istruzioni operative

®
Mycobacterium tuberculosis (MTB) Test
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit
RSP PREP
AMPLICOR M. tuberculosis Positive Control
MTB CTL
AMPLICOR Mycobacterium Amplification Kit
MYCO AMP
96 Tests
MTB MWP DK
96 Tests
AMPLICOR M. tuberculosis Detection Kit
100 Tests
P/N: 20756903 122
ART: 07 5690 3
US: 83267
P/N: 20756954 122
ART: 07 5695 4
US: 83263
P/N: 20756784 122
ART: 07 5678 4
US: 83258
P/N: 20757462 122
ART: 07 5746 2
US: 83275
Il kit seguente può essere usato per la rilevazione del controllo interno Mycobacterium amplificato
mediante il kit di amplificazione AMPLICOR Mycobacterium. La rilevazione del controllo interno è
opzionale.
AMPLICOR Internal Control Detection Kit
IC MWP DK
96 Tests
P/N: 20763306 122
ART: 07 6330 6
US: 83324
USO PREVISTO
Il test Mycobacterium tuberculosis (MTB) è un test diagnostico in vitro per la rilevazione qualitativa dei
batteri M. tuberculosis nei campioni clinici. Il test utilizza la tecnica di amplificazione a reazione a
catena della polimerasi (PCR) e di ibridazione dell'acido nucleico per la rilevazione dei
M. tuberculosis, in campioni liquefatti, decontaminati e concentrati, prelevati dal sistema respiratorio
umano, comprendenti l'espettorato spontaneo e lo sputo indotto e il materiale di lavaggio bronchiale
e bronco-alveolare (BAL).
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
I micobatteri sono batteri aerobici acido-resistenti, immobili, di forma cilindrica, che non producono
spore. Comprendono parecchie specie patogene per l'uomo. Molte specie di micobatteri sono
saprofite del suolo e dell'acqua. I principali patogeni umani sono quelli delle specie del complesso
M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum ed M. microti) e l'M. leprae. I micobatteri
M. tuberculosis sono l'agente patogeno più importante. Il bacillo della tubercolosi è presente solo
nell'uomo che ne è portatore e lo trasmette a terzi mediante goccioline di saliva. Circa un terzo della
popolazione mondiale è portatore dei bacilli M. tuberculosis e si trova a rischio di sviluppare
un'infezione attiva da tubercolosi. Nei soli Stati Uniti, si stima l'esistenza di 15 milioni di tubercolotici
infetti ed ogni anno vengono referenziati oltre 18.000 casi di tubercolosi attiva. I bacilli del complesso
M. tuberculosis possono sia causare la malattia polmonare cronica che infettare altri organi del corpo.
La loro diagnosi rapida è estremamente importante alla luce del rischio di diffusione della tubercolosi,
del potenziale di comparsa di ceppi farmaco-resistenti e della gravità del decorso della malattia in
pazienti HIV-1-positivi. La tubercolosi causa 3 milioni di decessi annui in tutto il mondo ed il 26% della
mortalità adulta evitabile nei paesi in via di sviluppo1-5.
La diagnosi definitiva della tubercolosi richiede l'isolamento di un microrganismo del complesso
M. tuberculosis. Le colture di routine sono laboriose e possono richiedere fino ad otto settimane.
L'esame al microscopio di strisci acido-resistenti costituisce il metodo più rapido di rilevazione dei
micobatteri, ma è poco sensibile ed aspecifico. In genere, le tecniche immunologiche e sierologiche
sono limitate, a causa della cattiva sensibilità e/o specificità6,7. L'analisi degli acidi micolici mediante
cromatografia liquida a prestazioni elevate si è dimostrata un utile sussidio alle analisi biochimiche e
colturali 8. Le sonde di acido nucleico specifiche alla specie hanno notevolmente migliorato la rapidità
di conferma dei referti colturali di parecchie specie micobatteriche9. È stato dimostrato che lo
sviluppo di test basati su PCR specifici ai micobatteri facilita ulteriormente la rapida diagnosi della
tubercolosi, consentendo la rilevazione diretta dei micobatteri presenti nei campioni clinici10-19.
1
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il test AMPLICOR MTB prevede quattro fasi principali: preparazione del campione; amplificazione
mediante PCR20,21 del DNA bersaglio usando primer biotinilati; ibridazione dei prodotti amplificati con
sonde oligonucleotidiche specifiche al bersaglio; e rilevazione del prodotto amplificato legato alla
sonda mediante reazione colorimetrica.
Il test AMPLICOR MTB permette l'amplificazione contemporanea del DNA sia dell'MTB bersaglio e
che del controllo interno del Mycobacterium. Il reagente Master Mix contiene coppie di primer
biotinilati, specifici all'MTB ed al controllo interno Mycobacterium. La rilevazione del DNA amplificato
del controllo interno Mycobacterium è opzionale. I controlli positivi e negativi di riferimento sono forniti
assieme al kit del test.
Preparazione del campione
I campioni respiratori umani di NALC/NaOH22, NaOH22 o SDS-NaOH23,24, comprendenti
l'espettorato e lo sputo indotto, il materiale di lavaggio bronchiale e BAL, dopo essere stati liquefatti,
decontaminati e concentrati vengono lavati con la soluzione di lavaggio per campioni respiratori. Gli
microrganismi vengono lisati tramite incubazione nel reagente di lisi per campioni respiratori e il
campione viene preparato per l'amplificazione addizionando il reagente di neutralizzazione del
campione respiratorio.
Amplificazione mediante PCR
Amplificazione del bersaglio
La scelta della sequenza DNA bersaglio dipende dall'identificazione delle regioni del genoma
micobatterico che presentano il massimo grado di conservazione di sequenza tra le specie del
complesso M. tuberculosis. Di conseguenza, la selezione appropriata dei primer e della sonda è
cruciale per riuscire a rilevare tutti gli microrganismi del complesso M. tuberculosis con questo test.
Il genoma del Mycobacterium contiene una regione di circa 1500 nucleotidi che codificano il gene per
16S rRNA. Il test AMPLICOR MTB utilizza i primer KY18 e KY75 biotinilati specifici al genere
Mycobacterium per definire una sequenza di 584 nucleotidi all'interno di tale regione18,25,26.
I campioni trattati vengono addizionati alla miscela di amplificazione nelle provette di reazione in cui
avviene la reazione polimerasica a catena (PCR). Il ciclatore termico riscalda la miscela di reazione
nella provetta per denaturare il DNA a doppio filamento ed esporre le sequenze bersaglio del primer.
Man mano che la miscela si raffredda, i primer biotinilati KY18 e KY75 si appaiano al DNA bersaglio
di M. tuberculosis e del controllo interno di Mycobacterium. La Taq polimerasi (DNA polimerasi
termostabile), in presenza di un eccesso di trifosfati desossinucleosidi (dNTP), comprendenti
desossiadenosina, desossiguanosina, desossicitidina e desossiuridina (al posto della deossitimidina)
trifosfati, estende i primer legati agli stampi bersaglio, per produrre una sequenza di DNA detta
amplicon. Questo processo viene ripetuto per un certo numero di cicli, praticamente raddoppiando la
quantità di amplicon ad ogni ciclo.
Amplificazione del controllo interno
Nelle tecniche di amplificazione che si basano su una reazione di amplificazione enzimatica come la
PCR, l'efficienza può essere ridotta dalla presenza di agenti inibitori nei campioni clinici. Il controllo
interno Mycobacterium è stato aggiunto al test AMPLICOR MTB per identificare i campioni contenenti
sostanze interferenti con l'amplificazione PCR. Il controllo interno Mycobacterium è un DNA
plasmidico con regioni di legame per il primer identiche a quelle della sequenza di DNA bersaglio
dell'MTB, una sequenza interna casuale, simile per lunghezza e per composizione di base alla
sequenza bersaglio dell'MTB e con una specifica regione di legame per la sonda che distingue
l'amplicon del controllo interno Mycobacterium dall'amplicon bersaglio. Queste caratteristiche sono
state selezionate per assicurare una amplificazione equivalente del DNA bersaglio del controllo
interno e dell'MTB. Il controllo interno Mycobacterium viene introdotto in ciascuna reazione di
amplificazione e viene amplificato insieme al DNA bersaglio del campione clinico.
