F. Benevelli

Introduzione ai gradienti
Francesca Benevelli
Bruker Italia – Viale Lancetti 43 – MILANO
[email protected]
PROGRAMMA
• COSA E’ UN GRADIENTE
• SPETTROSCOPIA NMR CON GRADIENTI
• GRADIENTI DI SPOILING
• ESPERIMENTI CON SELEZIONE DI COERENZA MEDIANTE
GRADIENTI:
•
COSY
•
COSYDF
•
HMQC
•
HSQC
•
HMBC
• SOPPRESSIONE SEGNALE SOLVENTE MEDIANTE GRADIENTI
2
Cos’è un gradiente?
Il gradiente di campo
magnetico statico (B0) è
un campo magnetico, la
cui intensità dipende
dalla posizione.
Questo campo si
somma al campo
magnetico statico.
G(r) = δB(r)/δr
3
Cos’è un gradiente?
Negli spettrometri NMR tipicamente si ha un gradiente lungo la
sola direzione z.
Applicando il gradiente, spin posti a diverse coordinate z
risentono di campi magnetici diversi:
B(z) = B0 + z Gz
Cioè precedono a frequenze di Larmor diverse:
ω(z) = γ B(z) = γ [B0 + z Gz ].
4
Cos’è un gradiente?
L’applicazione del gradiente rende la velocità di
precessione dipendente dalla posizione del nucleo.
In altri termini, si introduce una marcatura spaziale.
5
Impulso di gradiente
In spettroscopia NMR quando si parla di un gradiente
tipicamente si fa riferimento a un impulso di gradiente
(PFG=Pulse Field Gradient).
Vediamo quali grandezze dobbiamo definire quando si
applicano i gradienti in spettroscopia (GRASP= GRAdient
SPectroscopy) NMR.
Schematicamente:
S
Gk
τ
d
Impulso di gradiente
S
Gk
τ
d
• Intensità (Gk).
• Durata (τ), ordine di grandezza ms.
• Delay di stabilizzazione (d), ordine di grandezza µs.
• Forma (S).
Cos’è un gradiente?
A questo punto possiamo capire cosa succede non solo alla
velocità di precessione, ma anche alla fase della
magnetizzazione.
φ(z) = ω(z) τ = γ B(z)
τ = γ [B0
+ z Gz ] τ =
γ B0 τ + γ z Gz τ
φG(z) = γ z Gz τ
Dopo un gradiente di durata τ e intensità Gz anche la fase della
magnetizzazione degli spin dipende dalla loro posizione z.
8
GRADIENT ECHO
Cosa succede applicando due gradienti uguali e contrari?
Il gradiente provoca la perdita di fase della magnetizzazione,
che può essere rifocalizzata da un secondo gradiente.
SI PUO’ DIMOSTRARE
APPLICANDO LA FORMULA
PRECEDENTE: φG(z) = γ z Gz τ
G2
G1
φG1(z) = γ z G1z τ
y
y
x
φG2(z) = γ z G2z τ
= - γ z G1z τ
y
= -φG1(z)
x
x
9
Cos’è un gradiente?
Facendo riferimento alla magnetizzazione trasversale, cioè
coerenza singolo quantica, abbiamo visto che :
φG(z) = γ z Gz τ
Essendo la velocità di precessione proporzionale all’ordine
di coerenza p, la precedente relazione si estende a una
generica coerenza di ordine p nel modo seguente:
φG(z) = γ z Gz τ p
10
A cosa servono i gradienti
In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni:
1. Imaging (es. Gradient Shimming)
2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient,
es. Noesy)
3. Selezionare dei cammini di coerenza
4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del
solvente)
5. Misurare coefficienti di diffusione
11
A cosa servono i gradienti
In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni:
1. Imaging (es. Gradient Shimming)
2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient,
es. Noesy)
3. Selezionare dei cammini di coerenza
4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del
solvente)
5. Misurare coefficienti di diffusione
12
GRADIENTI DI SPOIL
Per gradiente di spoiling si intende un gradiente che viene
applicato per DEFOCALIZZARE L’ORDINE DI COERENZA NON
DESIDERATO.
