PD-L1 IHC 28-8 pharmDx SK005 50 test per l`utilizzo con

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx
SK005
50 test per l'utilizzo con Autostainer Link 48
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è un saggio immunoistochimico qualitativo che utilizza Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8, destinato all'uso
nella rilevazione della proteina PD-L1 in tessuti di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) non squamoso e melanoma, fissati in
formalina e inclusi in paraffina (FFPE), con il sistema di visualizzazione EnVision FLEX su Autostainer Link 48. L'espressione della proteina
PD-L1 viene definita come percentuale di cellule tumorali che presentano positività per una colorazione di membrana di qualsiasi intensità.
L'espressione di PD-L1, rilevata tramite PD-L1 IHC 28-8 pharmDx in tumori NSCLC non squamosi, può essere associata a una
sopravvivenza superiore con OPDIVO® (nivolumab).
L'espressione di PD-L1 rilevata tramite PD-L1 IHC 28-8 pharmDx nel melanoma può essere utilizzata come ausilio per l'identificazione dei
pazienti che possono trarre beneficio da una terapia combinata con OPDIVO® (nivolumab) e YERVOY® (ipilimumab).
Riepilogo e spiegazione
Il legame dei ligandi di PD-1, PD-L1 e PD-L2, al recettore PD-1, localizzato sulle cellule T, inibisce la proliferazione delle cellule T e la
produzione di citochine. In alcuni tumori si verifica una sovraregolazione dei ligandi di PD-1 e la relativa via di trasduzione del segnale può
contribuire a inibire la sorveglianza immunitaria delle cellule T attive dei tumori (1). OPDIVO® (nivolumab) è un anticorpo monoclonale
immunoglobulina G4 (IgG4) che si lega al recettore PD-1 e ne blocca l'interazione con PD-L1 e PD-L2, rilasciando l'inibizione della risposta
immunitaria mediata dalla via di trasduzione del segnale di PD-1, inclusa la risposta immunitaria anti-tumorale (2). Nei modelli tumorali
murini singenici, il blocco dell'attività di PD-1 ha portato a una riduzione della crescita tumorale (3). Sono stati esaminati il beneficio clinico di
OPDIVO® e l'utilità clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx nei tumori NSCLC e nel melanoma.
Tumori NSCLC non squamosi: il rilevamento di cellule tumorali che esprimono PD-L1 in un campione di paziente con cancro del polmone
non a piccole cellule non squamoso può indicare un vantaggio in termini di miglioramento della sopravvivenza in risposta al trattamento del
paziente con OPDIVO® (nivolumab). Nel corso di studi clinici su OPDIVO® sponsorizzati da Bristol-Myers Squibb, i campioni prelevati dai
pazienti sono stati analizzati utilizzando PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Durante lo studio clinico CA209057 è stata esaminata la validità clinica di
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx per la valutazione dello stato di PDL1 nei pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso con OPDIVO® (5,11).
Melanoma: l'antigene 4 dei linfociti T citotossici (CTLA-4, Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4) è un regolatore negativo dell'attività
delle cellule T. YERVOY® (ipilimumab) è un anticorpo monoclonale che si lega all'antigene CTLA-4 e ne blocca l'interazione con i relativi
ligandi, CD80/CD86. È stato dimostrato che il blocco di CTLA-4 aumenta l'attivazione e la proliferazione delle cellule T, contribuendo a un
aumento generale della risposta immunitaria anti-tumorale (4).
La proteina PD-1 e l'antigene CTLA-4 inibiscono la risposta immunitaria anti-tumorale attraverso meccanismi complementari non-ridondanti.
La monoterapia con OPDIVO® e il trattamento combinato con OPDIVO® e YERVOY® hanno mostrato un aumento notevolmente superiore
della sopravvivenza libera da progressione (PFS, Progression-Free Survival), rispetto al solo YERVOY®, tra i pazienti affetti da melanoma
avanzato che non hanno ricevuto alcun trattamento precedente (8-10).
Nel corso degli studi clinici sponsorizzati da Bristol-Myers Squibb, i campioni di tessuto tumorale del melanoma prelevati da pazienti trattati
con OPDIVO® sono stati analizzati utilizzando PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Durante lo studio clinico CA209067 è stata esaminata la validità
clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx per la valutazione dell'espressione della proteina PDL1 nei pazienti affetti da melanoma e trattati con
OPDIVO®, OPDIVO® combinato con YERVOY® e solo YERVOY®.
OPDIVO® e YERVOY® sono marchi di fabbrica di proprietà di Bristol-Myers Squibb.
Principio della procedura
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx include il protocollo e i reagenti ottimizzati necessari per l'esecuzione di una procedura di colorazione IHC di
campioni FFPE con Autostainer Link 48 e PT Link Pre-treatment Module (6). Una volta eseguita l'incubazione con l'anticorpo monoclonale
primario anti-PD-L1 o con il reagente di controllo negativo Negative Control Reagent (NCR), i campioni vengono incubati con un anticorpo
linker specifico per la specie ospite dell'anticorpo primario, quindi vengono incubati con un reagente di visualizzazione pronto per l'uso che
consiste di molecole di anticorpo secondario e molecole di perossidasi di rafano legate a uno scheletro di polimeri di destrano. La
conversione enzimatica del cromogeno aggiunto successivamente causa la precipitazione di un prodotto di reazione visibile nel sito
dell'antigene. Il colore della reazione cromogena viene modificato da un reagente di potenziamento del cromogeno. Il campione può quindi
essere sottoposto a colorazione di contrasto e coperto con un vetrino coprioggetto. L'interpretazione dei risultati avviene per mezzo di un
microscopio ottico. I vetrini di controllo Control Slides contenenti due linee cellulari umane fissate in formalina, incluse in paraffina, vengono
forniti per convalidare i cicli di colorazione.
Materiali forniti
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx (codice SK005)
I materiali elencati di seguito sono sufficienti per 50 test (50 vetrini incubati con Primary Antibody contro PD-L1 e 50 vetrini incubati con
corrispondente Negative Control Reagent; 100 vetrini di test in totale). L'anticorpo primario aggiuntivo per la proteina PD-L1 viene fornito nel
kit per la colorazione di 15 vetrini di controllo della linea cellulare. Il numero dei test è basato sull'uso di 2 x 150 µL per vetrino di ciascun
reagente, ad eccezione di DAB+ e Target Retrieval Solution.
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Il kit fornisce materiale sufficiente per un massimo di 15 cicli di colorazione singoli.
Quantità
1 x 34,5 mL
Descrizione
Peroxidase-Blocking Reagent
PEROXIDASE-BLOCKING
REAGENT
Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno, detergente e sodio azide 0,015 mol/L.
1 x 19,5 mL
Primary Antibody: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8
MONOCLONAL RABBIT
ANTI-PD-L1
CLONE 28-8
Anti-PD-L1 monoclonale di coniglio in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/L.
1 x 15 mL
Negative Control Reagent*
NEGATIVE CONTROL
REAGENT
Anticorpo monoclonale IgG di coniglio di controllo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide
0,015 mol/L.
*Anticorpo monoclonale IgG di coniglio di controllo venduto su licenza da Cell Signaling Technology.
1 x 34,5 mL
LINKER, Anti-Rabbit
LINKER,
ANTI-RABBIT
Anticorpo secondario murino diretto contro immunoglobuline di coniglio in soluzione tamponata contenente proteina
stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/L.
1 x 34,5 mL
Visualization Reagent-HRP
VISUALIZATION
REAGENT-HRP
Destrano legato a molecole di perossidasi e molecole di anticorpi secondari di capra diretti contro immunoglobuline di
coniglio e di topo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico.
15 x 7,2 mL
DAB+ Substrate Buffer
DAB+
SUBSTRATE BUFFER
Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno e un agente antimicrobico.
1 x 5 mL
DAB+ Chromogen
DAB+ CHROMOGEN
3,3’-diaminobenzidina tetraidrocloruro in solvente organico.
1 x 34,5 mL
DAB Enhancer
DAB ENHANCER
Solfato rameico in acqua.
6 x 30 mL
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)
EnVision FLEX
TARGET RETRIEVAL SOLUTION
LOW pH (50X)
Soluzione tamponata, pH 6,1, contenente detergente e un agente microbico.
15 vetrini
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Control Slides
CONTROL SLIDES
XXXXX
PD-L1, SK005
pharmDx
Ciascun vetrino contiene sezioni di due linee cellulari in pellet fissate in formalina e incluse in
paraffina: NCI-H226** positive per l'espressione della proteina PD-L1 e MCF-7 negative per
l'espressione della proteina PD-L1.
MCF-7: negative per PD-L1
NCI-H226: positive per PD-L1
**Si ringraziano il Dr. AF Gazdar e il Dr. JD Minna dell'NIH per il loro contributo nello sviluppo della linea NCI-H226 (numero ATCC: CRL-5826™)(7)
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Nota: tutti i reagenti inclusi sono formulati in modo specifico per l'utilizzo con questo kit. Per eseguire il test secondo quanto specificato, non
è consentito effettuare sostituzioni, ad eccezione di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (codice K8005). PD-L1 IHC 28-8
pharmDx è stato formulato appositamente per l'uso con Autostainer Link 48. Per ulteriori informazioni, fare riferimento ai manuali utente di
Autostainer Link 48 e PT Link.