Amplificazione selettiva
Nel test AMPLICOR MTB, l'enzima AmpErase® LD (uracil-N-glicosilasi) ed il trifosfato di
desossiuridina (dUTP) consentono l'amplificazione selettiva dell'acido nucleico bersaglio nei
campioni. L'enzima AmpErase LD riconosce e catalizza la reazione di distruzione del DNA contenente
desossiuridina27, ma non di quello contenente deossitimidina. La desossiuridina non è presente nel
DNA naturale, però è sempre presente nell'amplicon, in quanto nel reagente Master Mix viene
utilizzato il trifosfato di desossiuridina al posto del trifosfato di deossitimidina. Di conseguenza,
solamente l'amplicon contiene desossiuridina. La presenza di desossiuridina nell'amplicon
contaminante lo rende suscettibili alla distruzione da parte dell'AmpErase LD prima
dell'amplificazione del DNA bersaglio. L'enzima AmpErase LD catalizza la dissociazione del DNA
contenente deossiuridina a livello dei residui di desossiuridina, aprendo la catena di desossiribosio
nella posizione C1. Una volta riscaldata durante la prima fase del ciclo termico (in presenza del pH
alcalino di Master Mix), la catena di DNA dell'amplicon si spezza in corrispondenza alla posizione
2
della desossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'AmpErase LD è inattivo a temperature
superiori a 55°C (cioè durante tutte le fasi del ciclo termico) e perciò non distrugge l'amplicon
bersaglio. Dopo l'amplificazione, qualsiasi enzima residuo viene denaturato tramite addizione della
soluzione di denaturazione, evitando così la degradazione dell'amplicon bersaglio. È stato dimostrato
che nel test AMPLICOR MTB, l'enzima AmpErase LD può disattivare almeno 103 copie di amplicon
di MTB contenenti desossiuridina per ogni reazione PCR.
Reazione di ibridazione
Dopo l'amplificazione mediante PCR, l'amplicon viene denaturato per formare un DNA a filamento
unico. Successivamente, aliquote di questa miscela vengono addizionate in micropiastre (MWP o
microwell plate) separate, contenenti sonde oligonucleotidiche specifiche al complesso
M. tuberculosis o al controllo interno Mycobacterium. La sonda del complesso M. tuberculosis viene
catturata dalla regione ipervariabile del gene 16S RNA18,25,26. L'amplicon biotinilato viene catturato
dalle micropiastre rivestite con le sonde. Questa ibridazione dell'amplicon con la sonda specifica al
bersaglio aumenta la specificità totale del test.
Reazione di rilevazione
Dopo la reazione di ibridazione, la micropiastra viene lavata per rimuovere il materiale non legato ed
in ciascun pozzetto viene addizionato un coniugato di avidina-perossidasi di rafano (Av-HRP). Tale
coniugato Av-HRP si lega all'amplicon biotinilato e ibridato alle sonde oligonucleotidiche legate alla
piastra. La micropiastra viene nuovamente lavata per rimuovere l'Av-HRP non legata e
successivamente viene addizionata nei pozzetti una soluzione di substrato perossido di idrogeno e
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). In presenza di acqua ossigenata, la perossidasi di rafano legata
catalizza l'ossidazione della TMB, formando un complesso colorato. La reazione viene arrestata
addizionando di un acido debole e l'assorbanza viene misura ad una lunghezza d'onda di 450 nm
usando un lettore automatico per micropiastre.
REAGENTI
AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit
Kit AMPLICOR di preparazione per campioni respiratori
(P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267)
RSP PREP
RW
(Soluzione di lavaggio dei campioni respiratori)
Tampone Tris-HCl
Solvente; <1%
EDTA
Azoturo di sodio; 0,05%
RL
(Reagente di lisi per i campioni respiratori)
Idrossido di sodio; 0,2%
Solvente; <1%
EDTA
Azoturo di sodio; 0,05%
2 x 25 ml
3 x 6 ml
RN
(Reagente di neutralizzazione dei campioni respiratori)
Tampone Tris-HCl
Cloruro di magnesio
Azoturo di sodio; 0,05%
AMPLICOR M. tuberculosis Positive Control
Controllo positivo AMPLICOR M. tuberculosis
(P/N: 20756954 122; ART: 07 5695 4; US: 83263)
MTB (+) C
[Controllo M. tuberculosis (+) alto]
Tampone Tris-HCl
DNA plasmidico non infettivo (batterico),
contenente sequenze MTB; <0,001%
Poli rA RNA (di sintesi); <0,005%
EDTA
Azoturo di sodio; 0,05%
3
100 Test
2 x 5 ml
MTB CTL
10 x 0,75 ml
AMPLICOR Mycobacterium Amplification Kit
Kit di amplificazione AMPLICOR Mycobacterium
(P/N: 20756784 122; ART: 07 5678 4; US: 83258)
MYCO AMP
MYCO MMX
(Master Mix Mycobacterium)
Tampone Tris-HCl
Glicerolo
AmpliTaq® (Taq DNA polimerasi, batterica); <0,01%
dATP, dCTP, dGTP, dUTP; <0,001%
Primer KY18 e KY75 biotinilati; <0,005%
Azoturo di sodio; 0,05%
AmpErase® LD
(Uracil-N-glicosilasi a DNA basso)
Tampone Tris-HCl
Uracil-N-glicosilasi (batterica); <0,01%
EDTA
Ditiotreitolo
Glicerolo
Solvente; <1%
Cloruro di sodio
Azoturo di sodio; 0,05%
MYCO IC
(Controllo interno Mycobacterium)
Tampone Tris-HCl
DNA plasmidico non infettivo (batterico) contenente
sequenze di legame con il primer per Mycobacterium ed
una regione specifica di legame con la sonda; <0,001%
Poli rA RNA (di sintesi); <0,005%
EDTA
Colorante amaranto
Azoturo di sodio; 0,05%
MYCO (–) C
[Controllo Mycobacterium (–)]
Tampone Tris-HCl
Poli rA RNA (di sintesi); <0,005%
EDTA
Azoturo di sodio; 0,05%
96 Test
3 x 1,7 ml
3 x 0,1 ml
3 x 0,1 ml
1 x 0,75 ml
AMPLICOR M. tuberculosis Detection Kit
Kit di rilevazione AMPLICOR per M. tuberculosis
(P/N: 20757462 122; ART: 07 5746 2; US: 83275)
MTB MWP DK
96 Test
MTB MWP
1 x 96 test
(Micropiastra per M. tuberculosis)
Micropiastra rivestita con sonda di DNA per M. tuberculosis
12 strisce da 8 pozzetti cad. in un sacchetto richiudibile contenente essiccante
1 x 12 ml
+
[1] DN
(Soluzione di denaturazione)
Idrossido di sodio; 1,6%
EDTA
Blu timolo
Xi
1,6% (p/p) di idrossido di sodio
Irritante
[2] MYCO HYB
(Tampone di ibridazione per Mycobacterium)
Soluzione di fosfato di sodio
Solvente; <0,2%
Tiocianato di sodio; <25%
4
1 x 20 ml
[3] AV-HRP
(Coniugato di avidina-perossidasi di rafano)
Tampone Tris-HCl
Coniugato di avidina-perossidasi di rafano; <0,001%
Gammaglobulina bovina (di mammifero)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
Fenolo; 0,1%
ProClin® 150; 1%
1 x 12 ml
[4A] SUB A
(Substrato A)
Soluzione di citrato
Perossido di idrogeno; 0,01%
ProClin 150; 0,1%
1 x 12 ml
[4B] SUB B
(Substrato B)
1 x 3 ml
3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB); 0,1%
Dimetilformammide (DMF); 40%
T
40% (p/p) di Dimetilformammide (DMF)
Tossico
R: 61-20/21-36
Può danneggiare i bambini non ancora nati.
Nocivo per inalazione e a contatto con la pelle.
Irritante per gli occhi.
S: 53-45
Evitare l'esposizione - procurarsi speciali
istruzioni prima dell'uso. In caso di incidente o
di malessere consultare immediatamente il
medico (se possibile, mostrargli l'etichetta).
[5] STOP
(Reagente di bloccaggio)
Acido solforico; 4,9%
1 x 12 ml
10X WB
(Concentrato di lavaggio 10X)
Tampone di fosfato; <2%
Cloruro di sodio; <9%
EDTA
Detergente; <2%
ProClin 300; 0,5%
2 x 90 ml
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
A.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
B.
Questo test è destinato esclusivamente all'analisi di campioni respiratori umani - comprendenti
espettorato e sputo indotto, il materiale di lavaggio bronchiale e BAL dopo essere stati
liquefatti, decontaminati e concentrati impiegando i metodi NALC-NaOH22, NaOH22 o
SDS-NaOH23,24.
C.
Non pipettare con la bocca.
D.
Non mangiare, bere né fumare nelle aree di lavoro del laboratorio. Indossare guanti monouso
di protezione, camici da laboratorio e protezione oculare durante il maneggio dei campioni e
dei reagenti del kit. Lavarsi bene le mani dopo il maneggio dei campioni e dei reagenti.
E.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti esterni durante la rimozione di aliquote dai
flaconi. Si raccomanda l'uso di pipette e di puntali sterili monouso.
F.
Non miscelare reagenti di lotti diversi o di flaconi diversi dello stesso lotto.
G.
Smaltire i reagenti non utilizzati ed i rifiuti in conformità alla normativa vigente.
H.
Non usare il kit dopo la sua data di scadenza.
I.
Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets = MSDS) sono disponibili su
richiesta presso l'ufficio Roche locale.
5
J.
Il flusso di lavoro di laboratorio deve procedere in modo unidirezionale, cominciando nell'area
di preamplificazione (preparazione dei reagenti, dei campioni e dei controlli) per poi passare
all'area di postamplificazione (amplificazione/rilevazione). Le attività di preamplificazione
devono iniziare con la preparazione dei reagenti e procedere con la preparazione dei campioni.
