PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 test per l`utilizzo con

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx
SK006
50 test per l'utilizzo con Autostainer Link 48
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è un saggio immunoistochimico qualitativo che utilizza Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3,
destinato all'uso nella rilevazione della proteina PD-L1 in tessuto di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) fissato in
formalina, incluso in paraffina (FFPE), con il sistema di visualizzazione EnVision FLEX su Autostainer Link 48. L'espressione della
proteina PD-L1 è determinata utilizzando il punteggio TPS (Tumor Proportion Score), che rappresenta la percentuale di cellule tumorali
vitali che mostrano una colorazione di membrana parziale o totale.
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è indicato come ausilio nell'identificazione di pazienti affetti da NSCLC idonei al trattamento con
KEYTRUDA® (pembrolizumab).
Riepilogo e spiegazione
Il legame dei ligandi di PD-1, PD-L1 e PD-L2, al recettore PD-1, localizzato sulle cellule T, inibisce la proliferazione delle cellule T e la
produzione di citochine. In alcuni tumori si verifica una sovraregolazione dei ligandi di PD-1 e la relativa via di trasduzione del segnale
può contribuire a inibire la sorveglianza immunitaria delle cellule T attive dei tumori. KEYTRUDA è un anticorpo monoclonale
umanizzato che si lega al recettore PD-1 e ne blocca l'interazione con PD-L1 e PD-L2, rilasciando l'inibizione della risposta immunitaria
mediata dalla via di trasduzione del segnale di PD-1, inclusa la risposta immunitaria anti-tumorale. In modelli tumorali murini singenici, il
blocco dell'attività di PD-1 ha portato a una riduzione della crescita tumorale (1).
Principio della procedura
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx include il protocollo e i reagenti ottimizzati necessari per l'esecuzione di una procedura di colorazione IHC di
campioni FFPE con Autostainer Link 48. Una volta eseguita l'incubazione con l'anticorpo monoclonale primario anti-PD-L1 o con il reagente
di controllo negativo Negative Control Reagent (NCR), i campioni vengono incubati con un anticorpo Linker specifico per la specie ospite
dell'anticorpo primario, quindi vengono incubati con un reagente di visualizzazione pronto per l'uso che consiste di molecole di anticorpo
secondario e molecole di perossidasi di rafano legate a uno scheletro di polimeri di destrano. La conversione enzimatica del cromogeno
aggiunto successivamente causa la precipitazione di un prodotto di reazione visibile nel sito dell'antigene. Il colore della reazione
cromogena viene modificato da un reagente di potenziamento del cromogeno. Il campione può quindi essere sottoposto a colorazione di
contrasto e coperto con un vetrino coprioggetto. L'interpretazione dei risultati avviene per mezzo di un microscopio ottico.
Materiali forniti
Ogni kit contiene 19,5 mL di anticorpo primario contro PD-L1 (concentrazione proteica pari a circa 3 µg/mL) e include i reagenti necessari
per effettuare 50 test in un massimo di 15 cicli di colorazione singoli. I materiali elencati di seguito sono sufficienti per 50 test (50 vetrini
incubati con Primary Antibody contro PD-L1 e 50 vetrini incubati con corrispondente Negative Control Reagent; 100 vetrini in totale). Il
numero dei test è basato sull'uso di 2 x 150 µL per vetrino di ciascun reagente ad eccezione di DAB+ e Target Retrieval Solution.
Il kit fornisce materiale sufficiente per un massimo di 15 cicli di colorazione singoli.
Quantità
1 x 34,5 mL
Descrizione
Peroxidase-Blocking Reagent
PEROXIDASE-BLOCKING
REAGENT
Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno, detergente e sodio azide 0,015 mol/L.
1 x 19,5 mL
Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3
MONOCLONAL MOUSE
ANTI-PD-L1
CLONE 22C3
Anti-PD-L1 monoclonale murino (IgG1) in soluzione tamponata, contenente proteina stabilizzante e sodio azide
0,015 mol/L.
1 x 15 mL
Reagente di controllo negativo
NEGATIVE CONTROL
REAGENT
Anticorpo monoclonale IgG murino di controllo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide
0,015 mol/L.
1 x 34,5 mL
Mouse LINKER
LINKER,
ANTI-MOUSE
Anticorpo secondario di coniglio diretto contro immunoglobuline murine in soluzione tamponata contenente proteina
stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/L.
1 x 34,5 mL
Visualization Reagent-HRP
VISUALIZATION
REAGENT-HRP
Destrano legato a molecole di perossidasi e molecole di anticorpi secondari di capra diretti contro immunoglobuline di
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15 x 7,2 mL
coniglio e di topo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico.
DAB+ Substrate Buffer
DAB+
SUBSTRATE BUFFER
Soluzione tamponata, contenente perossido di idrogeno e un agente antimicrobico.
1 x 5 mL
DAB+ Chromogen
DAB+ CHROMOGEN
3,3’-diaminobenzidina tetraidrocloruro in solvente organico.
1 x 34,5 mL
DAB Enhancer
DAB ENHANCER
Solfato rameico in acqua.
6 x 30 mL
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x
EnVision™ FLEX
TARGET RETRIEVAL SOLUTION
LOW pH (50X)
Soluzione tamponata, pH 6,1, contenente detergente e un agente microbico.
15 vetrini
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Slides
CONTROL SLIDES
XXXXX
PD-L1 IHC 22C3
pharmDx
Ciascun vetrino contiene sezioni di due linee cellulari in pellet fissate in formalina e incluse in paraffina: NCI-H226*
moderatamente positive per l'espressione della proteina PD-L1 e MCF-7 negative per l'espressione della proteina PD-L1.
MCF-7: negative per PD-L1
NCI-H226: positive per PD-L1
*Si ringraziano il Dr. AF Gazdar e il Dr. JD Minna dell'NIH per il loro contributo nello sviluppo della linea NCI-H226 (numero ATCC:
CRL-5826™) (2).
Nota: tutti i reagenti inclusi sono formulati in modo specifico per l'utilizzo con questo kit. Per eseguire il test secondo quanto specificato,
non è consentito effettuare sostituzioni, ad eccezione di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (codice K8005).
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stato formulato appositamente per l'uso con Autostainer Link 48. Per ulteriori informazioni, fare riferimento
ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link
Materiali necessari ma non forniti
PT Link Pre-treatment Module (codice PT100/PT101)
Autostainer Link 48 (codice AS480)
EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (codice K8007)
Hematoxylin (codice K8008)
Acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente)
Timer
Tessuti positivi e negativi da utilizzare come controlli della procedura (vedere la sezione Controllo di qualità)
Vetrini per microscopia: Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) o vetrini caricati Fisherbrand Superfrost Plus
Vetrini coprioggetto
Mezzo di montaggio permanente e reagenti ausiliari richiesti per il montaggio dei vetrini coprioggetto
Microscopio ottico (ingrandimento obiettivi 4x–40x)
Precauzioni
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Per uso professionale.
3. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica altamente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato
come prodotto a rischio, il composto NaN3 alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando
azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento del prodotto, far scorrere abbondante acqua nelle tubature per
impedire la formazione di azidi metalliche (3).
4. I reagenti Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker e Visualization Reagent contengono materiale di origine animale.
5. I campioni, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di
infezione e smaltiti con le opportune precauzioni (4).
6. Tempi, temperature o metodi di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati erronei.
7. I reagenti sono stati diluiti nel modo ottimale. L'ulteriore diluizione potrebbe compromettere la colorazione dell'antigene.
8. I reagenti Visualization Reagent, DAB+ Chromogen liquido e la soluzione substrato-cromogeno DAB+ preparata possono subire
alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Non conservare questi componenti del sistema né eseguire la colorazione in
condizioni di luce intensa, come ad esempio la luce solare diretta.
