diagnostica di laboratorio 2

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DIAGNOSTICA DI LABORATORIO
2
Gli autoanticorpi più comunemente
ricercati nelle malattie autoimmuni
sistemiche
„ Fattore reumatoide
„ Anticorpi anti-fosfolipidi
„ ANA (anticorpi anti-nucleo)
„ Anticorpi anti-DNA
„ Anticorpi anti-ENA
„ ANCA
Gli autoanticorpi: significato clinico
„
Valore diagnostico: anticorpi marker
„
Valore prognostico: correlazione fra anticorpi
di determinate specificità e danno d’organo o
attività di malattia
Il ruolo del laboratorio nella
diagnostica delle connettiviti
sistemiche
Fonte di antigeni:
Metodiche:
„ immunofluorescenza „ tessuti
„ estratti tissutali
„ immunoelettroforesi
„ proteine purificate
„ ELISA
„ proteine ricombinanti
„ immunoblot
Anticorpi anti-nucleo
„
„
Determinati mediante immunofluorescenza
indiretta su fegato di ratto o su linee cellulari
umane (Hep2).
Il diverso pattern di fluorescenza si correla
con la specificità degli anticorpi.
Diffuso: anti-complesso DNA-istoni
♦ Periferico: anti-DNA
♦ Speckled: anti-snRNP o anti-SSA o anti-SSB
♦ Nucleolare: anti-RNA nucleolare
♦ Centromerico: anti-centromero.
♦
Determinazione di ANA
Substrato: linee cellulari es HEp2 (linea epiteliale da
carcinoma laringeo umano)
Le linee cellulari
„ contengono più cromatina
„ contengono antigeni espressi in tutte le fasi del ciclo
cellulare
„ consentono di determinare anticorpi specie-specifici
Anticorpi anti-nucleo
„
„
„
La determinazione dei pattern di fluorescenza
non è nè sensibile nè specifica.
Spesso si modifica con la diluizione del siero per
la presenza simultanea di anticorpi di diversa
specificità.
Necessarie altre tecniche per determinare la
natura dell’antigene riconosciuto.
Anticorpi anti-nucleo
Utili per la diagnosi
„
„
„
„
„
„
„
Malattia
% Positività
LES
95-100
SSc
60-80
Utili per il monitoraggio o per la prognosi
Malattia
% Positività
RA giovanile (uveite)
20-50
Fen. Raynaud
20-60
„
„
„
„
„
„
„
„
Non utili per la prognosi
Malattia
% Positività
RA
30-50
MS
25
ITP
10-30
M. Tiroide
30-50
DLE
5-25
Talvolta utili per la diagnosi
Malattia
% Positività
SS
40-70
PM/DM
30-80
Parte integrante per la diagnosi
Malattia
% Positività
LES da farmaci
100
Epatite Autoimm.
100
MCTD
100
Non utili per la diagnosi
Malattia
% Positività
Imp. Silicone
15-25
Fibromialgia
15-25
Parenti di paz. autoimmuni 5-25
M.Infettive
varia
Neoplasie
varia
ANA in malattie non autoimmuni
Malattie infettive (ascessi cronici, TBC,
endocardite batterica subacuta, malaria, EBV)
„ In corso di neoplasie
„ In corso di terapie con farmaci noti per indurre
questo tipo di autoanticorpi e non sempre
associati con manifestazioni cliniche
(procainamide, idralazina, isoniazide,
cloropromazina, beta bloccanti etc)
„ Parenti (apparentemente sani) di pazienti con
malattie autoimmuni sistemiche
„
ANA positive healthy subjects
„
„
„
„
„
„
1:40
1:160
32%
5%
(Tan et al, Arthritis Rheum, 1997)
1:40
1:160
27% (34% women, 18% men)
8%
(13%women, 3% men)
SPECIFICITY
1:40
73
1:160
92
SENSITIVITY
92
81
(Hayashi et al, Clin Chem, 2001)
Specificity of anti-DNA
antibodies in lupus
„
„
„
„
„
Denatured DNA
Native and denatured DNA
Native
Base sequences
Z-DNA
Antigenic determinants in DNA
„
„
„
Purines and pyrimidines
Nucleosides
Sugar-phosphate backbone
Structure of anti-DNA antibodies
„
„
Minority: encoded by unmutated germ line genes
Majority:
„ mutated in third hypervariable region
„ high replacement/silent mutations
„ increase in arginine and asparagine
Specificity of
anti-DNA antibodies
„
Polyspecific in the binding of:
Nucleic acids
„ Cardiolipin and phospholipids
„ Proteins
„
Comparison of assays that
detect anti-nDNA antibodies
assay
high affinity
anti-DNA
Farr assay
+
ELISA
+
Crythidia Luciliae +
low affinity
anti-DNA
+
+
Sensitivity
CLIF
ELISA
62
70
specificity
sensitivity
high
low
high
high
high
low
Specificity
99
84
Determinazione degli ENA
„
„
„
„
Controimmunoelettroforesi (estratti
antigenici: timo o milza o rene)
ELISA (proteine purificate e/o proteine
ricombinanti)
immunoblot (estratti antigenici)
dot blot (proteine purificate e/o proteine
ricombinanti)
Determinazione degli ENA
CIE: molto specifico, poco sensibile, non
automatizzabile, non quantitativo, risultati in 3 giorni.
