assorbimento intestinale del grasso nel neonato pretermine

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UNIVERSITÀ POLITECNICA DELLE MARCHE
SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA DELLA
FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA
Curriculum:
PATOLOGIE IMMUNOMETABOLICHE, DEGENERATIVE ED INFETTIVE
IX° Ciclo
ASSORBIMENTO INTESTINALE DEL GRASSO
NEL NEONATO PRETERMINE
mo
Referente: Chiar.
Dottorando:
Dr.ssa Lorena Angelini
Prof. P.E. Varaldo
Relatore:
Chiar.mo Prof. Virgilio P. Carnielli
Anno Accademico 2009-2010
INDICE
1.INTRODUZIONE
1.1 lipasi
1
3
1.1.1 lipasi gastrica
3
1.1.2 lipasi pancreatica
4
1.1.3 lipasi stimolata dai Sali biliari
5
1.1.4 metabolismo degli acidi biliari
6
1.2 strategie nutrizionali per aumentare l’assorbimento del grasso nel neonato
9
pretermine
1.2.1 Trigliceridi a media catena
9
1.2.2 Olio di palma
15
1.2.3 Impatto della posizione strutturale dell’acido palmitico
18
2. OBIETTIVO DELLO STUDIO
20
3. MATERIALI E METODI
20
3.1 Soggetti in studio e reclutamento
20
3.2 Metodi analitici
24
3.2.1 Gas-cromatografia
3.3 Analisi statistica
25
27
4. RISULTATI
27
5. DISCUSSIONI E CONCLUSIONI
34
6. BIBLIOGRAFIA
37
Università Politecnica delle Marche
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1 .INTRODUZIONE
L’assorbimento dei grassi alimentari è fondamentale nell’apporto energetico per
la crescita questo è particolarmente vero per quanto riguarda le prime fasi di
sviluppo. Nel neonato, e soprattutto nel neonato di peso estremamente basso
(ELBW), una parte considerevole dell’apporto alimentare di lipidi non viene
assorbita dall’intestino e viene persa con le feci [1] [2] [3] [4].
Questo malassorbimento lipidico determina una perdita energetica cospicua, in
maniera particolare nel neonato ELBW, che necessita di apporti calorici elevati per
mantenere un tasso di crescita il più possibile vicino a quello intrauterino; obiettivo
che difficilmente viene raggiunto stanti le condizioni di malattia e di immaturità
gastrointestinale che non consentono un’adeguato apporto di nutrienti nell’ELBWI.
La maggior parte dei pretermine nati fra le 24 e le 29 settimane di età gestazionale
infatti quando raggiunge un’età gestazionale corrispondente circa al termine della
gravidanza presenta un importante ritardo di crescita [5] [6]. Tale ritardo si associa
con una riduzione dello sviluppo neurointellettivo nelle successive fasi della vita [7]
[8] [9] [10] [11] [12].
I grassi derivanti dalla dieta giocano un ruolo critico nella crescita e nello sviluppo
del neonato e rappresentano sia un’importante risorsa energetica sia i componenti dei
tessuti neuronali e retinici; questi vengono divisi in tre forme: triacilgriceroli,
fosfolipidi ed esteri del colesterolo, i primi costituiscono circa il 98% di tutti i grassi
della dieta nel latte umano o nella formula. La digestione e l’assorbimento dei grassi
della dieta avviene in tre fasi:
1. la solubilizzazione, l’emulsificazione e l’idrolisi del grasso
2. la riesterificazione degli acidi grassi e la secrezione nei chilomicroni linfatici o il
rilascio degli acidi grassi non esterificati nel sistema venoso portale
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3. l’assorbimento degli acidi grassi non esterificati o il trigliceride del chilomicrone
nei tessuti.
Durante la fase digestiva vengono coinvolte le lipasi e i sali biliari necessari per
l’attivazione di tali lipasi, inoltre i sali biliari rendono solubili i lipidi per permetterne
l’assorbimento; le lipasi coinvolte sono la lipasi gastrica, pancreatica e la lipasi del
latte umano. Nell’adulto l’assorbimento del grasso è un processo efficiente in quanto
ne viene assorbito il 95%, il neonato pretermine fra le 32 e le 34 settimane
gestazionali assorbe il 65-75% del totale, il neonato a termine invece assorbe 8590% del totale [13]. L’inefficienza dell’assorbimento del grasso nel neonato
pretermine è legata all’immaturità fisiologica della funzione pancreatica ed epatica,
ciò risulta in ridotti livelli della lipasi pancreatica e dei sali biliari. [14] [15] [16].
La qualità della composizione del grasso, come la lunghezza della catena, il grado di
insaturazione degli acidi grassi del latte materno o formula modula l’efficienza
dell’assorbimento del grasso. Gli acidi grassi insaturi e gli acidi grassi saturi a media
catena (MCT) sono assorbiti in maniera più efficiente rispetto agli acidi grassi saturi
a lunga catena (LCFA) come il C14:0, C16:0 e il C18:0 [17] [18] [19] [20]. Le
caratteristiche del latte materno come la presenza della lipasi stimolata dai sali biliari
[21] [22] [23] e la specifica struttura stereoisomeria dei trigliceridi permette un
migliore assorbimento del grasso rispetto alla formula [19] [24] [25]. L’efficacia
dell’assorbimento del grasso è legata alle modalità di conservazione del latte
materno, i neonati pretermine alimentati con latte fresco assorbono 85-90% del
grasso derivante dalla dieta [26].
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1.1 LIPASI
le lipasi coinvolte nella digestione del grasso posso essere divise in: lipasi gastrica,
pancreatica e del latte materno.
1.1.1 lipasi gastrica
la lipasi gastrica è prodotta dalle ghiandole localizzate nella mucosa gastrica, si tratta
di una glicoproteina il cui peso molecolare è approssimativamente di 52 kilo Dalton
(kD) ed è costituita da 379 residui di aminoacidi con un peso molecolare non
glicosilato di 43.16 kD. Questo enzima è stabile ad un pH compreso tra 2.5 e 6.5
con un optimun di pH di 5.4, è resistente alla proteasi gastrica e non ha bisogno di
cofattori o sali biliari per espletare la propria attività [27] [28] [29].
L’attività della lipasi negli aspirati gastrici è presente nei neonati a 25 settimane di
gestazione e resta costante fino a 34 settimane per poi aumentare di circa il 40%
rispetto al livello precedende e rimane allo stesso livello fino al termine di gestazione
[28]. La produzione di lipasi gastrica nella fase post prandiale nei neonati pretermine
è uguale a quella di adulti nutriti con dieta ad alto contenuto di lipidi (23±5 vs 23±3
UI/kg rispettivamente) ed è più alta rispetto a quella di adulti alimentati con dieta a
basso contenuto lipico (5.2 ± 1.3 UI/kg) in quanto la produzione della lipasi è
stimolata dal contenuto lipidico della dieta [30] [31].
Il sito selettivo dell’indrolisi è la posizione Sn-3 del trigliceride con il rilascio di
acidi grassi liberi e il di gliceride Sn-1,2. Gli acidi grassi polinsaturi a media e lunga
catena del latte sono localizzati principalmente a questa posizione e sono
efficientemente liberati dalla lipasi gastrica [4]
La natura idrofobica della lipasi gastrica permette all’enzima di penetrare nel globulo
di grasso del latte e idrolizzare quindi il trigliceride, questa attività permette la
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digestione della materia grassa del latte attraverso la lipasi pancreatica e la lipasi
stimolata dai sali biliari.
Studi iniziali in vitro hanno indicato che la preincubazione con la lipasi gastrica
porta ad un’aumento di 20 volte l’idrolisi successiva dei trigliceridi nei globuli di
grasso del latte, attraverso la lipasi pancreatica [32]. I prodotti della lipasi gastrica
promuovono l’emulsificazione dei trigliceridi nello stomaco e aumentano l’affinità
della lipasi pancreatica e colipasi alle goccioline di grasso che assicurano
un’efficiente digestione del grasso nel duodeno [32] [33] [34] [35]. La lipasi gastrica
permette l’idrolisi del 3-12% dei grassi della dieta [33]. Nei neonati questa attività è
aumentata del 15-30% [36] e nei bambini pretermine la lipasi gastrica gioca un ruolo
fondamentale nella digestione del grasso come indicato da una più alta escrezione
del grasso nei neonati alimentati con nasodigiunale (23.0 ± 2.9%) rispetto a quelli
alimentati con il sondino nasogastrico
(14.9 ± 1.7%) [37].
1.1.2 lipasi pancreatica
Il succo pancreatico contiene due enzimi che sono attivi nella digestione intestinale.