Le forniture e le attrezzature devono essere dedicate a ciascuna attività di preamplificazione e
non devono essere usate per altre attività né spostate da un'area all'altra. Indossare guanti in
ciascuna area e cambiarli prima di uscire da tale area. Le forniture e le attrezzature usate per
la preparazione del reagente non devono essere usate per le attività di preparazione dei
campioni, per il pipettamento né per il trattamento del DNA amplificato o di altre fonti di DNA
bersaglio. Le forniture e le attrezzature di postamplificazione devono rimanere sempre in tale
area.
K.
I campioni devono essere maneggiati come se fossero infettivi, adottando procedure di
sicurezza di laboratorio sul tipo di quelle delineate da Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories28 e nel documento NCCLS M29-A29. Pulire e disinfettare
accuratamente tutte le superfici di lavoro con una soluzione fresca allo 0,5% di ipoclorito di
sodio in acqua deionizzata o distillata.
NOTA:
La candeggina liquida in commercio per uso domestico de solito contiene 5,25% di
ipoclorito di sodio. Una diluizione 1:10 di candeggina produce una soluzione allo 0,5%
di ipoclorito di sodio.
L.
RW, RL, RN, MYCO MMX, AmpErase LD, MYCO IC, MTB (+) C e MYCO (–) C contengo
azoturo di sodio azide. Tale sostanza può reagire con i tubi in piombo ed in rame formando
azoturi metallici altamente esplosivi. Quando vengono smaltite nei lavelli del laboratorio
soluzioni contenenti azoturo di sodio, sciacquare gli scarichi con abbondanti quantità d'acqua
per impedire l'accumulo di azoturi.
M.
Indossare occhiali protettivi, camici di laboratorio e guanti monouso quando si utilizzano la
[1] DN, il [3] AV-HRP, il [4A] SUB A, il [4B] SUB B e la miscela di [4A] SUB A e [4B] SUB B
(substrato di lavoro). Evitare il contatto della pelle, degli occhi e delle membrane mucose con
queste sostanze. In caso di contatto, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua.
Se si verifica la fuoriuscita accidentale di questi reagenti, diluire con acqua prima di asciugare,
in modo da evitare bruciature.
N.
Evitare il contatto con la pelle o le mucose con il [4B] SUB B o con il substrato di lavoro. In
caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente con abbondant quantità d'acqua.
O.
Il [4B] SUB B ed il substrato di lavoro contengono dimetilformammide, una sostanza di cui è
stata relazionata la tossicità in dosi elevate e la possibile fetotossicità. Evitare il contatto
cutaneo, l'inalazione dei vapori e l'ingestione. In caso di contatto con la pelle, lavarsi
accuratamente con acqua e sapone e richiedere l'immediato intervento di un medico.
P.
Usare provette con tappo a vite per la preparazione dei campioni e dei controlli, in modo da
evitare gli schizzi e la potenziale contaminazione crociata dei campioni. Non usare provette
con tappo a pressione.
REQUISITI DI MANEGGIO E CONSERVAZIONE
A.
Non congelare i reagenti.
B.
Conservare le soluzioni RW, RL e RN a 2-25°C. Se sigillati, questi reagenti sono stabili fino alla
data di scadenza indicata.
C.
Conservare il MYCO MMX, l'AmpErase LD ed il MYCO IC a 2-8°C. Se sigillati, questi reagenti
sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Il reagente Master Mix di lavoro (ottenuto
addizionando l'AmpErase LD ed il MYCO IC al MYCO MMX) deve essere conservato a 2-8°C
ed è stabile per 1 settimana.
D.
Conservare l'MTB (+) C ed il MYCO (–) C a 2-8°C. Questi reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza indicata. I lotti di controllo devono essere preparati freschi ogni giorno.
E.
Conservare l'[1] DN, il [2] MYCO HYB ed il [5] STOP a 2-25°C. Questi reagenti sono stabili
fino alla data di scadenza indicata.
F.
Conservare la MTB MWP a 2-8°C nell'apposita confezione. La micropiastra MTB MWP è
stabile nella confezione sigillata fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperta la
confezione, la micropiastra è stabile per 3 mesi (oppure fino alla data di scadenza se
antecedente) se conservata nel sacchetto richiuso contenente essiccante.
G.
Conservare il [3] AV-HRP, il [4A] SUB A ed il [4B] SUB B a 2-8°C. Se sigillati, questi reagenti
sono stabili fino alla data di scadenza indicata. Una volta aperti, sono stabili per 3 mesi (oppure
fino alla data di scadenza se antecedente).
6
H.
Il substrato di lavoro deve essere preparato fresco miscelando il [4A] SUB A con il [4B] SUB
B ed è stabile a temperatura ambiente per 3 ore, se protetto dalla luce. Non esporre il
[4A] SUB A, il [4B] SUB B o il substrato di lavoro ai metalli, agli agenti ossidanti o alla luce
diretta.
I.
Conservare il 10X WB a 2-25°C. Il concentrato di lavaggio è stabile fino alla data di scadenza
indicata. Esaminare il 10X WB prima della diluizione e, se necessario, riscaldare a 30-37°C per
ridissolvere eventuali precipitati. La soluzione di lavaggio di lavoro (1X), preparata diluendo 10X
WB con acqua distillata o deionizzata, va conservata a 2-25°C in un contenitore di plastica
pulito e chiuso ed è stabile per due settimane a decorrere dalla data di preparazione.
MATERIALE FORNITO
AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) Test
A.
AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit
Kit di preparazione AMPLICOR dei campioni respiratori
(P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267)
RSP PREP
RW
(Soluzione di lavaggio dei campioni respiratori)
RL
(Reagente di lisi per i campioni respiratori)
RN
(Reagente di neutralizzazione dei campioni respiratori)
B.
AMPLICOR M. tuberculosis Positive Control
Controllo positivo AMPLICOR per M. tuberculosis
(P/N: 20756954 122; ART: 07 5695 4; US: 83263)
MTB CTL
MTB (+) C
[Controllo M. tuberculosis (+) alto]
C.
AMPLICOR Mycobacterium Amplification Kit
Kit di amplificazione AMPLICOR per Mycobacterium
(P/N: 20756784 122; ART: 07 5678 4; US: 83258)
MYCO AMP
MYCO MMX
(Master Mix Mycobacterium)
AmpErase LD
(Uracil-N-glicosilasi a DNA basso)
MYCO IC
(Controllo interno Mycobacterium)
MYCO (–) C
[Controllo Mycobacterium (–)]
D.
AMPLICOR M. tuberculosis Detection Kit
Kit di rilevazione AMPLICOR per M. tuberculosis
(P/N: 20757462 122; ART: 07 5746 2; US: 83275)
MTB MWP
(Micropiastra per M. tuberculosis)
[1] DN
(Soluzione di denaturazione)
[2] MYCO HYB
(Tampone di ibridazione per Mycobacterium)
[3] AV-HRP
(Coniugato di avidina-perossidasi di rafano)
[4A] SUB A
(Substrato A)
[4B] SUB B
(Substrato B)
[5] STOP
(Reagente di bloccaggio)
10X WB
(Concentrato di lavaggio 10X)
7
MTB MWP DK
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
Preamplificazione -Area di preparazione dei reagenti
•
Per il ciclatore termico Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9600, usare le provette
di reazione MicroAmp® (AB no N801-0533), i tappi (AB no N801-0535), il vassoio/
portaprovette (AB no 403081) e la base (AB no N801-0531)
•
Per il ciclatore termico Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400, usare le provette
di reazione MicroAmp (AB no N801-0533), i tappi (AB no N801-0535), il
vassoio/portaprovette (AB no N801-5530) e la base (AB no N801-5531)
•
Pipettatore a ripetizione Eppendorf Multipette® con serbatoio Combitip® da 1,25 ml (sterile,
a confezione individuale)
•
Pipettatori (capacità da 20 µl, 50 µl, 100 µl e 200 µl)* con puntali muniti di barriera
antiaerosol o ad erogazione positiva prive di ribonucleasi*
•
Guanti monouso, senza talco
•
Sacchetto in plastica richiudibile
Preamplificazione - Area di preparazione dei campioni
•
Provette in polipropilene da 1,5 ml, con tappo a vite, sterili, non siliconate (Sarstedt
72.692.105 o equivalenti)**
•
Rastrelliera portaprovette (Sarstedt 93.1428)
•
Pipette di trasferimento sterili prive di ribonucleasi, a punta sottile
•
Pipettatori (capacità da 50 µl, 100 µl e 1000 µl)* dotate di puntali con barriera antiaerosol o
ad erogazione positiva, privi di ribonucleasi*
•
Microcentrifuga (max. 16.000 RCF (forza centrifuga relativa) x g, min. 12.500 RCF x g);
Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, o equivalente
•
Vortex
•
Blocco termico da 60°C ± 2°C
•
Guanti in lattice monouso, senza talco
Postamplificazione - Area di amplificazione/rilevazione
•
Pipettatore multicanale (capacità da 25 µl e 100 µl) o pipettatore elettronico (Impact® o
AMPLICOR®)
•
Puntali per pipetta con barriera antiaerosol, privi di ribonucleasi , (capacità da 25 µl e 100 µl)
e senza barriera (100 µl)*
•
Ciclatore termico Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600 o 2400
•
Base MicroAmp e strumento tappaprovette da utilizzare con l' Applied Biosystems
GeneAmp PCR System 9600 o 2400
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Lavatore per micropiastre***
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Lettore per micropiastre****
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Serbatoio monouso per reagenti
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Coperchio per micropiastra
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Espulsore Costar® no 2578 per strisce da 96 pozzetti
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Incubatrice a 37°C ± 2°C
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Contenitori graduati
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Acqua distillata o deionizzata
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Guanti monouso, senza talco
*
I pipettatori devono essere accurati entro il 3% del volume dichiarato. Laddove specificato, è
necessario usare punte munite di barriera antiaerosol, prive di ribonucleasi o ad erogazione
positiva, in modo da evitare la contaminazione crociata del campione e dell'amplicon.
