Diapositiva 1

”Problematiche correlate all’uso di alcol e
droghe”
Milano, 23 settembre 2015
Gli esami di laboratorio per la diagnosi dell’abuso alcolico
A. Salomone
World Health Organization (WHO) memorandum
• harmful
drinking (alcohol abuse): modalità di uso dell’alcol
che ha già determinato effetti avversi fisici o mentali
• hazardous
drinking (at-risk): livello di consumo alcolico
(regolare o anche occasionale) che risulterà con altissima
probabilità nocivo per il consumatore. Il consumo di alcol “a
rischio” non ha ancora prodotto effetti che possano comportare
una chiara diagnosi di abuso alcolico o di alcol dipendenza, ma le
modalità del bere eccedono gli orientamenti medici e pongono il
consumatore a rischio di danno.
“harmful e hazardous alcohol consumption devono essere i
bersagli primari dell’intervento precoce e della prevenzione
secondaria di un programma sanitario”
Di quali soggetti stiamo parlando?
- Lavoratori a basso rischio (per sé e per terzi)
- Lavoratori ad alto rischio
(autisti, piloti, agenti di sicurezza)
- Soggetti a cui è stata ritirata la patente di guida
- Pazienti in cura presso i SerT
Diagnosi di abuso alcolico
SCREENING:
• Visita medica
• Anamnesi
• Questionario
• Analisi di biomarcatori
DIRETTI:
• EtOH
• EtG
• EtS
• PEth
• FAEE
Sangue
Urine
Capello
INDIRETTI:
• AST
• ALT
• γ-GT
• MCV
• CDT
• ALP
• Colesterolo
• Trigliceridi
Siero
(sangue)
Biomarcatori indiretti
forte variabilità intere intra-individuale
AST, ALT, γ-GT, MCV, CDT
Danno epatico a seguito
del consumo di alcol
età
sesso
BMI
etnia
patologie epatiche, uso / abuso di
farmaci e droghe illecite
Indagine retrospettiva a breve-medio termine
Determinazione semplice, veloce
economica, automatizzata
colorimetric assays
optical measurement
HPLC-UV, immunoassays
Protocolli standard condivisi: NO ; valori di cut-off: NO
Sensibilità e specificità diverse, ma individualmente sono considerati poco
sensibili e poco specifici
Transferrina Carboidrato Carente
(Carbohydrate-Deficient Transferrin), CDT
Sulla base di un ampio consenso scientifico si definisce
CDT un insieme di glicoforme della transferrina di cui le
componenti rappresentative sono: asialo-Tf, monosialo-Tf,
e disialo-Tf. Nei soggetti che non abusano di alcol si
ritrovano frazioni di disialo e asialotransferrina minori
del 2 % del totale, mentre questo valore aumenta
significativamente nei soggetti abusatori.
In particolare la glicoforma disialotransferrina è
considerata di riferimento quale marcatore di abuso
alcolico. L’asialotransferrina in teoria sarebbe più specifica
ma compare solo quando la disialotransferrina è elevata
La CDT nel consumo alcolico
L’elevato consumo alcolico (etanolo e acetaldeide) inibisce
la glicosilazione epatica della transferrina
e, di
conseguenza, aumentano in percentuale le isoforme meno
glicosilate (disialo, monosialo e asialo)
Transferrina Carboidrato Carente
(Carbohydrate-Deficient Transferrin), CDT
• Determinazione analitica
il siero e’ la matrice d’elezione per il dosaggio della CDT.
Subito dopo il prelievo e’ possibile conservare il siero a 46 °C per una settimana o a -20 °C per tempi superiori.
Campioni lipemici e/o emolizzati
possono creare
problemi di interpretazione del risultato. Congelamento e
scongelamento anche se ripetuti non alterano la
concentrazione della CDT.
Le metodiche attualmente in uso sono di tipo
immunologico e di tipo separativo.
Transferrina Carboidrato Carente
(Carbohydrate-Deficient Transferrin), CDT
- Metodiche immunologiche: utilizzano la formazione del
legame tra la CDT e un anticorpo specifico antitransferrina.
- Metodiche separative: HPLC come tecnica d’elezione ed
elettroforesi capillare zonale (CZE).
