cobas® TaqScreen DPX Test

cobas® TaqScreen DPX Test
for use on the cobas s 201 system
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
cobas® TaqScreen DPX Test
cobas® TaqScreen DPX Control Kit
cobas® TaqScreen Wash Reagent
DPX
96 Tests
P/N: 05509203 190
DPX CTL
12 Sets
P/N: 05509181 190
5.1 L
P/N: 04404220 190
TS WR
USO PREVISTO
Il test cobas® TaqScreen DPX, destinato all'uso sul sistema cobas s 201, è un test di amplificazione in vitro
degli acidi nucleici per le finalità di quantificazione diretta del DNA del parvovirus B19 (B19V), genotipi 1, 2 e 3,
e di rivelazione qualitativa diretta dell'RNA del virus dell'epatite A (HAV), genotipi I, II e III, nel plasma umano.
Il test cobas® TaqScreen DPX è destinato all'uso come "test in processo" per la sola quantificazione del DNA
del parvovirus B19 o per la simultanea quantificazione del DNA di parvovirus B19 e rivelazione dell'RNA del
virus dell'epatite A nel plasma destinato ad ulteriore lavorazione. È possibile utilizzare plasma ottenuto da
sangue intero (plasma recuperato) o raccolto per aferesi (plasma di origine). Il plasma ottenuto da tutti i
donatori o dai pool in lavorazione può essere sottoposto al test utilizzando i campioni individuali o i pool, che
sono costituiti dalle aliquote dei campioni individuali.
Questo test non può essere utilizzato sui campioni di sangue del cordone ombelicale.
Questo test non può essere utilizzato a scopo diagnostico.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Il test cobas® TaqScreen DPX incorpora molteplici coloranti che consentono la rivelazione simultanea di target
individuali senza l'uso di test discriminanti. In base al file di definizione del test (Test Definition File, TDF)
installato, con il test cobas® TaqScreen DPX è possibile ottenere risultati sia quantitativi per il virus B19V che
qualitativi per il virus HAV, oppure solo risultati quantitativi per il virus B19V.
Il parvovirus umano B19 (B19V) è un piccolo virus privo di involucro (envelope), con DNA a filamento singolo,
appartenente al genere Erythrovirus della famiglia delle Parvoviridae1. Gli eritrovirus umani sono raggruppati in tre
genotipi distinti: genotipo 1 (ceppi B19V), genotipo 2 (ceppi A6) e genotipo 3 (ceppi V9/D91.1)1. Il virus B19V è
diffuso in tutto il mondo e, in base ad alcuni studi sierologici, almeno il 50% degli adulti possiede gli anticorpi IgG
anti-B19V, il che indica un'infezione pregressa2, 3. Il virus è associato a una patologia clinica la cui manifestazione e
gravità dipendono dalle condizioni immunologiche ed ematologiche del soggetto4. Nei soggetti immunocompetenti
l'infezione è spesso asintomatica o si manifesta in forme lievi, ad esempio eritema infettivo (quinta malattia) in età
pediatrica o artropatia in età adulta. Tuttavia il virus B19V può anche causare patologie gravi, ad esempio crisi
aplastiche transitorie in soggetti con disfunzioni ematologiche e idrope, anemia congenita o morte fetale durante la
gravidanza4. La prevalenza di B19V nei donatori di sangue e plasma può variare tra 0,003 e 0,6%, a seconda che il
prelievo venga effettuato o meno mentre è in corso un'epidemia5, 6.
Pur trasmettendosi preferibilmente per via aerea, l'infezione da B19V può anche essere veicolata dai derivati del
plasma per effetto delle dimensioni dei pool, dell'incidenza delle infezioni acute e asintomatiche da B19V, dei
livelli elevati di virus in una donazione viremica (fino a 1012 UI/ml) e della resistenza del virus B19V alla maggior
parte dei trattamenti di inattivazione/rimozione virale più comuni, ad esempio il trattamento con
solvente/detergente (S/D) e la pastorizzazione7. La presenza del DNA di B19V nei pool di plasma e nei
plasmaderivati è stata segnalata8-10 e ampiamente documentata nella letteratura scientifica che si è occupata
della trasmissione del virus B19V a causa della somministrazione di plasmaderivati, in particolare dei fattori
della coagulazione7, 11-13.
La sezione Revisione del documento si trova in fondo a questo documento.
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Il virus dell'epatite A (HAV) è un piccolo virus a RNA privo di involucro (envelope), appartenente al gruppo
degli Hepatovirus della famiglia Picornaviridae14. L'HAV ha una diffusione globale e si trasmette per via oralefecale, principalmente attraverso il contatto personale ravvicinato. Nei Paesi in via di sviluppo, dove le epidemie
sono frequenti, l'infezione viene contratta nei primi anni di vita e gran parte della popolazione adulta è dunque
protetta dagli anticorpi anti-HAV15. Nei Paesi industrializzati si è invece assistito ad un graduale declino del
tasso di incidenza del virus, che ha determinato un avanzamento dell'infezione verso l'età adulta16. Negli esseri
umani le infezioni da HAV possono manifestarsi in modo altamente variabile, da infezioni totalmente
asintomatiche (soprattutto in età pediatrica) ad epatiti fulminanti con possibile esito mortale in alcuni casi.
Nell'Europa del Nord, in Giappone, in Canada e negli USA la prevalenza nella popolazione generale è molto
bassa (circa 0,01%), pertanto l'insorgenza dell'infezione è in genere associata ai gruppi considerati a rischio, ad
esempio i viaggiatori che si recano nelle regioni endemiche17. L'HAV può essere raggruppato in diversi genotipi
(I - VI). Negli esseri umani sono stati osservati i genotipi I, II e III18, 19. Sebbene l'HAV infettivo possa trovarsi nel
sangue nel periodo finestra sierologico20, il rischio di trasmissione dell'HAV mediante trasfusione è molto basso.
Ciononostante, come il virus B19V anche il virus HAV non viene facilmente inattivato con un trattamento S/D o
la pastorizzazione e sono stati segnalati casi di trasmissione di HAV attraverso i plasmaderivati, in prevalenza i
fattori della coagulazione21-23.
La tecnologia NAT consente di verificare la contaminazione dei pool di plasma con B19V e HAV, pertanto a
partire dal 2000 alcuni produttori di plasma hanno iniziato ad eseguire i test NAT per ricercare il DNA di B19V e
l'RNA di HAV nel plasma destinato ad ulteriore lavorazione. Questi test avevano lo scopo di ridurre il carico di
B19V nei pool di plasma e di eliminare tutte le unità contaminate dall'HAV. I test di questo tipo sono definiti
"test in processo". Dopo aver preso atto della presenza delle IgG anti-B19V nei pool di plasma e delle
trasmissioni segnalate di B19V attraverso prodotti contenenti > 104 UI/ml di DNA di B19V7, la FDA e le autorità
omologhe dell'UE hanno ritenuto opportuno suggerire un limite di < 104 UI/ml di DNA di B19V per i pool di
plasma, per quanto riguarda sia il plasma destinato ad ulteriore lavorazione nella produzione delle
immunoglobuline anti-D, sia il plasma che viene sottoposto a trattamento per l'inattivazione virale24, 25, 26. Al
momento i test per l'HAV sui pool di plasma non sono regolamentati a livello legislativo, tuttavia in base alle
disposizioni dell'UE, se vengono eseguiti i test NAT per l'HAV sui pool di plasma come parte integrante dei "test
in processo", il test utilizzato deve avere la capacità di rivelare un controllo contenente 100 UI/ml di RNA di
HAV26.
Il test cobas® TaqScreen DPX è un test duplex per la rivelazione simultanea del B19V e dell'HAV in campioni
individuali o in pool di campioni di plasma di origine umana. Grazie all'uso della tecnologia con coloranti
multipli, è possibile identificare ogni target virale senza eseguire ulteriori test discriminanti. Il test fornisce
inoltre un valore quantitativo (espresso in UI/ml) per il target B19V attraverso l'uso di uno standard di
quantificazione (Quantitation Standard, QS) con tracciabilità diretta allo standard internazionale B19V
dell'OMS27. Lo standard QS con un Controllo Interno (Internal Control, IC) per il target HAV viene co-estratto e
co-amplificato insieme ad ogni campione. Il test cobas® TaqScreen DPX si basa su una tecnica generica per la
preparazione degli acidi nucleici sullo strumento COBAS® AmpliPrep. Il DNA di B19V, l'RNA del virus HAV, lo
standard QS e il controllo IC vengono amplificati e rivelati in una provetta singola eseguendo l'analisi PCR realtime automatizzata sull'analizzatore COBAS® TaqMan®. È possibile ottenere la discriminazione del target virale,
dello standard QS e del controllo IC grazie all'uso di sonde fluorescenti che vengono rivelate in canali separati
dell'analizzatore COBAS® TaqMan®. Nel test è incorporato l'enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi), che riduce
la potenziale contaminazione con materiale amplificato in precedenza (amplicone).
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il test cobas® TaqScreen DPX per l'utilizzo sul sistema cobas s 201 si basa su 4 procedure principali:
1.
Creazione automatizzata dei pool di campioni e pipettamento dei controlli con il pipettatore Hamilton
MICROLAB® STAR/STARlet IVD (opzionale)
2.
Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep
3.
Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici e rivelazione automatizzata real-time dei prodotti della
PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan®
4.
Gestione automatizzata dei dati con il software PDM (Pooling and Data Management)
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Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con il pipettatore Hamilton MICROLAB
STAR/STARlet IVD
Il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD automatizza il pipettamento dei campioni individuali
dei donatori, la creazione di pool costituiti da più campioni dei donatori e il pipettamento dei controlli del