Questi gradienti vengono principalmente applicati quando è
attesa solo coerenza di ordine 0 sulla quale il gradiente non ha
alcun effetto:
φG(z) = γ z Gz τ p = 0
Di seguito analizziamo due esempi:
- l’effetto di un gradiente durante il relaxation delay
- l’effetto di un gradiente durante il mixing time di un
esperimento NOESY
13
GRADIENTI DI SPOIL
Effetto del gradiente durante il RELAXATION DELAY
(VEDI LEZIONE: Introduzione ai processi di rilassamento nella spettroscopia NMR T. Beringhelli)
π/2
RD
RF
G
+2
+1
p
0
-1
-2
14
GRADIENTI DI SPOIL
Effetto del gradiente durante il MIXING TIME in esperimento
NOESY
π/2
RD
RF
π/2
t1
π/2
τm
G
+2
+1
p
0
-1
-2
15
A cosa servono i gradienti
In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni:
1. Imaging (es. Gradient Shimming)
2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient,
es. Noesy)
3. Selezionare cammini di coerenza
4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del
solvente)
5. Misurare coefficienti di diffusione
16
SELEZIONE DI COERENZA CON PFG
Gli impulsi di RF consentono di cambiare il livello di coerenza.
La combinazione di impulsi e delay consente di creare diversi
cammini di coerenza. In genere la stessa sequenza consente di
creare molti percorsi di coerenza, anche se si vuole selezionare
solo quello (o solo quelli) che porta all’osservabile desiderata.
Gli impulsi di gradiente posso essere usati, in alternativa ai cicli
di fase, per selezionare uno specifico cammino di coerenza. A
tale scopo è necessario che sia verificata la seguente
condizione:
Σi φi = Σ (γi pi Gi τi ) = 0
γ = rapporto giromagnetico, dipende dal tipo di nucleo
p = ordine di coerenza
G τ = integrale del gradiente
17
SELEZIONE DI COERENZA CON PFG
Supponendo di applicare gradienti di uguale durata τ la suddetta
condizione diventa:
Σi φi = τ Σi (γi pi Gi) = 0
Quindi per esperimenti ETERONUCLEARI deve essere verificata
la condizione:
Σi (γi pi Gi) = 0
Quindi per esperimenti OMONUCLEARI deve essere verificata la
condizione:
Σi (pi Gi) = 0
18
SELEZIONE DI COERENZA CON PFG
Per capire in che modo più gradienti agiscono sulla
magnetizzazione analizziamo l’effetto della combinazione di un
GRADIENT ECHO e di uno SPIN ECHO
π
RF
Gz
+2
+1
p
0
-1
-2
19
COSY
π/2
RF
RD
π/2
?
t1
Determinare il
rapporto G1:G2 che
G
G1
G2
consente di
Percorso di coerenza echo
+1
0
-1
p
Percorso di coerenza antiecho
+1
0
-1
p
ΦE= p1E*G1E + p2E*G2E= 0
ΦE= 1*G1E – 1 *G2E= 0
selezionare il
percorso di coerenza
echo
ΦTOT= p1*G1 + p2*G2
ΦTOT= p1*G1 + p2*G2= 0
G1E - G2E= 0
G1E = G2E
20
COSY selezione coerenza echo /
antiecho
COSY su acido pamoico in DMSO, solo regione aromatica.
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
ppm
6.5
6.5
7.0
7.0
7.5
7.5
8.0
8.0
8.5
8.5
9.0
9.0
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
21
COSY selezione coerenza echo /
antiecho
COSY su acido pamoico in DMSO.
Solo regione aromatica.
Hz
-500
-400
310 Hz
- 310 Hz
-300
-194 Hz
-194 Hz
-200
-100
0
100
-194 Hz
194 Hz
200
300
310 H z
310 H z
400
500
500
400
300
200
100
0
-100
-200
-300
-400
-500
Hz
22
COSY
π/2
RD
RF
π/2
?
t1
Analizzare quale
effetto ha sui picchi
G
G1
assiali il rapporto dei
G2
Picchi assiali
due gradienti
+1
0
-1
p
determinato per la
selezione del percorso
di coerenza echo.