Queste tecniche hanno il vantaggio di separare ed
evidenziare le singole glicoforme della transferrina
consentendo l’identificazione di varianti o di possibili
patologie
Biomarcatori diretti
metabolita diretto dell’etanolo per
coniugazione con l’acido glucuronico
Ethyl glucuronide
FAEEs
metaboliti diretti dell’etanolo per reazione con
acidi grassi liberi
Correlazione diretta con la quantità
di alcol assunta
•sangue
•urina
•matrice cheratinica
Determinazione in matrice cheratinica per
indagini retrospettive a lungo termine
TEMPO
≈ 1 cm/mese
Biomarcatori diretti
EtilGlucuronato, EtG
•metabolita non ossidativo che si forma per coniugazione con
l’acido glucuronico: acido etil β-D-6-glucuronico (meno dello
0.1%, range 0.02-0.06% dell’etanolo assunto viene trasformato
in EtG)
• idrosolubile, non volatile e stabile
• presente in tutti i fluidi corporei e nei tessuti cheratinizzati
• lunga emivita (2 – 3 ore)
• attualmente isolato e dosato in cromatografia (LC-MS)
• specifico
• sensibile
• efficiente
ALCOL ETILICO
EtilGlucuronato nelle urine
L’EtG, metabolita diretto dell’etanolo, marker specifico di
consumo alcolico, può essere determinato nelle urine fino a
circa 80 ore dalla cessazione dell’assunzione di alcol. In un
gruppo di 106 pazienti sono state analizzate 286 urine,
ottenendo concentrazioni di EtG comprese nell’intervallo
3.6–710 mg/L, valore medio 344  242 mg/L, con un tempo
di rivelabilità dall’astensione del consumo di 12–80 h, valore
medio 57.7  16.9 h (Friedrich Martin Wurst et al., Alcohol &
Alcoholism Vol. 34, No. 1, pp. 71-77, 1999).
ALCOL ETILICO
EtilGlucuronato nel sangue
•la concentrazione massima di EtG nel siero (variabilità interindividuali
significative) si raggiunge in 3.5–5.5 ore dall’assunzione di etanolo
• la concentrazione massima di EtG nel siero si raggiunge più tardi di 2.0–3.5
ore rispetto alla Cmax dell’etanolo
• calcoli teorici indicano che la concentrazione di EtG nel siero rimane
determinabile fino a 17 ore dall’assunzione
• la ricerca di EtG nel sangue può essere risolutiva quando è necessario
distinguere l’ingestione ante-mortem di etanolo dalla formazione post-mortale
dell’alcol (presenza di etanolo nel sangue e assenza nell’umor vitreo per
fenomeni putrefattivi)
Gudrun Høiseth et Al. Forensic Science International 2007 Oct 25; 172(2-3):
119-24
ALCOL ETILICO
EtilGlucuronato nei capelli
La determinazione dell’EtG nei capelli consente di discriminare i consumatori
occasionali da quelli abitudinari. Un risultato positivo indica un elevato consumo di
alcol.
Proposta di valori di cut-off: concentrazioni di EtG (pg/mg)
<8
astemi (Teetotalers)
8 - 25 consumatori occasionali (Social Drinkers, 11-60 g/die di etanolo)
> 25
consumatori cronici (Heavy Drinkers, > 60 g/die di etanolo).
M. Yegles, F. Pragst. Cut-offs for the detection of alcohol abuse by measurement of fatty acid
ethyl esters and ethyl glucuronide in hair. Workshop of the Society of Hair Testing (SOHT),
Strasbourg, 28-30 September 2005
Biomarcatori diretti
“ Una concentrazione superiore al cut-off di 0.5 ng/mg per
la somma dei quattro esteri nei primi 3 cm di capello
analizzato può indicare un consumo cronico di alcol ”
“The cut-off for EtG in hair strongly suggesting
chronic excessive alcohol consumption is proposed
at 30 pg/mg scalp hair, measured in 0-3 cm (up 06 cm) proximal segment”
Protocolli standard
e valori di cut-off
condivisi
“The cut-off for the sum of the four fatty acid
esters in hair to strongly support chronic excessive
alcohol consumption is proposed at 0.5 ng/mg
scalp hair, measured in 0-3 cm proximal segment.