**
Usare provette con tappo a vite per la preparazione dei campioni e dei controlli, in modo da
evitare gli schizzi e la potenziale contaminazione crociata dei campioni e dei controlli. Non
usare provette con tappo a pressione.
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***
In grado di lavare micropiastre da 12 x 8 pozzetti con 250-300 µl di soluzione di lavaggio per
pozzetto, ad intervalli di 30 secondi.
****
Caratteristiche tecniche del lettore per micropiastre: larghezza di banda = 10 ± 3 nm; gamma
di assorbanza = da 0 a ³ 3,00 A450; ripetibilità = £ 1%; accuratezza = £ 3% da 0 a 3,00 A450;
scarto = £ 0,01 A450/h.
PRELIEVO, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
NOTA: Maneggiare tutti i campioni come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi
A.
Raccolta dei campioni
Gli unici campioni respiratori accettabili sono: (a) espettorato e sputo indotto; (b) materiale di lavaggio
bronchiale; e (c) materiale di lavaggio BAL raccolti in contenitori sterili in plastica. Questi campioni
devono essere liquefatti, decontaminati e concentrati impiegando i metodi NALC-NaOH22, NaOH22 o
SDS-NaOH23,24.
B.
Trasporto dei campioni
I campioni decontaminati devono essere trasportati al laboratorio entro 24 ore dalla raccolta,
mantenendoli a 2-25°C. Se non vengono spediti entro 24 ore, i campioni devono essere conservati e
spediti a -70°C. I campioni devono essere spediti in conformità alla normativa vigente in merito al
trasporto di agenti eziologici30.
C.
Conservazione dei campioni
I campioni decontaminati possono essere conservati a -70°C per un massimo di 8 mesi. I campioni
trattati possono essere conservati a -70°C per un massimo di 6 mesi o da 2° a 8°C per non più di
4 giorni.
ISTRUZIONI PER L'USO
NOTA: Questa procedura va eseguita in due aree del laboratorio (preamplificazione e
postamplificazione) secondo le modalità precisate nelle seguenti istruzioni.
NOTA: Se le fasi di preparazione, di amplificazione e di rilevazione dei campioni vengono
eseguite in un'unica giornata di lavoro, procedere come segue. Se invece la
preparazione dei campioni non avviene nello stesso giorno in cui si eseguono
l'amplificazione e la rilevazione, effettuare la preparazione dei reagenti (parte A) nello
stesso giorno in cui si eseguono l'amplificazione e la rilevazione (parte C).
NOTA: Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente prima dell'uso. Usare
pipettatori con punte dotate di barriera antiaerosol, oppure ad erogazione positiva
laddove specificato. Esercitare estrema cautela per garantire l'amplificazione selettiva.
A.
Preparazione dei reagenti
Eseguita nell'area di preamplificazione - preparazione dei reagenti
1. Determinare il numero di provette di reazione necessarie per le analisi dei campioni e dei
controlli. Collocare le provette nella vassoio dei campioni e bloccarle in sede con il fermo.
NOTA: Anche se non si effettua la rilevazione del controllo interno MYCO IC, esso va
addizionato al reagente MYCO MMX. Agitare al vortex la provetta di MYCO IC.
2. Preparare il reagente MYCO MMX di lavoro, addizionando 100 µl di MYCO IC e 100 µl di
enzima AmpErase LD in un flacone di MYCO MMX (la miscela è sufficiente per
32 amplificazioni). Non è necessario misurare il volume del Master Mix. Aggiungere 100 µl
di MYCO IC e 100 µl di enzima AmpErase LD all'intera fiala di MYCO MMX. Ritappare il
flacone del reagente Master Mix e miscelarne bene il contenuto, capovolgendo il flacone
10-15 volte. Registrare la data di preparazione sul flacone. Il reagente Master Mix di lavoro
(ottenuto addizionando l'enzima AmpErase LD ed il controllo interno MYCO IC al MYCO
MMX) conservato a 2-8°C è stabile per 1 settimana. Smaltire i flaconi vuoti di enzima
AmpErase LD e di MYCO IC.
3. Pipettare 50 µl di Master Mix di lavoro in ciascuna provetta di reazione usando un
pipettatore a Ripetizione o un pipettatore munito di punta dotata di barriera antiaerosol o
ad erogazione positiva. Non chiudere ancora i tappi delle provette di reazione.
4. Collocare il vassoio contenente il Master Mix di lavoro ed il numero necessario di tappi per
le provette di reazione in un sacchetto di plastica richiudibile. Chiudere bene il sacchetto e
trasferirlo nell'area di preamplificazione - preparazione dei campioni. Conservare i vassoi
contenenti il Master Mix di lavoro a 2-8°C nell'area di preamplificazione-preparazione dei
campioni sino alla conclusione della fase di preparazione dei campioni e dei controlli. Il
Master Mix di lavoro rimane stabile per 24 ore a 2-8°C nelle provette di reazione sigillate
nel sacchetto in plastica.
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B.
Preparazione dei campioni e dei controlli
Eseguita nell'area di preamplificazione - preparazione dei campioni e dei controlli
1. Determinare il numero di campioni da analizzare e predisporre sul piano di lavoro una
quantità di provette da 1,5 ml, in polipropilene con tappo a vite, sufficiente per i campioni
ed i controlli. Non usare provette con tappo a scatto. Vedere la sezione "Avvertenze e
precauzioni". Contrassegnare ciascuna provetta di preparazione del campione con
l'apposito numero di identificazione.
2. Addizionare 500 µl di soluzione di lavaggio RW in ciascuna provetta.
3. Mediante un pipettatore con puntale dotato di barriera antiaerosol, addizionare 100 µl di
campione respiratorio liquefatto, decontaminato e concentrato nella provetta
appositamente identificata, contenente la RW. Usare un nuovo puntale dotato di barriera
antiaerosol per ogni campione. Ritappare le provette e miscelarle al vortex per 5 secondi.
4. Centrifugare a > 12.500 x g per 10 minuti.
5. Aspirare il supernatante usando una pipetta di trasferimento a punta fine ed addizionare al
sedimento cellulare 100 µl di RL, usando una nuova pipetta dotata di barriera antiaerosol
per ogni campione. Miscelare al vortex per 5 secondi per rimettere il sospensione il
sedimento cellulare.
6. Preparare i controlli di lavoro nel modo seguente:
NOTA: I controlli di lavoro devono essere preparati freschi all'inizio di ogni giornata
di analisi e vanno smaltiti alla fine della giornata stessa.
a)
Agitare al vortex per 5 secondi il flacone di MYCO (–) C. Pipettare 100 µl di
MYCO (–) C in una provetta da 1,5 ml, in polipropilene, usando un pipettatore con
punta dotata di barriera antiaerosol. Addizionare 400 µl di RL. Agitare al vortex per
5 secondi. Questo è il controllo negativo di lavoro dei Mycobacterium.
b) Agitare al vortex per 5 secondi il flacone di MTB (+) C. Pipettare 100 µl di MTB (+) C
in una provetta da 1,5 ml, in polipropilene, usando un pipettatore con punta dotata di
barriera antiaerosol. Addizionare 400 µl di RL. Agitare al vortex per 5 secondi. Questo
è il controllo positivo di lavoro di M. tuberculosis.
c)
Pipettare 100 µl di ciascun controllo di lavoro in provette separate da 1,5 ml, in
polipropilene con tappo a vite, da analizzare parallelamente ai campioni clinici.
7. Incubare i campioni e i controlli in un blocco termico asciutto a 60°C ± 2°C per 45 minuti.
8. Rimuovere le provette dal blocco termico e centrifugarle a impulsi per 5 secondi in modo
da eliminare la condensazione dai tappi.
9. Usando una pipetta con punta munita di barriera antiaerosol, addizionare 100 µl di RN in
ciascuna provetta di campioni e controlli. Agitare al vortex per 5 secondi a velocità
dimezzata. Usare un puntale nuovo dotato di barriera antiaerosol per ogni campione.