La colipasi pancreatica lipasi dipendente (CLD) è un polipeptide di 449 aminoacidi
con un peso molecolare di 48 kD e un pH ottimale compreso fra 6.5-8.0 [38]. La
CLD è inibita dai Sali biliari che si trovano nel duodeno, questa inibizione è invertita
dalla colipasi pancreatica, una proteina che è secreta come una procolipasi ed è
attivata dalla tripsina. La colipasi riconosce e lega una molecola di trigliceride in
presenza dei Sali biliari, mentre una lipasi riconosce e lega questo complesso
colipasi-TG. La CLD è molto più attiva contro il substrato emulsionato insolubile
che contro quello solubile ed idrolizza i trigliceridi in posizione Sn 1 e Sn3 liberando
2-monoacilgliceroli e gli acidi grassi liberi [39]. L’attività della lipasi durante la
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piccola età gestazionale (SGA) è più bassa di quella trovata nei bambini prematuri
con appropriata età gestazionale (AGA), questo suggerisce che la lipasi pancreatica
abbia potuto risentire della privazione dei nutrienti in utero [4]. Un’altra lipasi, la
carbossilestere lipasi (CEL), è una glicoproteina di 100 kD e costituisce il 4% del
totale delle proteine nel succo pancreatico di un’adulto, è molto più attiva contro
substrati micellari solubili che contro i substrati emulsionati insolubili. Queste lipasi
sono presenti a basse concentrazioni dopo la nascita e nei bambini pretermine la
concentrazione è più bassa che nei neonati a termine. Durante la prima settimana di
vita, l’attività della lipasi aumenta circa quattro volte nei neonati pretermine, ma
un’aumento verso valori dell’adulto si verifica durante il primo anno di vita [14].
1.1.3 Lipasi stimolata dai Sali biliari
la lipasi del latte materno fu la prima ad essere descritta nel 1953 [40] e da allora la
lipasi del latte umano fu rilevata e caratterizzata.
La lipasi stimolata dai Sali biliari (BSSL) possiede 722 residui di aminoacidi ed ha
un peso molecolare di circa 90 kD. La lipasi stimolata dai Sali biliari sembra essere
un’enzima costitutivo delle ghiandole mammarie in quanto è indipendente dal
volume di latte, l’attività è simile sia durante la lattazione che durante lo
svezzamento [41] [42].
Le caratteristiche dell’enzima (cinetica, concentrazione enzimatica, optimum di pH,
stabilità del pH, ed effetto dei Sali biliari) sono simili indipendentemente dalla durata
della gravidanza o della lattazione. L’attività nel latte è costante e non cambia
durante il giorno o all’interno dell’alimentazione [43].
La nutrizione materna sembra interessare questa attività, il latte di donne malnutrite
ha più bassa attività enzimatica rispetto a quelle meglio nutrite [44]. La BSSL ha un
massimo di attività tra un pH neutrale e alcalino di 7.3-8.6, anche se in realtà il 45____________________________________________________________________
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70% del massimo di attività si sviluppa ad un pH compreso tra 6.2-6.8, questo è il
pH del piccolo intestino superiore del neonato pretermine. Questo enzima è stabile
ad un pH di 3.5 per un’ora, tale proprietà lo rende adatto a sopravvivere nello
stomaco con una piccola perdita di attività [41]. La BSSL è attivata dai Sali biliari
primari, colato e chenodeossicolato, ad una concentrazione trovata nel duodeno dei
bambini pretermine (1-2 mM) che è al di sotto della concentrazione critica micellare.
Il legame tra la BSSL e i Sali biliari protegge l’enzima dall’inattivazione da parte del
calore e dalla proteolisi messa in atto dalla tripsina e chemotripsina [21]. La BSSL
idrolizza i trigliceridi senza specificità di posizione, i principali prodotti sono acidi
grassi liberi che vengono assorbiti più rapidamente dei mono gliceridi in presenza di
basse concentrazioni intraduodenali di Sali biliari come nei nati pretermine [21] [45].
Questa funzione permette alla BSSL di completare l’idrolisi del digliceride e
monogliceride prodotti rispettivamente dalla lipasi pancreatica e gastrica. Un’ altro
ruolo importante della BSSL è la capacità di idrolizzare gli esteri del retinolo perché
l’efficiente assorbimento di questa vitamina richiede la precedente idrolisi. Degli
studi in vitro hanno suggerito che la BSSL potrebbe avere un ruolo per un utilizzo
più efficiente degli acidi grassi polinsaturi a lunga catena del latte umano [46].
L’attività dell’enzima è stabile durante la conservazione del latte a -20°C e tra i 1525°C per 24 ore. Mentre la pastorizzazione del latte permette l’inattivazione della
BSSL che causa un ridotto assorbimento del grasso del 30% [47].
1.1.4 Metabolismo degli acidi biliari
La biosintesi degli acidi biliari inizia nel fegato a partire dal colesterolo, l’acido
colico e chenodesossicolico sono i primari acidi biliari, nell’adulto il rapporto
dell’acido colico sull’acido chenodesossicolico è approssimativamente 1.5:1.0. Gli
acidi biliari primari sono metabolizzati, dall’azione della microflora intestinale, in
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acido deossicolico, litocolico, e ursodeossicolico, chiamati acidi biliari secondari.
Acido colico rappresenta il 40% degli acidi biliari totali, il chenodesossicheolico il
37% e l’acido desossicolico il 20%. Gli acidi biliari sono coniugati nel fegato con la
glicina o la taurina prima di essere escreti nella bile, il rapporto di glicina coniugata
agli acidi biliari e quello di taurina coniugata agli acidi biliari è approssimativamente
3:2 [48] [49].
Gli acidi biliari coniugati sono escreti dal fegato nella bile e vengono concentrati
nella cistifellea a circa un quinto del volume originale, successivamente alla
contrazione della cistifellea la bile è scaricata nel duodeno. Gli acidi biliari ad alte
concentrazioni si aggregano per formare dei complessi molecolari chiamati micelle
che presentano la regione idrofobica orientata all’interno e la regione idrofilica verso
l’esterno. La concentrazione alla quale l’acido biliare monomerico si aggrega a
formare delle micelle viene detta “ critical micellar concentration” (CMC), sotto
condizioni fisiologiche di digiuno la CMC è in un range compreso tra 1-2 mM.
Gli acidi biliari sono assorbiti per la maggior parte nell’ileo, negli adulti normali il
95-98% degli acidi biliari coniugati sono assorbiti attraverso un meccanismo di
trasporto attivo nell’ileo in modo tale che solo il 2-5 % dei sali biliari secreti ogni
giorno viene perso con le feci [13] [48] [49]. La quantità totale di sali biliari
contenuti nella circolazione enteropatica viene chiamata pool di sali biliari.,
nell’adulto è circa 3g, e tale quantità resta costante a causa del meccanismo di
feedback per cui la quantità di sali biliari persi ogni giorno è sostituta dalla sintesi
epatica di nuovi sali biliari [50]. La sintesi degli acidi biliari aumenta
progressivamente durante la gestazione e a 22-26 settimane gestazionali i principali
acido biliari della cistifellea fetale sono la taurina coniugata all’acido biliare colico e
chenodesossicolico[51]; nel feto la coniugazione della taurina è il processo
principale, i coniugati della glicina sembrano essere predominanti durante l’infanzia.
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L’acido colico è predominante alla nascita, entro il primo mese di vita la sintesi
dell’acido chenodesossicolico aumenta e la proporzione fra acido colico e
chenodeossicolico rientra nei valori normali di 1.2:1 [52]. Il metabolismo dell’acido
biliare nei bambini è caratterizzato dall’immaturità dei differenti steps. Il neonato ha
un più basso pool di acido biliare rispetto all’adulto; uno studio, che ha utilizzato la
tecnica della marcatura con isotopi non radioattivi, ha mostrato che la media della
quantità del pool dell’acido colico nei neonati a termine era 290±36 mg/m² mentre il
pool degli adulti di 605±122 mg/m². Il tasso medio della sintesi dell’acido colico nel
bambino è stato trovato essere di 110±20 mg/m²/die rispetto a quello dell’adulto
194±28 mg/m²/die [13]. La quantità del pool di acido biliare del neonato prematuro
era ulteriormente ridotto, approssimativamente, da un mezzo ad un terzo rispetto al
neonato nato a termine [13]. Bohem e collaboratori [16] hanno trovato che la
concentrazione degli acidi biliari nel succo duodenale, misurato durante i primi
sessanta giorni di vita, aumentava significativamente, e di continuo fino alla fine del
periodo di osservazione. Altri steps della circolazione enteropatica sono alterati, in
effetti è stato notato che a digiuno, nel siero, i livelli di acido colico coniugato e
acido chenodesossicolico coniugato nei primi anni di vita sono significativamente
più alti rispetto a quelli dell’adulto sano e gradualmente si riducono fino a
raggiungere i valori dell’adulto alla fine del primo anno [53]. Questi dati
suggeriscono che la capacità di secrezione e la clearance degli acidi biliari del siero
attraverso il fegato è deficitaria e quindi responsabili della colestasi fisiologica. La
bassa quantità del pool di acido biliare e l’incapacità di escrezione spiega la bassa
concentrazione di acido biliare intraluminale trovata nei neonati soprattutto nei
pretermine mentre la concentrazione media totale di acidi biliari nei fluidi duodenali
era 1.8 mM; questo è in contrasto con i livelli medi di 5.3 mM nei neonati a termine,
7.0 mM nei bambini più grandi e 8.5 mM negli adulti [54] [55]. Gli acidi biliari
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giocano un ruolo critico nel promuovere la lipolisi attraverso l’attivazione della
lipasi pancreatica e del latte materno [13] [16] [49]. L’aggregazione degli acidi
biliari nelle micelle è essenziale solo per garantire un’efficiente trasporto e
assorbimento dei nutrienti insolubili nell’acqua. Questo include il prodotto di lipolisi
come gli acidi grassi e monogliceridi e altri lipidi come il colesterolo e le vitamine
solubili A, D, E ,K. Nei neonati pretermine la bassa concentrazione degli acidi biliari
intraluminali non favorisce l’aggregazione per formare le micelle, quindi la
digestione dei grassi alimentari è alterata, eccetto per gli acidi grassi medi e corti che
sono assorbiti in assenza dei sali biliari .