test. Il sistema cobas s 201 risolve i pool reattivi scomponendo i risultati dei singoli campioni che
costituiscono il pool. Il sistema cobas s 201 è progettato in modo specifico per il trattamento dei campioni
in batch. Il batch è un gruppo di campioni e controlli da sottoporre tutti insieme alle procedure di
pipettamento, estrazione, amplificazione e rivelazione. Al termine del pipettamento di un batch con il
pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, l'intero rack per campioni viene trasferito sullo
strumento COBAS® AmpliPrep per la fase successiva della procedura.
Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep
Vengono trattati simultaneamente gli acidi nucleici dei campioni, le molecole aggiunte del controllo interno (IC)
di Armored RNA di HAV e le molecole dello standard di quantificazione (QS) del DNA di B19V incapsulate in
lambda (che agiscono come controlli per la preparazione dei campioni e per il processo di
amplificazione/rivelazione/quantificazione). Il test cobas® TaqScreen DPX contiene i reagenti necessari per
completare una sequenza di cinque fasi sullo strumento COBAS® AmpliPrep. La soluzione di proteinasi,
coinvolta nella digestione enzimatica delle proteine, consente di indurre la lisi, inattivare le nucleasi e facilitare il
rilascio dell'RNA e del DNA dalle particelle virali. L'aggiunta del reagente di lisi nel campione induce la lisi
virale e l'inattivazione delle nucleasi attraverso la denaturazione delle proteine. L'RNA e il DNA vengono
rilasciati e simultaneamente protetti dalle nucleasi. Gli acidi nucleici rilasciati si legano alla superficie di silice
delle biglie magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP) aggiunte. Ciò avviene prevalentemente a causa della
carica positiva netta sulla superficie delle biglie magnetiche e della carica negativa netta degli acidi nucleici,
dovuta alla concentrazione dei sali caotropici e alla forza ionica della reazione di lisi. Il reagente di lavaggio
rimuove le sostanze non legate e le impurità, come le proteine denaturate, i detriti cellulari e i potenziali inibitori
della PCR (ad esempio l'emoglobina), riducendo la concentrazione salina. Gli acidi nucleici purificati vengono
rilasciati dalle biglie magnetiche a una temperatura elevata con il tampone di eluizione.
Amplificazione automatizzata e rivelazione dell'acido nucleico con l'analizzatore COBAS® TaqMan®
Dopo la fase di preparazione automatizzata dei campioni, durante la quale gli acidi nucleici purificati vengono
isolati dal plasma umano, viene utilizzato il reagente Master Mix (MMX) cobas® TaqScreen DPX per eseguire
l'amplificazione/rivelazione dell'RNA di HAV e dell'RNA del controllo interno (IC) e l'amplificazione/
quantificazione del DNA di B19V e del DNA dello standard di quantificazione (QS). Dopo l'attivazione tramite
l'aggiunta di acetato di manganese, il reagente Master Mix cobas® TaqScreen DPX consente la trascrizione
inversa (per i target RNA), quindi l'amplificazione PCR delle regioni altamente conservate dell'RNA di HAV,
dell'RNA del controllo IC, del DNA di B19V e del DNA dello standard QS grazie all'uso di primer specifici. Gli
ampliconi vengono rivelati tramite l'ibridazione delle sonde oligonucleotidiche specifiche. L'amplificazione,
l'ibridazione e la rivelazione avvengono simultaneamente.
Trascrizione inversa e amplificazione PCR
Le reazioni di trascrizione inversa e amplificazione sono rese possibili da un enzima ricombinante
termostabile, denominato DNA Polimerasi Z05. In presenza di manganese (Mn2+), l'enzima DNA Polimerasi
Z05 induce le attività di trascrittasi inversa e di polimerasi del DNA. Sia la trascrizione inversa che
l'amplificazione PCR possono dunque avere luogo nella stessa miscela di reazione.
Durante l'amplificazione PCR, l'elevata temperatura intermittente durante i cicli induce la denaturazione del
target e dell'amplicone IC/QS, con la conseguente formazione di un DNA a filamento singolo. La Polimerasi
DNA Z05 estende i primer appaiati lungo gli stampi target, producendo una molecola di DNA a filamento
doppio (amplicone). Questo processo viene ripetuto per molti cicli e, ad ogni ciclo, la quantità di amplicone
raddoppia. L'amplificazione interessa soltanto la regione dei genomi target che è compresa tra i primer, mentre
non vengono amplificati i genomi interi.
Prevenzione della contaminazione per carry-over
È possibile prevenire la contaminazione dell'amplicone dovuta all'effetto carry-over utilizzando l'enzima
AmpErase (uracil-N-glicosilasi) e il trifosfato di deossiuridina (dUTP). La deossiuridina non è presente nel DNA
in natura, ma è sempre presente nell'amplicone perché uno dei dNTP utilizzati nel reagente Master Mix è una
miscela composta da trifosfato di deossiuridina e trifosfato di timidina, pertanto solo l'amplicone contiene
deossiuridina. L'enzima AmpErase riconosce i filamenti di DNA che contengono deossiuridina28 e ne catalizza
la distruzione aprendo la catena di deossiribosio in posizione C1, rendendo così il DNA non amplificabile. Non
sono interessati il DNA contenente deossitimidina e l'RNA contenente ribouridina29, 30. Nella fase iniziale della
trascrizione inversa, l'enzima AmpErase catalizza la segmentazione dell'amplicone del carry-over al livello dei
residui di deossiuridina. Dopo l'esposizione a temperature superiori ai 55°C, l'enzima AmpErase è inattivo per
un periodo di tempo prolungato, durante il quale non distrugge l'amplicone target che si è appena formato.
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Rivelazione dei prodotti della PCR31, 32
Il reagente MMX cobas® TaqScreen DPX contiene sonde di rivelazione che sono specifiche per gli acidi
nucleici di HAV, IC, B19V o QS. Ogni sonda di rivelazione è marcata con 1) uno dei quattro fluorocromi che
agiscono da reporter e 2) un altro fluorocromo che funge da quencher. Ogni specifico fluorocromo reporter è
associato al rispettivo target e viene misurato a una lunghezza d'onda precisa. Per tutte le sonde viene utilizzato
un solo tipo di fluorocromo quencher. Questo sistema assicura la rivelazione di tutti i target amplificati a
lunghezze d'onda differenti.
Prima che l'amplificazione PCR abbia inizio, le sonde sono intatte e la fluorescenza del fluorocromo reporter è
soppressa dall'azione del colorante quencher, in virtù del trasferimento di energia tipo Förster. Durante
l'amplificazione PCR, le sonde si ibridizzano a specifiche sequenze di DNA a filamento singolo e si segmentano
per effetto dell'attività della 5'-3' nucleasi della DNA polimerasi Z05, nello stesso momento in cui avviene
l'amplificazione. Una volta che i fluorocromi reporter e quencher vengono separati per effetto di questa
segmentazione, l'attività di fluorescenza del reporter viene rivelata. Con ogni ciclo di PCR vengono generate
quantità maggiori di sonde segmentate e il segnale cumulativo del fluorocromo reporter aumenta
parallelamente.
È possibile ottenere la rivelazione real-time dei prodotti della PCR misurando la fluorescenza dei fluorocromi
reporter rilasciati, che individualmente rappresentano i target virali, il controllo IC e lo standard QS.
Gestione automatizzata dei dati con il software PDM
Il software Roche PDM consente all'operatore di esaminare i risultati e creare i report. Il software Roche
PDM classifica i risultati dei test cobas® TaqScreen DPX come non reattivi, reattivi o non validi per quanto
riguarda il target HAV e < cutoff,  cutoff o non valido per quanto riguarda il target B19V. Oltre che per
recuperare ed esaminare i risultati della PCR, il software Roche PDM può essere utilizzato dall'operatore
per stampare i report, cercare i risultati, accettare i risultati dei donatori e trasmettere i dati a un sistema
LIS (opzionale).
MATERIALI FORNITI DA ROCHE
I kit necessari che vengono forniti per la rivelazione dell'RNA del virus HAV e la quantificazione del DNA di
B19V nei campioni di plasma sono tre: 1) cobas® TaqScreen DPX Test 2) cobas® TaqScreen DPX Control
Kit e 3) cobas® TaqScreen Wash Reagent. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data
Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale.
cobas® TaqScreen DPX Test
(P/N: 05509203 190)
DPX
96 test
DPX CTL
DPX
CTL
12 set
DPX CS1
(Cassetta di reagente MGP per DPX)
DPX CS2
(Cassetta di reagente di lisi per DPX)
DPX CS3
(Cassetta multireagente per DPX)
DPX CS4
(Cassetta di reagente test-specifico per DPX)
cobas® TaqScreen DPX Control Kit
Kit di controlli cobas® TaqScreen DPX
(P/N: 05509181 190)
DPX D(+)C
(Controllo doppio HAV-positivo e B19V-basso positivo)
DPX H(+)C
(Controllo B19V-positivo alto)
DPX (–) C
(Controllo negativo cobas® TaqScreen DPX)
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4
cobas® TaqScreen Wash Reagent
Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen
(P/N: 04404220 190)
5,1 l
TS WR
TS WR
(Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen)
ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE
(ACQUISTABILI PRESSO ROCHE)
Questo test deve essere obbligatoriamente eseguito sul sistema cobas s 201. Il sistema cobas s 201 deve
essere obbligatoriamente installato e utilizzato come una configurazione completa. I singoli componenti del
sistema cobas s 201 non possono essere utilizzati separatamente uno dall'altro, né possono essere
sostituiti con altri componenti. Il sistema cobas s 201 utilizza i componenti elencati di seguito.
Strumentazione e software per il sistema cobas s 201

Pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (opzionale), workstation e software Pooling
Manager

Strumento COBAS® AmpliPrep

Analizzatore COBAS® TaqMan®

Stazione dati e software AMPLILINK

Server Roche PDM Data Manager, workstation e software Data Manager

File di definizione del test DPX per il test cobas® TaqScreen DPX

File di definizione del test Parvovirus B19 (B19V) per il test cobas® TaqScreen DPX

Manuale operativo del sistema cobas s 201 - Configurazione D
Rack e materiali di consumo

Rack per campioni COBAS® AmpliPrep (SK24) (P/N: 28122172001)

Rack per SPU COBAS® AmpliPrep (P/N: 05471664001)

Rack per reagenti COBAS® AmpliPrep (P/N: 28122199001)

Unità di trattamento campioni (Sample Processing Units, SPU) (P/N: 03755525001)

Provette per campioni iniziali (provette S) con clip dei codici a barre (P/N: 03137040001)

Rack per puntali K (P/N: 03287343001)

Confezione di provette K da 12 x 96 (P/N: 03137082001)

Carrier K per COBAS® TaqMan® (P/N: 28150397001)

Puntali CO-RE a volume elevato (1000 μl), filtro (P/N: 04639642001)

Piastre a pozzetti profondi con etichette del codice a barre (P/N: 04639634001)

Coperchi per piastre a pozzetti profondi (P/N: 04789288001)

Rack portacampioni per 24 provette di analisi (P/N: 04639502001)

Rack portacampioni per 32 provette di analisi (P/N: 04639529001)

Rack portapuntali (P/N: 04639545001)

Rack per piastre a pozzetti profondi (P/N: 04639553001)

Vassoio per rack SK24 (P/N: 04639600001)

Kit spray disinfettante Hamilton (P/N: 06254250001)

Kit detergente Hamilton MICROLAB (P/N: 06254268001)