Materiali necessari ma non forniti
PT Link Pre-treatment Module (codice PT100/PT101)
Autostainer Link 48 (codice AS480)
EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (codice K8007)
EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (codice K8008)
Acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente)
Timer
Tessuti positivi e negativi da utilizzare come controlli della procedura (vedere la sezione Controllo di qualità e la tabella 1)
Vetrini per microscopia: Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) o vetrini caricati Fisherbrand Superfrost Plus.
Vetrini coprioggetto
Mezzo di montaggio permanente e reagenti ausiliari richiesti per il montaggio dei vetrini coprioggetto
Microscopio ottico (ingrandimento obiettivi 4x–40x)
Precauzioni
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Per uso professionale.
3. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica altamente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato
come prodotto a rischio, il composto NaN3 alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi
metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento del prodotto, far scorrere abbondante acqua nelle tubature per impedire la
formazione di azidi metalliche (12).
4. I reagenti Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker e Visualization Reagent contengono materiale di origine animale.
5. I campioni, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di infezione e
smaltiti con le opportune precauzioni (13).
6. Tempi, temperature o metodi di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati erronei.
7. I reagenti sono stati diluiti nel modo ottimale. L'ulteriore diluizione potrebbe compromettere la colorazione dell'antigene.
8. I reagenti Visualization Reagent, DAB+ Chromogen liquido e la soluzione substrato-cromogeno DAB+ preparata possono subire
alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Non conservare questi componenti del sistema né eseguire la colorazione in condizioni
di luce intensa, come ad esempio la luce solare diretta.
9. I residui di paraffina possono produrre falsi negativi.
10. L'uso di volumi di reagenti diversi da quelli consigliati può comportare la perdita di immunoreattività di PD-L1 visibile.
11. Per le sezioni di tessuto di grandi dimensioni, che coprono oltre i 2/3 del vetrino, possono essere necessari 3x150 µl di reagente.
12. Come regola generale, ai minori di 18 anni non è consentito lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli
utenti sulle corrette procedure di lavoro, le proprietà rischiose del prodotto e le norme di sicurezza necessarie. Fare riferimento alla
scheda di sicurezza (SDS) per ulteriori informazioni.
13. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e la cute.
14. La soluzione non utilizzata deve essere smaltita conformemente alle normative locali, regionali, nazionali e internazionali in materia.
15. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.
Pericolo
DAB+ Chromogen: 1–5% di tetracloruro di bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraammonio
H350
Può provocare il cancro.
H341
Sospettato di provocare alterazioni genetiche.
P201
Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso.
P202
Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze.
P280
Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Indossare indumenti protettivi.
P308 + P313
IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Consultare un medico.
P405
Conservare sotto chiave.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e
internazionali.
Avvertenza
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% di acido citrico
H319
Provoca grave irritazione agli occhi.
H411
Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata.
P280
Proteggere gli occhi/il viso.
P273
Non disperdere nell'ambiente.
P264
Lavare accuratamente le mani dopo l'uso.
P305 + P351 + P338 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le
eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare.
P337 + P313
Se l'irritazione degli occhi persiste: Consultare un medico.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e
internazionali.
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Conservazione
Quando non in uso su Autostainer Link 48, tutti i componenti di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, inclusi i vetrini di controllo Control Slides, devono
essere conservati nel contenitore originale, al buio e a una temperatura di 2-8°C.
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sull'esterno della confezione. Nel caso in cui i reagenti vengano conservati
diversamente da quanto specificato nel presente foglietto informativo, le condizioni dovranno essere convalidate dall'utente.
Non è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto, pertanto è necessario analizzare gli opportuni controlli positivi e negativi
contemporaneamente ai campioni dei pazienti.
Preparazione dei campioni
I campioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per la colorazione IHC. Utilizzare per tutti i campioni i metodi
standard di processazione dei tessuti.
Sezioni incluse in paraffina
Tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono idonei all'uso. Le condizioni di manipolazione e processazione consigliate sono indicate
di seguito: Tempo di ischemia <30 minuti prima dell'immersione nel fissativo e tempo di fissazione di 24-48 ore in formalina neutra
tamponata al 10%. L'uso di altri fissativi non è stato convalidato e può produrre risultati erronei. I campioni devono essere suddivisi in blocchi
con spessore di 3 o 4 mm, fissati in formalina neutra tamponata al 10%, deidratati e chiarificati in una serie di alcoli e xilene, quindi infiltrati
con paraffina fusa. La temperatura della paraffina non deve superare i 60 °C.
I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 4-5 µm. Dopo il sezionamento, i tessuti devono essere montati su vetrini caricati
Fisherbrand Superfrost Plus o su vetrini Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020), quindi incubati in forno a 58 ± 2°C per 1 ora. Per
preservare l'antigenicità, dopo il montaggio sui vetrini le sezioni tissutali devono essere conservate al buio a 2-8°C o a una temperatura
ambiente massima di 25 C, quindi sottoposte a colorazione entro 4 mesi dal sezionamento. La temperatura di conservazione e di manipolazione
dei vetrini in ogni fase posteriore alla preparazione non dovrà superare i 25 °C per assicurare l'inte grità e l'antigenicità dei tessuti.
L'uso di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx su tessuti decalcificati non è stato convalidato e non è consigliato.
Preparazione dei reagenti
Prima della colorazione, è necessario preparare i reagenti indicati di seguito:
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)
Preparare una quantità sufficiente di Target Retrieval Solution, Low pH, 1x diluendo la soluzione Target Retrieval Solution, Low pH (50x)
1:50 con acqua di grado reagente; il pH della soluzione Target Retrieval Solution 1x deve essere 6,1 ± 0,2. Con una bottiglia da 30 ml di
Target Retrieval Solution, Low pH (50x), diluita 1:50 si ottengono 1,5 l di reagente 1x, quantità sufficiente per il riempimento di una tanica di
PT Link, che consente di trattare fino a 24 vetrini per utilizzo. Eliminare la soluzione Target Retrieval Solution 1x dopo tre utilizzi e dopo non
più di 5 giorni dalla diluizione.
Se necessario, sono disponibili quantità aggiuntive di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x), con il codice K8005.
EnVision FLEX Wash Buffer (20x)
Preparare una quantità sufficiente di tampone di lavaggio, diluendo Wash Buffer (20x) 1:20 con acqua di grado reagente per le fasi di
lavaggio. Conservare la soluzione 1x inutilizzata a 2-8 ºC per un periodo massimo di un mese. Eliminare il tampone se appare torbido. Per
ulteriori informazioni, fare riferimento al manuale utente del sistema Autostainer Link 48 in uso.
EnVision FLEX Wash Buffer (20x) è disponibile con il codice K8007.
Soluzione substrato-cromogeno DAB+
Questa soluzione deve essere accuratamente miscelata prima dell'uso. La formazione di precipitati nella soluzione non influisce sulla qualità
della colorazione.
Per preparare la soluzione substrato-cromogeno DAB+, aggiungere 1 goccia di DAB+ Chromogen liquido per mL di DAB+ Substrate Buffer
e miscelare. La soluzione substrato-cromogeno è stabile per 5 giorni se conservata al buio a 2-8°C.
Note importanti:
•
Se si utilizza una bottiglia di DAB+ Substrate Buffer intera, aggiungere 9 gocce di DAB+ Chromogen. Sebbene
sull'etichetta sia riportata la dicitura 7,2 ml, questa indica il volume utilizzabile e non tiene in considerazione il "volume morto" nella
bottiglia.
•
Il colore di DAB+ Chromogen liquido nella bottiglia può variare da trasparente a color lavanda-marrone. Ciò non influisce sulle
prestazioni del prodotto. Diluire secondo le linee guida fornite in precedenza. L'aggiunta di un eccesso di DAB+ Chromogen
liquido a DAB+ Substrate Buffer causa una riduzione del segnale positivo.
Procedura di colorazione su Autostainer Link 48
Note sulla procedura
Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e acquisire dimestichezza con tutti i componenti e lo strumento
(vedere la sezione "Precauzioni").
Prima di procedere all'immunocolorazione, tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20-25 °C). Analogamente, tutte
le fasi di incubazione devono essere eseguite a temperatura ambiente.
Non consentire l'essiccazione delle sezioni tissutali durante la procedura di colorazione. Sezioni tissutali asciutte possono mostrare livelli di
colorazione aspecifica superiori.
Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati nel software Dako Link. Per ulteriori informazioni sulla
programmazione dei protocolli e sul caricamento di vetrini e reagenti, fare riferimento ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link.
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Nota: i reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati progettati per l'ottenimento di prestazioni ottimali quando utilizzati con i
reagenti e i materiali consigliati. L'ulteriore diluizione dei reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati
possono produrre risultati erronei o discordanti.
Protocollo di colorazione
Selezionare il protocollo di colorazione PD-L1 IHC 28-8 pharmDx tra le opzioni del menu a discesa DakoLink.
Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati in DakoLink. Se nel server in uso non sono presenti i
protocolli PD-L1 IHC 28-8 pharmDx appropriati, contattare il rappresentante dell'assistenza tecnica locale.
Fase 1: Procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1)
Procedura consigliata:
Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link.
Impostare PT Link (codice PT100/PT101) con il preriscaldamento e il raffreddamento a 65°C. Impostare i l riscaldamento a 97°C per
20 minuti.
►Riempire le taniche di PT Link con 1,5 l di soluzione di lavoro Target Retrieval Solution, Low pH, 1x, per tanica, per coprire le sezioni
di tessuto.
►Preriscaldare la soluzione Target Retrieval Solution a 65 °C.