ΦAX= p1AX*G1 + p2AX*G2
G1 = G2
ΦAX= 0*G1 – 1 *G2 = – G2
ΦAX ≠ 0
23
COSYDF
Spesso all’esperimento COSY è preferibile la variante con filtro
doppio quanto, in quanto offre i seguenti vantaggi:
• I picchi diagonali sono in parte cancellati
• I segnali che non hanno accoppiamenti omonucleari (cioè i
singoletti) sono eliminati.
• Solitamente l’esperimento è phase sensitive con conseguente
migliore risoluzione rispetto all’esperimento, ma ….
π/2
RF
RD
π/2
π/2
t1
G
24
GRADIENTI ED ESPERIMENTI PHASE
SENSITIVE
Negli esperimenti phase sensitive è necessario mantenere
durante il tempo di evoluzione sia +p che –p.
Il gradiente consente di selezionare un solo percorso di
coerenza.
Come si possono fare esperimenti phase sensitive con
gradienti ?
• NON si applicano gradienti durante t1
• Si ripete l’esperimenti due volte selezionando
alternativamente +p e –p.
25
COSYDF Phase sensitive
π/2
RF
RD
π/2
π/2
?
t1
Determinare i rapporti che
G
devono avere i 2 gradienti
indicati nello schema in
modo da poter effettuare
+2
+1
p
0
l’esperimento in modo phase
sensitive.
-1
-2
ΦTOT= p1* G1 + p2* G2= 0
ΦTOT= 2 * G1 - 1 * G2= 0
ΦTOT= 0
2 * G1 = G2
26
COSYDF Phase sensitive
Per semplicità finora abbiamo trascurato eventuali evoluzioni
della magnetizzazione (o più generalmente, coerenza) durante il
gradiente indipendenti dal gradiente stesso.
In particolare l’evoluzioni per chemical shift e/o per
accoppiamento scalare possono determinare la distorsione della
fase del segnale. Si rende quindi spesso necessario modificare la
sequenza inserendo opportunamente impulsi di RF e/o di
gradiente.
27
COSYDF Phase sensitive
Questa è una variazione “classica” della sequenza precedente.
π/2
π/2
RF
RD
t1
τ
τ
?
π
π/2
π
τ
τ
Cosa è cambiato rispetto a
prima?
G
τ
τ
+2
+1
p
0
-1
-2
28
Esperimenti correlazione inversa
Tra gli esperimenti che hanno maggiormente giovato
dell’introduzione dei gradienti ci sono gli esperimenti di
eterocorrelazione 1H-X.
Storicamente le prime eterocorrelate prevedevano l’acquisizione
diretta del nucleo X.
Il vantaggio principale è che non è necessario sopprimere il
segnale dei 1H legati a nuclei non attivi all’NMR, per esempio nel
caso di
13C
l’99% della magnetizzazione.
Successivamente sono stati introdotti esperimenti con acquisizione
su 1H detti esperimenti inversi.
Questi esperimenti sono HSQC, HMQC e HMBC.
29
Strategia esperimenti correlazione
inversa
1.
Si parte da magnetizzazione 1H
2.
Si trasferisce la magnetizzazione 1H al nucleo X, mediante
accoppiamento J (INEPT e simili)
3.
Evoluzione in X
4.
Si ri-trasferisce magnetizzazione ad 1H
5.
Si osserva 1H
Vantaggi:
Si parte da magnetizzazione “robusta” (1H)
Si osserva 1H
Svantaggi: Bisogna eliminare tutto il segnale 1H non accoppiato a X (per
esempio
13C).
Sono richieste caratteristiche strumentali
ottimali (impulsi esatti, strumentazione stabile).