ELISA: molto sensibile, risultati in poche ore,
automatizzabile, quantitativo, specificità variabile.
Western blot: sensibile, di difficile interpretazione.
Dot blot: caratteristiche simili ad ELISA
Le specificità comunemente determinate sono 6:
anti-SSA; anti-SSB; anti-Sm; anti-RNP; anti-Scl
70; anti-Jo1.
Anticorpi anti-ENA
„
„
„
Anti-Sm: marker di LES; la sensibilitˆ clinica varia
dal 15 al 30%.
Anti-U1RNP: Presenti nel 30-40% dei pazienti con
LES; ad alto titolo costituiscono criterio diagnostico
irrinunciabile per la diagnosi di MCTD.
Anti-SSA/Ro: Nei pazienti con SS sono presenti
fino al 60% se testati con immunodiffusione e fino al
90% se testati con ELISA; si associano più
frequentemente a interessamento extraghiandolare.
Possono inoltre essere presenti in circa il 30% dei
pazienti con LES. Alti titoli sono un fattore di rischio
per lupus neonatale.
Anticorpi anti-ENA
Anti-SSB/La:Sia nei pazienti con SS che in
quelli con LES sono presenti con frequenza
inferiore rispetto agli anticorpi anti SSA/Ro. Si
associano a lupus neonatale.
„ Anti-centromero: associati a SSc limitata.
„ Anti-Topoisomerasi I (Scl70): associati a SSc
diffusa.
„ Anti-Jo-1: specifici per PM/DM. Associati ad
interstiziopatia polmonare e artrite.
„
Anticorpi anti-ENA:
specificità rare
„ Anti-PM-Scl,
si associa a miopatia.
„ Anti-U3-RNP (fibrillarina), presente nel
4-8% dei pazienti con SSc.
„ Anti-RNA polimerasi I, più frequente
nelle forme progressive di SSc.
„ Anti-polimerasi III, comune nella SSc.
„ Anti-PCNA, si associa a LES in fase
attiva.
A) 3D Rekonstruktion von U1 snRNP bei 1 nm Auflösung.
B) U1 snRNP (semitransparent) mit Interpretation des molekularen Aufbaus. Das erhaltene Strukturmodell zeigt die Lage
der einzelnen Proteine (A, 70K, C und Sm Heptamer-Ring) und der RNA (dunkelblau, rot und orange) von U1 snRNP.
Anti-ribosomal antibodies
Directed against the ribosomal P proteins P0, P1 e P2,
acidic proteins localized in the major ribosomal subunit.
These proteins share the C-terminal sequence
which is the target of anti-P antibodies.
The antibodies are detected by immunoblot on ribosomal
extracts or by ELISA on the C-terminal sequence of P
proteins
Anti-ribosomal antibodies in SLE
„
First described in 1985 (Elkon et al, J Exp
Med,162, 459)
„
Association with neuropsychiatric manifestations
suggested in 1987 (Bonfa et al, N Engl J Med,
317, 265)
„
Several studies thereafter (retrospective or
prospective) gave very discordant results
Anti-ribosomal antibodies and
neuropsychiatric manifestations
Discordant results may be due to:
„ different methods to detect anti-P antibodies
„ different study format
„ heterogeneity in the diagnostic criteria for
neuropsychiatric disorders
„ limited role of anti-P antibodies in the
pathogenesis of neuropsychiatric disorders
Anti-ribosomal antibodies:
clinical associations
Associated with:
„ skin manifestations
„ hepatic involvement
„ renal involvement
„ disease activity
„ leukopenia
Frequently are detected in anti-Sm and anti-dsDNA
positive sera: coexpression of 2 autoantibodies
or double specificity of the same antibody
population?
Anti-C1q antibodies
Directed against the collagen-like region of C1q
Detected in:
„ SLE
IgG→ 20-80%
„ Urticaria vasculitis syndrome
IgG→ 100%
„ IgA nephropathy
IgA → 30%
IgG → 2,5 %
Rheumatoid vasculitis
IgA → 29%
IgG → 61%
ANCA
anti-citoplasma dei neutrofili
„
„
Anti-mieloperossidasi: sindrome di
Churg-Strauss.
Anti-proteinasi 3: granulomatosi di
Wegener.