If the 0-6 cm proximal segment is used the
proposed cut-off is 1.0 ng/mg scalp hair”
“EtG should be the first choice in abstinence
assessment. A concentration ≤ 7 pg/mg EtG in the
0-3 up to 0-6 cm proximal scalp hair segment
is not in contradiction to the self-reported
abstinence of a person during the corresponding
time period before sampling”
EtG over FAEE
(extracts from Consensus of SoHT 2014)
• EtG appears not to be influenced by hairspray, gel, wax, oil,
grease or ethanol-containing hair care products
• Regular use of ethanol-containing hair care products
(e.g. hairspray or hair lotions) lead to false positive FAEEs
• Possibility of alternative sampling (chest hair) when head hair
is not available (not enough data for FAEEs)
• EtG should be the first choice in abstinence assessment,
while the analysis of FAEEs alone is not recommended
Chapter 4,
Alcohol
Biomarkers in Hair,
Prof. F. Pragst
Research activity
Assessment of alcohol abuse and abstinence
“Chemometric evaluation of nine alcohol biomarkers in a large population of clinicallyclassified subjects: pre-eminence of ethyl glucuronide concentration in hair for confirmatory
classification”
Pirro V, Valente V, Oliveri P, De Bernardis A, Salomone A, Vincenti M.
Analytical Bioanalytical Chemistry 2011, 401(7):2153-64.
“A study of distribution of ethyl glucuronide in different keratin matrices”
Pirro V, Di Corcia D, Pellegrino S, Vincenti M, Sciutteri B, Salomone A.
Forensic Science International 2011, 210(1-3):271-7.
“Multivariate strategies for screening evaluation of harmful drinking”
Pirro V, Oliveri P, Sciutteri B, Salvo R, Salomone A, Lanteri S, Vincenti M.
Bioanalysis 2013, 5(6):687-99.
“How has screening of harmful drinking changed over the years?”
Vincenti M., Salomone A, Pirro V., Bioanalysis 2013, 5(24), 2981–2983.
“Interpretation of group-level factors from a large population dataset in the determination
of ethyl glucuronide in hair”
Salomone A, Pirro V., Lombardo T., Di Corcia D., Pellegrino V., Vincenti M.
Drug Testing and Analysis 2014, DOI 10.1002/dta.1697.
“Determination of basic ethyl glucuronide levels in hair for the assessment of alcohol
abstinence”
Pirro V, Di Corcia D, Seganti F, Salomone A, Vincenti M.
Forensic Science International 10.1016/j.forsciint.2013.07.024
Direct over indirect markers
(extracts from our research activity)
Hair EtG can be used as a
unique biomarker for the
confirmatory diagnosis of
chronic alcohol abuse ?
Which of the indirect
biomarkers can be utilized
to screen for alcohol
misuse?
1° studio
CAD + ASL TO4 +
ASL TO2
Studio sperimentale:
- 175 soggetti
- 9 biomarcatori
Astinenti
Bevitori occasionali
Abusatori cronici
Pirro et al. (2011)
Analytical Bioanalytical
Chemistry 401:2153-2164
EtG vs.
CDT
Pirro et al. (2011) Anal. Bioanal. Chem. 401:2153-2164
PCA: analisi esplorativa
Non-drinkers
Social drinkers
175 soggetti × 5-9 marcatori
Heavy drinkers
• EtG: marcatore
moltola
Quando
l’EtG è rimosso,
sensibile e specifico
separazione
tra consumatori
cronici
non-cronici
• CDT &eMCV:
marcatori
diminuisce
drasticamente
specifici, ma non sensibili
(CDT > MCV)
• γ-GT, AST & ALT: scarsa
sensibilità e specificità
(γ -GT > AST, ALT)
EtG nel capello vs. CDT come marcatore di conferma
2.5
non-harmful
drinkers
Log(EtG)
2
1.5
1
0.5
0
352371
378
358374391
357
398
410
409
375
403
367
388
364
414
363
360380 411
419
379
404
382
389
418
401
407
359
365
422
355
353
370
381
412
396
408
372
416
395
362
373
405
413
376
390
393
356
386
369
361 387406
354
421