9. Residui di paraffina possono produrre risultati falsi negativi.
10. L'uso di volumi dei reagenti diversi da quelli consigliati può comportare la perdita di immunoreattività di PD-L1 visibile.
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11. I risultati di un piccolo studio hanno mostrato un intervallo dinamico simile di espressione di PD-L1 in coppie di campioni di NSCLC
primario e metastatico. È possibile che vi siano delle differenze nell'espressione di PD-L1 nei tumori primari rispetto alle sedi
metastatiche dello stesso paziente.
12. Sezioni di tessuto di grandi dimensioni possono richiedere 3x150 µL di reagente.
13. Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli utenti
sulle corrette procedure di lavoro, le proprietà rischiose del prodotto e le norme di sicurezza necessarie. Fare riferimento alla
scheda di sicurezza (SDS) per ulteriori informazioni.
14. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e la cute.
15. La soluzione non utilizzata deve essere smaltita in conformità alle normative locali e nazionali vigenti in materia.
16. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.
Pericolo
DAB+ Chromogen: 1–5% di tetracloruro di bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraammonio
H350
Può provocare il cancro.
H341
Sospettato di provocare alterazioni genetiche.
P201
Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso.
P202
Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze.
P280
Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Indossare indumenti protettivi.
P308 + P313
IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Consultare un medico.
P405
Conservare sotto chiave.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali.
Avvertenza
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% di acidi citrico
H319
Provoca grave irritazione agli occhi.
H411
Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata.
P280
Proteggere gli occhi/il viso.
P273
Non disperdere nell'ambiente.
P264
Lavare accuratamente le mani dopo l'uso.
P305 + P351 +
IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le
P338
eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare.
P337 + P313
Se l’irritazione degli occhi persiste: consultare un medico.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali.
Conservazione
Conservare tutti i componenti di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, inclusi i vetrini di controllo Control Slides, al buio a 2-8 °C quando non in
uso su Autostainer Link 48.
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sull'esterno della confezione. Nel caso in cui i reagenti vengano conservati
diversamente da quanto specificato nel presente foglietto informativo, le condizioni dovranno essere convalidate dall'utente.
Non è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto, pertanto, è necessario analizzare gli opportuni controlli positivi e
negativi contemporaneamente ai campioni dei pazienti.
Preparazione dei campioni
I campioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per la colorazione IHC. Utilizzare per tutti i campioni i metodi
standard di processazione dei tessuti.
Sezioni incluse in paraffina
Tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono idonei all'uso. L'uso di altri fissativi non è stato convalidato e può produrre risultati
erronei. Si raccomanda un tempo di fissazione di 12-72 ore in formalina neutra tamponata al 10%, tuttavia, uno studio con un numero
limitato di campioni ha mostrato che un tempo di fissazione compreso tra 4 e 168 ore in NBF 10% non ha alterato in modo sistematico
la rilevazione di PD-L1. Un tempo di fissazione ≤3 ore può determinare una variabilità nella rilevazione di PD-L1. I campioni devono
essere suddivisi in blocchi dello spessore di 3 o 4 mm, fissati in formalina, deidratati e chiarificati in una serie di alcoli e xilene, quindi
infiltrati con paraffina fusa. La temperatura della paraffina non deve superare i 60 °C. I blocchi di tessuto FFPE preparati almeno 5 anni
prima possono determinare una perdita di immunoreattività di PD-L1.
I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 4-5 µm. Dopo il sezionamento, i tessuti devono essere montati su vetrini
Fisherbrand Superfrost Plus o su vetrini Dako FLEX IHC Microscope (codice K8020), quindi incubati in forno a 58 ± 2 °C per 1 ora. Per
preservare l'antigenicità, una volta montate sui vetrini, le sezioni tissutali devono essere mantenute al buio a 2-8 °C (preferibilmente) o a
una temperatura ambiente massima di 25 °C, quindi sottoposti a colorazione entro 6 mesi dal sezionamento. La temperatura di
conservazione e di manipolazione dei vetrini in ogni fase posteriore alla preparazione non dovrà superare i 25 °C per assicurare
l'integrità e l'antigenicità dei tessuti.
L'uso di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su tessuti decalcificati non è stato convalidato e non è consigliato.
Preparazione dei reagenti
Prima della colorazione, è necessario preparare i reagenti indicati di seguito:
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x
Preparare una quantità sufficiente di Target Retrieval Solution, Low pH, 1x, diluendo la soluzione Target Retrieval Solution, Low pH,
50x 1:50 con acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente); il pH della soluzione Target Retrieval Solution 1x deve essere
6,1 ± 0,2. Un pH della Target Retrieval Solution 1x inferiore a 5,9 può determinare la produzione di risultati errati. Con una bottiglia da
30 mL di Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, diluita 1:50 si ottengono 1,5 L di reagente 1x, quantità sufficiente per il riempimento di
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una tanica di PT Link, che consente di trattare fino a 24 vetrini per utilizzo. Eliminare la soluzione Target Retrieval Solution 1x dopo tre
utilizzi e dopo non più di 5 giorni dalla diluizione.
Se richieste, quantità aggiuntive di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, sono disponibili con il codice K8005.
EnVision FLEX Wash Buffer, 20x
Preparare una quantità sufficiente di Wash Buffer diluendo il Wash Buffer 20x 1:20 con acqua distillata o deionizzata (acqua di grado
reagente) per le fasi di lavaggio. Conservare la soluzione 1x inutilizzata a 2-8 ºC per un periodo massimo di un mese. Eliminare il
tampone se appare torbido. Per ulteriori informazioni, fare riferimento al manuale utente del sistema Autostainer Link 48 in uso.
EnVision FLEX Wash Buffer, 20x è disponibile con il codice K8007.
Soluzione substrato-cromogeno DAB+
Questa soluzione deve essere accuratamente miscelata prima dell'uso. La formazione di precipitati nella soluzione non influisce sulla
qualità della colorazione.
Per preparare la soluzione substrato-cromogeno DAB+, aggiungere 1 goccia di DAB+ Chromogen liquido per mL di DAB+ Substrate
Buffer e miscelare. La soluzione substrato-cromogeno è stabile per 5 giorni se conservata al buio a 2-8 C.
Note importanti:

Se si utilizza una bottiglia di DAB+ Substrate Buffer intera, aggiungere 9 gocce di DAB+ Chromogen. Sebbene
sull'etichetta sia riportata la dicitura 7,2 mL, questa indica il volume utilizzabile e non tiene in considerazione il "volume morto"
nella bottiglia.

Il colore di DAB+ Chromogen liquido nella bottiglia può variare da trasparente a color lavanda-marrone. Ciò non influisce sulle
prestazioni del prodotto. Diluire secondo le linee guida fornite in precedenza. L'aggiunta di un eccesso di DAB+ Chromogen
liquido a DAB+ Substrate Buffer causa una riduzione del segnale positivo.
Procedura di colorazione sul sistema Autostainer Link 48
Note sulla procedura
Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e acquisire dimestichezza con tutti i componenti e lo strumento
(vedere la sezione "Precauzioni").
Prima di procedere all'immunocolorazione, tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20-25 °C). Analogamente,
tutte le fasi di incubazione devono essere eseguite a temperatura ambiente.
Non consentire l'essiccazione delle sezioni tissutali durante la procedura di colorazione. Sezioni tissutali asciutte possono mostrare
livelli di colorazione aspecifica superiori.
Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati nel software Dako Link. Per ulteriori informazioni sulla
programmazione dei protocolli e sul caricamento di vetrini e reagenti, fare riferimento ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link.
Nota: i reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati progettati per l'ottenimento di prestazioni ottimali quando utilizzati con i
reagenti e i materiali consigliati. L'ulteriore diluizione dei reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati
possono produrre risultati erronei o discordanti.
