Scheda tecnica di tutti i servizi di sequenziamento Ion

Sequenziamento con il sistema ION PGM
Obiettivi
Il sequenziatore Ion Personal Genome Machine (PGM) e’ uno strumento altamente versatile i cui campi di
applicazione sono i seguenti:
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sequenziamento mirato di DNA;
sequenziamento mirato di RNA;
sequenziamento di PICCOLI GENOMI;
METAGENOMICA;
PANNELLI a RNA e DNA.
Il sequenziamento mirato di DNA o RNA si applica quando si conoscono a priori specifici DNA/RNA target di
interesse: i target di interesse sono quindi amplificati via PCR e usati come input nel processo di preparazione delle
librerie.
Il sequenziamento di piccoli genomi, come la tipizzazione virale e batterica e il sequenziamento de novo di
microbi, e’ utilizzato al fine di identificare, ad esempio, nuove specie, o di monitorare la presenza di virus e batteri in
condizioni di salute e di malattia o di contaminazioni ambientali.
Campioni polibatterici, inoltre, possono essere analizzati rapidamente in studi di metagenomica, amplificando le
regioni ipervariabili del 16S. Due set di primers, corrispondenti alle regioni V2-4-8 e V3-6, 7-9, possono essere utilizzati
da soli o in combinazione facilitando l’identificazione di un ampio spettro di batteri all’interno di una popolazione
mista.
TM
I pannelli Ampliseq a RNA/DNA sono stati, infine, sviluppati per poter effettuare il sequenziamento mirato di
specifiche regioni genomiche potenzialmente connesse all’insorgenza di patologie quali cancro e malattie ereditarie a
carattere mendeliano o di trascritti genici coinvolti, ad esempio, in un determinato pathway biochimico o in una
particolare fase/stadio di malattia.
A seconda della profondità’ di sequenziamento desiderata e in funzione dell’applicazione scelta, si possono
utilizzare tre chip differenti, Ion 314, 316 e 318. La sola differenza tra essi e’ data dal numero di pozzetti presenti sulla
superficie del chip: cio’ permette di sequenziare da poche centinaia di migliaia di reads ad un massimo di 6-8M di
reads a corsa.
Applicazioni che richiedono, quindi, un numero limitato di reads a campione, come il sequenziamento mirato di
DNA, l’analisi di genomi di piccole dimensioni (virus, batteri), l’analisi dell’espressione genica di pochi trascritti, puo’
essere fatta con qualsiasi dei chips sopra descritti.
Pannelli Ion AmpliSeqTM
TM
La metodica che caratterizza i pannelli a DNA e/o RNA si basa sulla tecnologia Ion AmpliSeq che, utilizzando
in multiplex diverse centinaia di coppie di primers, permette di selezionare, amplificandoli contemporaneamente, i
diversi geni di interesse. I prodotti di amplificazione così ottenuti sono successivamente sequenziati su piattaforma Ion
Torrent, PGM.
Rispetto ai metodi di sequenziamento mirato attualmente disponibili commercialmente, il sistema Ion
TM
AmpliSeq richiede quantitativi di DNA o RNA piuttosto bassi (approssimativamente da 10 a 40 ng), permettendo
quindi anche il sequenziamento di campioni di quantità esigua (vd. biopsie). Data la ridotta lunghezza degli ampliconi,
il sistema ben si adatta anche all’amplificazione di campioni di DNA o RNA parzialmente degradato, come quello
proveniente da materiale biologico conservato in paraffina (FFPE).
TM
Il sistema Ion AmpliSeq è ad oggi la migliore risposta ad analisi che richiedono un’elevata scalabilità del
numero di campioni e/o geni, velocità e riproducibilità dell’informazione ottenuta.
Esistono due tipologie di pannelli, predisegnati (ready to use) da Life Technologies o custom. Per la costruzione
di pannelli personalizzati (custom) si utilizza il software Ion AmpliSeq™ Designer.
Di seguito una descrizione generale dei pannelli per DNA:
•
Ion AmpliSeq™ DNA panels (uomo): I pannelli attualmente in commercio sono specifici per:
l’analisi mirata di oncogeni e sopressori tumorali di diversi tumori;
per lo studio di malattie ereditarie a carattere mendeliano;
per altre malattie di rilevanza clinica come ad esempio la fibrosi cistica e la demenza
precoce.