384 417
400420
423
348366385
394
392
415
383402
309
307
368 399
340
351 377
311 343
308
306
310 350
305 335
13
9 24
75 113
206223
3646 62
114
116
126
243
263
315
325
26
31
264
274295
138
142
177
179
201
233
321
337
67
139
155172
250
252
273
299
300
323
120
151
187
194
230
341
266
339
68
69
133
186
218
224
345
35
91
121
326
20
85
118
226
251
2410
23
71
153
277
43
87
124
246
282
322
25
29
52
64
108
209
279
59
90
104
106
204
208
210
248
253
47
213
227
247
76
100
162
164 199
259
329
333
336
347
714
38
51
86
103
107
129
232
30
54
60
147
235
249
292
328
11
6
96
228
265
269
313
32
303
342
39
154
245
260
344
82
137
141
15
19
125
161
189
203
314
331
49
185
268
270
298
316
5 28
4856
272
287
318
338
93
231
80
111
156
255
283
312
42
131
145
220
58
143
157
159
205
221
238
278
33
182
212
229
77
184
214
216
291
115
296
112
119 148
152
165
241
271
301 330349
22
40
175
244
57
66
167
168
191
222
297
18
158
225
1312
73
215
44
88
94
110
192
37
234
275
21 415363 79
257
8398
188
256
817
169
181
144
193
197
240
180
202
258
81
267284304 346
134
150
171
242
254
211 237
16 34
135
149
160
166
127
146
170
99 122
174196
320
95
65 92
132
276
285
207 236 262
288
293
173
102
130
289
27 5061
183200
178
109
302319
286
97
290
84
117
198
334
195
239
324
128
89
70
72
78
163
219
280 317
4555 74 101
105 136
176
190 217
332
261281
294 327
123140
0
50
100
150
200
250
Sample index
300
350
1.2
0.2
0
-0.2
Log(CDT)
EtG alta sensibilità (91%) e
alta specificità (97%)
CDT bassa sensibilità (51%)
e alta specificità (90%)
397
400
EtG
371
372
387 413
0.8
0.4
30 pg/mg
2° studio:
423 soggetti
401
1
0.6
Harmful drinkers
359
364
373
375
411
395
400
420
409
382 416
418
381398
412
410
376 402
422
197
57
308
378
369 405
354
363
385403
423
39 5870
7688
179
192
337
341
366
365
368
370
406
236
309 343
384
407
5
667893
201
281303
357374
388
393
414
143163
168189
210
225
249
252
259277
342
346
54
61
86
87
134
194
232
233
234
280
286
307
315
316
319
326
345
348
367
379
386
399
421
91726
75
128
136
139
159
161
170
173195
212
238
243
320 344
362380
383
419
12314
34 50
51
52 73
77
8191108125
126
132
147
153
157
158
160
162
198
199
209
216
221
224
228
246
247
250
256276
284
290
292
294314
318
350
353
356
360
396
404
11
815
20
21
24
25
28
31
33
35
38
46
48
4959
60
62
6979
8392
94
97
103 135
140
145
146
148
150
154
167
169 211
213
217
229
235
240
248
260282
283
291
293
295
304
306
312
317340
10
612
719
23
29
32
36
40
4356
42
6372
74
80
82
84
85
90110
116
131152
155
156
164
165
172
174
180
183
196
204
207
222
223
230
241
244
254
255
264
267
271
285
287310
325
327
329
338
391
394
397
408
13
18
22
3041
47
5365
67
68
71 89
102
99
106
111
112
114
115
118
119
121
122
123
124 166
171
175
186
200
202
203
214
219
231
237
251
253
266
268
272
274
273
275
278
289
296
300322
334355
361 389 417
4162737
44
455564 96
98
105
107129
130
133
141
142
144
151 182
184
187205
218
220
226242
257
269
279
288
301
305
313
321
332
347
352
415
100
104
113
117
120
127
185 208
215
227
239
245261
263
265
270 297
302323
324
330
331
335
349 390
95
101
109 137
138
149 177
181
188
190206
258
262 298 328
333
339358377
392
176193
336
178
191
299
351
311
0
50
100
150
200
250
Sample index
300
350
400
CDT
2.0%
CURVE ROC
Accertamento dell’astinenza dal consumo di alcolici mediante
analisi dell’EtG nel capello
• concentrazioni HEtG < LOD
(unita’ di pg/mg)
• cut-off attuale proposto: 7 pg/mg
16-32 g alcol/giorno ⇒ EtG
capello < 7 pg/mg
44 astemi e astinenti
93% dei campioni: HEtG < 1 pg/mg
Media HEtG 0.8±0.4 pg/mg
0-3 cm
Revision del cut-off