Protocollo di colorazione
Selezionare il protocollo di colorazione PD-L1 IHC 22C3 pharmDx dalle opzioni del menu a discesa Dako Link.
Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati nell'Autostainer Link 48. Se i protocolli PD-L1 IHC
22C3 pharmDx appropriati non sono presenti sul server in uso, contattare il rappresentante dell'assistenza tecnica locale per richiederli.
Fase 1: Procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1)
Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link.
Impostare PT Link (codice PT100/PT101) con il preriscaldamento e il raffreddamento a 65 °C. Impostare il riscaldamento a 97 °C per
20 minuti.
►Riempire le taniche di PT Link con 1,5 L di soluzione di lavoro Target Retrieval Solution, Low pH, 1x, per tanica, per coprire le sezioni
di tessuto.
►Preriscaldare la soluzione Target Retrieval Solution a 65 °C.
►Immergere i rack Autostainer contenenti sezioni tissutali FFPE montate nella soluzione Target Retrieval Solution, Low pH, (soluzione
di lavoro 1x) preriscaldata, all'interno della tanica di PT Link. Incubare per 20 minuti a 97 °C.
►Una volta completata l'incubazione per lo smascheramento antigenico e portata la temperatura a 65 °C, rimuovere ciascun rack
Autostainer con i vetrini dalla tanica di PT Link e posizionarlo immediatamente in una vaschetta apposita (ad esempio, PT Link
Rinse Station, codice PT109) contenente Wash Buffer (codice K8007) diluito e a temperatura ambiente.
►Incubare i vetrini immersi in Wash Buffer diluito e a temperatura ambiente per 5 minuti.
Fase 2: Procedura di colorazione
Dopo la procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1), i rack Autostainer con i vetrini vengono
posizionati in Autostainer Link 48. Lo strumento eseguirà la procedura di colorazione applicando il reagente appropriato, monitorando il
tempo di incubazione ed effettuando il lavaggio dei vetrini tra le applicazioni dei reagenti. I tempi di incubazione dei reagenti sono
preimpostati nel software Dako Link.
Fase 3: Colorazione di contrasto
I vetrini devono essere sottoposti a colorazione di contrasto per 5 minuti con Hematoxylin (Link) (codice K8008). Il tempo di incubazione
con Hematoxylin è preimpostato nel protocollo.
Fase 4: Montaggio
È richiesto un mezzo di montaggio permanente e non acquoso.
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Nota: è possibile che si verifichi una perdita di intensità della colorazione dei vetrini associata a diversi fattori che includono, a titolo
esemplificativo ma non limitativo, la colorazione di contrasto, metodi e materiali di montaggio e le condizioni di conservazione. Per
ridurre al minimo la perdita di intensità della colorazione, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20-25 °C).
Controllo di qualità
I reagenti in PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sono stati sottoposti a controllo di qualità tramite immunoistochimica utilizzando le procedure di
smascheramento antigenico e colorazione descritte in precedenza. Eventuali variazioni apportate alle procedure consigliate per la
fissazione, la processazione e l'inclusione dei tessuti nel laboratorio dell'utente possono produrre una significativa variabilità nei risultati.
I controlli di qualità devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Tali controlli di qualità sono indicati nella tabella 1 e includono un
campione tissutale del paziente con colorazione H&E, tessuti di controllo positivo e negativo forniti dal laboratorio e un vetrino Control
Cell Line Slide fornito da Dako (5). Negli Stati Uniti, consultare le linee guida per il controllo della qualità dell'Accreditation Program for
Immunohistochemistry del College of American Pathologists (CAP); per ulteriori informazioni, fare riferimento anche al documento del
CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (5, 6, 7).
Verifica del saggio
Prima del primo utilizzo di un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, l'utente deve verificare le prestazioni del saggio su
una serie di tessuti forniti dal laboratorio con prestazioni IHC note e che rappresentino tessuti con positività e negatività note.
Consultare le procedure di controllo di qualità descritte nella rispettiva sezione sopra riportata. Tali procedure di controllo della qualità
devono essere ripetute per ogni nuovo lotto di anticorpo o ogniqualvolta venga apportata una modifica ai parametri del saggio. Opzioni
per la risoluzione di potenziali problemi, relative cause e interventi correttivi consigliati sono descritti nella tabella 10.
Interpretazione del punteggio - NSCLC
Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Sul vetrino
colorato per PD-L1 devono essere presenti un minimo di 100 cellule vitali perché il campione si possa considerare valido per la
valutazione di PD-L1.
Per assegnare correttamente un punteggio ai campioni colorati con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è essenziale che siano valutate le
cellule corrette, che sia identificata la giusta localizzazione cellulare e che l'intensità della colorazione sia interpretata in modo
appropriato. La valutazione dei vetrini deve essere eseguita da un patologo per mezzo di un microscopio ottico. Per la valutazione della
colorazione immunoistochimica e del punteggio, è consigliato l'impiego di un obiettivo con ingrandimento di 10-40x. Deve essere
inclusa nel punteggio ogni colorazione percepibile delle membrane di cellule tumorali.
Attribuire un punteggio alla colorazione parziale o completa della membrana cellulare (≥1+) percepita come distinta dalla colorazione
citoplasmatica. La colorazione citoplasmatica deve essere considerata aspecifica ed è esclusa dalla valutazione dell'intensità della
colorazione. Le cellule normali e le cellule immunitarie associate al tumore, quali i linfociti o i macrofagi infiltranti, non devono essere
incluse nel punteggio per la determinazione della positività di PD-L1. I campioni di tumore colorati con NCR devono mostrare
colorazione specifica 0 e una colorazione di fondo ≤1+.
Il punteggio TPS (Tumor Proportion Score) rappresenta la percentuale di cellule tumorali vitali che mostrano una colorazione di
membrana parziale o totale (≥1+). Il campione deve essere considerato PD-L1 positivo se TPS ≥1% delle cellule tumorali vitali mostra
colorazione di membrana di qualunque intensità (ovvero ≥1+).
Per ogni ciclo di colorazione, i vetrini devono essere esaminati nell'ordine indicato nella tabella 1 per determinare la validità del ciclo di
colorazione e per consentire la valutazione della colorazione del tessuto del campione.
Per ulteriori indicazioni, fare riferimento al documento PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual (Manuale per l'interpretazione di
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).
Ulteriori raccomandazioni per l'interpretazione della colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx
1. Per verificare la colorazione della membrana cellulare, utilizzare un obiettivo con ingrandimento 10-40x.
2. Vari elementi che non costituiscono un target, come cellule immunitarie associate al tumore (ad es. macrofagi) e stroma, possono
altresì colorarsi positivamente per PD-L1, tuttavia non devono essere inclusi nel punteggio.
Tabella 1. Ordine consigliato per la valutazione dei vetrini
Campioni
Principio
Requisiti
1. H&E
Una colorazione con ematossilina
La colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx e quella H&E devono essere
ed eosina (H&E) del campione
eseguite su sezioni seriali provenienti dallo stesso blocco in paraffina del
(componente
tissutale viene analizzata per
campione. Nel campione devono essere presenti un minimo di 100 cellule vitali
fornito dal
prima per valutare l'istologia e il
perché questo si possa considerare valido per la valutazione di PD-L1.
laboratorio)
livello di preservazione del tessuto.
I campioni tissutali devono essere integri, con un buon livello di preservazione
e devono confermare l'indicazione del tumore.
2. Vetrino Control
Il vetrino Control Cell Line Slide
Un vetrino Control Cell Line Slide deve essere sottoposto a colorazione con
Cell Line Slide
sottoposto a colorazione con
Primary Antibody
l'anticorpo primario contro PD-L1
contro PD-L1 in ogni ciclo di colorazione.