10. Mediante un pipettatore con puntali dotati di barriera antiaerosol, trasferire 50 µl cadauno
di ciascun campione preparato, controllo positivo di lavoro di M. tuberculosis e controllo
negativo di lavoro di Mycobacterium nelle appropriate provette di reazione contenenti il
Master Mix di lavoro. Evitare con cura di trasferire sedimenti non rimessi in sospensione.
Tappare le provette. Registrare sulla scheda del vassoio la posizione dei campioni dei
pazienti e dei relativi controlli.
11. Trasferire le rastrelliere di campioni preparati (campioni dei pazienti e controlli) nell'area di
amplificazione/rilevazione. Questi campioni pronti per la PCR possono essere
conservati a 2-8°C per non più di 8 ore.
10
C.
Amplificazione
Eseguite nell'area di postamplificazione - amplificazione/rilevazione
NOTA: Mettere sotto tensione il ciclatore termico Applied Biosystems GeneAmp PCR
System 9600 o 2400 almeno 30 minuti prima di iniziare l'amplificazione.
1. Inserire il vassoio/fermaprovette nel blocco dei campioni del ciclatore termico.
2. Programmare come segue il sistema Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600 o
2400 ai fini del test AMPLICOR MTB:
Programma HOLD:
10 minuti a 50°C
Programma CYCLE (2 cicli): 20 secondi a 98°C; 20 secondi a 62°C; 45 secondi a 72°C
Programma CYCLE (41 cicli): 20 secondi a 94°C; 20 secondi a 62°C; 45 secondi a 72°C
D.
Programma HOLD:
5 minuti a 72°C
Programma HOLD:
72°C SEMPRE (PER NON PIU' DI 24 ORE)
Nei programmi CYCLE lasciare i tempi di rampa sul valore predefinito (0:00) che
corrisponde alla velocità massima e l'errore permesso del punto di riferemento sul valore
predefinito de 2ºC.
Unire i 5 programmi in un unico programma METHOD.
Per ulteriori informazioni relative alla programmazione e all'uso del ciclatore termico,
consultare il Manuale d'Uso Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600 o GeneAmp
PCR System 2400.
3. Avviare il programma METHOD. Il programma dura circa 2 ora e 30 minuti. I campioni ed i
controlli devono essere rimossi entro 24 ore dall'inizio del programma HOLD finale.
4. Rimuovere dal ciclatore termico il vassoio in qualsiasi momento durante il programma
HOLD finale, collocarlo sulla base e poi intraprendere immediatamente il passo 5.
NON TRASFERIRE I CAMPIONI AMPLIFICATI NELL'AREA DI PREAMPLIFICAZIONE.
I CONTROLLI ED I CAMPIONI AMPLIFICATI DEVONO ESSERE CONSIDERATI UNA
FONTE PRINCIPALE DI CONTAMINAZIONE POTENZIALE.
5. Stappare le provette evitando la formazione di aerosol dei prodotti amplificati. Pipettare
immediatamente 100 µl di [1] DN nella prima colonna (o riga) di provette di reazione
usando un pipettatore multicanale completo di puntali dotati di barriera antiaerosol e
miscelare pipettando su e giù. Ripetere questa procedura per ciascuna colonna (o riga),
usando ogni volta un gruppo nuovo di puntali. Incubare per 10 minuti a temperatura
ambiente per consentire il completamento della denaturazione.
6. L'amplicon denaturato può essere conservato a temperatura ambiente per non più di 2 ore
prima di sottoporlo alla rilevazione (parte D). Se non fosse possibile effettuare la reazione
di rilevazione entro 2 ore, ritappare le provette e conservare l'amplicon denaturato a 2-8°C
per non più di una settimana.
Rilevazione
Eseguite nell'area di postamplificazione - amplificazione/rilevazione
NOTA: Attenersi a questa procedura per rilevare l'amplicon di MTB e del controllo
interno MYCO. Per la rilevazione utilizzare in maniera appropriata la micropiastre
MTB MWP e del controllo interno. Per la micropiastra del controllo interno,
utilizzare il tampone [2] MYCO HYB fornito assieme al kit di rilevazione
AMPLICOR M. tuberculosis.
NOTA: Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente.
1. Preparare la soluzione di lavaggio di lavoro (1X) nel modo seguente. Esaminare il 10X WB
e, se necessario, riscaldare a 30-37°C per ridissolvere il precipitato. Aggiungere una parte
di 10X WB in 9 volumi di acqua deionizzata o distillata. Miscelare bene. Ai fini del lavaggio
manuale, preparare 40 ml di soluzione di lavaggio di lavoro per ciascuna striscia da otto
pozzetti della micropiastra. Ai fini del lavaggio automatizzato, preparare la quantità di
soluzione di lavaggio richiesta dal modello di lavatore per micropiastre in dotazione. La
soluzione di lavaggio di lavoro va conservata a 2-25°C in un contenitore in plastica pulito
e chiuso ed è stabile per 2 settimane a decorrere dalla data di preparazione.
11
2. Porta a temperatura ambiente le micropiastre MTB MWP ed IC MWP prima di estrarle
dalla confezione. Estrarre il numero necessario di strisce da 8 pozzetti dalla bustina e
disporle sul telaio della micropiastra. Richiudere le strisce non utilizzate nella relativa
confezione, assieme all'essiccante. (NOTA: le strisce MWP devono essere maneggiate
con cautela per evitarne la rottura). Per estrarre le strisce dal telaio, centrare la
micropiastra sull'espulsore Costar 96 ed esercitare una pressione uniforme contro gli
angoli del telaio. Per bloccare le strisce in posizione, porre l'espulsore Costar 96 sopra le
strisce ed esercitare una pressione uniforme contro le strisce stesse.
3. Addizionare 100 µl di [2] MYCO HYB in ciascun pozzetto della micropiastra da testare.
NOTA: Se l'amplicon denaturato è stato conservato a 2-8°C, incubarlo a 37°C per
2-4 minuti in modo da ridurne la viscosità.
4. Con una pipetta con puntale dotato di barriera antiaerosol, addizionare 25 µl di amplicon
denaturato nei pozzetti corrispondenti della micropiastra. Percuotere leggermente la
piastra 10-15 volte finché il colore non vira dal blu al giallo chiaro (questo cambiamento
cromatico indica l'avvenuta miscelazione).
5. Coprire la micropiastra MWP con l'apposito coperchio ed incubarla per 1 ora e mezzo a
37°C ±2°C.
6. Lavare la piastra manualmente o per mezzo di un lavatore automatico, usando la soluzione
di lavaggio di lavoro.
Per il lavaggio manuale:
a. Svuotare il contenuto della micropiastra e asciugare la micropiastra stessa
percuotendola delicatamente sopra un asciugamano di carta.
b. Pipettare la soluzione di lavaggio di lavoro riempiendo ciascun pozzetto fino
all'orlo (250-300 µl). Lasciare riposare per 30 secondi. Svuotare il contenuto ed
asciugare la micropiastra percuotendola.
c. Ripetere il passo (b) altre 4 volte.
Per effettuare il lavaggio automatico, programmare il lavatore come segue:
a. Aspirare il contenuto dei pozzetti.
b. Riempire fino all'orlo ciascun pozzetto con la soluzione di lavaggio di lavoro (circa
250-300 µl a seconda dell'apparecchio utilizzato). Lasciare riposare per 30 secondi
ed asciugare per aspirazione.
c. Ripetere il passo (b) altre 4 volte.
d. Una volta completato il lavaggio automatico, asciugare la micropiastra
percuotendola.
7. Addizionare 100 µl di [3] AV-HRP in ciascun pozzetto. Coprire la micropiastra ed incubarla
per 15 minuti a 37°C ±2°C.
8. Preparare la soluzione di substrato di lavoro miscelando 2,0 ml di [4A] SUB A e 0,5 ml di
[4B] SUB B per ciascun multiplo di due strisce da 8 pozzetti (16 test). Preparare questo
reagente non più di tre ore prima dell'uso. Conservarlo a temperatura ambiente e
proteggerlo dall'esposizione alla luce diretta.
9. Lavare la piastra come descritto nel passo 6.
10. Addizionare 100 µl della soluzione di substrato di lavoro in ciascun pozzetto da analizzare
(pipettatore elettronico AMPLICOR, programma 2).
11. Attendere per 10 minuti il viraggio cromatico, mantenendo la micropiastra a temperatura
ambiente (20-25°C) ed al buio.
12. Addizionare 100 µl di [5] STOP in ciascun pozzetto (pipettatore elettronico AMPLICOR,
programma 2).
13. Misurare l'asssorbanza a 450 nm entro 30 minuti dall'addizione del reagente di bloccaggio
[5] STOP. Registrare i valori di assorbanza per ciascun campione clinico e per ciascun
controllo analizzato.