Chain-of-custody
Sampling
Report on-line
Transportation
Payment (€ 70)
Analysis (ISO 17025)
Reception
Zona di prelievo
% poistive samples
Etil glucuronato (cut off 30 pg/mg)
14,0
12,0
10,0
11,4
9,9
head hair
8,0
chest hair
6,0
4,0
2,6
axillary hair
2,0
0,0
Matrice cheratinica (25533campioni)
Distribuzione dei risultati positivi
Capello: 20,973
Ascella: 1,946
Torace: 762
cumulative %
100%
80%
> 200 pg/mg
60%
100 pg/mg
40%
50 pg/mg
20%
30 pg/mg
0%
1
2
torace
capello
(20973 campioni) (1946 campioni)
VALUTAZIONE INTERINDIVIDUALE
11 su 32 falsi positivi analizzando peli pubici
EtG peli pubici > capello > peli ascellari
Sovrastima
sottostima
Età e genere
Uomini: 18,920
Donne: 1,373
18-30 anni: 4,684
31-40 anni: 5,878
>40 anni: 9,731
% positivi
EtG (cut-off 30 pg/mg)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
18
18-30 years
31-40 years
4
8
head hair (20293 samples)
over 40 years
6.6
%
12.3 %
Stagionalità
Campioni capello: 4,503
17 %
12 %
Inverno vs. Autunno
Estate vs. Primavera
11 %
Statisticamente non
differenti
Inverno e Autunno
vs.
Estate e Primavera
Statisticamente
differenti
7%
Studio di possibili fattori di bias:
fattori biologici e personali
- Età
- Indice di massa corporea
- Sesso M/F
- Trattamenti cosmetici forti
- Età (intersezione con fattori sociologici)
- Indice di massa corporea (non c’è dipendenza)
- Sesso M/F (non c’è dipendenza)
- Trattamenti cosmetici forti e/o ripetuti
Possibili fattori di bias: trattamenti cosmetici chimici e fisici
• No contaminazione esterna da prodotti contenenti alcol. Un solo caso di
contaminazione descritto in letteratura da prodotti contenenti EtG (Sporkert
et al. 2012)
• Prodotti decoloranti (forti ossidanti) possono degradare e dilavare la
matrice cheratinica e ridurre la concentrazione riscontrata di EtG
Non trattati
Piastrati
Analisi SEM (microscopio elettronico a scansione)
Decolorati
Cut-Off
FAEEs
Sensibilità
Specificità
0.5 ng/mg
97%
76%
0.8 ng/mg
83%
88%
1.0 ng/mg
66%
91%
CONCLUSIONI
 I marcatori indiretti possono essere utilmente impiegati in valutazioni di
screening su popolazioni ampie di soggetti (es. lavoratori), considerando i dati
dopo un’opportuna sintesi (es. trattamento statistico)
 EtG nel capello rappresenta un insostituibile marcatore di abuso alcolico
cronico, da utilizzare senza eccezione in tutti i casi sospetti (es. ritiro della
patente di guida), nonché nelle mansioni di particolare rischio (es. disponibilità
di armi, autisti di autobus, piloti, ecc.)
 Il campionamento di pelo toracico può sostituire quello del capello per la
determinazione dell’EtG, benchè l’intervallo cronologico non sia ben definito
La determinazione di EtG nel capello è raccomandato per la valutazione di
astinenza da alcol. Un cut-off di 1-2 pg/mg è verosimilmente idoneo allo scopo
“SCREENING”: mondo del lavoro
 Commisurare gli strumenti accertativi ai
rischi che la mansione comporta per i
terzi (maestro vs. autista di scuolabus)
in relazione al rapporto costi/benefici
Accettare il conseguente rischio di non
riuscire a riconoscere tutti i consumatori
problematici di alcol e/o di sostanze
stupefacenti
“CONFERMA”: (presunta colpa)
- Allontanamento da mansione lavorativa
- Sospensione della patente di guida
- Concessione del porto d’armi
 Utilizzare SEMPRE gli strumenti accertativi più
efficaci a riconoscere inequivocabilmente il
consumo di sostanze stupefacenti e/o il
consumo problematico di alcol
 NON accettare il rischio di non riconoscere
tutti i consumatori problematici di alcol
GRAZIE !