1.2 STRATEGIE NUTRIZIONALI PER AUMENTARE L’ASSORBIMENTO
DEL GRASSO NEL NEONATO PRETERMINE
1.2.1 Trigliceridi a media catena
I trigliceridi a media catena (MCTs) sono acidi grassi saturi con catene di lunghezza
che variano da C6 a C12, sono ottenuti dall’idrolisi e frazionamento dell’olio di
cocco, il preparato MCT contiene C6 dall’1 al 2%, C8 dal 65 al 75%, C10 dal 25 al
35% ed il C12 dal 1 al 2%. Il punto di ebollizione degli acidi grassi a media catena
(MCFAs) è molto più basso (C8:0 a 16,7°C, il C10:0 a 31.3° C) rispetto a quello
degli acidi grassi a lunga catena (LCFAs) (C16:0 ha una temperatura di ebollizione
di 63.1°C), di conseguenza gli MCFAs sono liquidi a temperatura ambiente [56]. Il
latte materno delle madri dei neonati a termine e dei neonati pretermine possono
contenere fino al 10% di MCTs [57] mentre le formule per i neonati pretermine negli
USA contengono il 50% e in Europa percentuali variabili dallo 0 al 25% del grasso
come MCTs. L’aggiunta degli MCTs nella formula dei neonati pretermine è dovuta
ad una migliore digestione e assorbimento rispetto agli LCTs. Gli MCTs sono
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relativamente solubili in acqua e il loro basso peso molecolare rispetto agli LCTs
facilita la digestione attraverso la lipasi e l’assorbimento intestinale perfino in
presenza di bassi livelli di sali biliari e ridotti livelli di lipasi pancreatica [56]. Gli
MCFAs sono principalmente trasportati nel fegato attraverso la vena porta, solo una
piccola quantità di MCFAs viene trovata nei chilomicroni degli MCTs del latte
umano, mentre gli LCFAs e monoacilgliceroli sono riassemblati nel triacilglicerolo
nell’enterocita e secreto nella linfa come componente dei chilomicroni [58]. Studi
che confrontano l’assorbimento del grasso nelle formule dei pretermine, con
aggiunta di MCTs a differenti concentrazioni, hanno evidenziato quasi completo
assorbimento intestinale degli MCFAs [59] [60]. Il confronto tra formule con e senza
MCTs documenta un miglioramento nell’assorbimento del grasso nelle formule con
MCTs [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66]. Per esempio Spencer e collaboratori
hanno studiato 33 neonati pretermine, clinicamente stabili, a 4-5 settimane di età e
hanno trovato un alto assorbimento di grasso dell’83.5% nel gruppo alimentato con il
30% di MCTs confrontato con il solo 71.6% nei neonati alimentati con la formula
contenete 1.4% di MCTs; la loro conclusione è stata che il miglioramento è
largamente dovuto al quasi completo assorbimento del C8:0 e del C10:0 i quali
rappresentano una porzione elevata di grasso nella formula con MCTs [66]. Sebbene
in stessi studi non è stato osservato un differente assorbimento di grasso, tra questi
Hamosh e collaboratori hanno trovato lo stesso assorbimento degli acidi grassi in
venti prematuri appropriati per età gestazionale ad età post natale di 3.13±0.71
settimane (4.33±0.91 settimane) alimentati con formula contenete il 50% 14% e 1,5
% di MCTs [67]. Hanno notato che sia gli MCFAs che LCFAs non saturi erano
idrolizzati nello stomaco dei neonati. Tutto ciò conferma che gli MCTs sono meglio
assorbiti in confronto agli acidi grassi a lunga catena (C16:0. C18:0) e
l’assorbimento degli acidi grassi polinsaturi (C18:1 e C18:2n6) risulta alto [60] [66].
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L’uso degli MCTs nelle formule pretermine riduce la formazione dei saponi
insolubili di calcio e magnesio e quindi aumenta il loro assorbimento [59] [68], così
l’equilibrio del bilancio dei minerali può essere migliorato con l’uso degli MCTs
nelle formule. L’aumento dell’assorbimento del grasso con gli MCTs tuttavia non si
associa ad una aumentata crescita nei neonati pretermine [65] [69]. Whyte e
collaboratori [69] hanno notato che il 46% di MCTs nella formula non consente un
vantaggio nutrizionale nella digeribilità o nella metabolizzazione di energia delle
formule ne una differenza nel bilancio energetico e nell’aumento del tasso di crescita
nei neonati con basso peso alla nascita alimentati con la formula. Il più basso
contenuto di energia degli MCFAs rispetto agli LCFAs (34 Kj vs 39 Kj/g) può
portare solo ad un piccolo vantaggio in termini di aumento di energia, al 7% di
aumento nella digeribilità dei grassi, come riportato da Okamoto e collaboratori [63]
ci si potrebbe aspettare un aumento del 2% dell’energia digeribile, un effetto di
dubbio significato biologico. L’alto effetto termogenico degli MCTs può spiegare la
mancanza di energia disponibile [70] [71]. Gli MCTs sono ossidati più rapidamente
rispetto agli LCTs [72] [73] [74] [75]. Nel fegato gli MCTs attraversano la
membrana mitocondriale più facilmente degli LCTs grazie all’indipendenza del
sistema di trasporto della carnitina; recenti studi hanno portato alla luce che la
carnitina gioca un ruolo fondamentale nel metabolismo degli MCTs della dieta
nell’uomo [76] [77]. Nei mitocondri gli MCTs vengono β-ossidati, tuttavia l’alta
concentrazione degli MCTs nella formula pretermine impedisce la completa
ossidazione mitocondriale. Sulkers e collaboratori usando la tecnica degli isotopi
stabili hanno visto che le formule contenenti il 40% di C8:0 e C10:0 non più del 47%
degli MCTs era ossidato sia nei bambini a termine che in quelli pretermine [78].
L’aumento dell’acetyl CoA risulta in un aumentata ω-ossidazione degli acidi grassi.
Il processo coinvolge il citocromo p-450 nel reticolo endoplasmatico e l’escrezione
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dell’acido di carbossilico (DCA) prodotto nelle urine [79] [80]. L’escrezione del
DCA rappresenta lo 0.7% degli MCTs assunti con la dieta per cui la quantità di
energia persa con le urine è bassa. Attualmente non ci sono evidenze che i valori
trovati nei neonati alimentati con formula contenente il 40% di grassi come MCTs
siano nocivi, la concentrazione del DCA è inoltre più bassa rispetto al valore di DCA
responsabile di effetti neurologici avversi [81] [82] [83]. Alte concentrazioni di 3idrossibutirrato sono state trovate nei neonati alimentati con il 50% contro il 25% di
MCTs nella formula [84], il valore di chetonemia era simile a quello riportato per i
neonati a termine allattati al seno [85]. I chetoni nel corpo giocano un ruolo
importante nel metabolismo dei neonati soprattutto nel cervello dove il loro uso
come substrati per la sintesi del colesterolo della mielina, acidi grassi [86] sono
ossidati ad elevati tassi [87]. Gli acidi grassi a media catena contribuiscono poco al
deposito di grasso nei tessuti, analisi gas cromatografiche degli acidi grassi del
tessuto adiposo dei neonati pretermine alimentati con formula contenente il 44% e il
51 % di MCTs come grassi, ha evidenziato che il C8:0 e il C10:0 sono mal
incorporati nei grassi corporei mentre l’utilizzo del C12:0 aveva indicato una stretta
correlazione con l’apporto della dieta [88].