12
CONTROLLO DI QUALITA'
Includere in ogni lotto di campioni almeno un duplicato del controllo positivo MTB (+) e tre del
controllo negativo MYCO (-). Com'è il caso con qualsiasi procedura nuova di laboratorio, i nuovi
operatori dovrebbero considerare l'uso di ulteriori controlli positivi e negativi ogni volta che eseguono
il test e finché non conseguono un elevato livello di fiducia nelle proprie capacità di svolgimento
corretto della procedura. La posizione dei controlli nel vassoio MicroAmp è del tutto facoltativa.
Controllo negativo
Il risultato del test del controllo negativo MYCO (–) deve essere inferiore a 0,25 unità A450. Se
l'assorbanza del controllo negativo è pari o superiore a 0,25 unità A450, la serie deve essere
considerata inaccettabile e bisogna ripetere l'intera procedura di test (preparazione del campione,
amplificazione e rilevazione). Se l'assorbanza del controllo negativo MYCO (–) è consistentemente
superiore a 0,35 A450, richiedere assistenza tecnica all'ufficio locale Roche.
Controllo positivo
Il risultato del test del controllo positivo MTB (+) deve essere pari o superiore a 2,0 unità A450. Se
l'assorbanza del controllo positivo è inferiore a 2,0 unità A450, la serie deve essere considerata
inaccettabile e bisogna ripetere l'intera procedura di test (preparazione del campione, amplificazione
e rilevazione). Se l'assorbanza del controllo positivo MTB (+) è consistentemente inferiore a 2,0 A450,
richiedere assistenza tecnica all'ufficio locale Roche.
Controllo della preparazione dei campioni
Per verificare l'efficacia della preparazione dei campioni (si consiglia di effettuare questa verifica una
volta al mese) si devono prima preparare e poi analizzare, come se fossero un campione clinico,
104 cellule di M. tuberculosis, attenendosi alle indicazioni offerte nella parte B, "Preparazione dei
campioni" della sezione Preparazione dei campioni e dei controlli. Quando si prepara correttamente
il campione, con il test AMPLICOR MTB si ottiene un'assorbanza > 0,35 A450.
RISULTATI
Interpretazione dei risultati senza rilevazione del controllo interno
1.
Accertarsi che i valori dei controlli della serie siano accettabili. Se la serie risulta inaccettabile,
ripetere l'intera procedura (preparazione del campione, amplificazione e rilevazione ).
2.
In una serie accettabile, i risultati dei campioni vanno interpretati nel modo seguente:
A450
INTERPRETAZIONE
<0,35
DNA di MTB non rilevato. Il campione è presunto MTB negativo.
Un risultato negativo non esclude la presenza di una infezione da MTB,
poiché i risultati dipendono da un adeguato prelievo dei campioni,
dall'assenza di inibitori e dalla presenza di una quantità rilevabile di DNA.
³0,35
DNA di MTB rilevato. Il campione è MTB positivo.
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Interpretazione dei risultati con rilevazione del controllo interno
1.
Assicurarsi che i valori dei controlli della serie siano accettabili. Se la serie risulta inaccettabile,
ripetere l'intero procedimento (preparazione del campione, amplificazione e rilevazione ).
2.
In una serie accettabile, i risultati dei campioni vanno interpretati come segue:
Risultati
MTB
A450
Risultati del
Controllo Interno
A450
<0,35
³0,35
DNA di MTB non rilevato. Il campione è presunto MTB
negativo. Un risultato negativo non esclude la presenza di
una infezione da MTB, poiché i risultati dipendono da un
adeguato prelievo dei campioni, dall'assenza di inibitori e
dalla presenza di una quantità rilevabile di DNA.
<0,35
<0,35
Campione inibito. L'DNA di MTB, se presente, non è
rilevabile. Preparare un'altra aliquota del campione
originale e ripetere il test. Spesso gli inibitori sono labili ed
i campioni inizialmente inibiti possono non esserlo più
quando vengono rianalizzati. Se il campione originale non
risulta disponibile, prelevarne uno nuovo.
³0,35
QUALSIASI
INTERPRETAZIONE
DNA di MTB rilevato. Il campione è MTB positivo.
PRECAUZIONI PROCEDURALI
1.
Il flusso di lavoro di laboratorio deve procedere in modo unidirezionale, cominciando nell'area
di preamplificazione (preparazione dei reagenti/campioni e preparazione dei controlli) per poi
passare all'area di postamplificazione (amplificazione/rilevazione). Le attività di
preamplificazione devono iniziare con la preparazione del reagente e procedere con la
preparazione del campione. Le forniture e le attrezzature devono essere dedicate a ciascuna
attività di preamplificazione e non devono essere usate per altre attività né spostate da un'area
all'altra. Indossare guanti in ciascuna area e cambiarli prima di uscire da tale area. Le forniture
e le attrezzature usate per la preparazione del reagente non devono essere usate per le attività
di preparazione dei campioni, per il pipettamento né per il trattamento del DNA amplificato o
di altre fonti di DNA bersaglio. Le forniture e le attrezzature di postamplificazione devono
rimanere sempre in tale area.
2.
Com'è il caso con qualsiasi procedura
laboratorio ai fini dello svolgimento di
questo test, esercitare estrema cautela
miscele di amplificazione. E' necessario
Gettare via qualsiasi reagente sospetto.
di test, è essenziale osservare una buona prassi di
questa analisi. Vista l'elevata sensibilità analitica di
nel preservare la purezza dei reagenti del kit e delle
monitorare attentamente la purezza di tutti i reagenti.
LIMITI DELLA PROCEDURA
1.
Il test AMPLICOR MTB è stato convalidato per l'uso solamente con campioni respiratori umani,
quali l'espettorato e lo sputo indotto, il materiale di lavaggio bronchiale e BAL, che siano stati
liquefatti, decontaminati e concentrati impiegando i metodi NALC-NaOH22 NaOH22 o
SDS-NaOH23,24. L'analisi di altri tipi di campioni può dare risultati falsonegativi o falsopositivi.
2.
L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure di prelievo e trasporto, della
conservazione e della preparazione dei campioni.
3.
La rilevazione di M. tuberculosis dipende dal numero di microrganismi presenti nel campione
e può essere influenzata dai metodi di prelievo del campione, da fattori legati al paziente (ad
es., età, sintomatologia) e/o dallo stadio dell'infezione.
4.
E' possibile ottenere risultati falsonegativi imputabili all'inibizione della polimerasi. Il controllo
interno del Mycobacterium è stato aggiunto al test AMPLICOR MTB per permettere di
identificare i campioni trattati contenenti sostanze che possono interferire con l'amplificazione
PCR.
14
5.
La presenza dell'enzima AmpErase nell'MTB Master Mix riduce il rischio di contaminazione
dell'amplicon. Comunque, la contaminazione da parte di controlli e di campioni clinici MTBpositivi può essere evitata soltanto grazie ad una buona prassi di laboratorio ed all'attenta
aderenza alle procedure specificate in questo inserto.
6.
Non è stata stabilita l'interferenza da parte di sostanze endogene ed esogene.
7.
Come con tutti i test diagnostici, i risultati del test AMPLICOR MTB devono essere interpretati
alla luce del quadro clinico e di laboratorio complessivo.
8.
L'uso di questo prodotto è limitato al personale specializzato nelle tecniche di PCR.
9.
Questo prodotto può essere usato solamente con i ciclatori termici Applied Biosystems
GeneAmp PCR System 9600 o 2400.
CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO
A.
Specificità
La specificità analitica del test AMPLICOR MTB è stata valutata analizzando i seguenti batteri o virus,
molti dei quali fanno parte della flora normale o dei patogeni comuni delle vie respiratorie. Tutti i batteri
isolati sono stati analizzati usando 107 cellule/ml o l'equivalente di 106 copie di acido nucleico/PCR.
I virus isolati sono stati analizzati ai livelli di PFU/PCR indicati sotto. Clamidia isolati sono state
analizzati ai livelli di IFU/PCR indicati sotto. Nessuno dei ceppi isolati è risultato positivo al test
AMPLICOR MTB.