I geni compresi nei diversi pannelli sono stati estrapolati considerando come database di riferimento COSMIC
(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) per i geni legati al cancro, e NCBI ClinVar database per le malattie
ereditarie.
•
Ion AmpliSeq™ DNA Custom Panels (varie specie): i pannelli personalizzati a DNA permettono il
sequenziamento mirato di regioni genomiche di interesse di diversi genomi quali uomo, topo, maiale, pecora,
mucca, pollo, mais e altri ancora. Nel caso in cui il genoma di riferimento non sia caricato nel software, puo’
essere importato manualmente. I primers vengono forniti in uno o più pool contenenti ciascuno dai 12 ai
6144 coppie di primers. Il numero dei pool varia a seconda della dimensione della regione genomica da
analizzare.
Di seguito una descrizione generale dei pannelli per RNA:
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Ion AmpliSeq™ RNA panels (uomo): al momento esistono in commercio pannelli relativi a geni apoptotici,
coinvolti nel cancro e nel tumore al polmone. Vengono valutati i livelli di espressione di mRNA come di RNA
non codificanti ed in particolare, nell’ultimo pannello citato, si pone attenzione all’identificazione di trascritti
di fusione dovuti a riarrangiamenti cromosomici.
•
Ion AmpliSeq™ RNA Custom Panels (uomo): i pannelli personalizzati permettono di scegliere al massimo 300
geni tra più di 20.000 geni da analizzare in contemporanea in un’unica reazione di amplificazione. Il numero
di coppie di primer, forniti in un singolo pool, varia da un minimo di 12 ad un massimo di 300, a seconda del
disegno richiesto. Creare questi pannelli e’ molto semplice, basta selezionare on line i propri targets di
interesse, o la regione genomica di riferimento, e il software Ion AmpliSeq™ Designer crea il pannello piu’
adatto.
Dove possibile, nei pannelli ad RNA, l’amplicone disegnato copre la giunzione esone-esone per minimizzare
l’amplificazione di eventuale DNA genomico presente nel campione. Inoltre, la referenza utilizzata dal software per la
sintesi degli ampliconi, contiene la sequenza del trascritto identificato come quella a piu’ alto coverage per ogni
singolo gene in RefSeq.
E’ possibile consultare una lista completa ed aggiornata dei pannelli a DNA e a RNA attualmente disponibili in
commercio registrandosi al sito www.ampliseq.com
Procedura di costruzione librerie
Il procedimento per la costruzione di librerie AmpliSeq è
comune sia per campioni a DNA che a RNA.
Come mostrato in figura, se il materiale di partenza è costituito
da RNA è previsto un passaggio iniziale di retrotrascrizione a cDNA.
Le regioni bersaglio del DNA genomico o del cDNA sono amplificate in
multiplex utilizzando pools di coppie di primers specifici. Gli ampliconi
ottenuti sono quindi trattati enzimaticamente in modo da digerire
parzialmente i primers di amplificazione e fosforilare gli ampliconi
stessi. Dopo questo passaggio, alle due estremità di ciascun
amplicone sono ligati covalentemente gli adattatori specifici (A/P1)
richiesti per il sequenziamento con piattaforma Ion Torrent. In questa
fase è possibile sostituire l’adattatore A con specifici adattatori dotati
di codici a barre differenti marcando i diversi campioni.
I prodotti della ligazione sono purificati tramite biglie
magnetiche Agentcourt AMPure XP (SPRI technology) e sottoposti ad
amplificazione tramite PCR che selezionerà solo le molecole dotate di
entrambe le coppie di adattatori. La qualità e quantità delle librerie
così ottenute è valutata mediante fluorimetria (Qubit) o
microelettroforesi capillare (Agilent Bioanalyzer).
Le librerie infine sono sequenziate, isolatamente o in multiplex.
Per la costruzione di librerie non AmpliSeq, sono previsti due tipologie di librerie, a frammenti o mate-paired.