►Immergere i rack Autostainer contenenti sezioni tissutali FFPE montate nella soluzione Target Retrieval Solution, Low pH (soluzione
di lavoro 1x) preriscaldata, all'interno della tanica di PT Link. Incubare per 20 minuti a 97°C.
►Appena completata l'incubazione per lo smascheramento antigenico e portata la temperatura a 65°C, rimu overe ciascun rack
Autostainer con i vetrini dalla tanica di PT Link e posizionarlo immediatamente in una vaschetta apposita (ad esempio, PT Link
Rinse Station, codice PT109) contenente Wash Buffer (codice K8007) diluito e a temperatura ambiente.
►Lasciare i vetrini immersi in Wash Buffer diluito e a temperatura ambiente per 5 minuti.
Fase 2: Procedura di colorazione
Dopo la procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1), i rack Autostainer con i vetrini vengono
posizionati in Autostainer Link 48. Assicurarsi che i vetrini siano sempre bagnati con il tampone durante il caricamento e prima di
iniziare il ciclo. Lo strumento eseguirà la procedura di colorazione applicando il reagente appropriato, monitorando il tempo di
incubazione ed effettuando il lavaggio dei vetrini tra le applicazioni dei reagenti. I tempi di incubazione dei reagenti sono preimpostati
nel software Dako Link.
Fase 3: Colorazione di contrasto
I vetrini devono essere sottoposti a colorazione di contrasto per 7 minuti con EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (codice K8008). Il
tempo di incubazione con Hematoxylin è preimpostato nel protocollo.
Fase 4: Montaggio
È richiesto un mezzo di montaggio permanente e non acquoso.
Nota: con il tempo, potrebbe verificarsi una perdita di intensità della colorazione dei vetrini associata a diversi fattori che includono, a titolo
esemplificativo ma non limitativo, la colorazione di contrasto, metodi e materiali di montaggio e le condizioni di conservazione. Per ridurre al
minimo la perdita di intensità della colorazione, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20-25 °C).
Controllo di qualità
I reagenti in PD-L1 IHC 28-8 pharmDx sono stati sottoposti a controllo di qualità tramite immunoistochimica utilizzando le procedure di
smascheramento antigenico e colorazione descritte in precedenza. Eventuali variazioni apportate alle procedure consigliate per la
fissazione, la processazione e l'inclusione dei tessuti nel laboratorio dell'utente possono produrre una significativa variabilità nei risultati. I
controlli di qualità devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Tali controlli di qualità sono indicati nella tabella 1 e includono un
campione tissutale del paziente con colorazione H&E, tessuti di controllo positivo e negativo forniti dal laboratorio e un vetrino Control Slide
fornito da Dako (15). Negli Stati Uniti, consultare le linee guida di controllo qualità del Certification Program for Immunohistochemistry del
College of American Pathologists (CAP). Per ulteriori informazioni, fare riferimento anche al documento del CLSI Quality Assurance for
Immunocytochemistry, Approved Guideline (14).
Verifica del saggio
Prima del primo utilizzo di un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, l'utente deve verificare le prestazioni del saggio su una
serie di tessuti forniti dal laboratorio con prestazioni IHC note e che rappresentino tessuti con positività e negatività note. Fare riferimento
alle procedure di controllo della qualità precedentemente descritte in questa sezione del foglietto informativo del prodotto. Tali procedure di
controllo qualità devono essere ripetute per ogni nuovo kit oppure ogniqualvolta venga apportata una modifica ai parametri del saggio. Le
opzioni per la risoluzione dei potenziali problemi, il relative cause e gli interventi correttivi consigliati sono descritti nella tabella 12.
Interpretazione della colorazione - Tumore NSCLC non squamoso e melanoma
La valutazione dei vetrini deve essere eseguita da un patologo per mezzo di un microscopio ottico. Per la valutazione della colorazione
immunoistochimica di PD-L1 e l'assegnazione del punteggio, è possibile utilizzare un ingrandimento dell'obiettivo 4x per una valutazione
iniziale del campione intero, quindi passare a obiettivi 10-20x per l'assegnazione del punteggio (se necessario, è possibile utilizzare obiettivi
40x per conferma). La colorazione di PD-L1 è rappresentata da un prodotto di reazione marrone (3,3'-diaminobenzidina, DAB).
Una colorazione positiva per PD-L1 viene definita come colorazione delle membrana plasmatica completa circonferenziale e/o parziale
lineare, di qualsiasi intensità.
La valutazione deve essere eseguita sull'intero campione. Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino del paziente sottoposto alla
colorazione di PD-L1 devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Per determinare la percentuale di cellule
colorate, sul vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1, devono essere presenti almeno 100 cellule tumorali vitali.
La colorazione citoplasmatica, se presente, non viene considerata per l'assegnazione del punteggio. Anche le cellule non maligne e le
cellule immunitarie (ad esempio linfociti o macrofagi infiltranti) possono presentare una colorazione con PD-L1. Queste cellule non devono
essere tuttavia incluse nell'assegnazione del punteggio per la determinazione della positività per PD-L1.
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NOTA: durante l'interpretazione dei campioni dei pazienti affetti da melanoma può essere riscontrata una pigmentazione marrone dovuta
alla melanina. La melanina deve essere esclusa durante l'assegnazione del punteggio alla colorazione della membrana plasmatica. Al fine di
identificare ed escludere il contenuto di melanina, può essere utile un confronto con un vetrino sequenziale colorato con NCR. Se un
contenuto elevato di melanina impedisce l'assegnazione del punteggio alla colorazione della membrana plasmatica delle cellule tumorali, il
campione può essere escluso dall'interpretazione e considerato indeterminato.
Per ogni ciclo di colorazione, i vetrini devono essere esaminati nell'ordine indicato nella tabella 1, al fine di determinare la validità del ciclo di
colorazione e per consentire la valutazione della colorazione del tessuto del campione.
Per ulteriori indicazioni, fare riferimento al documento "PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Interpretation Manual for Non-Squamous Non-Small Cell
Lung Cancer o for Melanoma" (Manuale per l'interpretazione relativa al cancro del polmone non a piccole cellule non squamoso o al
melanoma di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx).
Tabella 1: Ordine consigliato per la valutazione dei vetrini
Campioni
Principio
Requisiti
1. H&E
Una colorazione con ematossilina
La colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx e la colorazione H&E devono
ed eosina (H&E) del campione
essere eseguite su sezioni seriali provenienti dallo stesso blocco in paraffina
(componente
tissutale viene analizzata per
del campione.
fornito dal
prima per valutare l'istologia e il
laboratorio)
livello di preservazione del tessuto. I campioni tissutali devono essere integri, con un buon livello di preservazione
e devono confermare l'indicazione del tumore.
2. Control Slide
Il vetrino Control Slide sottoposto a
Un vetrino Control Slide deve essere sottoposto a colorazione con l'anticorpo
primario anti-PD-L1 in ogni ciclo di colorazione.
colorazione con l'anticorpo primario
(componente
anti-PD-L1 di PD-L1 IHC 28-8
pharmDx deve essere esaminato
Criteri di accettazione per NCI-H226 (linea cellulare di controllo positiva per
fornito da Dako)
per confermare il funzionamento
PD-L1):
corretto di tutti i reagenti.
• Colorazione della membrana plasmatica di una percentuale di cellule ≥80%,
con un'intensità della colorazione media ≥2+.
Il vetrino Control Slide contiene il
• Colorazione aspecifica con intensità <1+.
pellet di una linea cellulare positiva
per PD-L1 e il pellet di una linea
Criteri di accettazione per MCF-7 (linea cellulare di controllo negativa per PD-L1):
cellulare negativa per PD-L1.
• Nessuna colorazione specifica.
• Colorazione aspecifica con intensità <1+. Tenere presente che nel pellet
cellulare MCF-7 occasionalmente è possibile osservare la colorazione di
alcune cellule. Si applicano i seguenti criteri di accettazione: la presenza di
un totale di cellule con colorazione caratteristica della membrana plasmatica
≤10 o una colorazione citoplasmatica con intensità ≥1+ entro i bordi del pellet
cellulare MCF-7 è considerata accettabile.
3. Vetrini con
tessuto di
controllo positivo
(componente
fornito dal
laboratorio)
Successivamente devono essere
esaminati i vetrini con tessuto di
controllo positivo sottoposti a
colorazione sia con l'anticorpo
primario anti-PD-L1, sia con
Negative Control Reagent. Questi
vetrini consentono di verificare
l'efficacia del metodo di fissazione e
del processo di smascheramento
antigenico. I controlli basati su
tessuti positivi noti devono essere
utilizzati solo per il monitoraggio
della correttezza delle prestazioni
dei tessuti sottoposti alla procedura
e dei reagenti di test, NON come
ausilio nella formulazione di una
diagnosi specifica dei campioni del
paziente.
Se una delle linee cellulari di controllo non soddisfa tali criteri, tutti i risultati
relativi ai campioni del paziente devono essere considerati non validi.
I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione
tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e
inclusi prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del
paziente.
Per l'interpretazione dei risultati della colorazione utilizzare campioni integri,
poiché le cellule necrotiche o deteriorate spesso presentano colorazioni
aspecifiche.
I tessuti selezionati per l'uso come controlli positivi devono presentare una
colorazione positiva da debole a moderata, quando sottoposti a colorazione
con PD-L1, per consentire il rilevamento di variazioni anche lievi nella
sensibilità del saggio.
Due vetrini con tessuto di controllo positivo devono essere inclusi in ogni ciclo
di colorazione.
Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: si deve riscontrare la presenza
di colorazione marrone della membrana plasmatica. La colorazione aspecifica
deve essere ≤1+.
Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna
colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
Se i controlli con tessuto di controllo positivo non presentano la colorazione
positiva appropriata, i risultati relativi ai campioni di test devono essere
considerati non validi.
(128913-002)
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 6/18
4. Vetrini con
tessuto di
controllo negativo
(componente
fornito dal
laboratorio)
5. Vetrino del
tessuto del
paziente
sottoposto a
colorazione con
Negative Control
Reagent
6. Vetrino del
tessuto del
paziente
sottoposto a
colorazione con
l'anticorpo primario
anti-PD-L1
Successivamente devono essere
esaminati i vetrini con tessuto di
controllo negativo (con negatività
per PD-L1 nota) sottoposti a
colorazione sia con l'anticorpo
primario anti-PD-L1, sia con
Negative Control Reagent, per
verificare la specificità della
marcatura dell'antigene bersaglio
con l'anticorpo primario. In
alternativa, è possibile usare
porzioni di tessuto di controllo
positivo come tessuto di controllo
negativo, tuttavia ciò deve essere
verificato dall'utente.
Esaminare i campioni del paziente
sottoposti a colorazione con il
reagente Negative Control
Reagent di PD-L1 IHC 28-8
pharmDx. Questo reagente viene
utilizzato al posto dell'anticorpo
primario e fornisce un ausilio
nell'interpretazione della
colorazione specifica nel sito
dell'antigene.
Esaminare infine l'intero vetrino
dei campioni del paziente
sottoposto a colorazione con
l'anticorpo primario anti-PD-L1 di
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Per
informazioni specifiche
sull'immunoreattività di PD-L1 IHC
28-8 pharmDx, fare riferimento alle
sezioni Cenni introduttivi, Limiti e
Caratteristiche di prestazione.
I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione
tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e inclusi
prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del paziente.
In ogni ciclo di colorazione devono essere inclusi due vetrini con tessuto di
controllo negativo.
Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: Nessuna colorazione della
membrana nelle cellule tumorali. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna
colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
Se si osserva una colorazione specifica della membrana plasmatica nei vetrini
con tessuto di controllo negativo, i risultati relativi ai campioni del paziente
devono essere considerati non validi.
L'assenza della colorazione della membrana plasmatica consente di verificare
la marcatura specifica dell'antigene bersaglio con l'anticorpo primario antiPD-L1. La colorazione aspecifica deve essere ≤1+.
L'intensità della colorazione positiva deve essere valutata nel contesto della
colorazione aspecifica di fondo osservata sul vetrino trattato con Negative
Control Reagent nello stesso ciclo.
Come per ogni test immunoistochimico, un risultato negativo indica che
l'antigene non è stato rilevato ma non necessariamente che l'antigene era
assente nelle cellule/tessuti analizzati.
Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino del paziente sottoposto alla
colorazione di PD-L1 devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del
punteggio per PD-L1. Per determinare la percentuale di cellule colorate, sul
vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1, devono essere
presenti almeno 100 cellule tumorali vitali.
Limiti generali
1. L'immunoistochimica è una tecnica diagnostica multifase che richiede una formazione specifica per quanto riguarda la selezione dei
reagenti appropriati, la scelta dei tessuti, la fissazione, la processazione e la preparazione dei vetrini per immunoistochimica, nonché
l'interpretazione dei risultati della colorazione.
2. La colorazione dei tessuti è correlata alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. Procedure
errate di fissazione, congelamento, scongelamento, lavaggio, asciugatura, riscaldamento e sezionamento oppure la contaminazione con
altri tessuti o liquidi possono produrre artefatti, intrappolare l'anticorpo o generare risultati falsi negativi. Risultati incoerenti possono
essere dovuti anche a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto.
3. Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta può compromettere la correttezza dell'interpretazione dei risultati.
4. L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione positiva o della sua assenza deve essere effettuata tenendo in considerazione la
presentazione clinica, la morfologia e altri criteri istopatologici. L'interpretazione clinica di una colorazione o della sua assenza deve
essere integrata da studi morfologici e da controlli adeguati, nonché da altri test diagnostici. Il vetrino colorato deve essere interpretato
da un patologo qualificato con una conoscenza approfondita di anticorpi, reagenti e metodi impiegati. La colorazione deve essere
eseguita in un laboratorio autorizzato certificato, sotto la supervisione di un patologo, il quale esaminerà i vetrini colorati e garantirà
l'adeguatezza dei controlli positivi e negativi.
5. I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) potrebbero evidenziare
una colorazione aspecifica con perossidasi di rafano (15).
6. Non si può escludere completamente la possibilità di reazioni impreviste in tipi di tessuto già analizzati in precedenza, a causa della
variabilità biologica dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. Si invita a documentare le reazioni impreviste
e a comunicarle all'Assistenza tecnica Dako.
7. È possibile che vengano generati risultati falsi positivi a causa del legame non immunologico di proteine o prodotti di reazione con il
substrato. I falsi positivi possono essere causati anche dall'attività della pseudoperossidasi (eritrociti) e dall'attività della perossidasi
endogena (citocromo c) (14).
8. I reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati concepiti per l'ottenimento di prestazioni ottimali. L'ulteriore diluizione dei
reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati possono produrre risultati erronei o discordanti.
Limitazioni specifiche del prodotto
1. Il deterioramento dell'antigene nel tessuto, nel tempo, può provocare risultati falsi-negativi. Una volta montate sui vetrini, le sezioni
tissutali devono essere conservate al buio a 2-8°C o a una temperatura ambiente massima di 25 C, quindi sottoposti a colorazione entro
4 mesi dal sezionamento. La temperatura di conservazione e di manipolazione dei vetrini in ogni fase posteriore alla preparazione non
dovrà superare i 25 °C per assicurare l'integrità e l'antigenicità dei tessuti.
2. Per garantire risultati ottimali e riproducibili, la proteina PD-L1 richiede un pretrattamento di smascheramento antigenico quando i tessuti
sono fissati come di routine (in formalina tamponata neutra) e inclusi in paraffina.
3. Non sostituire i reagenti con reagenti di altri numeri di lotto di questo prodotto o di kit di altri produttori. L'unica eccezione è rappresentata
da EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) che, se necessario, è disponibile con il codice K8005.
(128913-002)
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 7/18
4. Le linee cellulari di controllo sottoposte a colorazione devono essere utilizzate esclusivamente per la convalida del ciclo di colorazione e
non devono essere utilizzate per l'assegnazione del punteggio alla reazione di colorazione nelle sezioni tissutali.
5. L'uso di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx su tessuti trattati con fissativi diversi dalla formalina neutra tamponata al 10% non è stato convalidato.
6. Le biopsie escissionali, incisionali, punch o core needle sono state considerate campioni accettabili nelle sperimentazioni cliniche con
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Gli agoaspirati o gli altri campioni citologici sono risultati insufficienti per l'analisi dei biomarker e sono stati
esclusi dalle sperimentazioni cliniche con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx.
Valutazione delle prestazioni non cliniche
Specificità analitica per PD-L1 IHC 28-8 pharmDx
L'anticorpo primario di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è un anticorpo monoclonale di coniglio diretto contro la proteina PD-L1 umana, clone 28-8.
L'immunogeno utilizzato per la generazione dell'anticorpo è una proteina PD-L1 umana ricombinante purificata contenente il dominio
extracellulare (Phe19-Thr239) della PD-L1 umana. La colorazione IHC con l'anticorpo primario anti-PD-L1 non ha mostrato alcuna reattività
crociata per la proteina PD-L2 esogena espressa in cellule di ovaio di criceto cinese (CHO).
PD-L1 IHC 28-8 pharmDx rileva in modo specifico la proteina di membrana PD-L1 espressa in cellule tumorali in tessuti FFPE. Tale
rilevamento può essere completamente abolito con l'aggiunta di antigene PD-L1. PD-L1 IHC 28-8 pharmDx non rileva la proteina di
membrana PD-L1 in cellule tumorali knock-out per PD-L1, in cui il gene di PD-L1 è stato eliminato tramite manipolazione genetica.
Tessuti normali e neoplastici
La tabella 2 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 relativamente a tessuti normali
selezionati. La tabella 3 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 relativamente a tessuti
neoplastici in microarray tissutali multi-tumorali. Tutti i tessuti analizzati sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina e successivamente
colorati con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, secondo le istruzioni riportate nel foglietto informativo. PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ha rilevato la
proteina PD-L1 localizzata sulla membrana plasmatica di tipi cellulari per cui si conosce l'espressione dell'antigene PD-L1, quali cellule
immunitarie e cellule di origine epiteliale principalmente tumorali.