Specie micobatteriche:
Ceppi simili al Mycobacterium terrae
Mycobacterium asiaticum
Mycobacterium aurum
Mycobacterium avium
Mycobacterium celatum
Mycobacterium chitae
Mycobacterium cookii
Mycobacterium fallax
Mycobacterium flavescens
Mycobacterium fortuitum
Mycobacterium gastri
Mycobacterium genavense
Mycobacterium gordonae
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium komassense
Mycobacterium leprae
Specie diverse dalla Mycobacterium:
Acinetobacter calcoaceticus
Actinomadura madurae
Actinomyces pyogenes
Actinoplanes italicus
Aeromanas hydrophila
Arcanobacterium haemolyticum
Arthrobacter oxydans
Bacillus subtilis
Bacteriodes fragilis
Blastomyces dermatitidis
Bordetella parapertussis
Bordetella pertussis
Branhamella (Moraxella) catarrhalis
Brevibacterium linens
Campylobacter jejuni
Candida albicans
Chromobacterium violaceum
Citrobacter freundii
Clostridium perfringens
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium
malmoense
marinum
neoaurum
nonchromogenicum
phlei
scrofulaceum
senegalens
simiae
smegmatis
sphagni
szulgai
terrae
thermoresistibile
triviale
xenopi
Coccidiodes immitis
Corynebacterium aquaticum
Corynebacterium diphtheriae
Corynebacterium flavescens
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium jeikeium
Corynebacterium minutissimum
Corynebacterium pseudodiphetheriticuma
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium renale
Corynebacterium striatum
Corynebacterium xerosis
Cryptococcus neoformans
Deinococcus radiudurans
Dermotophilus congolensis
Eikenella corrodens
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
15
Escherichia coli
Fusobacterium nucleatum
Gordona sputi
Haemophilus influenza
Haemophilus parainfluenzae
Histoplasma capsulatum
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae sottosp. ozaneae
Lactobacillus casei
Legionella micdadei
Legionella pneumophila
Microbacterium lactamica
Mycoplasma hominis
Mycoplasma pneumonia
Nocardia transvalensi
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis
Nocardia asteroides
Nocardia brasiliensis
Nocardia farcinica
Nocardia nova
Nocardia otidisscaviarum
Oerskovia turbata
Peptococcus niger
Peptostreptococcus anaerobius
Peptostreptococcus magnus
Pneumocyostis carinii
Porphyromonas asaccharolytic
Porphyromonas gingivalis
Prevotella melaninogenica
Propionibacterium acnes
Proteus mirabilis
Pseudmonas aeruginosa
Rhodococcus aichiensis
Rhodococcus bronchialis
Rhodococcus chubuensis
Rhodococcus equi
Salmonella cholerasuis sottospecie cholerasuis
Serratia marcenscens
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus gordonii
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptomices griseinus
Veillonella atypica
Veillonella parvula
Vibrio parahaemolyticus
Xanthomonas maltophilia
Yersinia enterocolitica
Ceppi virali isolati:
VIRUS
Analizzato con PFU/PCR
Adenovirus
Cytomegalovirus
Enterovirus
Herpes Simplex I
Influenza B
Parainfluenza 2
Virus sinciziale respiratorio
Rhinovirus 14
3,2 x 105
98
5,6 x 105
5,6 x 105
Ignoto*
2,8 x 105
28
2,8 x 104
* Questo campione è stato prelevato da un paziente tramite
lavaggio faringeo.
Ceppi clamidiali isolati:
B.
Specie di clamidia
Analizzata con IFU/PCR
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis
188
88
Sensibilità analitica
DNA purificato
Nella determinazione della sensibilità analitica per il DNA bersaglio purificato, il test AMPLICOR MTB
si è dimostrato capace di rilevare in modo riproducibile 5 o più copie di DNA purificato di
M. tuberculosis per ogni reazione PCR. Il numero di copie di DNA di M. tuberculosis usate in questo
esperimento è stato determinato tramite analisi di Poisson.
16
Cellule di M. tuberculosis
La sensibilità analitica del test AMPLICOR MTB è stata inoltre valutata diluendo cellule di
M. tuberculosis (ATCC no 25177) in sputo negativo. I livelli cellulari in esame sono risultati compreso
tra 12.800 CFU/ml e 40 CFU/ml. Mediante il test AMPLICOR MTB, sono stati estratti e analizzati cento
microlitri (100 µl) di ogni livello cellulare. Il test AMPLICOR MTB si è dimostrato capace di rilevare in
modo riproducibile la presenza di M. tuberculosis ad un livello > 1600 CFU/ml, equivalente a 40 cellule
di M. tuberculosis per ogni PCR.
C.
Precisione
La precisione nella serie, interserie, tra un giorno e l'altro e la precisione totale del test AMPLICOR
MTB è stata determinata per i DNA del controllo positivo di M. tuberculosis (+) e del controllo interno
di Mycobacterium. Ogni controllo positivo di M. tuberculosis (+) è stato amplificato con 20 copie di
controllo interno di Mycobacterium presenti nella reazione di amplificazione. Nel corso di dieci giorni,
sono state analizzate due determinazioni multiple di ogni concentrazione di DNA, una volta al giorno
in ciascuna delle due serie separate. Di conseguenza, 4 determinazioni multiple per ogni
concentrazione di DNA sono state effettuate ogni giorno per un totale di 40 test. I calcoli della
precisione del test sono stati eseguiti in conformità alle direttive NCCLS EP5-A. I risultati di questo
studio sono riassunti nelle tabelle 1 e 2.
Tabella 1
Precisione del test AMPLICOR MTB usando il controllo positivo di M. tuberculosis (+)
Numero di copie MTB per PCR
Precisione
0
5
10
20
40
0,047
0,038
0,064
40
3,760
2,642
4,000
40
3,814
2,073
4,000
40
3,869
2,448
4,000
DA UN GIORNO ALL'ALTRO
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,00001
0,00280
6,0%
0,045
0,212
5,6%
0,048
0,220
5,8%
0,053
0,229
5,9%
INTERSERIE
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,00002
0,00442
9,4%
0,057
0,239
6,3%
0,094
0,306
8,0%
0,050
0,223
5,8%
NELLA SERIE
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,00001
0,00263
5,6%
0,046
0,214
5,7%
0,019
0,136
3,6%
0,006
0,076
2,0%
TOTALE
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,00003
0,00585
12,5%
0,148
0,384
10,2%
0,160
0,401
10,5%
0,108
0,329
8,5%
o
N totale duplicati
Assorbanza media
Valore minimo
Valore massimo
NOTA: I calcoli di cui sopra sono stati basati sulle direttive NCCLS (EP5-A)
relative alla precisione nella serie ed alla precisione totale. Le stime
della varianza sono state generate in base ad un'analisi del modello
di varianza prevedente i fattori Giorni, Serie (lo stesso giorno) e
Duplicato (nella serie, lo stesso giorno). Le stime della varianza sono
state ottenute risolvendo le espressioni quadratiche medie previsti
per i componenti della varianza.
17
Tabella 2
Precisione del test AMPLICOR MTB usando il controllo interno di Mycobacterium
Precisione
N totale duplicati
Assorbanza media
Valore minimo
Valore massimo
Numero di copie del controllo interno
Myco IC (MTB) per PCR
20 (0)
20 (5)
20 (10)
20 (20)
40
40
40
40
3,822
3,880
3,905
3,925
2,048
2,136
2,186
2,513
4,000
4,000
4,000
4,000
DA UN GIORNO ALL'ALTRO
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,028
0,167
4,4%
0,050
0,223
5,7%
0,043
0,207
5,3%
0,008
0,092
2,3%
INTERSERIE
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,134
0,366
9,6%
0,123
0,351
9,0%
0,028
0,166
4,3%
0,034
0,183
4,7%
NELLA SERIE
Varianza
Standard Deviation
Coefficiente di variazione
0,058
0,240
6,3%
0,003
0,059
1,5%
0,034
0,184
4,7%
0,028
0,169
4,3%
TOTALE
Varianza
Deviazione standard
Coefficiente di variazione
0,219
0,468
12,3%
0,176
0,420
10,8%
0,105
0,323
8,3%
0,070
0,265
6,8%
o
NOTA: I calcoli di cui sopra sono stati basati sulle direttive NCCLS (EP5-A)
relative alla precisione nella serie ed alla precisione totale. Le stime
della varianza sono state generate in base ad un'analisi del modello
di varianza prevedente i fattori Giorni, Serie (lo stesso giorno) e
Duplicato (nella serie, lo stesso giorno). Le stime della varianza sono
state ottenute risolvendo le espressioni quadratiche medie previsti
per i componenti della varianza.
D.
Prestazioni cliniche
Il test AMPLICOR MTB è stato valutato nel corso di studi clinici eseguiti in sei centri. In tutti i centri è
stato usato il controllo interno di Mycobacterium. I risultati dello striscio AFB e della coltura
micobatterica sono stati documentati per 5231 campioni. Tra i campioni colturati, 337 sono risultati
positivi al complesso M. tuberculosis.
I risultati per campione sono stati calcolati confrontando il risultato del test AMPLICOR MTB con
quello della coltura dello stesso campione. Le discrepanze dei risultati tra la coltura di M. tuberculosis
ed il test AMPLICOR dei campioni sono state risolte esaminando le cartelle cliniche dei pazienti e,
quando il campione era in quantità sufficiente, ritestandone la presenza di M. tuberculosis mediante
la PCR di un'altra sequenza bersaglio di DNA, specifica all'M. tuberculosis [superossido dismutasi
(SOD) gene31].
Il rendimento del test è stato calcolato in due modi. Per valutare il rendimento senza usare il controllo
interno, i campioni sono stati interpretati mettendo a confronto il risultato ottenuto con il test
AMPLICOR MTB e quello della coltura (tabella 3). Per calcolare il rendimento usando il controllo
interno, i campioni inibiti sono stati interpretati come positivi o negativi in base ai risultati della
ripetizione del test. In caso di inibizione persistente, dopo il riesame i campioni sono stati considerati
inadeguati ed esclusi dai calcoli della sensibilità e della specificità dei risultati del test AMPLICOR
MTB confrontati a quelli della coltura (tabella 4).