Guanti monouso, senza talco
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Doc Rev. 4.0
5
REAGENTI
cobas® TaqScreen DPX Test
(P/N: 05509203 190)
DPX
DPX CS1
MGP
(Biglie magnetiche)
Biglie magnetiche
93% Isopropanolo
Xi
96 test
2 x 48 test
2 x 7,0 ml
93% (p/p) Isopropanolo
Irritante
F
93% (p/p) Isopropanolo
Facilmente
infiammabile
DPX CS2
LYS
(Reagente di lisi)
Diidrato di citrato di sodio
42,5% Tiocianato di guanidina
< 14% Polidocanolo
0,9% Ditiotreitolo
Xn
42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina
2 x 48 test
2 x 78 ml
Nocivo
DPX CS3
Pase
(Soluzione proteinasi)
Tampone TRIS
< 0,05% EDTA
Cloruro di calcio
Acetato di calcio
≤ 7,8% Proteinasi
Glicerolo
Xn
≤ 7,8% (p/p) Proteinasi
2 x 48 test
2 x 3,8 ml
Nocivo
EB
(Tampone di eluizione)
Tampone TRIS
0,2% Conservante Metilparaben
2 x 7,0 ml
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Doc Rev. 4.0
6
DPX CS4
DPX MMX-R1
(Master Mix DPX Reagente 1)
Acetato di potassio
Acetato di manganese
Glicerolo
14,4% Dimetil sulfoxide
0,08% Sodio azide
Acido acetico
2 x 48 test
2 x 3,0 ml
DPX MMX-R2
(Master Mix DPX Reagente 2)
Tampone tricina
Acetato di potassio
Idrossido di potassio
4,1% Dimetil sulfoxide
Glicerolo
Tween 20
< 0,09% dATP, dGTP, dCTP, dUTP, dTTP
< 0,01% Primer upstream e downstream per B19V e HAV
< 0,01% Sonde fluorescenti per B19V e HAV
< 0,01% Sonde fluorescenti per QS di B19V e IC di HAV
< 0,01% Aptamero oligonucleotidico
< 0,01% DNA Polimerasi Z05 (batterica)
< 0,01% Enzima AmpErase® [uracil-N-glicosilasi] (batterico)
0,08% Sodio azide
DPX IC/QS
(Controllo Interno e standard di quantificazione DPX)
Tampone TRIS
≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico)
EDTA
0,05% Sodio azide
< 0,001% RNA di IC sintetico, non infettivo,
incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago MS2
< 0,001% DNA di QS B19V sintetico, non infettivo,
incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago Lambda
cobas® TaqScreen DPX Control Kit
Kit di controlli cobas® TaqScreen DPX
(P/N: 05509181 190)
DPX CTL
DPX D(+)C
(Controllo positivo doppio DPX)
< 0,001% RNA di HAV sintetico, non infettivo,
incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago MS2
< 0,001% DNA di B19V sintetico, non infettivo,
incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago Lambda
Plasma umano negativo, non reattivo (in base ai test su licenza della FDA USA) a:
IgG B19V e IgM Ab, HBsAg, HBV core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab e RNA di HIV-1.
Non reattivo in base ai test NAT per RNA di HAV; e DNA di B19V ≤ 5 UI/ml
in base ai metodi PCR.
0,1% Conservante ProClin® 300
Xi
2 x 2,5 ml
2 x 13 ml
12 set
12 x 1,6 ml
Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone
e 2-metil-3(2H)-isotiazolone
Irritante
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
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Doc Rev. 4.0
7
DPX H(+)C
(Controllo positivo alto DPX)
< 0,001% DNA di B19V sintetico, non infettivo,
incapsulato in proteina di rivestimento batteriofago Lambda
Plasma umano negativo, non reattivo (in base ai test su licenza della FDA USA) a:
IgG B19V e IgM Ab, HBsAg, HBV core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab e RNA di HIV-1.
Non reattivo in base ai test NAT per RNA di HAV; e DNA di B19V ≤ 5 UI/ml
in base ai metodi PCR.
0,1% conservante ProClin 300
Xi
12 x 1,6 ml
Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone
e 2-metil-3(2H)-isotiazolone
Irritante
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
DPX (–) C
(Controllo negativo cobas® TaqScreen DPX)
Tampone fosfato di sodio
EDTA
0,002% Poly rA RNA (sintetico)
Colorante amaranto
0,1% conservante ProClin 300
Xi
12 x 1,6 ml
Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone
e 2metil-3(2H)-isotiazolone
Irritante
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
cobas® TaqScreen Wash Reagent
Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen
(P/N: 04404220 190)
TS WR
5,1 litri
TS WR
(Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen)
Diidrato di citrato di sodio
0,1% Conservante Metilparaben
REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE
A. La temperatura ambiente è definita tra 15 e 30°C.
B.
Non congelare i reagenti e i controlli.
C. Conservare i reagenti DPX CS1, DPX CS2, DPX CS3 e DPX CS4 tra 2 e 8°C. I reagenti in confezione
integra sono stabili fino alla data di scadenza indicata.
D. Dopo l'apertura i reagenti sono stabili per 30 giorni tra 2 e 8°C o fino alla data di scadenza indicata, se
precedente.
E.
I reagenti possono essere utilizzati per un massimo di 6 sedute e per un massimo di 48 ore cumulative
sullo strumento COBAS® AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8°C tra le sedute. Il software
AMPLILINK tiene traccia delle ore di utilizzo delle cassette di reagente sullo strumento COBAS® AmpliPrep
e impedisce l'uso delle cassette che hanno raggiunto 48 ore cumulative.
F.
Il software AMPLILINK non tiene traccia del numero di sedute dello strumento che sono state eseguite con
le cassette. È compito dell'operatore smaltire le cassette dei reagenti dopo averle utilizzate per 6 sedute
dello strumento.
G. Conservare i controlli DPX D(+)C, DPX H(+)C e DPX (–) C tra 2 e 8°C. I controlli sono stabili fino alla
data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, è necessario smaltire le parti inutilizzate.
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H. Conservare il reagente TS WR tra 15 e 30°C. In confezione integra, il reagente TS WR è stabile fino alla
data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente è stabile per 30 giorni tra 15 e 30°C o fino alla data
di scadenza, se precedente.
PRECAUZIONI
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
A. I campioni potrebbero essere infettivi. Osservare le precauzioni universali durante lo svolgimento del
test.33,34 Questa procedura dovrebbe essere eseguita esclusivamente da personale qualificato ed esperto
nell'uso del test cobas® TaqScreen DPX e nella manipolazione di materiali infettivi. Pulire e disinfettare
accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base di ipoclorito di
sodio 0,5% e acqua deionizzata o distillata (candeggina diluita). Successivamente pulire la superficie con
etanolo 70%.
B.
ATTENZIONE: i controlli DPX D(+)C e DPX H(+)C contengono plasma umano derivato da
sangue umano. Il plasma utilizzato è stato sottoposto ai test NAT opportuni, che ne hanno
accertato la non reattività per quanto riguarda gli anticorpi IgG e IgM anti-B19V, HBsAg, HBV
core Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab e la non reattività per quanto riguarda l'RNA di HIV-1. Il plasma
utilizzato è stato inoltre sottoposto ai test cobas® TaqScreen DPX, che hanno confermato la non
reattività all'RNA di HAV e hanno verificato un contenuto di DNA di B19V ≤ 5 UI/ml. Allo stato
attuale, tuttavia, nessun metodo di analisi garantisce con assoluta certezza che i prodotti
derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali derivati da sangue
umano devono essere considerati come potenzialmente infettivi e manipolati nel rispetto delle
precauzioni universali. In caso di fuoriuscita accidentale, disinfettare immediatamente l'area con una
soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina diluita) o seguire le procedure di
laboratorio opportune.
C. Osservare le precauzioni di routine del laboratorio. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o
fumare nelle aree di lavoro designate. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit,
indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere manipolato i
campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani.
D. I reagenti DPX MMX-R1, DPX MMX-R2 e DPX IC/QS contengono sodio azide come conservante. Se
le soluzioni contenenti sodio azide devono essere smaltite attraverso l'impianto di scarico, è necessario
diluire e sciacquare con abbondante acqua corrente, in modo da evitare l'accumulo di depositi nelle
tubature metalliche in grado di dare luogo a reazioni esplosive.
E.
È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa
procedura.
F.
È consigliabile utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di nucleasi, di tipo monouso. Se non si
previene adeguatamente la contaminazione crociata durante la manipolazione e il trattamento dei
campioni, i risultati generati potrebbero essere falsi positivi.
G. Per garantire prestazioni ottimali del test, utilizzare soltanto i materiali di consumo forniti e consigliati.
H. Manipolare tutti i materiali contenenti campioni o controlli osservando la Buona Prassi di Laboratorio, in
modo da prevenire la contaminazione crociata di campioni e controlli.
I.
Prima dell'uso ispezionare visivamente le singole cassette di reagente, le provette di controllo e il reagente
di lavaggio in modo da escludere eventuali segni di perdite. Se si accertano perdite, non utilizzare il
materiale per eseguire i test.
J.
Smaltire tutti i materiali che sono entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto delle leggi
pertinenti a livello nazionale e locale.
K.
Non utilizzare il kit cobas® TaqScreen DPX Test, il kit di controlli cobas® TaqScreen DPX o il reagente di
lavaggio cobas® TaqScreen dopo le rispettive date di scadenza. Non scambiare, mescolare o combinare
reagenti appartenenti a kit o a lotti diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS®
AmpliPrep.
L.
Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta
presso l'ufficio Roche locale.
M. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare
immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita
accidentale dei reagenti, diluire con acqua prima di asciugare.
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N. Evitare che la soluzione LYS, contenente tiocianato di guanidina, entri in contatto con la
soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). Tale miscela può produrre un gas fortemente
tossico.
O. Per un corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee guida fornite.
Qualunque deviazione dalle procedure e dalle linee guida approvate potrebbe compromettere le
prestazioni del test.
P.
Evitare di utilizzare campioni eccessivamente emolizzati.
Q. La contaminazione dei campioni di plasma con globuli rossi (> 5 %) può inibire il test cobas® TaqScreen
DPX.
R.
Non utilizzare mai, in nessuna fase del test, componenti con etichette dei codici a barre danneggiate.
PREPARAZIONE DEI CONTROLLI E DEI REAGENTI
A. Rimuovere i reagenti del kit di controlli cobas® TaqScreen DPX e i reagenti del test cobas® TaqScreen
DPX dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso, in modo da ridurre al minimo la condensa sul codice a barre.
PRELIEVO, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DEI POOL DI CAMPIONI
Nota: manipolare tutti i campioni come se fossero agenti infettivi.
Campioni
A. I campioni raccolti utilizzando EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, citrato 4% e BD Vacutainer PPT