30
ESPERIMENTI DI CORRELAZIONE
ETERONUCLEARE
Negli esperimenti di correlazione eteronucleare uno specifico cammino di
coerenza può essere selezionato utilizzando impulsi di gradiente di uguale
durata purché sia verificata la condizione:
Σ (γi pi Gi ) = 0
γ = rapporto giromagnetico (dipende dal tipo di nucleo)
p = ordine di coerenza
G = integrale del gradiente
Per calcolare correttamente il rapporto tra gradienti bisogna considerare i
livelli di coerenza di entrambi i nuclei e può essere conveniente definire un
livello di coerenza p’:
p’ = p(1H) + p(X) γ(X)/γ(1H)
31
HMQC
1H
∆
?
∆
Sapendo che γ(1H)
26.7519 107 rad/T*s e
γ(13C) 6.7283 107 rad/T*s,
t1
X
determinare i rapporti
G1:G2:G3 che consentono
di selezionare il cammino
G
G1
G2
G3
di coerenza echo e quello
1H
+1
0
-1
13C
+1
0
-1
antiecho nell’esperimento
HMQC 1H-13C.
32
HMQC
1H
∆
∆
?
Sapendo che γ(1H) 26.7519 107 rad/T*s e γ(13C)
t1
X
6.7283 107 rad/T*s, determinare i rapporti
G1:G2:G3 che consentono di selezionare il
G
G1
G2
cammino di coerenza echo e quello antiecho
G3
1H
+1
0
-1
13C
+1
0
-1
nell’esperimento HMQC 1H-13C.
ΦTOT= [γHp1H + γCp1C] * G1 + [γHp2H + γCp2C] * G2+ [γHp3H + γCp3C] * G3 = 0
ΦTOT= [4γCp1H + γCp1C] * G1 + [4γCp2H + γCp2C] * G2+ [4γHp3H + γCp3C] * G3 = 0
ΦTOT= [4γC(1) + γC(1)] * G1 + [4γC(-1) + γC(1)] * G2+ [4γH(-1) + γC(0)] * G3= 5 G1 - 3 G2- 4G3 =0
G1 = G2
5G2-3G2-4G3=0
2G2=4G3
G2=-2G3
G1:G2:G3 = 2:2:1
ΦTOT= [4γC(1) + γC(-1)] * G1+ [4γC(-1) + γC(-1)] * G2+ [4γH(-1) + γC(0)] * G3= 3G1 - 5G2- 4G3 =0
G1 = G2
3G2-5G2-4G3=0
-2G2=4G3
G2=-2G3
G1:G2:G3 = 2:2:-1
33
HSQC
Hetero Single Quantum Coherence
I
τ
τ
S
t1
inept
1H
τ
τ
τ
τ
GARP
t2
retro-inept
13C
13C
t1
1H
t2
34
HSQC
Hetero Single Quantum Coherence
1H
τ
τ
τ
?
τ
Sapendo che γ(1H) 26.7519
t1/2
t1/2
107 rad/T*s e γ(15N) -2.712
X
107 rad/T*s, si calcoli il
INEPT 1H --> X
INEPT X ---> 1H
rapporto G1:G2 per un
esperimento HSQC 1H-15N
G
G1
G2
ΦTOT= [γHp1H + γNp1N] * G1 + [γHp2H + γNp2N] * G2= 0
γ(1H)/γ(15N) = -9.86 -≈ -10
ΦTOT= [-10 γNp1H + γNp1N] * G1 + [-10γNp2H + γNp2N] * G2= 0
ΦTOT= [-10 γN(*(0) + γN *(-1)] * G1 + [-10 γN*(-1) + γN * (0)] * G2= 0
-1 G1 +10 G2= 0
G1 = 10 G2
ΦTOT= [-10 γN(*(0) + γN *(1)] * G1 + [-10 γN*(-1) + γN * (0)] * G2= 0
G1 + 10 G2= 0
G1 = - 10 G2
35
Si può aumentare la sensibilità?
Per aumentare la sensibilità si può modificare la sequenza
aggiungendo impulsi e delay che permettono di rifocalizzare
cammini di coerenza che si “perdono” nella sequenza base.
Molto utile per campioni diluiti o per nuclei poco sensibili (15N).
A volte compaiono artefatti COSY.