(componente
di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx deve
Criteri di accettazione per NCI-H226 (linea cellulare di controllo positiva per PD-L1):
fornito da Dako)
essere esaminato per confermare

Colorazione della membrana cellulare di una percentuale di cellule ≥70%,
il corretto funzionamento di tutti i
con un'intensità della colorazione media ≥2+.
reagenti.

Colorazione aspecifica con intensità <1+.
Il vetrino Control Cell Line Slide
contiene il
pellet di una linea cellulare positiva
per PD-L1 e il pellet di una linea
cellulare negativa per PD-L1.
Criteri di accettazione per MCF-7 (linea cellulare di controllo negativa per PD-L1):

Nessuna colorazione specifica.

Colorazione aspecifica con intensità <1+. Tenere presente che nel pellet
cellulare MCF-7 occasionalmente è possibile osservare la colorazione di
alcune cellule. Si applicano i seguenti criteri di accettazione: la presenza
di un totale di cellule con colorazione caratteristica della membrana
plasmatica ≤10 o una colorazione citoplasmatica con intensità ≥1+ entro i
bordi del pellet cellulare MCF-7 è considerata accettabile.
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Se una delle linee cellulari di controllo non soddisfa tali criteri, tutti i risultati
relativi ai campioni del paziente devono essere considerati non validi.
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3. Vetrini con
tessuto di
controllo positivo
(componente
fornito dal
laboratorio)
Successivamente devono essere
esaminati i vetrini con tessuto di
controllo positivo sottoposti a
colorazione sia con l'anticorpo
primario anti-PD-L1 sia con
Negative Control Reagent. Questi
vetrini consentono di verificare che
il metodo di fissazione e il processo
di smascheramento antigenico
siano efficaci. I controlli basati su
tessuti positivi noti devono essere
utilizzati solo per il monitoraggio
della correttezza delle prestazioni
dei tessuti sottoposti alla procedura
e dei reagenti di test e NON come
ausilio nella formulazione di una
diagnosi specifica dei campioni del
paziente.
I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione
tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e inclusi
prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del paziente.
Per l'interpretazione dei risultati della colorazione, utilizzare campioni integri
poiché cellule necrotiche o deteriorate spesso presentano colorazioni aspecifiche.
I tessuti selezionati per l'uso come controlli positivi devono presentare una
colorazione positiva da debole a moderata quando sottoposti a colorazione con
PD-L1, per consentire la rilevazione di variazioni anche lievi nella sensibilità del
saggio.
Due vetrini con tessuto di controllo positivo devono essere inclusi in ogni ciclo
di colorazione.
Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: si deve riscontrare la presenza
di colorazione marrone della membrana plasmatica. La colorazione aspecifica
deve essere ≤1+.
Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna
colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
4. Vetrini con
tessuto di
controllo negativo
(componente
fornito dal
laboratorio)
5. Vetrino del
tessuto del
paziente
sottoposto a
colorazione con
Negative Control
Reagent
6. Vetrino del
tessuto del
paziente
sottoposto a
colorazione con
l'anticorpo primario
anti-PD-L1
Successivamente devono essere
esaminati i vetrini con tessuto di
controllo negativo (con negatività
per PD-L1 nota) sottoposti a
colorazione sia con l'anticorpo
primario anti-PD-L1 sia con
Negative Control Reagent, per
verificare la specificità della
marcatura dell'antigene bersaglio
con l'anticorpo primario. In
alternativa, è possibile usare
porzioni di tessuto di controllo
positivo come tessuto di controllo
negativo, tuttavia ciò deve essere
verificato dall'utente.
Esaminare i campioni del paziente
sottoposti a colorazione con il
reagente Negative Control
Reagent di PD-L1 IHC 22C3
pharmDx. Questo reagente viene
utilizzato al posto dell'anticorpo
primario e fornisce un ausilio
nell'interpretazione della
colorazione specifica nel sito
dell'antigene.
Infine, esaminare l'intero vetrino dei
campioni del paziente sottoposto a
colorazione con l'anticorpo primario
anti-PD-L1 di PD-L1 IHC 22C3
pharmDx. Per informazioni
specifiche sull'immunoreattività di
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, fare
riferimento alle sezioni Cenni
introduttivi, Limiti e Caratteristiche
di prestazione.
Se i controlli con tessuto di controllo positivo non presentano la colorazione
positiva appropriata, i risultati relativi ai campioni di test devono essere
considerati non validi.
I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione
tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e
inclusi prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del
paziente.
Due vetrini con tessuto di controllo negativo devono essere inclusi in ogni ciclo
di colorazione.
Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: Nessuna colorazione della
membrana nelle cellule tumorali. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna
colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
Se si osserva una colorazione specifica della membrana cellulare nei vetrini
con tessuto di controllo negativo, i risultati relativi ai campioni del paziente
devono essere considerati non validi.
L'assenza della colorazione della membrana cellulare consente di verificare la
marcatura specifica dell'antigene bersaglio con l'anticorpo primario. La
colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
L'intensità della colorazione positiva deve essere valutata nel contesto della
colorazione aspecifica di fondo osservata sul vetrino del paziente trattato con
Negative Control Reagent nello stesso ciclo.
Come per ogni test immunoistochimico, un risultato negativo indica che
l'antigene non è stato rilevato ma non necessariamente che l'antigene era
assente nelle cellule/tessuti analizzati.
Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino del paziente sottoposto alla
colorazione di PD-L1 devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del
punteggio per PD-L1. Nel campione devono essere presenti un minimo di
100 cellule vitali perché questo si possa considerare valido per la valutazione
di PD-L1.
Limiti generali
1. L'immunoistochimica è una tecnica diagnostica multifase che richiede una formazione specifica per quanto riguarda la selezione dei
reagenti appropriati, la scelta dei tessuti, la fissazione, la processazione e la preparazione dei vetrini per immunoistochimica nonché
l'interpretazione dei risultati della colorazione.
2. La colorazione dei tessuti è correlata alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. Procedure
errate di fissazione, congelamento, scongelamento, lavaggio, asciugatura, riscaldamento e sezionamento oppure la contaminazione
con altri tessuti o liquidi possono produrre artefatti, intrappolare l'anticorpo o generare risultati falsi negativi. Risultati incoerenti possono
essere dovuti anche a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto.
3. Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta può compromettere la correttezza dell'interpretazione dei risultati.
4. L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione positiva o della sua assenza deve essere effettuata tenendo in considerazione la
presentazione clinica, la morfologia e altri criteri istopatologici. L'interpretazione clinica di una colorazione o della sua assenza deve
essere integrata da studi morfologici e da controlli adeguati, nonché da altri test diagnostici. La colorazione deve essere interpretata
da un patologo qualificato con un'approfondita conoscenza degli anticorpi, dei reagenti e dei metodi impiegati. La colorazione deve
essere eseguita in un laboratorio autorizzato certificato, sotto la supervisione di un patologo, il quale esaminerà i vetrini colorati e
garantirà l'adeguatezza dei controlli positivi e negativi.
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5. I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) potrebbero
evidenziare una colorazione aspecifica con perossidasi di rafano (7).
6. I reagenti possono provocare reazioni impreviste in tipi di tessuto che non sono mai stati analizzati prima. Non si può escludere
completamente la possibilità di reazioni impreviste anche in tipi di tessuto già analizzati in precedenza, a causa della variabilità
biologica dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. Si invita a documentare le reazioni impreviste e a
comunicarle all'Assistenza tecnica Dako.
7. È possibile che vengano generati risultati falsi positivi a causa del legame non immunologico di proteine o prodotti di reazione con il
substrato. Risultati falsi positivi possono essere causati anche dall'attività della pseudoperossidasi (eritrociti) e dall'attività della
perossidasi endogena (citocromo C) (7).