La procedura alla base della costruzione delle librerie a frammenti è molto
simile a quanto descritto per le librerie AmpliSeq. In generale, il DNA
genomico e’ frammentato fino ad ottenere la grandezza desiderata e
ligato agli adattatori specifici Ion. La libreria così ottenuta e’ selezionata
per dimensione e amplificata per PCR per ottenere la quantita’ di DNA
necessaria a procedere con la preparazione del templato sulle particelle
Ion Sphere e il successivo sequenziamento.
In questa categoria di librerie ricade anche quella utilizzata negli studi di
metagenomica. In particolare, il DNA genomico prima di essere utilizzato
per costruire la libreria, viene amplificato con primer specifici per le
regioni ipervariabili del 16S. I prodotti di PCR cosi’ ottenuti sono uniti
insieme in un unico pool e processati, come descritto sopra saltando la
fase di frammentazione del campione.
Le librerie mate-paired sono principalmente utilizzate per i
sequenziamenti de novo in aggiunta alle librerie di frammenti. Ciò
permette di riempire i buchi tra contigui rendendo più fattibile
l’assemblaggio delle sequenze.
Il DNA genomico, privo di contaminanti di RNA, viene inizialmente
frammentato ad una grandezza media piu’ grande di quella dell’inserto
desiderato. Le sue estremità sono riparate prima dell’aggiunta della coda
A-tail e degli adattatori come in una libreria di frammenti. Viene quindi
fatta una size-selection sul frammento per renderlo della dimensione
desiderata e viene ligato ad una sorta di gancio utilizzato per identificare
correttamente i frammenti. Questo inserto viene circolarizzato e trattato
con diversi enzimi, inizialmente per rimuovere i frammenti lineari di DNA,
e successivamente per tagliarlo nella lunghezza corretta facendo uso di
un mix di enzimi specifici per ogni genoma. Viene ligato un altro
adattatore, che riconosce correttamente le giunzioni del frammento, e la
libreria cosi’ ottenuta e’ nuovamente circolarizzata ed amplificata per
PCR, con un numero di cicli adeguato a ridurre una potenziale
overamplificazione del frammento. La libreria purificata e’ adesso pronta
per la preparazione del templato e il successivo sequenziamento con il
sistema Ion PGM.
Tipo e quantità di campione necessario
La quantità e il tipo di campioni variano a seconda dell’applicazione di interesse e in funzione della richiesta di
esecuzione del controllo di qualita’ iniziale sui campioni. Mediamente per i pannelli AmpliSeq, per DNA sono necessari
dai 10 ai 40ng, mentre per l’ RNA si utilizzano dai 10 ai 20ng.
Per tutte gli altri tipi di applicazione, si va dai 20ng ad 1ug di DNA a campione.
Per maggiori dettagli si prega di consultare le schede progetto specifiche.
Analisi Bioinformatica
Ad ogni applicazione DNA o RNA e’ associata una procedura analitica specifica. Il punto di partenza e’ sempre il
controllo di qualita’ ed il trimming delle read di sequenza, seguito dal mappaggio sul genoma di riferimento e dalla
generazione dei files in formato binario .bam, contenenti le read allineate e quelle non allineate. In questa fase
vengono anche generate tabelle e grafici riassuntivi.
Nelle applicazioni di tipo ‘diagnostico’ (pannelli a DNA) viene generata una tabella riassuntiva estesa
contenente i risultati dell’analisi di identificazione di SNV ed Indel identificati a seguito del mappaggio, corredati da
informazioni come la posizione della variante, gli alleli di riferimento e variante, le call di ploidia, la frequenza
dell’allele variante, il tipo di variante, il coverage e la qualita’ di sequenza in corrispondenza della variante. Queste
informazioni di carattere fisico vengono complementate da annotazioni delle varianti ricavata dal confronto con
database pubblici come dbSNP, COSMIC, OMIM e dalla predizione dell’effetto funzionale delle varianti non contenute
in dbSNP.
Nelle applicazioni di misura dell’espressione genica (pannelli a RNA) alla fase iniziale di mappaggio segue la
quantificazione dell’espressione assoluta dei trascritti identificati e, ove richiesto dal progetto, l’espressione
differenziale.