(Plasma Preparation Tube) sono idonei all'uso con il test cobas® TaqScreen DPX. Attenersi alle istruzioni
fornite dal produttore delle provette.
B.
I campioni raccolti in EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A, citrato 4% e PPT possono essere conservati fino
a 72 ore tra 2 e 30°C e successivamente per altre 48 ore tra 2 e 8°C prima della plasmaferesi. Per periodi di
conservazione superiori ai 5 giorni, è necessario separare il plasma dai globuli rossi e conservarlo tra
2 e 8°C fino a 9 giorni.
Figura 1
Stabilità del sangue intero
30
Temperatura (°C)
Sangue intero
(2°C - 30°C)
20
10
Sangue intero
(2°C - 8°C)
Plasma
(2°C - 8°C)
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Giorni
C. Il plasma in aferesi conservato con EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A o citrato di sodio al 4% può
essere conservato fino a 10 giorni a 2-30°C e fino a 46 giorni a 2-8°C.
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D. Le linee guida seguenti per i volumi di plasma si riferiscono al pipettamento da provette di plastica o vetro
da 13 x 100 mm eseguito con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. I volumi indicati si
riferiscono al plasma sopra ai globuli rossi depositati e devono essere rispettati durante lo svolgimento del
test cobas® TaqScreen DPX.
Tabella 1
Indicazioni dei volumi per lo strumento Hamilton MICROLAB® STAR/STARlet IVD Pipettor
Tipo di pool
Volume minimo di plasma
Pool primario *
3 ml
Pool ripetuto
1,5 ml
Pool di risoluzione
2 ml
*Include la creazione di una piastra a pozzetti profondi (piastra di archiviazione)
E.
Non congelare il sangue intero.
F.
Le piastre a pozzetti profondi con il coperchio possono essere conservate a 2-30°C fino a 3 giorni,
a ≤ -18°C fino a 150 giorni e a 2-8°C fino a 30 giorni. Non sono stati osservati effetti negativi sulle
prestazioni del test sottoponendo i campioni di plasma a 3 cicli di congelamento/scongelamento.
G. Il plasma con EDTA, CPD, CPD-A, CP2D, ACD-A e citrato di sodio al 4% può essere conservato fino a
12 mesi a ≤ -18°C e fino a 15 giorni a 2-8°C. Non sono stati osservati effetti negativi sulle prestazioni del
test sottoponendo i campioni di plasma a 3 cicli di congelamento/scongelamento.
H. Rimuovere i campioni dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso, in modo da ridurre al minimo la condensa sul
codice a barre.
I.
Eventuali condizioni alternative per la raccolta e la conservazione dei campioni dovranno essere validate
dall'utente. Se i campioni devono essere trasportati, utilizzare imballaggi ed etichette conformi alle leggi
nazionali e internazionali per il trasporto di campioni e agenti eziologici.35
PIPETTAMENTO E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI
A. Il sistema cobas s 201 utilizza il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD per tutte le attività di
pipettamento e creazione dei pool di campioni. Il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD
esegue le attività di scansione dei codici a barre e di creazione dei pool di campioni.
B.
È possibile configurare il sistema cobas s 201 senza uno strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet
IVD Pipettor, ma in questo caso è necessario inserire manualmente gli ID dei codici a barre. Per istruzioni
dettagliate, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201.
C. Se il test cobas® TaqScreen DPX identifica pool reattivi all'HAV o  valore di cutoff per B19V, viene
utilizzato lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per pipettare i campioni dalle
piastre a pozzetti profondi o dalle provette campione originali, in modo da poter eseguire i test secondari.
NOTE SULLA PROCEDURA
A. Attrezzatura
B.
1.
Preparare il sistema cobas s 201 per l'uso in base alle istruzioni fornite nel Manuale operativo del
sistema cobas s 201.
2.
Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati per garantire il corretto funzionamento degli
strumenti.
Reagenti
1.
Rimuovere i reagenti del kit di controlli cobas® TaqScreen DPX e i reagenti del test cobas®
TaqScreen DPX dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso, in modo da ridurre al minimo la condensa
sul codice a barre. Il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen deve raggiungere la temperatura
ambiente prima dell'uso. Per informazioni sulle condizioni di conservazione dei reagenti, vedere la
sezione "Requisiti per la manipolazione e la conservazione".
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2.
Ogni kit cobas® TaqScreen DPX Test contiene materiale sufficiente per un totale di 96 test,
preferibilmente suddivisi in sedute in batch fino a 24 test per ogni rack SK24. In ogni batch o rack
SK24 è necessario includere un controllo negativo e un controllo positivo. I controlli vengono
sottoposti allo stesso trattamento dei campioni con il test cobas® TaqScreen DPX.
3.
Tutti i controlli sono esclusivamente monouso.
4.
Il sistema impedirà l'uso di eventuali reagenti provenienti da lotti diversi, di reagenti rimasti
sullo strumento per un numero di ore superiore al consentito, o di reagenti scaduti o di cassette
miste appartenenti a un set di quattro cassette già utilizzato nel sistema. Non caricare lotti di
reagenti misti sullo strumento COBAS® AmpliPrep.
C. Trattamento dei campioni
1.
Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli.
2.
Fare attenzione a non contaminare i campioni e il materiale di controllo negativo con il materiale di
controllo positivo.
ISTRUZIONI PER L'USO
Il sistema cobas s 201 si basa su quattro procedure principali: pipettamento dei campioni e dei controlli
con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD; preparazione dei campioni sullo strumento
COBAS® AmpliPrep con il test cobas® TaqScreen DPX; amplificazione/rivelazione sull'analizzatore
COBAS® TaqMan®; gestione dei dati.
Ogni kit cobas® TaqScreen DPX Test contiene otto cassette: due cassette DPX CS1 con biglie magnetiche;
due cassette DPX CS2 con reagente di lisi; due cassette DPX CS3 con proteasi e tampone di eluizione; infine
due cassette DPX CS4 con IC, MMX Reagente 1 e MMX Reagente 2. Questo kit di test deve essere utilizzato
insieme al kit di controlli cobas® TaqScreen DPX e al reagente di lavaggio cobas® TaqScreen.
Nota: non aprire le cassette.
Nota: non creare pool di reagenti provenienti da lotti diversi o da flaconi diversi dello stesso lotto.
Nota: non mescolare cassette appartenenti a lotti diversi sullo strumento COBAS® AmpliPrep.
Nota: non separare le provette di controllo dai rispettivi adattatori (supporti di plastica per provette
di controllo).
Nota: il software PDM verifica che un batch venga eseguito su un solo strumento COBAS®
AmpliPrep e un solo analizzatore COBAS® TaqMan® collegati alla stessa stazione dati
AMPLILINK.
Nota: non suddividere i batch tra più strumenti COBAS® AmpliPrep o analizzatori COBAS® TaqMan®.
Eseguire tutti gli interventi di manutenzione necessari, come descritto nel Manuale operativo del sistema
cobas s 201.
Per istruzioni dettagliate sull'uso, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201.
A. Pipettamento dei controlli e dei campioni con il pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD
Nota: evitare di contaminare i guanti durante la preparazione dei campioni e dei controlli.
Nota: miscelare i controlli per inversione almeno 3 volte, evitando la formazione di bolle d'aria
(come descritto più avanti).
 Miscelare per inversione significa capovolgere il controllo a testa in giù e riportarlo a
testa in su ogni volta.
 Durante ogni inversione mantenere il controllo in ognuna delle posizioni per almeno
2 secondi: in altre parole, capovolgere il controllo a testa in giù e mantenerlo in questa
posizione per 2 secondi, quindi riportare il controllo a testa in su e mantenerlo in questa
posizione per 2 secondi.
Nota: i target virali nei controlli, nei campioni di pool e nei campioni sono stabili nel sistema
(fino a 30°C) per almeno 18 ore prima della loro estrazione sullo strumento COBAS®
AmpliPrep.
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1.
Eseguire le procedure di avviamento del pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD,
quindi dare inizio alla procedura guidata Roche PDM Pooling Wizard e seguire le istruzioni
visualizzate.
2.
Fare attenzione a non danneggiare il codice a barre identificativo sulle provette dei campioni e sugli
adattatori delle provette di controllo. Se il codice a barre è danneggiato, il sistema non è in grado di
identificare i campioni e i controlli.
3.
Rimuovere il tappo dalle provette di controllo e caricare i campioni, i materiali di consumo e i
controlli sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo il caricamento dei campioni,
dei materiali di consumo e dei controlli, sullo strumento ha inizio il trasferimento dei controlli e dei
campioni nelle provette S.
4.
Al termine del pipettamento è possibile leggere gli allarmi e stampare il report (o i report) di pooling.
Ispezionare i pool e i pozzetti delle piastre a pozzetti profondi. Considerare i pool e/o i pozzetti non
validi se appaiono contaminati con globuli rossi o se i volumi non sono uniformi.
5.
Ritappare le provette S e trasferire il rack (o i rack) SK24 sullo strumento COBAS® AmpliPrep per
l'estrazione degli acidi nucleici.
6.
Coprire e mettere da parte le piastre a pozzetti profondi (se sono state create durante la seduta di
pipettamento).
7.
Rimuovere e conservare le provette dei donatori. Per informazioni sulle condizioni di conservazione,
fare riferimento alla sezione Prelievo, conservazione e creazione dei pool di campioni.
8.
Rimuovere e gettare via le provette di controllo (esclusivamente monouso).
9.
Gli ordini dei test vengono creati e trasmessi automaticamente a tutte le stazioni dati AMPLILINK
collegate alla rete.
B. Preparazione e caricamento dei reagenti per il test cobas® TaqScreen DPX
Nota: fare attenzione a non danneggiare le etichette delle cassette. Il lettore di codici a barre
dello strumento COBAS® AmpliPrep acquisisce automaticamente il codice a barre di ogni
cassetta quando i rack per reagenti vengono caricati sullo strumento.
1.
Prima di iniziare è necessario caricare un numero di cassette sufficiente per tutti i campioni che
dovranno essere trattati, in modo da garantire il funzionamento ininterrotto dello strumento
COBAS® AmpliPrep. Ogni cassetta contiene reagenti sufficienti per 48 test. Per informazioni sul
caricamento di tutti i reagenti necessari in modo da evitare interruzioni, fare riferimento al Manuale
operativo del sistema cobas s 201.
2.
Inserire la cassetta DPX CS1 in un rack per reagenti, verificando che il codice a barre della
cassetta sia allineato al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. Le cassette DPX CS1
devono essere caricate tutte insieme su un rack per reagenti diverso da quello delle altre cassette.
3.
Caricare il rack per reagenti contenente la cassetta DPX CS1 nella posizione A del rack, farlo
scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS® AmpliPrep, quindi attendere che la
spia LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack fino in fondo, verso la
parte posteriore dello strumento. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento.
4.
Caricare sul rack (o sui rack) per reagenti un set di cassette DPX CS2, DPX CS3 e DPX CS4 per
ogni cassetta DPX CS1, verificando che i codici a barre delle cassette siano allineati al codice a
barre del rack, sul lato destro del rack.
5.
Caricare il rack (o i rack) per reagenti nella posizione B, C, D o E, fare scorrere il rack fino al perno
di arresto sullo strumento COBAS® AmpliPrep, quindi attendere che la spia LED del rack per
reagenti diventi verde prima di spingere il rack fino in fondo, verso la parte posteriore dello
strumento.
6.
La spia LED sulla barra di stato dello strumento COBAS® AmpliPrep diventa verde solo dopo che
tutti i componenti del kit richiesti sono stati caricati e identificati dal sistema.
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C. Estrazione degli acidi nucleici dai campioni e dai controlli pipettati
Nota: eseguire questa procedura su una superficie di lavoro pulita.
1.
Rimuovere il rivestimento dall'involucro delle unità SPU, lasciando intatto il nastro e il coperchio di
plastica.
2.
Dopo aver rivolto verso l'operatore il bordo più largo del rack per SPU, inserire l'involucro con le
unità SPU in modo che sia a livello con il lato destro del rack per SPU.
3.
Rimuovere il nastro e il coperchio di plastica dalle unità SPU, dopo averle inserite nel rack.
Assicurarsi che tutte le unità SPU siano inserite perfettamente nel rack e siano a livello. Eventuali
unità SPU sollevate potrebbero bloccare lo strumento. Non esercitare pressioni sull'ago campione
nell'unità SPU.
4.
Far scorrere i rack per SPU caricati nelle posizioni J, K o L dello strumento COBAS® AmpliPrep
finché non sono completamente inseriti e identificati. Lo strumento può ospitare al massimo
72 unità SPU alla volta. Caricare il numero di unità SPU necessario per la seduta o di più, secondo
necessità.
5.
Rimuovere il cellophane dalle confezioni originali dei rack per provette K e per puntali K, facendo
attenzione a non capovolgere i rack. Verificare che tutti siano inseriti perfettamente.
6.
Far scorrere almeno il numero richiesto di rack per provette K e per puntali K nelle posizioni M, N,
O o P dello strumento COBAS® AmpliPrep.
7.
Caricare i rack SK24 con i campioni pipettati dal pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD
e i controlli nelle posizioni F, G o H dello strumento COBAS® AmpliPrep. Spingere il rack fino a
bloccarlo. Controllare lo stato del sistema nella finestra Sample e assicurarsi che tutti i campioni
presenti nei rack siano stati identificati.
8.
Nel software AMPLILINK verificare che i reagenti e i materiali di consumo caricati siano sufficienti
per completare la preparazione del numero di campioni desiderato.
9.
Premere Start nella workstation AMPLILINK per avviare la procedura di preparazione dei campioni
sullo strumento COBAS® AmpliPrep.
10. Eventuali provette K e puntali K inutilizzati potranno essere monitorati sullo strumento COBAS®
AmpliPrep e utilizzati all'occorrenza per la seduta successiva, se non vengono rimossi.
D.
E.
Amplificazione e rivelazione
1.
Per le configurazioni senza una Docking Station, trasferire il rack SK24 contenente i campioni
trattati e il Master Mix sull'analizzatore COBAS® TaqMan®, in modo da avviare automaticamente l'amplificazione e la rivelazione. Per ogni campione, il software AMPLILINK tiene traccia
dell'ora in cui viene aggiunto il reagente Master Mix e considera non valido il campione se
l'amplificazione non è stata avviata entro il tempo previsto nel file di definizione del test
corrispondente (120 minuti). Per semplificare il flusso di lavoro, trasferire il rack SK24
sull'analizzatore COBAS® TaqMan® entro 1 ora dal completamento della preparazione dei
campioni presenti sul rack.
2.
Al termine dell'amplificazione/rivelazione sull'analizzatore COBAS® TaqMan®, i campioni analizzati
vengono automaticamente smaltiti nel contenitore di scarico.
3.
I risultati vengono accettati e trasferiti automaticamente al software PDM.
Revisione e rilascio dei risultati
1.
Avviare la workstation Roche PDM.
2.
Recuperare i batch non valutati nella scheda "Review Batches" della workstation Data Manager.
3.
Rivedere gli allarmi evidenziando un batch e facendo clic su "Next".
4.
Rivedere i risultati dei controlli nella scheda "Controls Review". Per informazioni sui criteri di validità
dei controlli, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità.
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Doc Rev. 4.0
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5.
Rivedere i risultati dei pool nella scheda "Alarms Review" relativa al batch selezionato. Se
necessario, l'utente può assegnare manualmente lo stato di non valido ai pool che sono risultati
non reattivi all'HAV e < cutoff per B19V. I campioni dei donatori appartenenti a un pool non valido
devono essere sottoposti nuovamente al test.
6.
Rivedere e rilasciare i donatori nella scheda "Donor Review" relativa al batch selezionato.
7.
Stampare i report e, se pertinente, inviarli al sistema LIS (Laboratory Information System).
CONTROLLO DI QUALITÀ
1.
In ogni batch è necessario includere un controllo negativo (DPX (–) C) e uno ciascuno dei due
controlli positivi (DPX D(+)C e DPX H(+)C).
2.
Stato del batch: lo stato del batch è "Complete, Valid" quando i controlli del batch sono validi. Se
uno qualsiasi dei controlli non è valido, l'intero batch non è valido. Il software PDM assegna
automaticamente lo stato di non validità ai risultati sulla base degli errori dei controlli.
a.
Controllo negativo
La validità del controllo negativo viene verificata in base al test eseguito.
Test DPX (HAV e B19V): per essere considerato valido, il controllo negativo (DPX (–) C) deve
generare un risultato interpretato di non reattività sia all'HAV che al virus B19V e i rispettivi IC e QS
devono essere validi. Se il risultato interpretato per il controllo negativo non è valido, l'intero batch
non è valido e deve essere ripetuto.
Solo test B19V: per essere considerato valido, il controllo negativo (DPX (–) C) deve generare un
risultato interpretato di non reattività al virus B19V e il rispettivo QS deve essere valido. Se il
risultato interpretato per il controllo negativo non è valido, l'intero batch non è valido e deve essere
ripetuto.
b.
Controllo positivo doppio DPX
La validità del controllo positivo doppio DPX viene verificata in base al test eseguito.
Test DPX (HAV e B19V): per essere considerato valido, il controllo positivo doppio (DPX D(+)C)
deve generare un risultato interpretato di reattività all'HAV, una concentrazione del virus B19V
compresa tra 1,20 x 102 e 1,20 x 103 UI/ml e i rispettivi IC e QS devono essere validi. Se il risultato
interpretato per l'HAV non è valido o la concentrazione del virus B19V non rientra nel range di
accettabilità, l'intero batch non è valido e deve essere ripetuto.
Solo test B19: per essere considerato valido, il controllo positivo doppio (DPX D(+)C) deve
generare un risultato interpretato con una concentrazione del virus B19V compresa tra 1,20 x 102
e 1,20 x 103 UI/ml e il rispettivo QS deve essere valido. Se il risultato interpretato per la
concentrazione del virus B19V non rientra nel range di accettabilità, l'intero batch non è valido e
deve essere ripetuto.
c.
Controllo positivo alto DPX
Per la validità del controllo positivo alto DPX (DPX H(+)C), è necessario che la concentrazione
del virus B19V sia compresa tra 2,40 x 105 e 2,40 x 106 UI/ml e che il rispettivo QS sia valido. Se
la concentrazione del virus B19V non rientra nel range di accettabilità, l'intero batch non è
valido e deve essere ripetuto.
3.
4.
IC per campioni di donatori
a.
Il campione di un donatore può generare un risultato valido di non reattività al test (–) solo
se il rispettivo IC è valido; in caso contrario, il risultato di non reattività non è valido e il
campione del donatore deve essere sottoposto nuovamente al test.
b.
Un risultato valido di reattività all'HAV per il campione di un donatore può essere associato
a un risultato IC valido o non valido.
QS per campioni di donatori
a.
Il campione di un donatore può generare un risultato valido per il virus B19V solo se il
rispettivo QS è valido; in caso contrario, il risultato non è valido e il campione del donatore
deve essere sottoposto nuovamente al test.
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RISULTATI
1.
I risultati dei campioni sono validi solo se è valido il batch del quale fanno parte. Per informazioni sui criteri
di validità, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità. Per ogni campione vengono misurati quattro
parametri: uno per il target virale HAV, uno per il target virale B19V, uno per il controllo interno (IC) e uno
per lo standard di quantificazione (QS).
Solo test B19V: per ogni campione vengono misurati solo due parametri, ovvero target virale B19V e QS.
2.
I risultati finali del test sono non reattivo, reattivo oppure non valido per il target HAV; < cutoff,  cutoff o
non valido per il target B19V.
3.
Lo stato finale del donatore per il test cobas® TaqScreen DPX viene indicato nel software PDM con le
seguenti modalità:
Tabella 2
Descrizione dello stato finale del donatore
Stato finale del donatore
Completed
Accepted
Completed Unresolved
Accepted Unresolved
Descrizione
È stato determinato il risultato finale per ogni target.
Il donatore completato (Completed) è stato accettato.
Il limite temporale di vitalità è scaduto prima che il donatore
venisse accettato.
Il donatore completato e irrisolto (Completed Unresolved) è
stato accettato.
Test ripetuti per campioni individuali
Le provette donatori con un risultato finale di non validità per un target comportano la ripetizione del test
indipendentemente da quale sia il risultato finale per l'altro target. L'utente ha tuttavia la possibilità di
selezionare l'opzione "Force Unresolve" e completare il flusso di lavoro per il donatore. La funzione "Force
Unresolve" assegna lo stato "Accepted Unresolved" ai donatori che non hanno generato un risultato finale
di reattività all'HAV o un valore ≥ cutoff per B19V oppure assegna lo stato "Accepted” ai donatori che
hanno generato un risultato finale di reattività all'HAV o un valore ≥ cutoff per B19V.
Test di pool secondari
Le provette donatori in un pool multicampione con un risultato finale di non validità per un target
comportano la ripetizione del test se il risultato finale per l'altro target è di non reattività o di non validità
per l'HAV o se il valore espresso è < cutoff o non è valido per B19V.
Quando un pool multicampione viene indicato come reattivo all'HAV o  cutoff per B19V, il sistema cobas