Tabella 2: Reattività dei tessuti normali a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx
Tipo di tessuto
Colorazione positiva della membrana
(q.tà testata)
plasmatica:
Elementi del tessuto
Cellule mesoteliali (3)
0/3
Cerebrum (3)
0/3
Cervelletto (3)
0/3
Cervice (3)
1/3 epitelio
Colon (3)
2/3 macrofagi
Cute (3)
0/3
Esofago (3)
0/3
Fegato (3)
2/3 cellule immunitarie
Ghiandola salivare (3)
0/3
Intestino tenue (2)
0/2
Ipofisi (3)
1/3 adenoipofisi anteriore
Mammella (3)
Midollo osseo (3)
Milza (3)
Muscolo, cardiaco (3)
Muscolo, scheletrico (3)
Nervo, periferico (3)
Ovaio (3)
Pancreas (3)
Paratiroide (3)
Polmone (3)
Prostata (2)
Rene (3)
Stomaco (3)
Surrene (3)
Testicolo (3)
Timo (3)
Tiroide (3)
Tonsilla (3)
Utero (3)
(128913-002)
0/3
3/3 megacariociti
1/3 macrofagi
3/3 cellule reticolo-endoteliali
0/2
0/2
0/3
0/3
3/3 epitelio (principalmente cellule insulari)
3/3 epitelio
3/3 macrofagi alveolari
0/2
3/3 epitelio tubulare
0/3
3/3 cellule della midollare
0/3
3/3 epitelio midollare
0/3
3/3 epitelio criptico
3/3 centro germinale (cellule immunitarie)
0/3
Colorazione positiva citoplasmatica:
Elementi del tessuto
0/3
0/3
0/3
1/3 epitelio
0/3
1/3 epitelio
0/3
2/3 cellule immunitarie
0/3
0/2
1/3 adenoipofisi anteriore
3/3 neuroipofisi posteriore
0/3
3/3 megacariociti
0/3
0/2
0/2
0/3
0/3
3/3 epitelio (principalmente cellule insulari)
0/3
0/3
0/2
3/3 epitelio tubulare
0/3
3/3 cellule della midollare
1/3 cellule di Leydig
0/3
0/3
0/3
0/3
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Tabella 3: Reattività dei tessuti neoplastici a PD-L1 IHC 28-8 pharmDx
Tipo di tumore
Ubicazione/organo
Appendice
Carcinoma broncoalveolare, polmone
Cervice, tipo endocervicale
Cistifellea
Colon
Colon, metastatico al fegato
Colon, mucinoso
Esofago
Ghiandola salivare/parotide
GI, metastatico al polmone
Intestino tenue
Mammella, DCIS
Mammella, duttale invasivo
Mammella, duttale invasivo metastatico ai linfonodi
Ovaio
Adenocarcinoma
Ovaio, endometrioide
Ovaio, mucinoso
Ovaio, sieroso
Pancreas
Pancreas, duttale
Polmone
Prostata
Retto
Stomaco
Stomaco, mucinoso
Testa e collo, palato duro
Tiroide, follicolare
Tiroide, follicolo-papillare
Tiroide, papillare
Utero, a cellule chiare
Utero, endometrio
Astrocitoma
Cervello
Carcinoma
Nasofaringeo, NPC
Carcinoma a cellule ad anello con castone del colon
Carcinoma a cellule ad anello con
metastatico all'ovaio
castone
Colon
Rene
Carcinoma a cellule di transizione
Vescica
Carcinoma a cellule squamose esofageo metastatico al
linfonodo
Cervice
Cute
Carcinoma a cellule squamose
Esofago
Polmone
Testa e collo
Utero
Carcinoma a grandi cellule
Polmone
Carcinoma a piccole cellule
Polmone
Carcinoma adrenocorticale
Surrenale
Carcinoma delle cellule basali
Cute
Carcinoma delle cellule renali
Cellule chiare
Rene
Papillare
Rene
Carcinoma embrionale
Testicolo
Carcinoma epatocellulare
Fegato
Carcinoma midollare
Tiroide
Cordoma
Cavità pelvica
Epatoblastoma
Fegato
Ependimoma
Cervello
Glioblastoma
Cervello
Linfoma
Anaplastico a grandi cellule
Linfonodo
Diffuso a cellule B
Linfonodo
Hodgkin
Linfonodo
Non-Hodgkin
Linfonodo
Liposarcoma
Cavità addominale, mucinoso
Medulloblastoma
Cervello
Cavità nasale
Melanoma
Retto
(128913-002)
Positivi per PD-L1/totale (N=162)
1/1
0/1
0/1
2/4
2/5
1/1
0/1
1/1
0/2
0/1
0/2
0/2
3/7
1/1
0/1
0/1
0/1
0/1
1/2
0/3
2/5
2/4
2/4
1/6
0/1
0/1
0/1
0/1
0/3
1/1
1/3
0/3
0/1
0/1
0/1
0/1
3/6
1/1
2/4
1/2
4/7
1/3
0/2
1/1
1/1
1/2
0/1
0/1
0/6
0/1
0/1
1/5
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
1/1
2/4
2/2
1/1
0/1
0/1
0/1
0/1
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Tipo di tumore
Meningioma
Mesotelioma
Neuroblastoma
Neuroectodermico primitivo
Neurofibroma
Sarcoma
Cellule chiare
Condrosarcoma
Leiomiosarcoma
Leiomiosarcoma
Liposarcoma
Osteosarcoma
Rabdomiosarcoma
Sarcoma sinoviale
Seminoma
Spermatocitoma
Timoma
Tumore delle cellule insulari
Tumore interstiziale
Ubicazione/organo
Cervello
Peritoneo
Retroperitoneo
Retroperitoneo
Tessuto molle, lombare
Parete addominale
Osso
Tessuto molle, parete toracica
Vescica
Cavità addominale, mucinoso
Osso
Prostata
Retroperitoneo
Tessuto molle, embrionale
Cavità pelvica
Testicolo
Testicolo
Mediastino
Pancreas
Colon
Intestino tenue
Retto
Positivi per PD-L1/totale (N=162)
0/2
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
0/2
0/1
0/1
0/1
0/1
0/2
0/2
1/1
0/1
0/1
0/1
0/1
Sensibilità analitica: NSCLC non squamoso
La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata analizzata su 112 casi unici di campioni FFPE di carcinoma polmonare non
squamoso (NSCLC) negli stadi da I a IV utilizzando un lotto di produzione industriale. La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha
evidenziato una colorazione in un intervallo dallo 0 al 100% di cellule tumorali positive e un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3.
Ripetibilità: NSCLC non squamoso
La ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata valutata presso Dako. I dati sulle prestazioni sono riportati nella tabella 4. Per ciascun
livello di espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa (NPA), la percentuale di
concordanza positiva (PPA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto dei test a coppie indipendenti. L'osservazione con
frequenza maggiore è stata utilizzata come riferimento per il calcolo di NPA, PPA, OA e dei corrispondenti intervalli di confidenza al 95%
secondo il punteggio di Wilson, pertanto uno dei risultati con tale osservazione è stato escluso dai confronti a coppie.
(128913-002)
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Tabella 4: Ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - Tumore NSCLC non squamoso
% di concordanza (IC 95%)
Ripetibilità
Metodo
Inter-strumento
Ciascuno di 10 campioni di NSCLC
non squamoso con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato
analizzato con tre replicati su ciascuno
di tre strumenti Autostainer Link 48. In
totale sono stati eseguiti 60 confronti a
coppie indipendenti.
Ciascuno di 12 campioni di NSCLC
non squamoso con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato
analizzato con tre replicati da tre
analisti su uno strumento Autostainer
Link 48. In totale sono stati eseguiti
72 confronti a coppie indipendenti.
Ciascuno di 10 campioni di NSCLC
non squamoso con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato
analizzato con tre replicati in cinque
giorni non consecutivi su uno
strumento Autostainer Link 48. In
totale sono stati eseguiti 80 confronti a
coppie indipendenti.
Ciascuno di 20 campioni di NSCLC
non squamoso con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato
analizzato con due replicati con
ciascuno di cinque lotti di reagenti su
uno strumento Autostainer Link 48. In
totale sono stati eseguiti 160 confronti
a coppie indipendenti.
Ciascuno di 10 campioni di NSCLC
non squamoso con diversi livelli di
espressione IHC di PD-L1 è stato
analizzato con otto replicati in un ciclo
su uno strumento Autostainer Link 48.
In totale sono stati eseguiti
70 confronti a coppie indipendenti.
Inter-analista
Inter-giorno
Inter-lotto
Intra-ciclo
Livello di espressione
≥1%
NPA 100 (82,4, 100)
PPA 100 (91,6, 100)
OA 100 (94,0, 100)
Livello di espressione
≥5%
NPA 100 (86,2, 100)
PPA 100 (90,4, 100)
OA 100 (94,0, 100)
Livello di espressione
≥10%
NPA 100 (91,6, 100)
PPA 100 (82,4, 100)
OA 100 (94,0, 100)
NPA 100 (86,2, 100)
PPA 100 (92,6, 100)
OA 100 (94,9, 100)
NPA 100 (91,6, 100)
PPA 100 (88,6, 100)
OA 100 (94,9, 100)
NPA 100 (93,4, 100)
PPA 100 (82,4, 100)
OA 100 (94,9, 100)
NPA 100 (86,2, 100)
PPA 100 (93,6, 100)
OA 100 (95,4, 100)
NPA 100 (89,3, 100)
PPA 100 (92,6, 100)
OA 100 (95,4, 100)
NPA 98,2 (90,6, 99,7)
PPA 100 (86,2, 100)
OA 98,8 (93,3, 99,8)
NPA 100 (94,3, 100)
PPA 100 (96,2, 100)
OA 100 (97,7, 100)
NPA 100 (95,4, 100)
PPA 100 (95,4, 100)
OA 100 (97,7, 100)
NPA 100 (96,4, 100)
PPA 100 (93,6, 100)
OA 100 (97,7, 100)
NPA 100 (84,5, 100)
PPA 100 (92,7, 100)
OA 100 (94,8, 100)
NPA 100 (87,9 100)
PPA 100 (91,6, 100)
OA 100 (94,8, 100)
NPA 100 (92,7, 100)
PPA 100 (84,5, 100)
OA 100 (94,8, 100)
Riproducibilità esterna: NSCLC non squamoso
La riproducibilità esterna di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata valutata in tre siti di analisi esterni, rispettivamente. Il blinding e la
randomizzazione delle sezioni colorate sono stati eseguiti prima di assegnare il punteggio a tali sezioni. I dati sulle prestazioni sono riportati
nella tabella 5. Per ciascun livello di espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa (NPA),
la percentuale di concordanza positiva (PPA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto dei test a coppie indipendenti.