Nelle applicazioni di sequenziamento DNA metagenomico (16S rRNA) alla fase di controllo di qualità e
mappaggio sulla referenza 16S seguono i passaggi di una procedura messa a punto in Genomnia: l’analisi statistica
della rappresentazione differenziale dei genomi (individui) distinti attribuibili a specie assegnate a generi o famiglie;
l’analisi statistica della rappresentazione differenziale delle specie assegnate ad un genere; l’analisi di richness.
Nelle applicazioni di sequenziamento di genomi batterici ‘de novo’, infine, alla fase iniziale di mappaggio segue
l’assemblaggio delle sequenze in contigui genomici e la generazione di metriche come il numero di contigui ed il
valore N50.
Informazioni per gli ordini
Richiedere ad [email protected] la scheda progetto specifica per l’applicazione di interesse.
Trattamenti per DNA e RNA
Prodotto
N. Catalogo
QC: controllo di qualità di preparazioni di RNA totale
RNA03
QC: controllo di qualità di DNA
DNA06
Preparazioni di librerie
Prodotto
N. Catalogo
Preparazione di libreria AmpliSeq con codice a barre
ASb
Preparazione di libreria RNA AmpliSeq con codice a barre
ASRb
Preparazione di libreria DNA con codice a barre
LDb
Arricchimento della regione ipervaribile con il kit Ion 16S
metagenomics
16S
Preparazione librerie custom arricchite con codice a barre, fino a
10Mb
ENRb
Preparazione librerie da ampliconi di PCR con codice a barre, fino
a 8kb
AMPb
Preparazione librerie mate-paired DNA
LD_Mp
Amplificazione di target specifici mediante pannelli AmpliSeq
Pannello
N. Catalogo
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq Cancer
Hotspot Panel v2
ASD_Hp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq
Comprehensive Cancer Panel
ASD_Cp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq Inherited
Disease Panel
ASD_IDp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq BRCA1
and BRCA2 Panel
ASD_BRCAp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq Colon
and Lung Research Panel v2
ASD_CLp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq Hearing
Loss Research Panel v1
ASD_HLp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq CFTR
Panel
ASD_CFTRp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq TP53
Panel
ASD_TP53p
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq
Dementia Research Gene Panel
ASD_Dp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq AML
Research Panel
ASD_AMLp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq RNA
Cancer Panel
ASR_Cp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq RNA
Apoptosis Panel
ASR_Ap
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq RNA
Fusion Lung Cancer Research Panel
ASR_FLCp
Amplificazione dei target mediante sistema Ion AmpliSeq RNA
Custom Panels
ASR_CUp
Sequenziamento
Prodotto
N. Catalogo
Sequenziamento forward 200 bp tags con codice a barre
SEQI200B
Sequenziamento forward 400 bp tags con codice a barre
SEQI400B
Sequenziamento mate-paired a 400 bp tags
SEQI400MP
Analisi Bioinformatica per ION Personal Genome Machine (PGM)
Prodotto
N. Catalogo
Dati di sequenza, senza analisi bioinformatica
SEQ-BF01
Trascrittoma Intero: analisi bioinformatica livello I
WTA-BF01
Trascrittoma Intero: analisi bioinformatica livello II
WTA-BF02
Piccoli RNA: analisi bioinformatica livello I
MIR-BF01
Piccoli RNA: analisi bioinformatica livello II
MIR-BF02
ChIP-seq: analisi bioinformatica livello I
CHIP-BF01
ChIP-seq: analisi bioinformatica livello II
CHIP-BF02
Risequenziamento dell’intero esoma: identificazione,
classificazione ed annotazione delle varianti.
FEX-BF01
Risequenziamento mirato: identificazione, classificazione ed
annotazione delle varianti.
TGT-BF01
Pannelli DNA Malattie Ereditarie: analisi bioinformatica livello I
PANEL-BF01
Pannelli DNA cancro hotspot v.2: analisi bioinformatica livello I
HOTSPOTBF01
Pannelli DNA cancro completi: analisi bioinformatica livello I
COMPLETEBF01
Pannelli DNA BRCA1 & BRCA2: analisi bioinformatica livello I
BRCA-BF01
Pannelli DNA custom: analisi bioinformatica livello I
CUSTOMBF01
ION Torrent, PGM Rev. 1 – 02/2016