Un possibile effetto positivo dell’assunzione di MCT è legato alla rapida ossidazione
di una gran quantità di MCTs assunti con la dieta che possono ridurre l’ossidazione
del glucosio e di acidi grassi polinsaturi [89] [90] con la potenziale utilizzazione di
questi metaboliti in altri pathway metabolici come la lipogenesi. L’assunzione degli
MCTs causa una profonda modificazione nel pattern dei lipidi plasmatici e il loro
effetto sul metabolismo degli acidi grassi essenziali è controverso, la capacità dei
neonati pretermine nell’allungare la catena degli MCTs provenienti dalla dieta è
stato messo in evidenza con gli isotopi stabili [91]. I prematuri alimentati con il 4050% di grassi sottoforma di MCTs risultano avere un significativo aumento di
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MCFAs nel plasma maggiormente come acidi grassi liberi o incorporati nei
triacilgliceroli, gli MCTs inoltre sembra che aumentino la lipogenesi degli acidi
grassi saturi a lunga catena e aumenti l’ossidazione del glucosio che a sua volta può
essere responsabile per l’aumento del tasso metabolico e la produzione di calore del
bambino [92] [71]. Studi in neonati pretermine hanno mostrato, ad esempio, che
l’acido stearico è ossidato solo al 50% nelle formule prese dai bambini e che gli acidi
grassi a media catena sono utilizzati per sintetizzare gli acidi grassi polinsaturi a
lunga catena [78] [91] Altri studi hanno evidenziato alti livelli di acido palmitico e
stearico nei lipidi e tessuto adiposo in umani e animali alimentati con MCTs [93]
[94]. Sarda e collaboratori nel 1987 [88] hanno suggerito che gli MCTs non sono
solamente usati come fonte di energia ma hanno anche visto che formule contenenti
circa il 30-40% di MCTs hanno provocato un’aumento di circa il 12.9% di acidi
grassi a media catena che sono immagazzinati nei grassi subcutanei. È stata anche
trovata una più alta concentrazione di acido palmitico nel tessuto adiposo dovuto
all’aumento degli MCTs suggerendo che quest’ultimi partecipano all’allungamento e
alla sintesi dell’acido palmitico, ciò è in linea con i risultati riportati da Carnielli e
collaboratori nel 1994 [91]. Wall e collaboratori [95] hanno usato un porcellino
come modello per suggerire che gli MCTs interferiscono con la sintesi dei PUFA a
lunga catena, in questo studio è stato trovato un aumento della concentrazione
dell’acido palmitico e oleico in tutte le classi lipidiche con diminuzione dell’acido
arachidonico che è importante per la crescita e lo sviluppo dei bambini. Mentre
l’ipotesi che un’alto contenuto di MCT possa diminuire la sintesi dei PUFA a lunga
catena indebolendo il metabolismo degli acidi grassi essenziali non è riportata [90]
[96] [95]. Carnielli e collaboratori [96] hanno studiato gli effetti, di un alto contenuto
di MCT (HCMCT 47% 8:0 + 10:0 mol of fat blend) e basso contenuto di MCT (
LMCT 4.8% 8:0 + 10:0 mol of fat blend), nelle formule, sia sui lipidi del plasma che
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sulla concentrazione degli acidi grassi del plasma e sul metabolismo degli acidi
grassi essenziali in 20 neonati pretermine, alimentati con formula per più di 24
giorni. Nel gruppo degli HMCT sono state trovate, nel plasma, alte quantità di acidi
grassi a media catena. Non c’erano differenze di acido palmitico e oleico nei due
gruppi indicando che la sintesi de novo degli acidi grassi a lunga catena dagli MCTs
ha generato Acetyl CoA nei neonati alimentati con formula HMCT. Inoltre il DHA
dei fosfolipidi del plasma era significativamente più basso nel gruppo HMCT, gli
autori suggeriscono che alti livelli di MCTs potrebbero competere con la betaossidazione perisossomiale che è coinvolta nella retroconversione dei PUFAs a lunga
catena ed anche la sintesi del DHA. Gli autori concludono che l’uso degli MCTs nei
pretermine aumenta la lipogenesi e interferisce con il metabolismo del DHA,
sebbene altri studi suggeriscono che gli MCTs non interferiscono con il metabolismo
degli acidi grassi essenziali [90]. Altri studi hanno valutato l’effetto di una formula
con MCTs( 37% MCTs e 63% LCTs) contro una formula con il 100% di LCTs
andando a studiare la termoregolazione e il sonno di 17 neonati pretermine [97].
Ogni bambino veniva alimentato per tre giorni consecutivi e misurato il cibo
ingerito, tasso metabolico, temperatura e sonno. È stato dimostrato che il gruppo
MCTs aveva un maggior aumento di energia ( 63.3 Kj/Kg/die), tasso metabolico (1.8
Ml O2 consumo/min Kg) temperatura cutanea (0.31°C) e aumentate ore di sonno (52
min) rispetto al gruppo degli LCTs. Nel gruppo degli MCTs si era anche riscontrato
un aumento della massa corporea rispetto al gruppo degli LCTs (16 g/kg vs. 15
g/kg)senza raggiungere però significatività. Gli autori notano che le differenze
nell’assunzione di cibo sono molto probabilmente dovute ad una minore sazietà data
dagli MCTs, a causa di uno svuotamento gastrico più veloce rispetto agli LCTs.
L’aumento della temperatura è forse legato all’aumento del dispendio energetico nel
gruppo MCT. L’aumento delle ore di sonno nel gruppo degli MCTs era attribuito ad
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un risveglio ritardato rispetto a quello degli LCTs. Gli autori hanno correlato questo
risveglio anticipato del gruppo con gli LCTs ad una componente comportamentale
dell’alimentazione ossia i bambini che vengono nutriti con gli LCTs sono meno sazi
per cui si svegliano prima e più volte rispetto al gruppo degli MCTs che dorme più
ore. Tutto ciò ci fa intuire che manipolando i lipidi delle formule possiamo avere
delle implicazioni fisiologiche importanti. Con questo studio di breve durata è
difficile valutare se l’aumento di temperatura, il dispendio di energia e l’ingestione
di cibo avrà un impatto positivo o negativo per il bambino. Gli autori dichiarano che
la formula con LCTs può dare giovamento per ciò che concerne la sazietà e che
invece una formula con MCTs può aiutare il neonato a mantenere la temperatura
corporea. Gli MCTs come maggior fonte di grasso nelle formule dei bambini può
migliorare l’assorbimento del grasso e del calcio rispetto all’olio di palma. Uno
studio ha comparato una formula, per neonati nati con basso peso, con il 38% di
MCTs contro una formula con il 6% di MCTs ed è stato riscontrato un più alto
assorbimento di grasso nel gruppo con contenuto di MCTs al 38% (88% vs79%), è
stato anche visto che c’era un maggior assorbimento di calcio (73% vs 60%) e
magnesio [65] [68]. Altri studi usando l’olio di cartamo e gli MCTs derivanti
dall’olio di soia e di cocco (30% e 28% rispettivamente) hanno riscontrato un
assorbimento di calcio del 57.4% [98], mentre uno studio usando il 60% di olio di
soia e il 40% di olio di cocco hanno visto che l’assorbimento di calcio era del 48.4%
[99].
1.2.2 Olio di palma
L’ olio di palma è un olio vegetale ricco di acido palmitico, l’oleina di palma è una
frazione con un punto di ebollizione più basso dell’olio di palma e contiene il 40% di
acido palmitico e il 43% di acido oleico. Molte formule per bambini che si trovano in
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commercio usano oleina di palma per uguagliare l’acido palmitico ed oleico,
contenuto nel latte umano. Tuttavia, l’acido palmitico nell’oleina di palma è
principalmente concentrato sui siti Sn-1 Sn-3 del trigliceride a differenza dell’acido
palmitico nel latte umano che è prevalentemente esterificato nella posizione Sn-2 o
Beta. L’acido palmitico nelle posizioni Sn-1 e Sn-3 è assorbito meno rispetto alla
posizione Sn-2 e questo avviene sia nei roditori che nei bambini [100] [101] [102]
[103]. Alcuni studi hanno mostrato che quando l’oleina di palma viene usata come
grasso principale, l’assorbimento dei grassi e del calcio è significativamente più
basso di quando non è presente, ciò può essere spiegato dal ridotto assorbimento
dell’acido palmitico e dalla formazione di saponi insolubili calcio-palmitato. In uno
studio incrociato randomizzato dove 11 bambini alimentati con formula contenente
l’oleina di palma (53% della miscela, 24.9% di acido palmitico) contro una formula
contenete 60% di olio di soia , 40% olio di cocco (9.5 % di acido palmico) si è visto
che l’assorbimento di grasso totale era il 4.6% più basso (p<0.001) per il gruppo che
assumeva l’oleina di palma [99]; l’assorbimento di calcio era il 9.6% più basso
(p<0.001) per il gruppo dell’oleina di palma.
In un altro trial con 10 bambini, sono state usate due formule, di cui una consisteva
di oleina di palma (45%) con soia, cocco e olio di cartamo e l’altra invece con olio di
cartamo, cocco e soia [98]. L’escrezione fecale era di 0.44g/kg/die più alta (p<0.001)
nel gruppo dell’oleina di palma, inoltre l’assorbimento del grasso era l’8.5% più
basso (p<0.001) rispetto al gruppo alimentato con formula contenete solo olio di
cocco, di soia e cartamo. Questa riduzione dell’assorbimento del grasso era, molto
probabilmente, dovuta al ridotto assorbimento di acido palmitico e stearico.