s 201 assegna a tutti i donatori appartenenti a tale pool una richiesta di esecuzione di test di pool
secondari. Questi campioni dei donatori vengono pipettati con il pipettatore Hamilton MICROLAB
STAR/STARlet IVD (dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette con i campioni originali) in pool
suddivisi, contenenti un numero inferiore di donatori o un solo donatore, dopodiché vengono sottoposti ad
altri test cobas® TaqScreen DPX nell'ambito di un processo di risoluzione che mira ad identificare i singoli
campioni che sono reattivi all'HAV o che esprimono un valore  cutoff per B19V. Per informazioni
specifiche sull'esecuzione dei test di risoluzione, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas
s 201.
Quando un pool multicampione suddiviso viene indicato come non reattivo all'HAV ed esprime un
valore < cutoff per B19V, i campioni individuali vengono classificati come "Completed", con un
risultato finale di non reattività all'HAV e un valore < cutoff per B19V.
Nota: nell'ambito di un programma globale di garanzia della qualità, l'utente può di propria
iniziativa sottoporre i campioni a ulteriori test per determinare la causa dell'iniziale
reattività del campione.
05509220001-04IT
Doc Rev. 4.0
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LIMITI DELLA PROCEDURA
1.
Questo test è stato valutato solo per l'uso contestualmente al kit cobas® TaqScreen DPX Test, al kit di
controlli cobas® TaqScreen DPX, al reagente di lavaggio cobas® TaqScreen e al sistema cobas s 201.
2.
È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa
procedura.
3.
L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure seguite per il prelievo e il trasporto dei
campioni.
4.
Per quanto riguarda la preparazione automatizzata dei pool di plasma, soltanto il pipettatore Hamilton
MICROLAB STAR/STARlet IVD è stato validato per l'uso con il test cobas® TaqScreen DPX. Attenersi alle
istruzioni hardware e alle precauzioni per la sicurezza descritte nel Manuale operativo del sistema cobas s
201 e nel manuale per l'utente del pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD.
5.
L'identificazione dell’RNA di HAV e la quantificazione del DNA di B19V dipendono dal numero di particelle
virali presenti nei campioni e possono essere influenzate dai metodi di prelievo dei campioni, da fattori
legati al paziente (ad esempio, età e presenza di sintomi) e/o dallo stadio dell'infezione e dalle dimensioni
del pool.
6.
Anche se rare, eventuali mutazioni nelle regioni altamente conservate dei genomi virali coperte dai
primer e/o dalle sonde del test cobas® TaqScreen DPX possono dare luogo alla mancata
identificazione dell'HAV o all'errata quantificazione del virus B19V.
7.
A causa di differenze intrinseche tra le tecnologie, prima di passare da una tecnologia a un'altra è
consigliabile condurre studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori, allo scopo di qualificare tali
differenze. Si consiglia agli utenti di seguire le strategie/procedure interne specifiche.
CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI
Studio clinico di riproducibilità
La riproducibilità del test cobas® TaqScreen DPX per l'uso con il sistema cobas s 201 è stata valutata con il
DNA di B19V e l'RNA di HAV in 3 siti esterni. Oltre al sito, sono stati presi in considerazione i seguenti fattori
variabili: lotto di reagenti, giorno, seduta e risultati nella stessa seduta. Per valutare il range del saggio è stato
utilizzato un pannello costituito da diverse concentrazioni dei 2 virus target.
Nella Tabella 3 sono riportati i fattori che influenzano la precisione per il virus B19V. Nella Tabella 4 sono
riportati i risultati per i membri del pannello HAV-positivi, suddivisi per lotto, sito, giorno e seduta.
Tabella 3
Fattori che influenzano la precisione della quantificazione del DNA di B19V (log10 UI/ml)
Conc. B19V Conc. B19V
attesa
media
(log10 UI/ml) (log10 UI/ml)
DS totale
di Log10
Nella stessa conc. B19V
Giorno Seduta
seduta
0,065 0,035
0,168
0,201
DS
2,60
2,48
N. di
test*
179
3,00
3,05
4,00
3,87
5,00
Lotto
Sito
0,009
0,081
175
0,042
0,054
0,043
0,000
0,138
0,160
178
0,023
0,156
0,030
0,022
0,083
0,182
4,74
180
0,026
0,057
0,034
0,039
0,059
0,101
6,00
5,75
177
0,072
0,085
0,000
0,051
0,097
0,156
7,00
6,84
179
0,057
0,258
0,042
0,076
0,075
0,288
*Numero di test validi. Sono stati programmati almeno 180 test per ogni membro del pannello.
I test non validi non sono stati ripetuti.
05509220001-04IT
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Tabella 4
Risultati per i membri del pannello HAV-positivi suddivisi per lotto, sito, giorno e seduta
Numero di test positivi/Numero totale di risultati validi
Conc.
Ct DS CV%
HAV medio Ct Ct
Lotto
ID
Sito
Reattivi/
%
Validi
49/60 81,7
40/56 71,4
40/60 66,7
1
2
3
Reattivi/
%
Validi
40/59 67,8
46/60 76,7
43/57 75,4
1
2
3
56/60 93,3
60/60 100,0
57/59 96,6
100,0 1
100,0 2
100,0 3
60/60 100,0
60/60 100,0
58/58 100,0
0,5xLOD 37,9 1,35 3,6
1
2
3
1,0xLOD 37,4 1,26 3,4
1
2
3
59/60
56/59
58/60
98,3
94,9
96,7
3,0x LOD 35,9 0,87 2,4
1
2
3
60/60
58/58
60/60
ID
Giorno
ID
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Reattivi/
Validi
25/35
27/35
23/36
25/34
29/36
35/36
34/36
34/36
35/35
35/36
36/36
35/35
36/36
35/35
36/36
Seduta
%
71,4
77,1
63,9
73,5
80,6
97,2
94,4
94,4
100,0
97,2
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
Reattivi/
ID
%
Validi
1 62/87 71,3
2 67/89 75,3
1
2
84/89
89/90
94,4
98,9
1
2
88/88
90/90
100,0
100,0
*Cycle threshold, ciclo soglia
Lo studio ha generato un falso risultato Reactive su 177 test DPX validi eseguiti sui membri del pannello
negativo. Il falso risultato Reactive è causato da un risultato Reactive per B19V inferiore al limite minimo di
quantificazione. Nella Tabella 5 è indicata la specificità analitica stimata utilizzando i membri del pannello
negativo.
Tabella 5
Specificità analitica stimata utilizzando membri del pannello negativo
N. di test
Risultato reattivo
Risultati negativi
Specificità (%)
IC 95%* (%)
177
1
176
99,4
96,9 – 100,0
Nota: per ottenere un risultato complessivamente negativo, per B19V deve essere generato il risultato “Target not
Detected” e per HAV deve essere generato il risultato “Non-Reactive”.
*intervallo di confidenza esatto al 95%
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Studio clinico dei pool di risoluzione
I pool di risoluzione per l'identificazione sia del DNA di B19V che dell'RNA di HAV sono stati valutati
separatamente per 5 pool su 96 e per 5 pool su 480, utilizzando combinazioni predefinite di campioni positivi e
negativi per HAV e B19V.
Tutti i campioni positivi e negativi noti sono stati identificati correttamente in entrambi gli studi, dimostrando
così una sensibilità del 100% e una specificità del 100%.
Nelle Tabelle 6 e 7 sono riportati i dati relativi alla concordanza dei risultati, rispettivamente per il pool di
96 campioni e per il pool di 480 campioni.
Tabella 6
Concordanza dei risultati dei pool di risoluzione costituiti da 96 campioni
Risultato pool di risoluzione
Positivi
Negativi
Reactive
27
0
Totale
27
Non-Reactive
0
453
453
Totale
27
453
480
Tabella 7
Concordanza dei risultati dei pool di risoluzione costituiti da 480 campioni
Risultato pool di risoluzione
Positivi
Negativi
Reactive
27
0
Totale
27
Non-Reactive
0
2370
2370
Totale
27
2370
2397*
*Non è stato possibile risolvere in modo definitivo 3 risultati su 2400 perché il volume era insufficiente.
Riproducibilità
La riproducibilità del test cobas® TaqScreen DPX per il virus HAV è stata determinata eseguendo i test su un
pannello di 8 membri, composto da un campione di plasma negativo e 7 campioni di plasma positivi all'HAV,
con concentrazioni di 0,35, 0,5, 0,71, 1, 1,41, 2,5 e 3,75 UI/ml.
I test sono stati eseguiti utilizzando 3 lotti del kit cobas® TaqScreen DPX Test nell'arco di due giorni, con 6 set
di strumenti e 9 operatori.
Tutti i dati validi relativi alla riproducibilità sono stati valutati calcolando la percentuale dei risultati reattivi al test
per ogni membro del pannello. I dati sono stati analizzati in base alla data della seduta e al lotto del kit.
Questo studio ha evidenziato prestazioni uniformi del test cobas® TaqScreen DPX con tutti i lotti di kit
(Tabella 8) e in giorni diversi (Tabella 9).
Tabella 8
Riproducibilità tra lotti
Risultati reattivi in base al lotto reagenti
Concentrazione di
HAV (UI/ml)
Lotto n. 1
Lotto n. 2
Lotto n. 3
3,75
100,0% (63/63)
100,0% (63/63)
100,0% (63/63)
2,50
100,0% (63/63)
100,0% (63/63)
100,0% (62/62)
1,41
100,0% (62/62)
100,0% (63/63)
96,8% (61/63)
1,00
93,7% (59/63)
90,5% (57/63)
95,2% (60/63)
0,71
85,7% (54/63)
90,5% (57/63)
81,0% (51/63)
0,50
74,6% (47/63)
74,6% (47/63)
76,2% (48/63)
0,35
63,5% (40/63)
69,8% (44/63)
69,8% (44/63)
0,00
0,0% (0/63)
0,0% (0/63)
0,0% (0/63)
05509220001-04IT
Doc Rev. 4.0
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Tabella 9
Riproducibilità tra giorni
Concentrazione di HAV
(UI/ml)
3,75
2,50
1,41
1,00
0,71
0,50
0,35
0,00
Risultati reattivi in base al giorno
Giorno n. 1
Giorno n. 2
100,0% (63/63)
100,0% (126/126)
100,0% (63/63)
100,0% (125/125)
100,0% (62/62)
98,4% (124/126)
93,7% (59/63)
92,9% (117/126)
85,7% (54/63)
85,7% (108/126)
74,6% (47/63)
75,4% (95/126)
63,5% (40/63)
69,8% (88/126)
0,0% (0/63)
0,0% (0/126)
Precisione della quantificazione del virus B19V
La precisione del test cobas® TaqScreen DPX per B19V è stata determinata eseguendo i test su un pannello di
4 membri, composto da campioni di plasma positivi al virus B19V con concentrazioni di 103, 104, 105 e 106 UI/ml.
Tutti i dati validi sono stati valutati calcolando la deviazione standard dei titoli di virus B19V (log10 UI/ml) per
ogni membro del pannello. I dati di 2 lotti di kit sono stati analizzati sia separatamente che in combinazione.
Questo studio ha evidenziato prestazioni uniformi del test cobas® TaqScreen DPX con tutti i lotti di kit
(Tabella 10).
Tabella 10
Deviazione standard dei titoli di virus B19V, log10 UI/ml (n = 20), con lotti di kit differenti
Membri del pannello
B19V (UI/ml)
106
105
104
103
Complessiva (103 - 106)
Lotto reagenti
n.°1
0,073
0,051
0,071
0,218
0,123
Lotto reagenti
n.°2
0,103
0,083
0,071
0,112
0,094
Lotti n.°1 e n.°2 combinati
0,088
0,070
0,070
0,176
0,110
Sensibilità analitica — Standard internazionali dell'OMS
I limiti di sensibilità (Limit of Detection, LOD) al 95% del test cobas® TaqScreen DPX sia per l'RNA di HAV che
per il DNA di B19V sono stati determinati utilizzando gli standard internazionali dell'OMS per l'HAV (codice
NIBSC 00/560)36 e per B19V (codice NIBSC 99/800) 27.
Sono state preparate tre serie di diluizioni indipendenti di ogni standard virale, utilizzando plasma umano
normale, negativo ai virus. Ogni serie di diluizioni è stata analizzata utilizzando tre lotti differenti del kit cobas®
TaqScreen DPX Test con 21 repliche per ogni lotto, per un totale di 189 repliche per ogni concentrazione. Nelle
