosi di tipo misto e parziale atrofia degli apici dei villi. Spesso in
associazione all’enterite era presente abomasite catarrale o catarrale-emorragica, anche piuttosto
intensa talora associata alla presenza di ife fungine. Le lesioni ai linfonodi erano l’espressione di
una reazione aspecifica ad un processo flogistico con caduta dell’immunità organica, mentre le
lesioni degenerative osservate a livello renale indicavano l’alterazione del metabolismo organico a
seguito del grave danno enterico. Non sono state osservate lesioni attribuibili alla patologia a livello
epatico, cardiaco e vescicale.
Esami batteriologici e tipizzazione mediante multiplex-PCR - Da nessuno dei campioni
analizzati è stata isolata Salmonella spp.. Nel colon e nel linfonodo meseraico della bovina n.1 è
stato isolato E. coli. Dai tessuti (fegato, reni, abomaso, digiuno, colon, linfonodi, sangue cardiaco, e
vescica urinaria) di 7 bovine (1, 2, 4, 5, 7, 8, 9) è stato isolato C. perfringens. Il reperto
batteriologico è risultato negativo nelle due bovine di controllo (12 e 13). All’analisi mediante
multiplex-PCR i ceppi isolati sono stati classificati come C. perfringens tossinotipo A e 4 di essi (1,
4, 7 e 8) sono risultati anche portatori del gene della tossina beta2.
Terapia - Solo in due delle undici bovine si è avuta una lenta e graduale remissione della
sintomatologia.
DISCUSSIONE
I reperti clinici, ematologici, anatomopatologici, istologici e microbiologici ottenuti permettono di
confermare l’identità della sindrome osservata in otto bovine da latte di razza bruna italiana,
appartenenti ad allevamenti diversi, a conduzione libera o semilibera, situati nella Murgia barese e
tarantina, con la Sindrome Emorragica del Digiuno. Per la bovina n. 9 è stata emessa una diagnosi
di peritonite acuta.
I dati in possesso confermano che la SED è un disordine intestinale acuto della bovina da latte
adulta caratterizzata da emorragie intraluminali e ostruzione del digiuno. Le anomalie ematologiche
e biochimiche riscontrate denotano in modo preciso l’andamento acuto della SED e gli effetti della
risultante stasi gastrointestinale. La neutrofilia è riconducibile al repentino e copioso rilascio di
neutrofili dagli organi emopoietici in risposta allo stimolo chemiotattico esercitato dall’infezione
batterica. L’iperglicemia può essere il risultato del rilascio di steroidi endogeni e di epinefrina.
L’incremento di LDH, AST GGT attestano il danno acuto epatico associato all’assorbimento di
tossine dall’apparato gastroenterico danneggiato (Carlson, 1990). L’incremento della CPK è
associabile al danno muscoloscheletrico con miodegenerazione secondaria a tossiemia e/o
conseguente al decubito permanente che assumono spesso gli animali malati.
Il trattamento medico della SED non ha apportato miglioramenti rilevanti nel decorso della malattia.
Il riscontro, nei campioni autoptici di sette delle otto bovine affette da SED, di Clostridium
perfrigens di tipo A, in 4 casi β2-positivo, suggerisce un ipotetico legame tra la SED e la presenza
di C. perfringens in accordo con quanto descritto da Dennison e collaboratori (2002).
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I reperti istopatologici di enterite emorragico-necrotizzante del digiuno con grave e totale
distruzione della mucosa, di emorragie puntiformi, talora molto estese, a carico di sottomucosa,
tonaca muscolare e sierosa del digiuno sono compatibili con l’azione della tossina α sulla mucosa
intestinale (Songer, 1996).
Anche se il ruolo della tossina β2 nella patogenesi delle malattie clostridio-associate non è ancora
chiaro sembra, tuttavia, esistere una correlazione tra presenza di tale tossina e gravità delle lesioni
(Greco et al. 2004b; Greco et al. 2005) e, pertanto, la drammaticità del reperto potrebbe essere la
risultante del sinergismo tra le tossine α e β2.
Non è ancora chiaro se questo batterio è la causa primaria di SED o se, più verosimilmente, il suo
sviluppo è secondario all’azione di fattori predisponenti come nel caso di enterotossiemie da C.
perfringens di tipo B e C scatenate dalla accidentale presenza di alte concentrazioni di carboidrati e
proteine nell’intestino tenue di vitelli, agnelli e suinetti (Niilo 1980; Fleming, 1985; Niilo 1986;
Michelsen, 1996; Maddox et al., 1999; Radostits et al., 1999). E’ possibile che questo meccanismo
possa verificarsi anche nelle bovine adulte da latte allorché si instaura una acidosi ruminale come ad
esempio in seguito all’ingestione di quantità eccessive di carboidrati facilmente digeribili o per
insufficiente e/o inadeguato apporto di fibra (Maddox et al., 1999).
Viene anche ipotizzata una associazione tra la malattia e l’assunzione di alimenti di cattiva qualità
contaminati da miceti e/o dalle loro tossine (Abutarbush et al., 2004). Anche fattori come la
tipologia di allevamento, la razza e fattori ambientali potrebbero essere delle concause. Nella
presente indagine, se pur limitata, i casi risultavano concentrati in un determinato periodo
(primavera-estate particolarmente piovose) e segnalati soprattutto in bovine di razza bruna non oltre
il terzo mese dal parto.
È verosimile concludere, quindi, che la SED, com’è stato riportato da più autori (Maddox et al.,
1999; Dennison et al., 2001; Godden et al., 2001; Kirkpatrick et al. 2001; Dennison et al. 2002;
Usda-Aphis, 2003), è una malattia multifattoriale nella quale il C. perfringens tipo A in
associazione alla tossina beta2 gioca un ruolo molto importante.
Poiché i trattamenti farmacologici non hanno apportato miglioramenti rilevanti sul decorso della
malattia, risulta fondamentale effettuare una attenta prevenzione. Oltre che evitare spinte alimentari
e produttive eccessive, si può ipotizzare l’impiego di vaccini nei confronti delle clostridiosi anche
se, attualmente, il mercato è privo di vaccini nei confronti della tossina beta2 (Dennison et al.
2002).
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