L’escrezione del calcio fecale era 16mg/kg/die (p<0.001) nel gruppo con l’oleina di
palma, inoltre l’assorbimento di calcio sempre in tal gruppo era il 19.9% più bassa
rispetto all’altro gruppo. Gli effetti della riduzione dell’assorbimento del calcio con
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l’oleina di palma sono stati legati a degli effetti clinici come la ridotta
mineralizzazione delle ossa. E’ stato inoltre effettuato uno studio su 128 bambini
alimentati con formula contenente il 45% di oleina di palma contro una formula
contenete olio di cartamo, cocco e soia per sei mesi [104].dove veniva appunto
valutata a zero, tre e sei mesi il contenuto di minerali nelle ossa (BMC) e la densità
di minerali nelle ossa (BMD). Il BMC e il BMD erano simili tra i due gruppi
all’inizio dello studio, ma a 3 mesi, il BMC per il gruppo dell’oleina di palma era
143.8 g rispetto ai 158.2g dell’atro gruppo, questo rappresentava un miglioramento
del 10% (p=0.002).
A sei mesi, il BMC per il gruppo dell’oleina di palma era 207.8g contro 224.1g,
anche qui un miglioramento del 7% (p=0.003). A tre mesi il BMD per il primo
gruppo era 0.251g/cm² contro 0.268g/cm² per il gruppo olio di cartamo, cocco, soia
rappresentando un miglioramento del 6% (p=0.001). A sei mesi il BMD era
rispettivamente 0.290g/cm² contro 0.304g/cm² con un miglioramento del 4%
(p=0.01).
In un altro studio sono stati dimostrati effetti simili sulla riduzione di accrescimento
della massa ossea per via dell’oleina di palma [105]; in questo studio sono stati
studiati tre gruppi, uno che veniva allattato al seno, un gruppo riceveva oleina di
palma e l’ultimo olio di palma libero per sei mesi. È stato trovato che il gruppo
allattato al seno aveva più alta BMC rispetto al gruppo dell’oleina di palma passato il
periodo di assunzione. A tre e sei mesi in seguito, nel momento in cui i neonati
allattati al seno iniziavano ad essere nutriti con formula a base di oleina di palma
l’accrescimento delle ossa in questo gruppo diminuiva; sei mesi dopo, il gruppo che
originariamente era allattato al seno (che dopo questo periodo di tempo aveva
consumato oleina di palma) e il gruppo dell’oleina di palma aveva l’11.5% di
diminuzione del BMC rispetto al gruppo dell’olio di palma originale. Una recente
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review ha riportato l’effetto negativo dell’oleina di palma sull’assorbimento del
calcio e di grasso nelle formule [106]. In questa review sono riportati nove studi in
cui sono state utilizzate formule con oleina di palma e non, in alcune è stato aggiunto
il beta-palmitato come fonte di grasso. In questi studi è stato visto che l’oleina di
palma era associata, con un impatto significativamente negativo (p<0.05) sul
l’assorbimento del grasso, dell’acido palmitico e del calcio. L’assorbimento
dell’acido palmitico e del calcio sembra essere più alto nelle formule prive di oleina
di palma, mentre il contenuto di minerali nelle ossa era significativamente più basso
con formule contenenti oleina di palma. Questi studi mostrano l’effetto negativo
dell’oleina di palma sullo sviluppo delle ossa nel primo periodo di vita; in uno studio
è stato mostrato che dopo 4 anni, in 178 bambini, l’ BMC e BMD di bambini
alimentati esclusivamente con formule contenenti oleina di palma non era differente
dai bambini allattati solo al seno o nutriti con formule senza oleina di palma [107].
1.2.3 impatto della posizione strutturale dell’acido palmitico
Nel latte umano l’acido palmitico è veramente abbondante e rappresenta circa il 2025% degli acidi grassi totali ed è principalmente esterificato per il 60-70% in
posizione Sn-2 (β) del trigliceride (β-palmitato). Questa posizione dell’acido
palmitico nel latte umano consente dei benefici nutrizionali per i bambini
promuovendo l’assorbimento dei minerali, assorbimento del grasso e rende le feci
meno dure [108] [103] [109] [110].
La struttura chimica degli acidi grassi saturi a lunga catena nei trigliceridi delle
formule è differente dal latte umano. Nel latte materno l’acido palmitico esiste
principalmente in posizione Sn-2 (β-posizione) mentre gli oli vegetali sono
principalmente esterificati in posione Sn-1 e Sn-3 (α-palmitato). La lipasi pancreatica
rilascia gli acidi grassi in posizione Sn-1,3 dei trigliceridi per produrre acidi grassi
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liberi e 2-monogliridi. Quando l’acido palmitico è presente in posizione Sn-1 o Sn-3,
può essere facilmente attaccato dagli enzimi per formare acidi grassi liberi i quali
possono legarsi con i minerali come calcio e magnesio e formare dei saponi
insolubili. Piuttosto che essere assorbiti, questi saponi insolubili di acidi grassi sono
escreti nelle feci che divengono più dure con minore perdita di feci e calcio. Il 2monogliceride è meglio assorbito rispetto agli acidi grassi liberi perché forma una
miscela micellare con gli acidi biliari impedendo la formazione di saponi insolubili
con calcio e magnesio. Degli studi hanno dimostrato che l’assorbimento dell’acido
palmitico del latte umano è più alto di quello presente nelle formule [19] [111] [112]
[7] [87] [88]. In uno studio su neonati a termine è stato visto che usando una formula
con grassi derivanti dal lardo (contente 85% di acido palmitico in posizione Sn-2),
l’acido palmitico esterificato in posizione Sn-2 del grasso della dieta era meglio
assorbito del grasso esterificato in posizione Sn1-3 [111] [102]. Tuttavia, Verkade e
collaboratori [2][3] [90] [91] non ha trovato un miglioramento nell’assorbimento del
grasso nel neonato pretermine alimentato con formula, contenente grasso modificato
rispetto alle formule standard. Studi recenti [112] [108] [103] [109] in neonati a
termine e non hanno stabilito che usando trigliceridi sintetici con struttura isomerica
simile a quelli del latte umano, aumenta significativamente l’assorbimento intestinale
dei maggior acidi grassi saturi (acido miristico palmitico e stearico) e nei neonati a
termine anche l’assorbimento totale del grasso. Bambini alimentati con β-palmitato
avevano più alti livelli di acido palmitico nei trigliceridi del plasma rispetto ai
neonati alimentati con α-palmitato [113] [114].
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2.OBIETTIVO DELLO STUDIO
Questo studio è parte di uno studio multicentrico prospettico randomizzato crossover, doppio cieco, BSSL-020 supportato dalla ditta farmaceutica biovitrum,
effettuato su neonati pretermine per confrontare l’assorbimento del grasso e la
crescita con l’aggiunta della lipasi stimolata dai sali biliari ricombinante (rhBSSL).
Abbiamo misurato la quantità totale di grasso fecale, gli acidi grassi fecali, i lipidi
del plasma e la composizione degli acidi grassi dei fosfolipidi e trigliceridi in neonati
pretermine alimentati sia con rhBSSL che senza. La formula è stata fornita dalla ditta
Ordesa .
3.MATERILI E METODI
3.1 soggetti in studio e reclutamento
In questo studio abbiamo analizzato i dati dei neonati pretermine reclutati dai tre dei
cinque reparti di terapia intensiva neonatale che hanno partecipato a questo studio; i
centri coinvolti sono il reparto di Neonatologia dell’ospedale “G salesi” di Ancona,
la Neonatologia del policlinico gemelli di Roma e la neonatologia del Policlinico
Universitario di Padova; lo studio è stato effettuato nel periodo che va da Marzo
2008 a aprile 2009. I neonati pretermine nati ad un’età gestazionale inferiore alle 32
settimane e alimentati esclusivamente con la formula sono stati arruolati dopo
consenso informato di entrambi i genitori. I neonati che ricevevano un’altra formula
precedentemente all’arruolamento sono stati fatti passare dalla formula che stavano
prendendo a quella dello studio il giorno dell’arruolamento. I criteri di esclusione
dallo studio erano:
- neonati che ricevevano nutrizione parenterale
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- neonati che ricevevano latte fortificato
- neonati sotto ventilazione meccanica
- neonati piccoli per l’età gestazionale
- neonati che ricevevano FiO2 > 30%
- neonati sotto fototerapia
- neonati con emmoragie intra ventricolari di III o IV grado, meningiti o idrocefalo,
leucomalacia periventricolare
- dismorfismi o malattie congenite che incidevano sulla crescita e lo sviluppo
- neonati con PDA ( dotto arterioso persistente)
- evidenze cliniche di sepsi
- documentate infezioni congenite (CMV)
- presenza di enterocolite necrotizzante
- emorragie polmonari
- trattamento con corticosteroide, eccetto idrocortisone
- arruolamento in altri studi clinici
le caratteristiche cliniche sono riportate in tabella 1.