18
Tabella 3
Rendimento per campione del test AMPLICOR MTB senza controllo interno
vs Coltura
Centro
Campioni
Categoria
Tuti campioni
1
France
N
Prevalenza
Sensibilità
Spezificità
Sensitivität
Spezifität
PPV*
NPV**
1026
8.8%
90/1026
76.7%
69/90
95.6%
895/936
82.9%
92/111
98.0%
897/915
83.6%
92/110
97.9%
897/916
64
78.1%
50/64
98.0%
49/50
35.7%
5/14
98.3%
58/59
100.0%
5/5
100.0%
58/58
83.3%
5/6
962
4.2%
40/962
50.0%
20/40
96.5%
890/922
65.4%
34/52
98.0%
892/910
65.4%
34/52
98.0%
892/910
869
6.4%
56/869
85.7%
48/56
98.4%
800/813
88.2%
60/68
99.9%
800/801
98.4%
60/61
99.0%
800/808
36
83.3%
30/36
90.0%
27/30
66.7%
4/6
90.6%
29/32
100.0%
4/4
100.0%
29/29
57.1%
4/7
833
3.1%
26/833
80.8%
21/26
98.6%
796/807
86.1%
31/36
99.9%
796/797
96.9%
31/32
99.4%
796/801
758
4.2%
32/758
90.6%
29/32
100.0%
726/726
90.6%
29/32
100.0%
726/726
100.0%
29/29
99.6%
726/729
11
81.8%
9/11
88.9%
8/9
100.0%
2/2
88.9%
8/9
100.0%
2/2
100.0%
8/8
66.7%
2/3
747
3.1%
23/747
91.3%
21/23
100.0%
724/724
91.3%
21/23
100.0%
724/724
100.0%
21/21
99.7%
724/726
607
1.5%
9/607
100.0%
9/9
99.5%
595/598
100.0%
10/10
99.7%
595/597
83.3%
10/12
100.0%
595/595
12
16.7%
2/12
100.0%
2/2
90.0%
9/10
100.0%
2/2
90.0%
9/10
66.7%
2/3
100.0%
9/9
595
1.2%
7/595
100.0%
7/7
99.7%
586/588
100.0%
8/8
99.8%
586/587
88.9%
8/9
100.0%
586/586
1048
5.6%
59/1048
89.8%
53/59
99.1%
980/989
89.4%
59/66
99.7%
979/982
95.2%
59/62
99.3%
979/986
58
79.3%
46/58
97.8
45/46
50.0%
6/12
98.1%
51/52
100.0%
6/6
100.0%
51/51
85.7%
6/7
990
1.3%
13/990
9.9%
91/923
61.5%
8/13
79.1%
72/91
99.7%
974/977
99.9%
831/832
57.1%
8/14
79.3%
73/92
99.7%
973/976
100.0%
831/831
72.7%
8/11
100.0%
73/73
99.4%
973/979
97.8%
831/850
68
79.4%
54/68
88.9
48/54
100.0%
14/14
88.9%
48/54
100.0%
14/14
100.0%
48/48
70.0%
14/20
855
4.3%
37/855
6.4%
337/5231
64.9%
24/37
113.4%
280/247
99.9%
817/818
98.6%
4827/4894
65.8%
25/38
85.2%
323/379
100.0%
817/817
99.5%
4828/4852
100.0%
25/25
93.1%
323/347
98.4%
817/830
98.9%
4828/4884
249
76.7%
191/249
93.7
179/191
69.0%
40/58
94.2%
196/208
97.6%
40/41
99.5%
196/197
76.9%
40/52
4982
2.9%
146/4982
69.2%
101/146
99.0%
4787/4836
74.3%
127/171
99.5%
4788/4811
84.7%
127/150
99.1%
4788/4832
Striscio +
Striscio Tuti campioni
2
Spain
Striscio +
Striscio Tuti campioni
3
Germany Striscio +
Striscio Tuti campioni
4
Holland
Striscio +
Striscio Tuti campioni
5
Canada
Striscio +
Striscio Tuti campioni
6
Italy
923
Striscio +
Striscio Tuti campioni
TOTALI
5231
Striscio +
Striscio -
vs Risultati Risolti
* PPV = Positive Predictive Value = valore profetico positivo
** NPV = Negative Predictive Value = valore profetico negativo
19
Tabella 4
Rendimento per campione del test AMPLICOR MTB con controllo interno
vs Coltura
Centro
1
France
N
Sensibilità
Specificità
PPV*
NPV**
Tuti campioni
1026
8.8%
90/1026
3.9%
40/1026
80.2%
69/86
95.4%
849/890
85.3%
93/109
97.8%
858/877
83.0%
93/112
98.2%
858/874
64
78.1%
50/64
0.0%
0/64
98.0%
49/50
35.7%
5/14
98.3%
58/59
100.0%
5/5
100.0%
58/58
83.3%
5/6
962
4.2%
40/962
4.2%
40/962
55.6%
20/36
96.3%
844/876
70.0%
35/50
97.8%
853/872
64.8%
35/54
98.3%
853/868
869
6.4%
56/869
2.8%
24/869
85.7%
48/56
98.3%
742/755
88.2%
60/68
99.6%
774/777
95.2%
60/63
99.0%
774/782
36
83.3%
30/36
0.0%
0/36
90.0%
27/30
66.7%
4/6
90.6%
29/32
100.0%
4/4
100.0%
29/29
57.1%
4/7
833
3.1%
26/833
2.9%
24/833
80.8%
21/26
98.5%
738/749
86.1%
31/36
99.6%
770/773
91.2%
31/34
99.4%
770/775
758
4.2%
32/758
1.2%
9/758
90.6%
29/32
100.0%
710/710
90.6%
29/32
100.0%
717/717
100.0%
29/29
99.6%
717/720
11
81.8%
9/11
0.0%
0/11
88.9%
8/9
100.0%
2/2
88.9%
8/9
100.0%
2/2
100.0%
8/8
66.7%
2/3
747
3.1%
23/747
1.2%
9/747
91.3%
21/23
100.0%
708/708
91.3%
21/23
100.0%
715/715
100.0%
21/21
99.7%
715/717
607
1.5%
9/607
1.0%
6/607
100.0%
9/9
99.5%
582/585
100.0%
10/10
99.7%
589/591
83.3%
10/12
100.0%
589/589
12
16.7%
2/12
0.0%
0/12
100.0%
2/2
90.0%
9/10
100.0%
2/2
90.0%
9/10
66.7%
2/3
100.0%
9/9
595
1.2%
7/595
1.0%
6/595
100.0%
7/7
99.7%
573/575
100.0%
8/8
99.8%
580/581
88.9%
8/9
100.0%
580/580
1048
5.6%
59/1048
1.1%
12/1048
89.8%
53/59
99.1%
957/966
89.4%
59/66
99.7%
967/970
95.2%
59/62
99.3%
967/974
58
79.3%
46/58
0.0%
0/58
97.8%
45/46
50.0%
6/12
98.1%
51/52
100.0%
6/6
100.0%
51/51
85.7%
6/7
990
1.3%
13/990
9.9%
91/923
1.2%
12/990
2.3%
21/923
61.5%
8/13
79.1%
72/91
99.7%
951/954
99.9%
805/806
57.1%
8/14
79.3%
73/92
99.7%
961/964
100.0%
810/810
72.7%
8/11
100.0%
73/73
99.4%
961/967
97.7%
810/829
68
79.4%
54/68
0.0
0/68
88.9%
48/54
100.0%
14/14
88.9%
48/54
100.0%
14/14
100.0%
48/48
70.0%
14/20
855
4.3%
37/855
6.4%
337/5231
2.5%
21/855
2.1%
112/5231
64.9%
24/37
84.1%
280/333
249
76.7%
191/249
0.0%
0/249
93.7%
179/191
4982
2.9%
146/4982
2.2%
112/4982
71.1%
101/142
Striscio +
Striscio Tuti campioni
2
Spain
Striscio +
Striscio Tuti camioni
3
Germany Striscio +
Striscio Tuti camioni
4
Holland
Striscio +
Striscio Tuti camioni
5
Canada Striscio +
Striscio Tuti camioni
6
Italy
vs Risultati Risolti
Campioni
Categoria
923
Striscio +
Striscio Tuti camioni
TOTALI
5231
Striscio +
Striscio -
Prevalenza Inibizione
99.9%
65.8%
791/792
25/38
98.6%
85.9%
4645/4712 324/377
69.0%
40/58
94.2%
196/208
98.9%
75.7%
4605/4654 128/169
* PPV = Positive Predictive Value = valore profetico positivo
** NPV = Negative Predictive Value = valore profetico negativo
20
Sensibilità Specificità
100.0% 100.0%
796/796
25/25
99.4%
92.3%
4715/4742 324/351
97.6%
40/41
99.5%
196/197
99.4%
83.1%
4675/4701 128/154
98.4%
796/809
98.9%
4715/4768
76.9%
40/52
99.1%
4675/4716
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