8. I reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati concepiti per l'ottenimento di prestazioni ottimali. L'ulteriore diluizione dei
reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati possono produrre risultati erronei o discordanti.
Limitazioni specifiche del prodotto
1. Il deterioramento dell'antigene nel tessuto, nel tempo, può provocare risultati falsi-negativi. I campioni devono essere sottoposti a
colorazione entro sei mesi dal montaggio dei tessuti sui vetrini, quando conservati al buio a 2-8 °C (preferibilmente) o a una
temperatura ambiente massima di 25 °C.
2. Per garantire risultati ottimali e riproducibili, la proteina PD-L1 richiede un pretrattamento di smascheramento antigenico quando i
tessuti sono fissati come di routine (in formalina tamponata neutra) e inclusi in paraffina.
3. Non sostituire i reagenti con reagenti di numeri di lotto diversi di questo prodotto o di kit di altri produttori. L'unica eccezione è
rappresentata da EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH 50x, che, se necessario, è disponibile con il codice K8005.
4. Le linee cellulari di controllo sottoposte a colorazione devono essere utilizzate esclusivamente per la convalida del ciclo di
colorazione e non devono essere utilizzate per l'assegnazione del punteggio alla reazione di colorazione nelle sezioni tissutali.
5. L'uso di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su tessuti trattati con fissativi diversi dalla formalina non è stato convalidato.
6. L'uso di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su agoaspirati non è stato convalidato.
Valutazione delle prestazioni cliniche
Il beneficio clinico di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stato esaminato in uno studio clinico randomizzato in aperto, multicentrico, condotto
per valutare la sicurezza e l'efficacia di KEYTRUDA in pazienti affetti da NSCLC in stadio avanzato (9). I pazienti erano PD-L1 positivi in
base a un saggio dello studio clinico (CTA) e hanno mostrato progressione della malattia successivamente al trattamento con
chemioterapia contenente platino. I pazienti con aberrazioni genomiche tumorali di EGFR o ALK hanno mostrato progressione della
malattia durante la somministrazione della terapia approvata dall'FDA per tali aberrazioni prima della somministrazione di KEYTRUDA. I
pazienti sono stati randomizzati (1:1:1) al trattamento con 2 mg/kg (n=344) o 10 mg/kg (n=346) di KEYTRUDA ogni 3 settimane o
75 mg/m2 di docetaxel ogni 3 settimane (n=343). La valutazione dello stato del tumore è stata effettuata ogni 9 settimane. Gli endpoint
primari di efficacia erano la sopravvivenza totale (OS) e la sopravvivenza libera da progressione (PFS) secondo i criteri RECIST di
valutazione della risposta nei tumori solidi versione 1.1 (RECIST 1.1) in base alla valutazione indipendente di radiologi in cieco.
Sulla base del CTA, nello studio sono stati randomizzati in totale 1.033 pazienti affetti da NSCLC. Per valutare l'utilità clinica di
PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, alcuni campioni archiviati da studi clinici sono stati analizzati retrospettivamente con questo saggio presso
un laboratorio di riferimento negli Stati Uniti. Sono stati analizzati retrospettivamente i tessuti tumorali di 529 pazienti su
1.033 utilizzando il saggio PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. I campioni di 413 pazienti sono risultati positivi per l'espressione di PD-L1
(≥1% delle cellule tumorali vitali mostrava colorazione della membrana a una qualunque intensità), mentre i campioni di 94 pazienti
sono risultati negativi per l'espressione di PD-L1 (<1% delle cellule tumorali vitali mostrava colorazione della membrana a qualunque
intensità). Tra questi 413 pazienti con espressione positiva di PD-L1, i campioni provenienti da 163 pazienti presentavano
un'espressione elevata di PD-L1 (≥50% delle cellule tumorali vitali mostrava colorazione della membrana a qualunque intensità).
Il livello di concordanza raggiunto tra il CTA e PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è mostrato nella tabella 2.
Tabella 2: Concordanza tra CTA e PD-L1 IHC 22C3 pharmDx
Tassi di concordanza
PD-L1
Cut-off
CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx
TPS 1%
TPS 50%
Percentuale di concordanza
negativa (intervallo di confidenza
(IC) al 95%)
94,5% [91,4%-96,6%]
98,3% [97,1%-99,0%]
Percentuale di concordanza positiva
(intervallo di confidenza (IC) al 95%)
80,0% [76,9%-82,8%]
73,2% [67,9%-77,9%]
Tra i pazienti randomizzati positivi in base al saggio PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, le caratteristiche demografiche e le atre caratteristiche
basali erano ben bilanciate tra i bracci di trattamento. L'età mediana era di 63 anni (44% di 65 anni di età o più). La maggior parte dei
pazienti era bianca (77%) e di sesso maschile (58%); lo stato delle prestazioni ECOG alla linea di base era 0 (29%) o 1 (71%). Il 78% dei
pazienti era stato o era fumatore. Il 22% dei pazienti presentava istologia squamosa e il 69% non squamosa. Le caratteristiche basali e
demografiche erano parimenti ben bilanciate nei bracci pembrolizumab e docetaxel nella popolazione generale dello studio clinico.
I risultati di efficacia sono riassunti nella tabella 3. KEYTRUDA ha dimostrato di apportare benefici clinici di lunga durata nei pazienti
affetti da NSCLC con espressione positiva di PD-L1 e TPS 1%, che erano amplificati nei pazienti con elevata espressione di PD-L1,
TPS  50%, come determinato mediante PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. L'entità del beneficio era paragonabile a quella osservata nella
popolazione generale dello studio clinico. La tabella 3 riassume gli endpoint principali di efficacia nell'intera popolazione PD-L1 positiva
(TPS  1%) e nel sottoinsieme con elevata espressione positiva di PD-L1 (TPS  50%) per la popolazione generale dello studio clinico
(PD-L1 positivi mediante CTA) e nella popolazione positiva mediante PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Nella figura 1 è riportata la curva di
Kaplan-Meier per l'OS (TPS 1%, determinato mediante PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).