I
S
GARP
36
HSQC Sensitivity Improvement
y
1H
τ
τ
∆
φ
t1/2
X
INEPT 1H --> X
∆
τ
τ
y
t1/2
‘Sensitive Improvement’
G
Fino a t1 la sequenza e’ identica alla precedente ; durante t1 evolvono gli operatori
IzSy e IzSx. Nell’esperimento phase sensitive vengono alternativamente acquisiti
modulati in seno e in coseno, ma per ogni esperimento uno solo dei due porta a
magnetizzazione osservabile in t2. Dal momento che il blocco di impulsi e delay che
consentono di ottenere questo guadagno è inserito tra i due gradienti il rapporto
G1:G2 non cambia rispetto alla sequenza descritta nella diapositiva precedente.
37
Sensitivity Improvement
In rosso: riga da spettro hsqcetgpsi
In blu: riga da spettro hsqcetgp
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0 ppm
38
HMBC
Heteronuclear Multi Bond Correlation
1H
∆(1J)
?
∆(Jlr)
Sapendo che γ(1H) è
circa 4 volte quello
X
t1
del
13C
determinare
quali rapporti
G1:G2:G3 consentono
G
di selezionare il
G1
G2
G3
cammino di coerenza
antiecho
1H
13C
+1
0
-1
+1
0
-1
nell’esperimento
HMBC 1H-13C
39
HMBC
Heteronuclear Multi Bond Correlation
1H
∆(1J)
∆(Jlr)
?
Sapendo che γ(1H) è circa
t1
X
4 volte quello del
13C
determinare quali rapporti
G
G1:G2:G3 consentono di
G1
G2
G3
+1
0
-1
1H
13C
+1
0
-1
selezionare il cammino di
coerenza antiecho
nell’esperimento HMBC 1H13C
ΦTOT= [γHp1H + γCp1C] * G1 + [γHp2H + γNp2C] * G2 + [γHp3H+γCp3C]*G3= 0
ΦTOT= [4γCp1H + γCp1C] * G1 + [4γCp2H + γNp2C] * G2 + [4γCp3H+γCp3C]*G3= 0
ΦTOT= [4γC(1) + γC(1)] * G1 + [4γC(-1) + γN(1)] * G2 + [4γC(-1)+γC(0)]*G3= 0
ΦTOT= [5γC] * G1 + [-3γC] * G2 + [-4γC]*G3= 0
5* G1 -3* G2 -4*G3= 0
G1:G2 :G3= 5:4:3
40
A cosa servono i gradienti
In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni:
1. Imaging (es. Gradient Shimming)
2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient,
es. Noesy)
3. Selezionare cammini di coerenza
4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del
solvente)
5. Misurare coefficienti di diffusione
41
WATERGATE
La sequenza WATERGATE per la soppressione del segnale del solvente
può essere realizzata pulsando selettivamente sull’acqua, per esempio
con un impulso profilato selettivo oppure con un treno di impulsi
binomiali. Nella schema sottostante è rappresentato il secondo caso.
Un treno di impulsi binomiali chiama 3-9-19 genera:
una rotazione di 0°on resonance (solvente) e a frequenze multiple di
d (1/d=2 ∆)
una rotazione di 180°off resonance.
π
2
3
9
19
19
9
3
2∆
RF
Gz
42
WATERGATE
π
2
3
9
2∆
RF
19
19
9
?
3
Verificare
due
gradienti
ottiene
Gz
0
−1
applicando
uguali
l’eliminazione
si
del
segnale ON RESONANCE.
?
ON RESONANCE
+1
che
Determinare il valore ∆
da
utilizzare per un campione
in
acqua
il
cui
spettro
protonico copre un finestra
spettrale da 0 a 12 ppm
lavorando
con
uno
spettrometro 500 MHz.
43
WATERGATE
π
2
3
9
19
19
9
3
?
2∆
RF
Verificare che applicando
due
Gz
gradienti
uguali
si
ottiene l’eliminazione del
segnale ON RESONANCE.