Tabella 1. Caratteristiche cliniche dei 25 neonati pretermine
Characteristiche
M±SD
Età Gestazionale (giorni)
Peso nascita (g)
Giorni di vita all’entrata dello
studio
Quantità di latte (ml•kg-1•day-1)
207±7
1225±287
23±10
164±3
I neonati erano randomizzati a ricevere formula con rhBSSL in 0.15 g/l o formula
senza rhBSSL per i primi sette giorni. Dopo un periodo di wash-out di due giorni il
paziente veniva fatto passare all’altro trattamento per ulteriori sette giorni. La
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formula data nello studio era fornita dalla Ordesa, la miscela lipidica della formula
lattea conteneva diversi oli vegetali (olio di palma, olio di girasole, olio di cocco,
olio di soia), la composizione ed il profilo degli acidi grassi sono riportati in tabella 2
e 3. La quantità di formula che i neonati dovevano ricevere era determinata pesando i
biberon o le siringhe nel caso di alimentazione con sondino naso-gastrico. Il bilancio
metabolico era ottenuto con la raccolta delle feci durante gli ultimi tre giorni di ogni
periodo di trattamento. L’inizio e la fine della raccolta delle feci erano identificati
mediante il rosso carminio. Il rosso carminio veniva somministrato prima del pasto
delle dodici il giorno quattro e sette di ogni periodo. Le feci erano raccolte
includendo la prima evacuazione con il rosso carminio ed escludendo l’ultima con
rosso carminio approssimativamente tre giorni dopo per ogni periodo di trattamento.
Abbiamo analizzato 5-10 mg di feci raccolte gli ultimi tre giorni di ogni periodo di
trattamento, e 0,2 ml di plasma anti coagulato con EDTA. La separazione del plasma
era ottenuta centrifugando il sangue contenuto nella provetta con EDTA a 1200 rpm
per 10 minuti Il plasma utilizzato per questa analisi era quello prelevato in eccesso
rispetto alle esigenze cliniche di routine.
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Tabella 2. Composizione della formula Sanor preterm (Ordesa)
Nutrienti
Energia
(kJ)
(Kcal)
Proteine (g)
Siero latte (g 65%)
Caseina (g 35%)
Carboidrati (g)
Lattosio
Malto destrina
Grassi (g)
Acido Linoleico (mg)
Acido Linolenico (mg)
Acido Arachidonico (mg)
Acido Docosaesaenoico(mg)
Taurina (mg)
L-Carnitina (mg)
100 ml
339
81
2.3
1.5
0.8
8.7
6.5
2.2
4.1
689
62
20.5
14.4
5.1
2.7
Tabella 3. Profilo degli acidi grassi della formula Sanor preterm (Ordesa)
Acidi grassi
C 8:0
C 10:0
C 12:0
C 14:0
C 16:0
C 16:1
C 18:0
C 18:1 trans
C 18:1 cis
C 18:2
C 20:0
C 18:3
20:4n-6
22:6n-3
Other
18:2/18:3
Saturated
Monoinsaturi
Poliinsaturaturi
%totale acidi grassi
0.5
0.5
7.2
3.0
22.3
0.0
3.3
0.0
40.1
16.6
0.0
1.4
0.5
0.35
4.1
12.1
36.9
40.1
23.0
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3.2 metodi analitici
I campioni di feci (5-10mg) stati addizionati con 100µl di standard interno C9-C17
(acido nonanoico ed eptadecanoico) direttamente metilati con HCL-MeOH (Merck
Milano) e gli esteri metilici degli acidi grassi estratti con esano. Un µl della miscela
è stato iniettato in gascromatografo (modello trace-GC Ultra Thermo Finnigan) con
iniettore operante in modalità splitless (280°C) e gli esteri metilici sono stati
quantificati con rivelatore fid (290°C) dopo separazione in colonna omegawax, 30m
x 0.25mm i.d. x 0.25um f.t (Supelco, milano Italy), utilizzando elio come carrier. Il
gascromatografo utilizzava il seguente programma di temperatura: T° iniziale 60°C
(3min), prima rampa da 20°C/min fino
200°C (20 min), seconda rampa da
0,4°C/min fino a 205°C (10 min), terza rampa da 0,1°C/min fino a 208°C (2 min),
quarta rampa 3°C/min fino a 213°C (10 min), quinta rampa 30°/min fino a 240°C
(18 min). Le aree dei picchi sono state calcolate con il software Crhomcard (Thermo
Finnigan). Gli acidi grassi sono stati identificati confrontando il loro tempo di
ritenzione con una miscela standard (NuCheck Prep, Elysian MN).
Per l’analisi delle classi lipidiche i lipidi plasmatici sono stati estratti da 200 µl di
plasma secondo il metodo descritto da Folch [115]], dopo aggiunta di acidi grassi
dispari come standard interni. Le varie classi lipidiche sono state isolate con la TLC,
una tecnica cromatografia adatta per l’esecuzione di valutazioni qualitative. I
fosfolipidi e i trigliceridi sono stati trasesterificati con HCL-MeOH (Merck Milano)
e gli esteri metilici degli acidi grassi estratti con esano. Anche in tal caso la
separazione e l’identificazione dei vari acidi grassi è stata effettuata con le stesse
modalità descritte sopra per le feci.
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3.2.1 Gas cromatografia
La gas-cromatografia è una tecnica cromatografia, impiegata a scopo analitico, che si
basa sulla diversa ripartizione di diverse sostanze tra una fase stazionaria e una fase
mobile, in funzione dell’affinità di ogni sostanza con la fase stazionaria. Le
caratteristiche che hanno fatto della gascromatografia una tecnica di larghissimo uso
possono essere così riassunte:
- tempi di analisi molto ridotti
- possibilità di separare, operando nelle opportune condizioni, qualsiasi miscela di
sostanze
- possibilità di effettuare analisi in serie, in quanto la stessa colonna può essere
rigenerata di continuo dal gas di trasporto
- alta sensibilità (quantità di sostanza analizzabile 1O-5 - 1O-12 g).
Le analisi gas-cromatografiche sono applicabili soltanto a sostanze volatili o
comunque rese tali e vengono realizzate con il gas cromatografo. In figura 1 viene
riportato lo schema essenziale di un gascromatografo.
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La bombola contiene il gas che costituirà la fase mobile (carrier), questo viene
purificato tramite alcune trappole prima di essere inserito in colonna.
La colonna cromatografica contenente la fase stazionaria è posta all'interno di una
camera opportunamente termostata allo scopo di tenere in fase gassosa i vari
costituenti della miscela da separare. Tramite l'iniettore s’introduce la miscela da
analizzare in colonna, questa può essere iniettata in fase gassosa, se la miscela è un
gas, oppure solubilizzata in un opportuno solvente se la miscela da analizzare è
liquida o solida. Alla fine della colonna viene posto un rivelatore in grado di
evidenziare le varie sostanze che fuoriescono in tempi diversi emettendo un segnale
con una intensità proporzionale alla loro concentrazione, il segnale viene registrato
da uno strumento che darà così luogo al cromatogramma (figura 2)
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Fig. 2: schema di un cromatogramma
3.3 analisi statistica
I dati sono stati espressi come medie e deviazioni standard e analizzati con il T-Test
per dati appaiati, la significatività è stata considerata a 0.05. Tutte le analisi
statistiche sono state fatte utilizzando il programma SPSS ( versione 15.0; SPSS Inc,
Chicago, IL) e microsoft EXCEL (versione 2000; microsoft Corp, Redmond, WA)
software.
4.RISULTATI
Per questo studio BSSL-020 sono stati arruolati 32 pazienti dai cinque centri
partecipanti allo studio. Per questo studio secondario nei tre centri principali sono
stati reclutati 25 pazienti. Noi abbiamo collezionato campioni di feci e di plasma
durante il periodo di trattamento. per quanto riguarda le feci abbiamo arruolato 21
pazienti, per quanto riguarda il plasma invece 18 pazienti in quanto il resto dei
campioni era inadeguato allo studio. La quantità di formula espressa come ml·Kg1
·day-1 era costante nei due periodi del trattamento per ogni neonato.