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Tabella 3: Risposta a KEYTRUDA in pazienti affetti da NSCLC trattati in precedenza: popolazione generale dello studio clinico
e pazienti positivi mediante PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: PD-L1 TPS 1% e TPS 50%
Endpoint
KEYTRUDA
2 mg/kg ogni 3 settimane
PD-L1 IHC
Studio clinico
22C3 pharmDx
KEYTRUDA
10 mg/kg ogni 3 settimane
PD-L1 IHC
Studio clinico
22C3 pharmDx
Docetaxel
75 mg/m2 ogni 3 settimane
PD-L1 IHC
Studio clinico
22C3 pharmDx
344
140
346
142
343
131
172 (50%)
0,71
(0,58, 0,88)
<0,001
10,4
(9,4, 11,9)
59 (42%)
0,54
(0,37, 0,78)
<0,001
11,8
(9,6, N/D)
156 (45%)
0,61
(0,49, 0,75)
<0,001
12,7
(10,0, 17,3)
59 (42%)
0,57
(0,39, 0,82)
0,00115
12,0
(8,7, N/D)
193 (56%)
67 (51%)
---
---
--8,5
(7,5, 9,8)
--7,5
(6,3, 9,9)
266 (77%)
0,88
(0,73, 1,04)
0,068
3,9
(3,1, 4,1)
97 (63%)
0,68
(0,50, 0,92)
0,00578
4,9
(4,1, 6,2)
255 (74%)
0,79
(0,66, 0,94)
0,005
4,0
(2,6, 4,3)
103 (73%)
0,79
(0,59, 1,06)
0,05767
4,0
(2,2, 4,6)
257 (75%)
94 (72%)
---
---
--4,0
(3,1, 4,2)
--3,8
(2,2, 4,2)
18%
(14, 23)
24%
(17, 32)
18%
(15, 23)
20%
(14, 28)
9%
(7, 13)
5%
(2, 11)
139
56
151
60
152
47
58 (42%)
0,54
(0,38, 0,77)
<0,001
14,9
(10,4, N/D)
18 (32%)
0,45
(0,24, 0,84)
0,00541
Non raggiunta
(9,3, N/D)
60 (40%)
0,50
(0,36, 0,70)
<0,001
17,3
(11,8, N/D)
19 (32%)
0,29
(0,15, 0,56)
<0,001
Non raggiunta
(8,3, N/D)
86 (57%)
25 (53%)
---
---
--8,2
(6,4, 10,7)
--7,2
(4,4, 8,3)
89 (64%)
0,58
(0,43, 0,77)
<0,001
5,2
(4,0, 6,5)
33 (59%)
0,47
(0,28, 0,80)
0,00221
5,9
(4,2, 9,0)
97 (64%)
0,59
(0,45, 0,78)
<0,001
5,2
(4,1, 8,1)
34 (57%)
0,41 (0,24,
0,70)
<0,001
4,8
(2,8, N/D)
118 (78%)
33 (70%)
---
---
--4,1
(3,6, 4,3)
--3,9
(2,0, 4,3)
30%
(23, 39)
37%
(25, 52)
29%
(22, 37)
28%
(18, 41)
8%
(4, 13)
4%
(1, 15)
TPS 1%
Numero di pazienti
OS
Decessi (%)
Rapporto di rischio*
(IC 95%)
Valore p†
Mediana in mesi
(IC 95%)
PFS‡
Eventi (%)
Rapporto di rischio*
(IC 95%)
Valore p†
Mediana in mesi
(IC 95%)
Tasso di risposta
complessiva‡
ORR %§
(IC 95%)
TPS 50%
Numero di pazienti
OS
Decessi (%)
Rapporto di rischio*
(IC 95%)
Valore p†
Mediana in mesi
(IC 95%)
PFS‡
Eventi (%)
Rapporto di rischio*
(IC 95%)
Valore p†
Mediana in mesi
(IC 95%)
Tasso di risposta
complessiva‡
ORR %§
(IC 95%)
*
†
‡
§
¶
Rapporto di rischio (KEYTRUDA in confronto a docetaxel) basato sul modello dei rischi proporzionali di Cox stratificato
Basato sul test dei ranghi logaritmici stratificato
Valutato mediante revisione centrale indipendente in cieco (BICR) e utilizzando i criteri RECIST 1.1
Tutte le risposte erano risposte parziali
Sulla base dei pazienti con risposta completa o parziale confermata come miglior risposta complessiva
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Sopravvivenza totale (%)
Figura 1: Curva di Kaplan-Meier per la sopravvivenza totale per braccio di trattamento
(TPS 1% mediante PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, popolazione intent-to-treat)
Docetaxel 75 mg/m2 Q3W
MK-3475 2 mg/kg Q3W
MK-3475 10 mg/kg Q3W
n a rischio
Docetaxel 75 mg/m2 Q3W
Tempo in mesi
MK-3475 2 mg/kg Q3W
MK-3475 10 mg/kg Q3W
Sono state condotte analisi aggiuntive di affidabilità per tenere in considerazione l'impatto potenziale di dati mancanti dovuti alla
presenza di pazienti con risultato positivo del saggio PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, ma che potevano essere risultati negativi con il CTA. I
pazienti che presentano tali risultati fanno parte della popolazione destinataria/intent-to-diagnose (ITD) di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx;
tuttavia, sono stati esclusi dallo studio clinico a causa dei risultati negativi del CTA allo screening. Per tenere conto di questi dati
mancanti, è stata condotta un'analisi di sensibilità per capire quale fosse l'intervallo plausibile per il rapporto di rischio (HR) stimato sulla
base del PD-L1 IHC 22C3 pharmDx nelle sottopopolazioni con TPS 1% e TPS 50% in un contesto ITD per verificare la coerenza con
l'HR osservato in base all'arruolamento con il CTA. I risultati dell'analisi di sensibilità dell'HR hanno mostrato che le stime dell'HR sono
affidabili anche tenendo conto di ipotetiche attenuazioni dell'effetto del trattamento in un contesto ITD.
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Valutazione delle prestazioni non cliniche
Sensibilità/specificità analitica
La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stata valutata su 127 casi unici di campioni FFPE di carcinoma polmonare non a
piccole cellule (NSCLC) negli stadi da I a IV utilizzando un lotto di produzione industriale. La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha
evidenziato una colorazione in un intervallo dallo 0 al 100% di cellule tumorali positive e un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3.
Tessuti normali: la tabella 4 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3
relativamente a tessuti normali selezionati. È stata osservata colorazione della membrana plasmatica sulle cellule immunitarie e di origine
epiteliale. È stata osservata colorazione citoplasmatica in alcuni tipi di cellule ma non è stata registrata come colorazione positiva. Tutti i
tessuti analizzati sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina e successivamente colorati con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, secondo le
istruzioni riportate nel presente foglietto informativo. Non sono stati riscontrati risultati inattesi nei tipi di cellule e di tessuti analizzati. La
colorazione osservata è risultata compatibile con la letteratura disponibile per l'espressione IHC di PD-L1 nei tessuti normali (10, 11).
Tabella 4: Reattività dei tessuti normali a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx
Tipo di tessuto
Colorazione positiva della
Colorazione positiva citoplasmatica:
(q.tà testata)
membrana plasmatica:
Elementi del tessuto
Elementi del tessuto
Cellule mesoteliali (2)
0/2
0/2
Cerebrum (3)
0/3
0/3
Cervelletto (3)
0/3
0/3
Cervice (3)
1/3 epitelio
0/3
Colon (3)
2/3 macrofagi
0/3
Cute (3)
0/3
0/3
Esofago (3)
0/3
0/3
Fegato (3)
1/3 macrofagi
0/3
1/3 epatociti
Ghiandola salivare (3)
0/3
0/3
Intestino tenue (3)
0/3
0/3
Ipofisi (3)
1/3 ipofisi anteriore
1/3 ipofisi anteriore
1/3 ipofisi posteriore
1/3 ipofisi posteriore
Mammella (3)
0/3
0/3
Midollo osseo (3)
3/3 megacariociti
3/3 megacariociti
Milza (3)
2/3 macrofagi
0/3
Muscolo, cardiaco (3)
0/3
0/3
Muscolo, scheletrico (3)
0/2
0/2
Nervo, periferico (3)
0/3
1/3 tessuto connettivo/vasi
Ovaio (3)
0/3
0/3
Pancreas (3)
0/3
0/3
Paratiroide (3)
1/3 epitelio ghiandolare
0/3
Polmone (3)
3/3 macrofagi alveolari
0/3
Prostata (2)
2/2 epitelio
0/2
Rene (3)
1/3 epitelio tubulare
0/3
Stomaco (3)
2/3 linfociti
1/3 ghiandole gastriche
1/3 ghiandole gastriche
Surrene (3)
0/3
1/3 cellule della midollare
Testicolo (3)
0/3
0/3
Timo (3)
3/3 epitelio midollare
0/3
Tiroide (3)
0/3
0/3
Tonsilla (3)
3/3 epitelio criptico
0/3
2/3 centro germinale (macrofagi)
Utero (3)
0/3
0/3
Colorazione
aspecifica
0/2
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/2
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/2
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
Tessuti neoplastici: la tabella 5 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3
relativamente a tessuti neoplastici. È stata osservata colorazione della membrana plasmatica sulle cellule immunitarie e di origine
epiteliale. È stata osservata colorazione citoplasmatica in alcuni tipi di cellule ma non è stata registrata come colorazione positiva. Tutti i
tessuti analizzati sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina e successivamente colorati con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, secondo
le istruzioni riportate nel presente foglietto informativo. Non sono stati riscontrati risultati inattesi nei campioni tumorali analizzati. La
colorazione osservata è risultata compatibile con la letteratura disponibile per l'espressione IHC di PD-L1 nei tessuti neoplastici (10-13).