ON RESONANCE
+1
0
−1
ΦTOT= p1* G1 + p2* G2
ΦTOT= p1* G1 + p2* G1 = G1 * (p1+p2)
ΦTOT= G1 *(1+1) = 2 G1 ≠0
44
WATERGATE
π
2
3
9
19
19
9
3
?
2∆
Determinare il valore ∆
RF
da
utilizzare
per
un
campione in acqua il cui
Gz
spettro
ON RESONANCE
+1
protonico
copre
un finestra spettrale da 0
a 12 ppm lavorando con
0
uno
−1
spettrometro
500
MHz.
La frequenza della trasmittente sarà posta in risonanza con il segnala dell’acqua a 4.7 ppm.
E quindi l’intera finestra spettrale dovrà essere di 14.6 ppm cioè 7300 Hz per coprire fino a
12 ppm. Quindi:
2∆ = 1/d
∆ = 1/2d = 1/7300 = 1.37 10-4 s = 137 µs
45
RIFERIMENTI SEQUENZE
COSY
• M. von Kienlin, C.T.W. Moonen, A. van der Toorn, and P.C.M. van Zijl,
Rapid Recording of Solvent-Suppressed 2D COSY Spectra with Inherent Quadrature Detection Using
Pulsed Field Gradients, J. Magn. Reson. 93, 423-429 (1991).
COSY con FILTRO DOPPIO QUANTO
• A.L. Davis, E.D. Laue, J. Keeler, D. Moskau, and J. Lohman, Absorption-Mode Two-Dimensional NMR
Spectra Recorded Using Pulsed Field Gradients, J. Magn. Reson. 94, 637-644 (1991)
HMQC
• J. Ruiz-Cabello, G.W. Vuister, C.T.W. Moonen, P. van Gelderen, J.S. Cohen, and P.C.M. van Zijl
Gradient-Enhanced Heteronuclear Correlation Spectroscopy. Theory and Experimental Aspects, J.
Magn. Reson. 100,282-302 (1992).
• R.E. Hurd and B.K. John, Gradient-Enhanced Proton-Detected Heteronuclear Multiple-Quantum
Coherence Spectroscopy
J. Magn. Reson.91, 648-653 (1991).
•J .M. Tyburn, I.M. Brereton, and D.M. Doddrell, Coherence Selection in Gradient-Enhanced,
Heteronuclear Correlation Spectroscopy J. Magn. Reson. 97, 305-312 (1992).
46
RIFERIMENTI SEQUENZE
HSQC
• M. Sattler, M.G. Schwendinger, J. Schleucher, and C. Griesinger, Novel Strategies for sensitivity
enhancement in heteronuclear multidimensional NMR Experiments employing pulsed field Gradients J.
Biomol. NMR, 6, 11-22 (1995).
• M. Sattler, P. Schmidt, J. Schleucher, O. Schedletzky, S.J. Glaser, and C. Griesinger, Novel Pulse
Sequences with Sensitivity Enhancement for In-Phase Coherence Transfer Employing Pulsed Field
Gradients, J. Magn. Reson. B108, 235-242 (1995 )
• G. Kontaxis, J. Stonehouse, E.D. Laue, and J. Keeler The Sensitivity of Experiments Which Use
Gradient Pulses for Coherence-Pathway Selection, J. Magn. Reson. A, 111, 70-76 (1994).
HMBC
• R.E. Hurd and B.K. John, Gradient-Enhanced Proton-Detected Heteronuclear Multiple-Quantum
Coherence Spectroscopy
J. Magn. Reson. 91, 648-653 (1991).
WATERGATE
• M. Piotto, V. Saudek, and V. Sklenar, Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR
spectroscopy of aqueous solutions, J. Biomol. NMR, 2, 661-665 (1992).
47
E ORA?
Dall’ introduzione del concetto di gradiente alla sua applicazione in
esperimenti NMR piuttosto sofisticati … Spero di aver stimolato la
curiosità di applicare questi concetti per risolvere problemi veri …
immagino che qualche dubbio sia rimasto, insieme a qualche
domanda su come impostare l’esperimento su uno spettrometro.
Allora:
[email protected]
0270636370
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
48
www.bruker.com
© Copyright Bruker Corporation. All rights reserved.