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Il contenuto del grasso nelle feci (espresso come mg di grasso/g di feci) era
significativamente più basso quando il bambino riceveva la formula con rhBSSL
(formula B) rispetto a quando erano alimentati con formula senza rhBSSL (formula
A,placebo) (331.54±83.06 mg/g vs 375.13±102.80 mg/g, p=0.045). Abbiamo
analizzato la concentrazione fecale dei maggiori acidi grassi (tabella 4). La
percentuale di alcuni acidi grassi saturi era significativamente aumentata nel gruppo
rhBSSL rispetto al Placebo (14:0: 4.70±0.54 vs 4.43±0.48 mol%, p=0.047; 16:0:
42,06±8.15 vs 37,52±8.11 mol% , p= 0.009; 18:0: 10.88±2.52 vs 9.18±2.35 mol% ,
p=0.005; 20:0: 0.56±0.13 vs 0.45±0.11 mol%, p= 0.003; 22:0: 0.51±0.13 vs
0.39±0.096 mol%, p=0.002; 23:0: 0.070±0.019 vs 0.050±0.013 mol%, p=0.000;
24:0: 0.21±0.06 vs 0.17±0.04 mol%, p=0.014; 21:0: 0.016±0.005 vs 0.013±0.003
mol%, p=0.026). La concentrazione degli acidi grassi monoinsaturi non era
differente tra i due gruppi solo il 16:1n-7e il 16:1n-9 erano più bassi nel gruppo
rhBSSL (0,07±0.03 vs 0,09±0.02 mol%, p=0.011 e 0.021±0.009 vs 0.028±0.01
mol%, p=0.003 rispettivamente). Mentre per quanto riguarda gli acidi grassi
polinsaturi
l’acido
linoleico,
linolenico
e
arachidonico
(ARA)
erano
significativamente più bassi nel gruppo rhBSSL che in quello placebo (18:2n-6:
6.05±3.28 vs 8.91±3.61, p=0.007; 18:3n3: 0.28±0.16 vs 0.45±0.23, p=0.011; ARA:
0.19±0.12 vs 0.29±0.14 mol% p=0.026), anche l’acido docosaesanoico (DHA) era
più basso nel gruppo rhBSSL ma senza significatività. In tabella 5 sono stati riportati
i valori assoluti degli acidi grassi, espressi come mg di acidi grassi/g di feci. Per gli
acidi grassi menzionati sopra, il risultato era simile a quello trovato considerando la
percentuale degli acidi grassi, abbiamo notato però che il contenuto di alcuni acidi
grassi in particolare il DHA e l’acido eicosapentaenoico (EPA) era più basso quando
la formula era supplementata con la rhBSSL (22:6n-3: 0,49±00,47 vs 0,83±0,67
mg/g, p=0.046; 20:5n-3: 0,36±0,17 vs 0,45±0,20 mg/g, p=0.026).
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Tabella 4. Concentratione dei principali acidi grassi fecali dei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula B
(rhBSSL) 1
P2
Acidi Grassi
Formula A (Placebo) Formula B ( rhBSSL)
8:0
0.28±0.087
0.32±0.098
0.094
10:0
0.5±0.50
0.5±0.10
0.967
11:0
0.002±0.0028
0.0025±0.0028
0.731
12:0
4.72±1.13
5.18±1.37
0.247
13:0
0.014±0.006
0.156±0.008
0.448
14:0
4.43±0.48
4.70±0.54
0.047
14:1n-5
0.007±0.002
0.008±0.003
0.228
15:0
0.06±0.01
0.07±0.01
0.060
16:0
37.52±8.11
42.06±8.15
0.009
16:1n-7
0.09±0.02
0.07±0.03
0.011
18:0
9.18±2.35
10.88±2.52
0.005
18:1n-9
26.91±6.30
23.59±9.21
0.118
18:1n-7
0.57±0.29
0.55±0.28
0.710
18:2n-6
8.91±3.61
6.05±3.28
0.007
18:3n-6
0.057±0.018
0.051±0.013
0.075
18:3n-3
0.45±0.23
0.28±0.16
0.011
20:0
0.45±0.11
0.56±0.13
0.003
20:1n-9
0.17±0.02
0.21±0.18
0.351
20:2n-6
0.016±0.010
0.013±0.0096
0.158
20:3n-6
0.041±0.016
0.034±0.011
0.042
20:4n-6
0.29±0.14
0.19±0.12
0.026
20:5n-3
0.10±0.028
0.09±0.032
0.074
22:0
0.39±0.096
0.51±0.13
0.002
22:1n-9
0.035±0.025
0.036±0.031
0.861
22:2n-6
0.003±0.005
0.002±0.003
0.295
22:6n-3
0.16±0.10
0.10±0.08
0.054
23:0
0.050±0.013
0.070±0.019
0.000
24:0
0.17±0.04
0.21±0.06
0.014
24:1n-9
0.031±0.021
0.029±0.011
0.691
17:1
0.022±0.008
0.021±0.011
0.604
21:0
0.013±0.003
0.016±0.005
0.026
16:1n-9
0.028±0.01
0.021±0.009
0.003
18:1n-9 OH
0.13±0.18
0.11±0.26
0.719
18:0 OH
4.00±3.83
3.26±3.87
0.554
1
2
Values are means ± SD, mol%
Paired sample T-Test
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Tabella 5. valori assoluti dei principali acidi grassi dei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula B
(rhBSSL) 1
Acidi grassi
Formula A (Placebo) Formula B (rhBSSL)
P2
8:0
0.57±0.09
0.57±0.08
0.847
10:0
1.35±1.02
1.16±0.80
0.411
11:0
0.004±0.006
0.005±0.005
0.629
12:0
13.96±5.74
13.32±4.95
0.688
13:0
0.04±0.001
0.04±0.002
0.406
14:0
14.55±4.13
13.48±3.13
0.244
14:1n-5
0.02±0.001
0.02±0.009
0.666
15:0
0.22±0.04
0.21±0.04
0.404
16:0
134.73±31.13
133±28.42
0.804
16:1n-7
0.06±0.02
0.04±0.02
0.009
18:0
35.01±9.96
37.25±8.62
0.263
18:1n-9
107.81±40.68
86.20±42.66
0.034
18:1n-7
2.16±0.7
1.85±0.71
0.134
18:2n-6
35.30±21.72
22.75±15.53
0.034
18:3n-6
0.22±0.11
0.17±0.06
0.022
18:3n-3
1.87±1.25
1.04±0.77
0.014
20:0
1.95±0.59
2.14±0.56
0.158
20:1n-9
0.74±0.28
0.86±0.85
0.509
20:2n-6
0.07±0.04
0.05±0.04
0.068
20:3n-6
0.18±0.08
0.13±0.06
0.018
20:4n-6
1.29±0.87
0.79±0.62
0.027
20:5n-3
0.45±0.20
0.36±0.17
0.026
22:0
1.86±0.59
2.13±0.69
0.074
22:1n-9
0.74±0.28
0.15±0.13
0.000
22:2n-6
0.01±0.02
0,01±0,01
0.382
22:6n-3
0.83±0.67
0.49±00.47
0.046
23:0
0.24±0.07
0.30±0.10
0.008
24:0
0.89±0.34
0.99±0.32
0.237
24:1n-9
0.15±0.10
0.13±0.05
0.335
17:1
0.08±0.04
0.07±0.04
0.347
21:0
0.05±0.01
0.06±0.02
0.171
16:19
0.09±0.04
0.07±0.03
0.000
18:19 OH
0.56±0.76
0.37±0.81
0.235
18:0 OH
15.83±16.49
11.21±14.46
0.319
1
Values are means ± SD, mg/g
2
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La concentrazione dei fosfolipidi del plasma era differente tra i due gruppi
(157.02±35.15 vs 155.22±29.20 mg/dl, p=0.82). Neppure la concentrazione dei
trigliceridi plasmatici era significativa tra il gruppo placebo e quello rhBSSL
(57.32±33.61 vs 57.65±32.94 mg/dl, p=0.95). L’aggiunta della rhBSSL alla formula
lattea ha determinato cambiamenti statisticamente significativi nella concentrazione
del DHA e ARA dei fosfolipidi plasmatici. Il DHA e ARA dei fosfolipidi del plasma
erano significativamente più alti nel gruppo la cui formula era supplementata con la
rhBSSL rispetto al gruppo con formula senza supplementazione (22:6n-3: 2.98±0.55
vs 2.72±0.45 mol% p=0.031; 20:4n6: 10.41±0.73 vs 9.92±1.14 mol% p=0.017). I
dati sui fosfolipidi e trigliceridi del plasma sono riportati in tabella 6 e 7. Non sono
state riscontrate differenze per quanto riguarda gli acidi grassi saturi e monoinsaturi.