Tabella 5: Reattività dei tessuti neoplastici a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx
Tipo di tumore
Adenocarcinoma
Posizione
Appendice
Cervice, tipo endocervicale
Cistifellea
Colon
Colon, metastatico al fegato
Colon, mucinoso
Esofago
Ghiandola salivare/parotide
GI, metastatico al polmone
Intestino tenue
Mammella, DCIS
Mammella, duttale invasivo
Mammella, duttale invasivo metastatico ai
linfonodi
Ovaio
Positivi per PD-L1/totale
(N=159)
0/1
0/1
1/5
0/5
0/1
0/1
0/1
0/2
0/1
0/2
0/2
0/7
0/1
0/1
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Positivi per PD-L1/totale
(N=159)
0/1
0/1
0/1
0/2
0/3
1/4
0/5
0/4
0/6
0/1
0/1
0/1
0/1
0/3
0/1
0/3
0/3
0/1
Tipo di tumore
Posizione
Astrocitoma
Carcinoma
Ovaio, endometrioide
Ovaio, mucinoso
Ovaio, sieroso
Pancreas
Pancreas, duttale
Polmone
Prostata
Retto
Stomaco
Stomaco, mucinoso
Testa e collo, palato duro
Tiroide, follicolare
Tiroide, follicolo-papillare
Tiroide, papillare
Utero, a cellule chiare
Utero, endometrio
Cervello
Nasofaringeo, NPC
Carcinoma a cellule ad anello con castone
del colon metastatico all'ovaio
Colon
Rene
Vescica
Carcinoma a cellule squamose esofageo
metastatico al linfonodo
Cervice
Cute
Esofago
Polmone
Testa e collo
Utero
Polmone
Surrenale
Cute
2/5
0/2
0/7
1/2
0/2
0/1
0/1
0/1
0/1
Rene
Rene
Testicolo
Fegato
Tiroide
Osso
Cavità pelvica
Fegato
Cervello
Surrenale
Cervello
Tessuto molle, parete toracica
Vescica
0/6
0/1
0/1
0/5
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
Linfonodo
Linfonodo
Linfonodo
Linfonodo
Cervello
Cavità nasale
Retto
Cervello
Peritoneo
Retroperitoneo
Tessuto molle, lombare
Osso
Prostata
Retroperitoneo
Tessuto molle, embrionale
Cavità pelvica
Testicolo
Testicolo
Mediastino
Pancreas
Colon
Intestino tenue
Retto
Retroperitoneo
0/1
0/4
2/2
1/1
0/1
0/1
0/1
0/2
0/1
0/1
0/1
0/2
0/1
0/1
0/1
0/1
0/2
0/2
1/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
Carcinoma a cellule ad anello con
castone
Carcinoma a cellule di transizione
Carcinoma a cellule squamose
Carcinoma a piccole cellule
Carcinoma adrenocorticale
Carcinoma delle cellule basali
Carcinoma delle cellule renali
Cellule chiare
Papillare
Carcinoma embrionale
Carcinoma epatocellulare
Carcinoma midollare
Condrosarcoma
Cordoma
Epatoblastoma
Ependimoma
Feocromocitoma
Glioblastoma
Leiomiosarcoma
Linfoma
Anaplastico a grandi cellule
Diffuso a cellule B
Hodgkin
Non-Hodgkin
Medulloblastoma
Melanoma
Meningioma
Mesotelioma
Neuroblastoma
Neurofibroma
Osteosarcoma
Rabdomiosarcoma
Sarcoma sinoviale
Seminoma
Spermatocitoma
Timoma
Tumore delle cellule insulari
Tumore interstiziale
Tumore neuroectodermico primitivo (PNET)
0/1
0/1
0/1
0/6
0/1
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Ripetibilità/riproducibilità esterna
La ripetibilità e la riproducibilità esterna di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stata valutata presso Dako e in tre siti di analisi esterni. I dati
delle prestazioni sono forniti nelle tabelle 6 e 9. Per gli studi di ripetibilità condotti presso Dako, sono state determinate la percentuale di
concordanza negativa (NPA), la percentuale di concordanza positiva (PPA) e la concordanza totale (OA) per i cut-off ≥1% e ≥50%,
come mostrato nella tabella 6 e nella tabella 7. Poiché gli studi di ripetibilità hanno mostrato una concordanza del 100%, gli intervalli di
confidenza sono stati calcolati utilizzando il metodo Wilson Score, in base al numero di confronti a coppie indipendenti.
Per gli studi di riproducibilità, sono state determinate la media della percentuale di concordanza negativa (ANA), la media della
percentuale di concordanza positiva (APA) e la percentuale di concordanza totale (OA) per i cut-off ≥1% e ≥50%, come mostrato nella
tabella 8 e nella tabella 9. Sono state calcolate le medie delle concordanze in quanto non esiste alcun riferimento naturale per i
parametri di riproducibilità quali il centro e l'osservatore. Gli intervalli di confidenza per le medie delle concordanze sono state calcolate
utilizzando un metodo bootstrap a percentili (si noti che gli studi di ripetibilità non sono stati analizzati utilizzando intervalli di confidenza
bootstrap dato che questi ultimi non possono essere calcolati su dati con discordanza pari a zero).
Tabella 6: Ripetibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in un sito (≥1%)
Studio di ripetibilità
Cut-off diagnostico
Disegno dello studio
% di concordanza (IC 95%)
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8 PD-L1
NPA 100% (91,2-100%)
negativi e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (91,2-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato su
OA 100% (95,4-100%)
ciascuno di sei strumenti Autostainer Link 48.
Inter-operatore
≥1%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8 PD-L1 negativi
NPA 100% (91,0-100%)
e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC
PPA 100% (91,2-100%)
di PD-L1 è stato analizzato da sei analisti sul
OA 100% (95,4-100%)
medesimo strumento Autostainer Link 48.
Inter-giorno
≥1%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8 PD-L1
NPA 100% (91,2-100%)
negativi e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (91,2-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei
OA 100% (95,4-100%)
giorni non consecutivi sul medesimo strumento
Autostainer Link 48.
Inter-lotto
≥1%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8 PD-L1
NPA 98,6% (96,0-100%)
negativi e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 98,6% (95,7-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in tre
OA 98,6% (95,8-100%)
repliche e con ciascuno di tre lotti di reagenti sul
medesimo strumento Autostainer Link 48.
Intra-ciclo
≥1%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8 PD-L1
NPA 100% (91,2-100%)
negativi e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (91,2-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei
OA 100% (95,4-100%)
repliche all'interno di uno stesso ciclo sullo
strumento Autostainer Link 48.
Intra-giorno
≥1%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8PD-L1
NPA 100% (91,0-100%)
negativi e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (91,2-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in
OA 100% (95,4-100%)
due cicli nella stessa giornata e ripetuto per tre
giorni sullo strumento Autostainer Link 48.
NPA=percentuale di concordanza negativa; PPA=percentuale di concordanza positiva; OA=concordanza totale
Inter-strumento
≥1%
Tabella 7: Ripetibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in un sito (≥50%)
Studio di ripetibilità
Cut-off diagnostico
Disegno dello studio
% di concordanza (IC 95%)
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (10 PD-L1
NPA 100% (92,9-100%)
negativi e 6 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (88,6-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato su
OA 100% (95,4-100%)
ciascuno di sei strumenti Autostainer Link 48.