L'osservazione con frequenza maggiore è stata utilizzata come riferimento per il calcolo di NPA, PPA, OA e dei corrispondenti intervalli di
confidenza al 95% secondo il punteggio di Wilson, pertanto uno dei risultati con tale osservazione è stato escluso dai confronti a coppie.
(128913-002)
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Tabella 5: Riproducibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx (tumore NSCLC non squamoso) valutata in tre siti esterni
% di concordanza (IC 95%)
Riproducibilità
Metodo
Livello di espressione ≥1% Livello di espressione ≥5%
Valutazione
Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con
inter-sito (tre siti) diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato
in cinque giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è stata
eseguita tra tre siti su un totale di 140 confronti a coppie
indipendenti.
Saggio intra-sito Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con
diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato
in cinque giorni non consecutivi presso ciascuno dei tre siti
dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per tre siti su
un totale di 120 confronti a coppie indipendenti.
InterIl punteggio relativo a 15 campioni di NSCLC non squamoso
osservatore (un con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
osservatore
colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, è stato fornito da
presso ciascuno tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni
dei tre siti)
non consecutivi. L'analisi inter-osservatore è stata eseguita tra
tre siti su un totale di 120 confronti a coppie indipendenti.
IntraIl punteggio relativo a 15 campioni di NSCLC non squamoso
osservatore (un con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
osservatore
colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, è stato fornito da
presso ciascuno tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni
dei tre siti)
non consecutivi. L'analisi intra-osservatore è stata eseguita
per tre siti su un totale di 90 confronti a coppie indipendenti.
NPA 100 (93,6, 100)
PPA 98,8 (93,6, 99,8)
OA 99,3 (96,1, 99,9)
NPA
PPA
OA
91,4 (82,5, 96,0)
97,1 (90,2, 99,2)
94,3 (89,1, 97,1)
NPA 100 (92,6, 100)
PPA 98,6 (92,5, 99,8)
OA 99,2 (95,4, 99,9)
NPA
PPA
OA
96,4 (87,9, 99,0)
95,3 (87,1, 98,4)
95,8 (90,6, 98,2)
NPA 96,9 (89,3, 99,1)
PPA 100 (93,6, 100)
OA 98,3 (94,1, 99,5)
NPA 100 (94,3, 100)
PPA 89,3 (78,5, 95,0)
OA 95,0 (89,5, 97,7)
NPA
PPA
OA
NPA
PPA
OA
95,8 (86,0, 98,8)
100 (91,6, 100)
97,8 (92,3, 99,4)
100 (93,1, 100)
100 (90,8, 100)
100 (95,9, 100)
Valutazione delle prestazioni cliniche: NSCLC non squamoso
L'utilità clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata valutata nello studio CA209057, uno studio di fase 3, randomizzato, in aperto su
nivolumab rispetto a docetaxel in soggetti adulti (≥ 18 anni) affetti da tumore NSCLC con cellule non squamose avanzato o metastatico in
seguito a fallimento di un trattamento precedente con una doppietta chemioterapica a base di platino. 582 soggetti sono stati randomizzati in
112 siti in 22 paesi (Argentina, Australia, Austria, Brasile, Canada, Cile, Repubblica ceca, Francia, Germania, Hong Kong, Ungheria, Italia,
Messico, Norvegia, Perù, Polonia, Romania, Federazione russa, Singapore, Spagna, Svizzera e Stati Uniti). I soggetti sono stati
randomizzati 1:1 e stratificati in base a: 1) precedente uso di terapia di mantenimento rispetto a nessuna terapia di mantenimento e 2)
terapia di seconda linea rispetto a terapia di terza linea. I campioni di tessuto tumorale pre-studio (linea di base) sono stati raccolti prima
della randomizzazione e prima del primo trattamento per analisi prepianificate dell'efficacia sulla base dei livelli di espressione di PD-L1 alla
linea di base predefiniti (obiettivo secondario). L'endpoint primario era rappresentato dalla sopravvivenza totale (OS). Altri endpoint
secondari erano rappresentati da tasso di risposta oggettiva (ORR), sopravvivenza libera da progressione (PFS) e miglioramento dei sintomi
associati alla malattia in 12 settimane, secondo la Scala dei sintomi del carcinoma polmonare (LCSS).
Le caratteristiche demografiche e della malattia alla linea di base sono state bilanciate tra i soggetti randomizzati nei gruppi di trattamento
con nivolumab e con docetaxel. L'età media era di 62 anni (intervallo: da 21 a 85) con il 34% ≥65 anni di età e il 7% ≥75 anni di età. La
maggior parte dei pazienti era di razza bianca (92%) e di sesso maschile (55%); lo stato delle prestazioni ECOG alla linea di base era 0
(31%) o 1 (69%). Il 79% dei pazienti era stato o era fumatore. I campioni tumorali sono stati raccolti da tumori NSCLC non squamosi, in
conformità ai criteri di inclusione dello studio. Le frequenze di espressione di PD-L1 per ciascuno dei livelli di espressione di riferimento
predefiniti in tutti i soggetti randomizzati nello studio CA209057 sono riportate nella tabella 6.
Tabella 6: Frequenza di espressione di PD-L1 pre-studio in tutti i soggetti con tumore NSCLC non squamoso randomizzati - CA209057
Categoria di espressione della proteina PD-L1
nella popolazione di riferimento
Nivolumab 3 mg/kg
Docetaxel
Totale
Complessiva
PD-L1 quantificabile, N (%)
Espressione di PD-L1 ≥ 1%
Espressione di PD-L1 < 1%
Espressione di PD-L1 ≥ 5%
Espressione di PD-L1 < 5%
Espressione di PD-L1 riferimento ≥ 10%
Espressione di PD-L1 < 10%
PD-L1 non quantificabile, N (%)
292
231 (79,1)
123/231 (53,2)
108/231 (46,8)
95/231 (41,1)
136/231 (58,9)
86/231 (37,2)
145/231 (62,8)
61 (20,9)
290
224 (77,2)
123/224 (54,9)
101/224 (45,1)
86/224 (38,4)
138/224 (61,6)
79/224 (35,3)
145/224 (64,7)
66 (22,8)
582
455 (78,2)
246/455 (54,1)
209/455 (45,9)
181/455 (39,8)
274/455 (60,2)
165/455 (36,3)
290/455 (63,7)
127 (21,8)
I pazienti con espressione di PD-L1 per tutti i livelli di espressione predefiniti nel gruppo OPDIVO® erano correlati a livelli di sopravvivenza
superiori rispetto a quelli osservati con docetaxel, mentre nei pazienti che non presentavano l'espressione di PD-L1 la sopravvivenza era
simile a quella osservata con docetaxel. Differenze significative nella OS mediana sono state osservate in sottogruppi di trattamento con
nivolumab rispetto a docetaxel quando analizzati in base al livello di espressione di PD-L1. La OS mediana è risultata pari a 17,1, 18,2 e
19,4 mesi per i soggetti trattati con nivolumab, rispetto ai 9,0, 8,1 e 8,0 mesi per i soggetti trattati con docetaxel, con livelli di espressione di
PD-L1 ≥1%, ≥5% e ≥10%, rispettivamente. Non sono state riscontrate differenze nella OS tra i gruppi di trattamento in soggetti con livelli di
espressione <1%, <5% e <10%, con intervalli di OS mediana da 9,7 a 10,4 mesi per il nivolumab e da 10,1 a 10,3 mesi per il docetaxel. I
rapporti di rischio (HR) non stratificato e la sopravvivenza totale (OS) mediana sono illustrati nella figura 1. Il grafico di Kaplan-Meier per
sottogruppi in base al livello di espressione di PD-L1 è mostrato nella figura 2 e nella figura 3.
(128913-002)
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 12/18
Figura 1: forest plot - OS sulla base dell'espressione di PD-L1 in pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso - CA209057
≥1% (n = 246)
HR non
stratificato
0,59
<1% (n = 209)
Livello di espressione di PD-L1
OS mediana (mesi)
OPDIVO
Docetaxel
17,1
9,0
0,90
10,4
10,1
≥5% (n = 181)
0,43
18,2
8,1
<5% (n = 274)
1,01
9,7
10,1
≥10% (n = 165)
0,40
19,4
8,0
<10% (n = 290)
1,00
9,9
10,3
0,25
0,5
1,0
2,0
A favore di OPDIVO
Nota: il rapporto di rischio non stratificato e l'IC al 95% corrispondente sono stati valutati in un modello a rischi proporzionali di Cox,
utilizzando il braccio randomizzato come covariata singola.