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Tabella 6. Concentratione dei principali fosfolipidi plasmatici nei neonati alimentati con formula A (Placebo) e
formula B (rhBSSL) 1
Formula A
Formula B
(Placebo)
(rhBSSL)
8:0
0.12±0.08
10:0
P2
P (wilcoxon)
0.12±0.07
0.982
0.879
0.05±0.02
0.05±0.02
0.979
0.811
12:0
0.21±0.08
0.21±0.07
0.877
0.879
14:0
0.61±0.10
0.61±0.11
0.599
0.528
14:1n-5
0.03±0.02
0.03±0.02
0.957
0.811
16:0
31.48±1.86
30.92±1.40
0.158
0.349
16:1n-7
0.88±0.56
0.79±0.65
0.490
0.122
18:0
14.01±1.05
14.37±1.05
0.373
0.500
18:1n-9
11.35±0.97
11.22±0.85
0.619
0.983
18:1n-7
1.88±0.42
1.79±0.51
0.347
0.267
18:2n-6
16.38±2.21
16.60±2.32
0.446
0.286
18:3n-6
0.18±0.06
0.17±0.06
0.277
0.215
18:3n-3
0.07±0.02
0.08±0.02
0.093
0.122
20:0
0.57±0.07
0.56±0.08
0.239
0.248
20:1n-9
0.30±0.08
0.30±0.06
0.600
0.199
20:2n-6
0.36±0.07
0.35±0.07
0.655
0.446
20:3n-9
0.65±0.50
0.53±0.46
0.198
0.102
20:3n-6
3.11±0.52
2.97±0.52
0.065
0.133
20:4n-6
9.92±1.14
10.41±0.73
0.017
0.022
20:5n-3
0.28±0.08
0.26±0.09
0.424
0.349
22:0
0.70±0.10
0.69±0.14
0.178
0.372
22:1n-9
0.07±0.01
0.07±0.02
0.940
0.879
22:2n-6
0.04±0.05
0.03±0.02
0.268
0.233
22:4n-6
0.35±0.06
0.34±0.11
0.484
0.845
22:5n-6
0.40±0.12
0.40±0.11
0.635
0.500
22:5n-3
0.20±0.05
0.20±0.07
0.896
0.679
22:6n-3
2.72±0.45
2.98±0.55
0.031
0.043
24:0
0.45±0.09
0.43±0.08
0.094
0.085
24:1n-9
2.41±0.42
2.35±0.35
0.539
0.349
Acidi grassi
1
2
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Tabella 7. Concentrazione dei principali triglicedi plasmatici dei neonati alimentati con formula A (Placebo) e formula
B (rhBSSL) 1
Formula A
Formula B
(Placebo)
(rhBSSL)
8:0
1.17±1.51
10:0
P2
P
(wilcoxon)
0.89±0.79
0.454
0.711
0.47±0.19
0.46±0.17
0.812
0.913
12:0
7.12±2.80
6.90±2.15
0.759
0.711
14:0
3.41±0.54
3.58±0.66
0.163
0.327
14:1-n5
0.03±0.08
0.03±0.08
0.070
0.068
16:0
27.10±2.55
27.16±3.54
0.935
0.811
16:1n-7
4.39±2.71
3.67±2.49
0.336
0.085
18:0
2.91±0.86
2.99±1.07
0.679
0.983
18:1n-9
33.50±3.76
33.79±3.41
0.765
0.948
18:1n-7
2.10±0.73
1.86±0.66
0.152
0.094
18:2n-6
12.63±3.31
13.03±3.01
0.540
0.500
18:3n-6
0.32±0.07
0.31±0.09
0.510
0.372
18:3n-3
0.57±0.14
0.63±0.23
0.320
0.267
20:0
0.04±0.03
0.06±0.05
0.027
0.030
20:1n-9
0.29±0.05
0.30±0.05
0.709
0.616
20:2n-6
0.17±0.04
0.16±0.06
0.899
0.845
20:3n-9
0.32±0.11
0.29±0.14
0.490
0.528
20:3n-6
0.71±0.16
0.84±0.23
0.043
0.085
20:4n-6
1.01±0.24
1.13±0.20
0.093
0.122
20:5n-3
0.11±0.06
0.13±0.05
0.310
0.356
22:4n-6
0.13±0.07
0.14±0.06
0.856
0.918
22:5n-6
0.92±0.18
1.04±0.20
0.081
0.102
22:5n-3
0.03±0.03
0.02±0.03
0.242
0.263
22:6n-3
0.36±0.15
0.38±0.12
0.621
0.586
Acidi grassi
1
2
____________________________________________________________________
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5.DISCUSSIONI E CONCLUSIONI
Questa tesi rientra in una serie di studi sul metabolismo lipidico del neonato che a
differenza dell’adulto assorbe male il grasso della dieta (latte formulato ma anche
latte materno). Questa condizione ha grosse ripercussioni nutrizionali soprattutto se
il neonato è pretermine in cui bisogni nutrizionali ed energetici sono ancora più alti
rispetto al neonato a termine e l’assorbimento del grasso è ancora più precario.
Riportiamo in questa tesi il primo studio dove è stata usata la rhBSSL aggiunta alla
formula nei neonati prematuri ed è stato messo a punto per valutare se si verifica un
miglioramento dell’assorbimento intestinale del grasso con l’ipotesi che l’aumento
dell’apporto energetico porti ad un miglioramento della crescita che è una delle sfide
più importanti per la cura di questi neonati prematuri. In questo studio pilota
abbiamo trovato un miglior assorbimento intestinale del grasso della dieta con la
supplemetazione con rhBSSL.
L’acido palmitico è principalmente esterificato in posizione Sn-1 e Sn-3 negli oli
vegetali, le lipasi pancreatiche liberano gli acidi grassi nelle posizioni Sn-1,3 a
formare acidi grassi non esterificati non assorbibili in quanto formano saponi
insolubili con i cationi divalenti come calcio e magnesio.
È stato notato un miglioramento nell’assorbimento soprattutto per gli acidi grassi
polinsaturi a lunga catena, ARA e DHA, quando la formula era supplementata con
rhBSSL. La concentrazione fecale del DHA tendeva ad essere più bassa in presenza
di rhBSSL anche se non c’erano differenze significative tra i due gruppi in entrambi i
periodi, molto probabilmente ciò è dovuto al numero basso di pazienti inclusi nello
studio. Inoltre è stato osservato un aumento significativo della concentrazione del
DHA e ARA nei fosfolipidi del plasma. Tutto ciò fa ipotizzare che l’uso della BSSL
migliori l’assorbimento degli LCPUFA. Un ruolo possibile della BSSL nel favorire
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l’aumento della digestione degli LCPUFA è stato suggerito da Hernell e
collaboratori in uno studio in vitro [46]. In tal studio hanno utilizzato il
triacilglicerolo del chilomicrone del ratto contenete acido arachidonico e linoleico
marcati oppure acido arachidonico e eicosapentaenoico marcati come substrato per
l’incubazione in vitro con lipasi pancreatica umana colipasi-dipendente purificata e
BSSL. L’acido arachidonico e l’acido eicosapentaenoico erano idrolizzati molto più
efficientemente ad acidi grassi liberi con la BSSL rispetto all’utilizzo della lipasi
pancreatica colipasi-dipendente. La loro ipotesi è stata che la posizione del doppio
legame fosse di grande importanza per l’idrolisi del legame estere da parte della
lipasi pancreatica mentre la BSSL non ha preferenze nella posizione del doppio
legame ed è in grado quindi di idrolizzare rapidamente gli acidi grassi rilasciando gli
acidi grassi liberi come ARA ed EPA. Una simile scoperta è stata fatta anche da
Chen e collaboratori, con alcuni studi in vitro hanno notato che quando la lipasi
pancreatica umana carbossilestere, enzima molto simile rispetto alle sue proprietà
con la BSSL del latte umano, e lipasi pancreatica colipasi-dipendente, erano
combinate l’idrolisi dei chilomicroni del ratto che contengono 20:4n-6 e 20:5n3
marcati era molto più efficiente rispetto alla lipasi pancreatica colipasi-dipendente
usata da sola [116]. Gli acidi grassi polinsaturi a lunga catena, soprattutto ARA e
DHA sono molto presenti in alte concentrazioni nelle cellule dei neuroni del feto e la
loro incorporazione aumenta nella parte finale della gestazione. Nel periodo postnatale una diminuzione della concentrazione del DHA è stata trovata, in studi
autoptici , nel cervello dei bambini alimentati con la formula rispetto ai bambini che
erano stati allattati al seno [117] [118]. Questi dati suggeriscono che l’assunzione del
DHA dalla dieta sia importante per lo sviluppo del cervello, questo è vero
specialmente per i neonati pretermine che hanno bassi depositi nel corpo di
LCPUFA. La supplementazione della formula con ARA e DHA consente di avere
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35
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nel plasma e nei glubuli rossi elevate concentrazioni dei due acidi grassi. Uno studio
ha riportato che nei neonati pretermine alimentati con formula supplementata con
ARA e DHA, livelli simili di ARA e DHA nel plasma e nei globuli rossi rispetto ai
neonati alimentati con latte umano [119]. Gli effetti benefici degli LCPUFA sullo
sviluppo della vista sono stati ampiamente dimostrati [120] [121] [122] [123] anche
se la questione sullo sviluppo mentale e psicomotorio a lungo termine è molto
controversa [124] [125] [126] [127]. Riguardo al fatto che I neonati pretermine
necessitino di una formula supplementata con LCPUFA è un qualcosa che è
suggerito da molti anni e che oggi è entarata a far parte della pratica. Nel nostro
studio l’uso di rhBSSL ha portato ad un migliore assorbimento e aumento nei
fosfolipidi del plasma di ARA e DHA, questi risultati fanno supporre che la rhBSSL
possa avere un ruolo fondamentale nell’assorbimento del grasso soprattutto degli
LCPUFA.
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