Inter-operatore
≥50%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (10 PD-L1
NPA 100% (92,7-100%)
negativi e 6 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (88,6-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato da sei
OA 100% (95,4-100%)
analisti sul medesimo strumento Autostainer Link 48.
Inter-giorno
≥50%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (10 PD-L1
NPA 100% (92,9-100%)
negativi e 6 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (88,6-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei
OA 100% (95,4-100%)
giorni non consecutivi sul medesimo strumento
Autostainer Link 48.
Inter-lotto
≥50%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (8 PD-L1
NPA 100% (92,6-100%)
negativi e 8 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (92,6-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in tre
OA 100% (96,2-100%)
repliche e con ciascuno di tre lotti di reagenti sul
medesimo strumento Autostainer Link 48.
Intra-ciclo
≥50%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (10 PD-L1
NPA 100% (92,9-100%)
negativi e 6 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (88,6-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei
OA 100% (95,4-100%)
repliche all'interno di uno stesso ciclo sullo
strumento Autostainer Link 48.
Intra-giorno
≥50%
Ciascuno di 16 campioni di NSCLC (10 PD-L1
NPA 100% (88,3-100%)
negativi e 6 PD-L1 positivi) con vari livelli di
PPA 100% (82,4-100%)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in
OA 100% (92,4-100%)
due cicli nella stessa giornata e ripetuto per tre
giorni sullo strumento Autostainer Link 48.
NPA=percentuale di concordanza negativa; PPA=percentuale di concordanza positiva; OA=concordanza totale
Inter-strumento
≥50%
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Tabella 8: Riproducibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in tre siti esterni (≥1%)
Studio di
Cut-off diagnostico
riproducibilità
Disegno dello studio
Inter-sito
≥1%
Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (16 PD-L1
negativi e 20 PD-L1 positivi) con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in
cinque giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è
stata eseguita tra tre siti su un totale di 2700
confronti a coppie.
Intra-sito
≥1%
Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (16 PD-L1
negativi e 20 PD-L1 positivi) con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in
cinque giorni non consecutivi in ciascuno di tre siti
dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per
tre siti su un totale di 1080 confronti a coppie.
Inter-osservatore
≥1%
Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC
(28 PD-L1 negativi e 34 PD-L1 positivi) con diversi
livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato
fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti
dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi
inter-osservatore è stata eseguita tra tre siti su un
totale di 1674 confronti a coppie.
Intra-osservatore
≥1%
Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC
(28 PD-L1 negativi e 34 PD-L1 positivi) con diversi
livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato
fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti
dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi
intra-osservatore è stata eseguita per tre siti su un
totale di 558 confronti a coppie.
ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva; OA=concordanza totale
Tabella 9: Riproducibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in tre siti esterni (≥50%)
Studio di
Cut-off diagnostico
riproducibilità
Disegno dello studio
Inter-sito
≥50%
Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (21 PD-L1
negativi e 15 PD-L1 positivi) con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in
cinque giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è
stata eseguita tra tre siti su un totale di 2700
confronti a coppie.
Intra-sito
≥50%
Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (21 PD-L1
negativi e 15 PD-L1 positivi) con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in
cinque giorni non consecutivi in ciascuno di tre siti
dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per
tre siti su un totale di 1080 confronti a coppie.
Inter-osservatore
≥50%
Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC
(30 PD-L1 negativi e 32 PD-L1 positivi) con diversi
livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato
fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti
dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi
inter-osservatore è stata eseguita tra tre siti su un
totale di 1674 confronti a coppie.
Intra-osservatore
≥50%
Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC
(30 PD-L1 negativi e 32 PD-L1 positivi) con diversi
livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato
fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti
dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi
intra-osservatore è stata eseguita per tre siti su un
totale di 558 confronti a coppie.
ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva; OA=concordanza totale
% di concordanza (IC 95%)
ANA 94,8% (90,3-98,4%)
APA 95,5% (91,2-98,7%)
OA 95,2% (90,8-98,6%)
ANA 96,2% (94,1-97,5%)
APA 96,7% (95,0-97,9%)
OA 96,5% (95,2-97,4%)
ANA 85,8% (79,3-91,8%)
APA 88,2% (82,2-93,3%)
OA 87,1% (81,0-92,6%)
ANA 93,7% (90,0-96,1%)
APA 94,8% (91,6-96,7%)
OA 94,3% (92,0-95,9%)
% di concordanza (IC 95%)
ANA 90,3% (84,4-95,2%)
APA 85,2% (75,6-92,9%)
OA 88,3% (81,4-94,3%)
ANA 91,9% (88,8-94,8%)
APA 87,6% (82,5-92,2%)
OA 90,2% (86,3-93,7%)
ANA 92,6% (87,8-96,7%)
APA 92,8% (88,1-96,8%)
OA 92,7% (88,1-96,8%)
ANA 96,4% (94,0-98,5%)
APA 96,5% (94,3-98,6%)
OA 96,4% (94,3-98,6%)
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Risoluzione dei problemi
Tabella 10: Risoluzione dei problemi
Problema
1. Nessuna colorazione dei vetrini
Possibile causa
1a. Errore di programmazione.
1b. Assenza di reazione con la soluzione
substrato-cromogeno DAB+ (DAB)
1c. Sodio azide in tampone di lavaggio.
2a. Colorazione debole dei vetrini con i
campioni.
2b. Colorazione debole dei vetrini dei
campioni o della linea cellulare positiva
sul vetrino Control Slide fornito da Dako.
3. Colorazione di fondo dei vetrini
eccessiva.
4. Distacco del tessuto dai vetrini.
5. Colorazione specifica del vetrino
eccessivamente intensa.
1d. Deterioramento del vetrino Control
Slide
2a. Utilizzo di un metodo di fissazione
non appropriato.
2b. Smascheramento antigenico
inadeguato.
3a. Paraffina rimossa in modo
incompleto.
3b. Essiccazione dei vetrini durante il
caricamento su Autostainer Link 48.
3c. Legame aspecifico dei reagenti alla
sezione di tessuto.
4. Utilizzo di vetrini per microscopio non
appropriati.
Intervento consigliato
1a. Verificare che il programma PD-L1 IHC 22C3
pharmDx sia stato selezionato per la programmazione
dei vetrini.
1b. Verificare che la soluzione substrato-cromogeno
DAB+ sia stata preparata in modo corretto.
1c. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer
(codice K8007).
1d. Controllare la data di scadenza e le condizioni di
conservazione del kit sull'esterno della confezione.
2a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e
metodi di fissazione approvati.
2b. Verificare che la procedura di pretrattamento
3-in-1 sia stata eseguita correttamente.
3a. Verificare che la procedura di pretrattamento
3-in-1 sia stata eseguita correttamente.
3b. Assicurarsi che i vetrini siano sempre bagnati con
il tampone durante il caricamento e prima di iniziare il
ciclo.
3c. Verificare che la fissazione del campione sia
appropriata e/o valutare l'eventuale presenza di necrosi.
4. Utilizzare Dako FLEX IHC Microscope Slides
(codice K8020) o vetrini caricati (come Fisherbrand
Superfrost Plus).
5a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e
metodi di fissazione approvati.
5b. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer
(codice K8007).
6. Ciò è normale e non influenza la colorazione.
5a. Utilizzo di un metodo di fissazione
non appropriato.
5b. Utilizzo di tampone di lavaggio non
appropriato.
6. La soluzione Target Retrieval
6. Quando riscaldata, la soluzione
Solution appare torbida quando
Target Retrieval Solution assume un
riscaldata.
aspetto torbido.
NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna delle cause sopracitate o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace,
contattare l'Assistenza tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla
preparazione dei campioni sono disponibili nel documento di Dako "Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods"
(Manuale di formazione: metodi di colorazione istochimica) (5) (fornito da Dako).
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