Citofluorimetria a flusso

Donatella Nava
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
Definizione
La citrometria a flusso è un metodo di conteggio, ed
eventualmente di selezione e isolamento, di elementi
corpuscolati (cellule) che, dopo essere state marcate
con un colorante,vengono fatti passare singolarmente
attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso
laminare e quindi conteggiate.
Per utilizzare la citometria nella ricerca di target non
corpuscolati, quali gli allergeni, è necessario farli
adsorbire a strutture cromaticamente inerti, aventi
dimensioni assimilabili a quelle di una cellula
(microsfere in lattice).
Principio di funzionamento
della citometria a flusso
1) Le cellule di una popolazione eterogenea
vengono aspirate dalla provetta e immesse
in una camera di flusso dove vengono
separate le une dalla altre.
2) Ogni singola cellula viene poi attraversata
da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e
determina l’emissione di un segnale
Fluorescente
3) Il segnale passando attraverso un sistema di
filtri e specchi raggiunge un rivelatore.
4) Viene quindi processato elettronicamente,
trasformato da analogico a digitale e inviato
all’analizzatore, che elabora il dato e lo
visualizza tramite un grafico.
5) Attraverso piastre di deflessione le cellule
analizzate possono essere raccolte
separatamente tramite un processo definito
“sorting”.
In seguito alla riorganizzazione dell’Istituto, non è
stato possibile esaminare i campioni nei nostri
laboratori. L’analisi è stata effettuata dal
laboratorio di immunologia della facoltà di Agraria
di Portici.
E’ stato utilizzato un FACScan flow cytometer
(Becton Dickinson USA)
L’analisi è stata eseguita seguendo il protocollo
messo a punto nel laboratorio per la
ricerca della gliadina
Diagramma di flusso
Estrazione in etanolo
Diluizione estratto
Adsorbimento sulle microsfere
Aggiunta anticorpi anti target
Incubazione con anticorpi anti IgG di ratto marcati
Lettura al citofluorimetro
L’approccio diagnostico è basato sull’utilizzo di particelle in
latex di 3 µm (Polysciences, Warrington, PA, USA) trattate
con 1 ml di estratto in etanolo (60%) del campione in esame.
Quindi lavate 2 volte in PBS e trattate con soluzione di
arresto (Kirkegaard & Perry Laboratory).
Le microsfere venivano incubate in successione con anticorpi
di ratto (1:50 PBS) verso i target ricercati (anti blattoglobulina o anti ovoalbumina) (Sigma-Aldrich) specifici
verso l’antigene, quindi con anticorpi anti IgG di ratto
marcati con isotiocianato (RαG - FITC) (Sigma-Aldrich)
diluito 1:600 in
​ PBS
L’indagine è stata eseguita esclusivamente sui
campioni di biscotti e polpette di carne inviati al
laboratorio per l’esecuzione dei test
immunoenzimatici.
Alcuni campioni non sono stati sottoposti all’analisi
citofluorimetrica in quanto utilizzati interamente
per i saggi ELISA.
La titolazione è stata effettuata diluendo βlattoglobulina e ovoalbumina (Sigma-Aldrich) in PBS
Come controllo negativo si è utilizzato un campione
nel quale gli anticorpi marcati erano sostituiti con
PBS
Le indagini sono state eseguite separatamente per la ricerca di
lattoglobulina e ovolabumina.
OVOALBUMINE - BISCOTTI
ELISA Test
Cf analysis
ppm
First replicate
(ppm)
Sec. replicate (ppm)
Third replicate
(ppm)
mean
SD
0
0
0
0
0
0
5
NE
NE
NE
NE NE
15
18,28456
13,65489
21,98547
17,97497333
4,173909883
30
35,25647
31,25658
39,32654
35,27986333
4,035030859
60
65,21455
68,29865
61,25455
64,92258333
3,531114499
OVOALBUMINE - BISCOTTI
Biscuits
80
60
40
20
0
ELISA test
Citofluorimetric
analysis
L0
L1
L2
Samples
L3
L4
POLPETTE - LATTE
ELISA Test
Cf analysis
First replicate
(ppm)
Second replicate
(ppm)
Third replicate
(ppm)
mean
0
0
0
0
0
0
1
NE
NE
NE
NE NE
3
8,26599
5,32221
9,36598
7,651393333
4,173909883
6
10,25648
13,23254
8,23658
10,5752
4,035030859
12
14,14897
12,65984
15,25885
14,02255333
3,531114499
ppm
SD
POLPETTE - LATTE
Meat
20
15
10
5
0
ELISA test
L0
L1
L2
Samples
L3
L4
Citofluorimetric
analysis
CONCLUSIONI
La citometria a flusso sembra più sensibile dell’ELISA,
anche se il divario rilevato con il test immunoenzimatico
in relazione alla ricerca delle ovoalbumine, pone il dubbio
di una possibile tendenza alla sovrastima dell’analisi
citofluorimetrica.
Ha però il limite di prevedere protocolli più sofisticati e
dispendiosi che non ne giustificano l’impiego nella
routine diagnostica.
In questo lavoro sono stati posti i preliminari per una
futura applicazione della citofluorimetria nella ricerca
degli allergeni in diagnostica
 I campioni sono stati omogeneizzati (2 min in un
omogeneizzatore a lame ) e quindi trattati con etanolo.
 Come controllo positivo sono stati allestiti campioni (1 mg) di
carne e sfarinati, uova-latte free, contaminati con l’aggiunta di
latte e uova (da 1 a 10-3 ppm), sono stati utilizzati e trattati per
l’estrazione come sopra descritto.
 Particelle in latex (105) con un diametro di 3 micron
(Polysciences) sono state incubate overnight con 1 ml di proteine
standard di uovo o latte (Sigma-Aldrich), quindi cimentate con 1
ml di estratto ottenuto come sopra descritto.