Tabelle 11 e 12 vengono illustrate le analisi del tasso di reattività rispettivamente per HAV e B19V.
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Doc Rev. 4.0
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Tabella 11
Riepilogo del tasso di reattività — Standard internazionale dell'OMS per HAV (00/560)
Concentrazione
dell'RNA di HAV
(UI/ml)
3,75
Numero di
reattivi
Numero di
test individuali
%
di reattivi
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(monolaterale)
98,1%
189
189
100,0%
2,50
188
188
100,0%
98,1%
1,41
186
188
98,9%
96,2%
1,00
176
189
93,1%
88,5%
0,71
162
189
85,7%
79,9%
0,50
142
189
75,1%
68,3%
0,35
128
189
67,7%
60,6%
0,00
0
189
0,0%
0,0%
Tabella 12
Riepilogo del tasso di reattività — Standard Internazionale dell'OMS per B19V (99/800)
Concentrazione del
DNA di B19V
(UI/ml)
Numero di
reattivi
Numero di
test individuali
%
di reattivi
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(monolaterale)
75,00
189
189
100,0%
98,1%
50,00
188
188
100,0%
98,1%
28,28
189
189
100,0%
98,1%
20,00
187
189
98,9%
96,2%
14,14
189
189
100,0%
98,1%
10,00
170
189
89,9%
84,7%
7,07
142
189
75,1%
68,3%
0,00
0
189
0,0%
0,0%
Per stimare il limite LOD al 95% e gli intervalli di confidenza bilaterali con fiducia al 95% è stata eseguita
l'analisi PROBIT dei dati combinati, ricavati da tutte le repliche analizzate per ogni virus (Tabella 13).
Tabella 13
LOD 95% mediante analisi PROBIT
Virus
LOD (UI/ml)
HAV
B19V
1,06
11,48
05509220001-04IT
Limite di
confidenza al
95% (UI/ml)
0,94 – 1,24
10,56 – 12,91
Doc Rev. 4.0
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Linearità della quantificazione del virus B19V
È stata determinata la linearità della quantificazione del virus B19V con il test cobas® TaqScreen DPX
eseguendo il test su una diluizione seriale di un campione B19V, genotipo 1, calibrato sullo standard
dell'OMS (99/800). Lo studio è stato condotto con 2 lotti di reagenti. Il range lineare è stato fissato tra 75 e
3,0 x 108 UI/ml in base alle linee guida CLSI EP6-A (Figura 2).
Risultato del test (log10 UI/ml)
Figura 2
Linearità del test cobas® TaqScreen DPX per B19V
8
7
6
5
y = 1,060x - 0,442
R2 = 0,996
4
3
2
1
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentrazione nominale Parvovirus B19 (log10 UI/ml)
Linearità della quantificazione del virus B19V in base al genotipo
È stata analizzata la linearità del test cobas® TaqScreen DPX per ogni genotipo di B19V utilizzando
5-6 diluizioni di un campione clinico per ogni genotipo di B19V. Utilizzando un lotto di reagenti sono state
eseguite 4-6 repliche di ogni campione e punto di diluizione (Tabella 14).
Tabella 14
Quantificazione del genotipo di B19V
Genotipo
1
2
3a
Concentrazione
media di B19V
osservata
log10 UI/ml
2,49
3,94
4,77
5,73
6,84
3,00
4,14
4,96
5,32
5,72
6,44
3,04
4,24
5,03
5,44
5,83
6,53
Concentrazione di B19V
iniziale
UI/ml
5 x 102
1 x 104
1 x 105
1 x 106
1 x 107
5 x 102
1 x 104
1 x 105
3 x 105
1 x 106
1 x 107
5 x 102
1 x 104
1 x 105
3 x 105
1 x 106
1 x 107
log10 UI/ml
2,70
4,00
5,00
6,00
7,00
2,70
4,00
5,00
5,48
6,00
7,00
2,70
4,00
5,00
5,48
6,00
7,00
05509220001-04IT
Differenza media:
log10 B19V osservata
- log10 B19V iniziale
-0,21
-0,08
-0,23
-0,27
-0,16
0,30
0,14
-0,04
-0,16
-0,28
-0,56
0,34
0,24
0,03
-0,04
-0,17
-0,47
Doc Rev. 4.0
22
Inclusività dei genotipi
Sono state determinate le prestazioni del test cobas® TaqScreen DPX per i diversi genotipi di HAV e B19V.
HAV
Sono stati analizzati campioni clinici e RNA trascritti di diversi genotipi di HAV diluiti fino a circa 0,3, 1 e
3 volte il limite LOD del test cobas® TaqScreen DPX. L'analisi PROBIT dei risultati ha dimostrato che il
limite LOD per ogni campione di genotipo equivale al limite LOD dello standard dell'OMS (00/560)
(Tabella 15).
Tabella 15
Inclusività dei genotipi di HAV
Genotipo
IA
IB
IIA
IIB
IIIA
IIIB
Tasso di
reattività
a 0,3 x LOD
65,8% (158/240)
41,7% (30/72)
79,2% (19/24)
79,2% (19/24)
73,6% (53/72)
43,8% (21/48)
Tasso di
reattività
a 1 x LOD
96,3% (231/240)
86,1% (62/72)
91,7% (22/24)
100,0% (24/24)
97,2% (70/72)
91,7% (44/48)
Tasso di
reattività
a 3 x LOD
100,0% (240/240)
100,0% (72/72)
100,0% (24/24)
100,0% (24/24)
100,0% (72/72)
100,0% (48/48)
LOD (Intervallo di
confidenza al 95%)
UI/ml
0,92 (0,77 - 1,18)
1,58 (1,18 - 2,51)
1,18 (0,61 – 257)
0,37 (N/A*)
0,80 (0,59 - 1,56)
1,25 (0,91 - 2,27)
Sono stati utilizzati undici campioni clinici (10 con genotipo IA, 1 con genotipo IB) e 9 trascritti (2 con
genotipo IB, 1 con genotipo IIA, 1 con genotipo IIB, 3 con genotipo IIIA e 2 con genotipo IIIB).
* Non è stato possibile generare gli intervalli di confidenza dell'analisi PROBIT.
B19V
Sono stati analizzati campioni clinici e plasmidi di diversi genotipi di B19V diluiti fino a circa 0,3, 1 e 3 volte
il limite LOD del test cobas® TaqScreen DPX. L'analisi PROBIT dei risultati ha dimostrato che il limite LOD
per ogni campione di genotipo equivale o è migliore del limite LOD dello standard dell'OMS (99/800)
(Tabella 16).
Tabella 16
Inclusività dei genotipi di B19V
Tasso di
Tasso di
Tasso di
LOD (Intervallo di
reattività
reattività
reattività
confidenza al 95%)
a 0,3 x LOD
a 1 x LOD
a 3 x LOD
UI/ml
1
15,6% (15/96)
90,6% (87/96)
100,0% (97/97)
13,57 (11,39 - 17,27)
2
88,5% (85/96)
100,0% (96/96)
99,0% (95/96)
6,07 (N/A*)
3A
83,3% (40/48)
100,0% (48/48)
100,0% (48/48)
3,94 (N/A*)
3B
91,7% (44/48)
97,9% (47/48)
100,0% (48/48)
5,31 (N/A*)
Sono stati utilizzati tre campioni clinici (genotipi 1A, 3A e 3B) e 2 plasmidi (genotipo 2).
* Non è stato possibile generare gli intervalli di confidenza dell'analisi PROBIT.
Genotipo
Microrganismi potenzialmente interferenti e reattività crociata
È stata svolta una valutazione della potenziale reattività crociata e interferenza di altri microrganismi con il test
cobas® TaqScreen DPX utilizzando un pannello di 19 microrganismi, tra i quali 13 isolati virali, 5 ceppi batterici
e 1 lievito isolato (Tabella 17). I microrganismi sono stati aggiunti al plasma umano normale e analizzati con e
senza HAV a 3 volte il limite LOD e il B19V a 5 volte il limite di quantificazione basso del test cobas®
TaqScreen DPX.
Il test cobas® TaqScreen DPX ha prodotto risultati non reattivi per tutti i campioni di microrganismi analizzati
senza HAV e B19V. I microrganismi analizzati non inducono una reazione crociata con il test cobas®
TaqScreen DPX. Si sono ottenuti risultati reattivi con tutti i campioni dei microrganismi analizzati con HAV e
B19V. I microrganismi analizzati non interferiscono con il test cobas® TaqScreen DPX.
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Tabella 17
Microrganismi analizzati
Specificità analitica — Microrganismi analizzati
Adenovirus 5
WNV
Citomegalovirus (CMV)
HIV-1 (Gruppo M)
Staphylococcus aureus
(BMTU 2947)
Staphylococcus epidermidis
negativo alla coagulasi
Virus di Epstein Barr (EBV)
HIV-2
Propionibacterium acnes
Varicella Zoster (VZV)
HBV
Streptococcus viridans
Virus linfotropico delle cellule T
umane tipo I (HTLV I)
Virus dell'herpes simplex tipo 1 (HSV-1)
Escherichia coli
Virus dell'influenza A
Virus dell'herpes simplex tipo 2 (HSV-2)
HCV
Candida albicans (BMTU 2949)
Campioni clinici di altre patologie potenzialmente interferenti e reattività crociata
È stata svolta una valutazione della potenziale reattività crociata e interferenza di campioni clinici di altre
patologie eseguendo il test cobas® TaqScreen DPX su campioni clinici di citomegalovirus, virus dell'epatite B,
virus dell'epatite C e virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1, gruppo M. Il test cobas® TaqScreen DPX è
stato utilizzato per analizzare campioni clinici patologici con e senza HAV a 3X limite di sensibilità e con e senza
B19V a 5X limite minimo di quantificazione.
Il test cobas® TaqScreen DPX ha prodotto risultati non reattivi per tutti i campioni clinici di altre condizioni
patologiche analizzati senza HAV e B19V. I campioni clinici di altre condizioni patologiche non inducono una
reazione crociata con il test cobas® TaqScreen DPX. Tutti gli altri campioni clinici analizzati, nei quali erano
presenti altre condizioni patologiche e i virus HAV e B19V, hanno prodotto risultati reattivi. I campioni clinici di
altre condizioni patologiche non interferiscono con il test cobas® TaqScreen DPX.
Sostanze potenzialmente interferenti
Sostanze interferenti di tipo endogeno
Campioni di plasma con livelli anomali di trigliceridi (33 g/l), emoglobina (2 g/l), bilirubina non coniugata
(200 mg/dl), albumina (60 g/l), DNA umano (4 mg/l) o globuli rossi (5% v/v) sono stati analizzati con e senza
virus HAV a 3 volte il limite LOD e B19V a 5 volte il limite di quantificazione basso del test cobas® TaqScreen
DPX. Queste sostanze endogene e i globuli rossi (5% v/v) non hanno interferito con la sensibilità o la specificità
del test cobas® TaqScreen DPX.
Sostanze interferenti di tipo esogeno
Campioni di plasma umano normale, contenenti concentrazioni anomale di acetaminofene (1324 μmol/l), acido
acetilsalicilico (3,62 mmol/l), acido ascorbico (342 μmol/l), atorvastatina (600 Eq/l), fluoxetina (11,2 μmol/l),
ibuprofene (2425 μmol/l), loratadina (0,78 μmol/l), nadololo (3,88 μmol/l), naprossene (2170 μmol/l), paroxetina
(3,04 μmol/l), fenilefrina HCl (491 μmol/l) e sertralina (1,96 μmol/l), sono stati analizzati con e senza HAV a
3 volte il limite LOD e B19V a 5 volte il limite di quantificazione basso del test cobas® TaqScreen DPX. Queste
sostanze esogene non hanno interferito con la sensibilità o la specificità del test cobas® TaqScreen DPX.
Specificità
Cinquecentotrentotto campioni individuali di plasma sieronegativi al virus B19V sono stati analizzati con uno di
due lotti del kit cobas® TaqScreen DPX Test. La specificità osservata per B19V e l'HAV è stata rispettivamente del
96,3% e del 99,8%. La specificità più bassa per B19V era prevedibile, vista l'endemicità del virus B19V nella
popolazione generale2, 3 e la sensibilità del kit cobas® TaqScreen DPX Test.
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Revisione della sezione CONTROLLO DI QUALITÀ, paragrafi “2.b. Controllo positivo
doppio DPX” e “2.c. Controllo positivo alto DPX”: l'intervallo relativo al controllo positivo
B19 è stato modificato da 2 cifre significative a 3 cifre significative.
Rimozione della frase “Tutti i diritti riservati” dalla dichiarazione relativa al copyright.
Aggiornate le descrizioni della pagina dei simboli armonizzati al termine del foglio
illustrativo.
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Mandatario nella Comunità Europea
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Fabbricante
Codice del lotto
Conservare al buio
Rischio biologico
Contenuto sufficiente per <n> test
Numero di catalogo
Limiti di temperatura
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File di definizione del test
SW
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Limite superiore
dell'intervallo assegnato
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