Figura 2: sopravvivenza totale (OS, Overall Survival) - Pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso con espressione di PD-L1
<1% - CA209057
1,0
0,9
Probabilità di sopravvivenza
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
OPDIVO
Docetaxel
0,1
0,0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
Sopravvivenza totale (mesi)
Numero di rischio
OPDIVO
123
98
Docetaxel
123
102
(128913-002)
86
77
73
65
27
13
5
0
80
61
44
36
13
4
3
0
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 13/18
Figura 3: sopravvivenza totale (OS, Overall Survival) - Pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso con espressione di PD-L1
<1% - CA209057
1,0
0,9
Probabilità di sopravvivenza
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
OPDIVO
Docetaxel
3
6
9
12
15
18
21
24
27
Sopravvivenza totale (mesi)
Numero di rischio
OPDIVO
108
82
Docetaxel
101
87
(128913-002)
70
60
48
39
26
17
4
0
69
53
38
30
13
5
2
0
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 14/18
Sensibilità analitica: Melanoma
La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata analizzata su 104 casi unici di campioni FFPE di melanoma negli stadi da I a IV.
La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha evidenziato una colorazione in un intervallo dallo 0 al 100% di cellule tumorali positive e
un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3.
Ripetibilità: Melanoma
La ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata valutata presso Dako. Il blinding e la randomizzazione delle sezioni colorate sono stati
eseguiti prima di assegnare il punteggio a tali sezioni. I dati sulle prestazioni sono riportati nelle tabelle 7 e 8. Per ciascun livello di
espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa media (ANA), la percentuale di
concordanza positiva media (APA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto non ridondante dei test a coppie.
Tabella 7: Ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx- Melanoma
Ripetibilità
Inter-strumento
Inter-analista
Inter-giorno
Inter-lotto
Intra-ciclo
Metodo
Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli
di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre
replicati su ciascuno dei tre strumenti Autostainer Link
48. In totale sono stati eseguiti 160 confronti a coppie.
Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli
di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre
replicati da tre analisti su uno strumento Autostainer Link
48. In totale sono stati eseguiti 240 confronti a coppie.
Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli
di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre
replicati in cinque giorni non consecutivi su uno
strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati
eseguiti 160 confronti a coppie.
Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli
di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con due
replicati con ciascuno dei cinque lotti di reagenti su uno
strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati
eseguiti 640 confronti a coppie.
Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli
di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con otto
replicati in un ciclo su uno strumento Autostainer Link 48.
In totale sono stati eseguiti 160 confronti a coppie.
% di concordanza (IC 95%)
Livello di espressione ≥1% Livello di espressione ≥5%
ANA 89,5 (83,2, 93,6)
APA 90,5 (84,8, 94,2)
OA 90,0 (86,0, 92,9)
ANA 90,8 (85,7, 94,2)
APA 85,5 (77,6, 90,9)
OA 88,8 (84,6, 91,9)
ANA 96,4 (92,9, 98,2)
APA 96,8 (93,8, 98,4)
OA 96,6 (94,5, 97,9)
ANA 91,3 (87,1, 94,2)
APA 88,8 (83,4, 92,6)
OA 90,2 (87,0, 92,7)
ANA 95,5 (90,3, 97,9)
APA 96,8 (93,1, 98,6)
OA 96,3 (93,5, 97,9)
ANA 90,0 (84,0, 93,9)
APA 90,0 (84,0, 93,9)
OA 90,0 (86,0, 92,9)
ANA 98,6 (97,3, 99,3)
APA 98,8 (97,8, 99,4)
OA 98,7 (98,0, 99,2)
ANA 92,6 (90,6, 94,2)
APA 86,6 (83,1, 89,5)
OA 90,5 (88,7, 91,9)
ANA 97,1 (92,6, 98,9)
APA 97,7 (94,1, 99,1)
OA 97,4 (94,9, 98,7)
ANA 93,6 (89,0, 96,4)
APA 89,8 (82,7, 94,2)
OA 92,2 (88,4, 94,8)
Riproducibilità esterna: Melanoma
La riproducibilità esterna di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx è stata valutata in tre siti di analisi esterni. Il blinding e la randomizzazione delle sezioni
colorate sono stati eseguiti prima di assegnare il punteggio a tali sezioni. I dati sulle prestazioni sono riportati nella tabella 8. Per ciascun livello di
espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa media (ANA), la percentuale di concordanza
positiva media (APA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto non ridondante dei test a coppie.
Tabella 8: Riproducibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx (melanoma) valutata in tre siti esterni
% di concordanza (IC 95%)
Riproducibilità
Metodo
Livello di espressione ≥1% Livello di espressione ≥5%
Ciascuno dei 18 campioni di melanoma con diversi livelli di
ANA 99,3 (98,8, 99,7)
ANA 93,8 (92,5, 95,1)
Valutazione inter- espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque
APA 99,3 (98,8, 99,7)
APA 92,7 (91,2, 94,2)
sito (tre siti)
giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è stata eseguita
OA 99,3 (98,7, 99,7)
OA 93,3 (91,9, 94,7)
tra tre siti su un totale di 1350 confronti a coppie.
Ciascuno dei 18 campioni di melanoma con diversi livelli di
ANA 99,3 (98,4, 99,8)
ANA 97,3 (95,8, 98,5)
espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque
Saggio intra-sito giorni non consecutivi presso ciascuno dei tre siti dello
APA 99,3 (98,5, 99,8)
APA 96,8 (95,1, 98,2)
OA 99,3 (98,5, 99,8)
OA 97,0 (95,6, 98,3)
studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per tre siti su un
totale di 540 confronti a coppie.
Il punteggio relativo a 30 campioni di melanoma con
Inter-osservatore diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
ANA 90,4 (88,1, 92,5)
ANA 93,2 (91,3, 94,8)
(un osservatore colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, è stato fornito
APA 91,7 (89,7, 93,6)
APA 91,9 (89,8, 93,9)
presso ciascuno da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre
OA 91,1 (89,1, 93,1 )
OA 92,6 (90,7, 94,3)
dei tre siti)
giorni non consecutivi. L'analisi inter-osservatore è stata
eseguita tra tre siti su un totale di 810 confronti a coppie.
Il punteggio relativo a 30 campioni di melanoma con
Intra-osservatore diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a
ANA 99,2 (97,9, 100)
ANA 97,9 (96,1, 99,4)
(un osservatore colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, è stato fornito
APA 99,3 (98,2, 100)
APA 97,6 (95,4, 99,2)
presso ciascuno da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre
OA 99,3 (98,1, 100)
OA 97,8 (95,9, 99,3)
dei tre siti)
giorni non consecutivi. L'analisi intra-osservatore è stata
eseguita per tre siti su un totale di 270 confronti a coppie.
(128913-002)
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 15/18
Valutazione delle prestazioni cliniche: Melanoma
Le prestazioni di PD-L1 IHC 28-8 pharmDx sono state valutate utilizzando i campioni dei pazienti inclusi nella sperimentazione clinica
CA209067, uno studio randomizzato di fase 3, in doppio cieco, per il confronto tra la monoterapia con nivolumab, o la terapia combinata con
nivolumab e ipilimumab, e la monoterapia con ipilimumab in pazienti affetti da melanoma metastatico non trattati in precedenza. Allo studio
hanno partecipato 1296 pazienti in tutto, presso 137 siti in 21 paesi diversi (Australia, Austria, Belgio, Canada, Repubblica Ceca, Danimarca,
Finlandia, Francia, Germania, Irlanda, Israele, Italia, Paesi Bassi, Nuova Zelanda, Norvegia, Polonia, Spagna, Svezia, Svizzera, Regno
Unito e Stati Uniti). Su 1296 pazienti, 945 sono stati randomizzati in uno dei tre bracci di trattamento, con un rapporto 1:1:1, e stratificati in
base allo stato PD-L1 (≥5% tramite CTA), allo stato BRAF e allo stadio M della AJCC. Le caratteristiche di riferimento per i vari aspetti
demografici e della malattia sono state globalmente bilanciate tra i soggetti randomizzati nei gruppi di trattamento. L'età mediana era di
60 anni (intervallo: da 18 a 90) con il 40% di età ≥65 anni e il 13% di età ≥75 anni. I pazienti erano quasi tutti di razza bianca (97%) e di
sesso maschile (65%).
I campioni tumorali pre-studio (riferimento) raccolti dai pazienti affetti da melanoma sono stati prelevati prevalentemente dalle sedi
metastatiche (86%). Le analisi retrospettive del tessuto tumorale archiviato con PD-L1 IHC 28-8 pharmDx sono state eseguite per 915 dei
945 pazienti dello studio randomizzato (97%). Per 55 pazienti dello studio (6%) la melanina ha impedito la valutazione dello stato
dell'espressione di PD-L1 e tale stato è risultato sconosciuto per 47 pazienti (5%) a causa del ritiro del consenso o di campioni mancanti. Lo
stato dell'espressione di PD-L1 è stato accertato per 843 pazienti dello studio (89%). La proporzione dei pazienti con espressione della
proteina PD-L1 tumorale con livelli ≥1% e <1% è stata bilanciata tra i gruppi di trattamento. I risultati dei test sullo stato dell'espressione di
PD-L1 per i pazienti dello studio CA209067 con PD-L1 IHC pharmDx sono riepilogati nella tabella 9.
Tabella 9: Frequenza dell'espressione di PD-L1 in tutti i soggetti con melanoma randomizzati - CA209067
Numero di soggetti, n (%)
nivolumab
nivolumab + ipilimumab
ipilimumab
a
Soggetti con PD-L1 quantificabile
288
278
277
Livello di espressione di PD-L1:
171 (59,4)
155 (55,8)
164 (59,2)
≥1%
<1%
117 (40,6)
123 (44,2)
113 (40,8)
80 (27,8)
68 (24,5)
75 (27,1)
≥5%
<5%
208 (72,2)
210 (75,5)
202 (72,9)
a
Il numero si riferisce solo ai risultati con PD-L1 quantificabile; non include i risultati con PD-L1 indeterminata
La terapia con nivolumab e la terapia combinata con nivolumab e ipilimumab mostrano un miglioramento della PFS, rispetto alla terapia con
ipilimumab, in tutti i sottogruppi di espressione di PD-L1. Il confronto tra la terapia nivolumab+ipilimumab e solo nivolumab non costituiva
l'obiettivo principale dello studio e non sono state effettuate analisi per determinare tale differenza. Tuttavia, nei soggetti con bassi livelli di
espressione di PD-L1, la combinazione nivolumab + ipilimumab ha mostrato un miglioramento della PFS, rispetto al trattamento con solo
nivolumab. Nei soggetti con alti livelli di espressione di PD-L1, il trattamento con solo nivolumab e la combinazione nivolumab + ipilimumab
hanno fornito livelli di PFS paragonabili.
Nei gruppi di trattamento nivolumab e nivolumab + ipilimumab sono stati riscontrati tassi di risposta oggettiva (ORR) superiori per entrambi
gli stati di espressione di PD-L1 (≥1% o ≥5% di espressione della membrana cellulare tumorale), rispetto al gruppo di trattamento con solo
ipilimumab. I soggetti trattati con nivolumab e nivolumab + ipilimumab in cui l'espressione della membrana cellulare tumorale era ≥1% o ≥5%
presentavano tassi ORR numericamente superiori, rispetto ai soggetti con <1% o <5%, rispettivamente. Nel gruppo trattato con ipilimumab, i
tassi ORR sono risultati paragonabili per tutti i sottogruppi di espressione di PD-L1, indipendentemente dalla definizione di tale espressione
(≥1% o ≥5% di espressione della membrana cellulare tumorale). Inoltre, per il gruppo trattato con nivolumab + ipilimumab è stato osservato
un rapporto ORR superiore, rispetto alla monoterapia con nivolumab, indipendentemente dal livello di espressione di PD-L1.
In base all'analisi dell'espressione di PD-L1 di questo studio, l'aumento della PFS per la combinazione nivolumab + ipilimumab, rispetto alla
terapia con solo nivolumab, risulta superiore per il gruppo con espressione di PD-L1 <5%. L'espressione di PD-L1 può essere utilizzata
come ausilio per l'identificazione dei pazienti che possono trarre beneficio dalla combinazione nivolumab+ipilimumab, rispetto alla
monoterapia con nivolumab, ma tali informazioni devono essere considerate nel contesto di tutte le informazioni cliniche disponibili, poiché
sono state osservate risposte clinicamente significative per tutti i sottogruppi di espressione di PD-L1. Tra tutti i livelli di espressione di
PD-L1, l'efficacia del trattamento è risultata superiore per la popolazione (ITT, intention-to-treat) sottoposta alla combinazione
nivolumab+ipilimumab, rispetto a quella trattata con solo ipilimumab.
I rapporti di rischio (HR) PFS e la mediana della PFS in base ai livelli di espressione di PD-L1 sono riepilogati nella tabella 10. I rapporti
ORR valutati dai ricercatori per i livelli di espressione di PD L1 sono riepilogati nella tabella 11.
(128913-002)
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 16/18
Tabella 10: Sopravvivenza libera da progressione (PFS) in base al livello di PD-L1 e al gruppo di trattamento - Tutti i soggetti con
melanoma randomizzati – CA209067
Trattamento
nivolumab
+ipilimumab
nivolumab
ipilimumab
Mediana della PFS
in mesi
(IC 95%)
HR per monoterapia con
nivolumab
(IC 95%])
Livello di
espressione
di PD-L1
N di eventi/
N di pazienti
≥5%
28/68
13,96(9,72, NR)
0,39
(0,25, 0,62)
0,96 (0,58, 1,58)
<5%
103/210
11,24(7,98, NR)
0,42
(0,32, 0,54)
0,70 (0,54, 0,91)
≥1%
72/155
12,35(8,51, NR)
0,44
(0,32, 0,58)
0,95 (0,69, 1,31)
<1%
59/123
11,17(6,93, NR)
0,38
(0,27, 0,53)
0,56 (0,40, 0,79)
≥5%
33/80
14,00(9,07, NR)
0,41
(0,26, 0,63)
--
<5%
122/208
0,59
(0,47, 0,75)
--
5,32(2,83, 7,06)
≥1%
79/171
<1%
76/117
12,39(8,11, NR)
2,83(2,76, 5,13)
≥5%
53/75
<5%
HR per ipilimumab
(IC 95%)
0,46
(0,34, 0,61)
--
0,67
(0,49, 0,92)
--
3,94 (2,79, 4,21)
--
--
154/202
2,83 (2,76, 3,09)
--
--
≥1%
122/164
3,91 (2,83, 4,17)
--
--
<1%
85/113
2,79 (2,66, 2,96)
--
--
Abbreviazioni: IC = intervallo di confidenza, NR = non raggiunto, PFS = sopravvivenza libera da progressione (Progression-Free Survival)
HR = rapporto di rischio (Hazard Ratio) per l'effetto del trattamento in base al modello dei rischi proporzionali di Cox con trattamento, stato
PD-L1 e interazione fra trattamento e stato PD-L1
Tabella 11: Rapporti ORR valutati dai ricercatori: pazienti con melanoma in base all'espressione di PD-L1 - Soggetti testati per
PD-L1 - CA209067
PD-L1
ORR
Numero
Livello di
di pazienti
Trattamento
espressione
%
[IC 95%]
≥5%
68
72%
(59,9, 82,3)
Nivolumab +
<5%
210
55%
(47,8, 61,6)
Ipilimumab
≥1%
155
65%
(56,4, 72,0)
<1%
123
52%
(42,8, 61,1)
≥5%
80
58%
(45,9, 68,5)
<5%
208
41%
(34,6, 48,4)
Nivolumab
≥1%
171
54%
(46,6, 62,0)
<1%
117
33%
(24,9, 42,6)
≥5%
75
21%
(12,7, 32,3)
<5%
202
18%
(12,8, 23,8)
Ipilimumab
≥1%
164
19%
(13,2, 25,7)
<1%
113
19%
(11,9, 27,0)
Tabella 12: Risoluzione dei problemi
Problema
1. Nessuna colorazione dei vetrini di
controllo o dei campioni
Possibile causa
1a. Errore di programmazione.
1d. Deterioramento del vetrino Control
Slide
2a. Utilizzo di un metodo di fissazione
non appropriato.
2b. Smascheramento antigenico
inadeguato.
Intervento consigliato
1a. Verificare che il programma SK005 PD-L1 IHC
28-8 pharmDx sia stato selezionato per la
programmazione dei vetrini.
1b. Verificare che la soluzione substrato-cromogeno
DAB+ sia stata preparata in modo corretto.
1c. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer,
codice K8007.
1d. Controllare la data di scadenza e le condizioni di
conservazione del kit sull'esterno della confezione.
2a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e
metodi di fissazione approvati.
2b. Verificare che la procedura di pretrattamento
3-in-1 sia stata eseguita correttamente.
3a. Paraffina rimossa in modo
incompleto.
3a. Verificare che la procedura di pretrattamento
3-in-1 sia stata eseguita correttamente.
1b. Assenza di reazione con la soluzione
substrato-cromogeno DAB+ (DAB)
1c. Sodio azide in tampone di lavaggio.
2a. Colorazione debole dei vetrini con i
campioni.
2b. Colorazione debole dei vetrini dei
campioni o della linea cellulare positiva
sul vetrino Control Slide fornito da
Dako.
3. Colorazione di fondo dei vetrini
eccessiva.
(128913-002)
P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 17/18
3b. Essiccazione dei vetrini durante il
caricamento su Autostainer Link 48.
3c. Legame aspecifico dei reagenti alla
sezione di tessuto.
4. Distacco del tessuto dai vetrini.
4a. Utilizzo di vetrini per microscopio
non appropriati.
3b. Assicurarsi che i vetrini siano sempre bagnati
con il tampone durante il caricamento e prima di
iniziare il ciclo.
3c. Verificare che la fissazione del campione sia
appropriata e/o valutare l'eventuale presenza di
necrosi.
4a. Utilizzare Dako FLEX IHC Microscope Slides,
(codice K8020), o vetrini caricati (come Fisherbrand
Superfrost Plus).
4b. Le sezioni tagliate devono essere collocate in un
forno a 58 ± 2 °C per 1 ora prima della colorazione .
5a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e
metodi di fissazione approvati.
5b. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer,
codice K8007.
6. Ciò è normale e non influenza la colorazione.
4b. Preparazione inadeguata dei
campioni
5. Colorazione specifica del vetrino
5a. Utilizzo di un metodo di fissazione
eccessivamente intensa.
non appropriato.
5b. Utilizzo di tampone di lavaggio non
appropriato.
6. La soluzione Target Retrieval
6. Quando riscaldata, la soluzione
Solution appare torbida quando
Target Retrieval Solution assume un
riscaldata.
aspetto torbido.
NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna delle cause sopracitate o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace,
contattare l'Assistenza tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla
preparazione dei campioni sono disponibili nel documento di Dako "Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods" (Manuale di
formazione: metodi di colorazione istochimica) (15) (fornito da Dako).
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3. OPDIVO® package insert.
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5. Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer. N Engl J
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13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired
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15. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.
Edizione 04/16
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P03914IT_02/SK00521-2/2016.04 p. 18/18