Valutazione di un kit del commercio per il

Valutazione di un kit del commercio
per il conteggio dei leucociti
nella preparazione di emocomponenti leucodepleti
Filippo D'Erasmo, Michela Di Loreto, Raffaele Romano
Servizio di Immunoematologia e Trasfusione
Azienda Ospedaliera "Di Venere - Giovanni XXIII" Bari - Carbonara
(Responsabile: Prof. R. Romano)
In the last years leucoreduced blood components
have been used in the prevention of a wide variety of
transfusion complications.
Since the number of leucocytes in these
preparations is very low, new methods have been
studied to increase the sensitivity, when counting these
residual cells. Some of these methods are also used in
other fields of Transfusion Medicine (for example, in
the precise and accurate enumeration of the CD 34positive haematopoietic progenitor cells).
Parole chiave: filtrazione, leucociti, eritrociti, citometria a
flusso.
Key words: filtration, leucocytes, red blood cells, flow
cytometry.
Introduzione
Sono stati descritti numerosi metodi utilizzati per il
conteggio leucocitario nelle preparazioni leucodeplete.
Esistono varie Reviews che li esaminano1-3.
Sono stati descritti metodi che utilizzano conteggi
microscopici in camere di conta di grande volume come la
camera di Nageotte4-17, metodi che utilizzano citometri a
flusso18-30 , metodi basati sulla Reazione di Polimerizzazione
a Catena (PCR)31-33, sulla citometria capillare volumetrica34,35
o sulla concentrazione del campione5,11,36-40.
Nel nostro laboratorio è utilizzato con successo un
metodo citofluorimetrico che utilizza emazie di pollo fissate
con glutaraldeide e marcate con Isotiocianato di
Fluoresceina (FITC) come standard interno26, e Ioduro di
Ricevuto: 3 novembre 1999 - Accettato: 18 gennaio 2000
Corrispondenza:
Dott. D'Erasmo Filippo
Via G. Postiglione 9
70126 Bari
Propidio (PI) per marcare il DNA dei leucociti41. Scopo del
presente lavoro è di valutare un kit del commercio che ha
uno standard interno costituito da microsfere marcate con
FITC ed un reagente allo Ioduro di Propidio per marcare il
DNA dei leucociti per il conteggio assoluto dei leucociti
residui.
Materiali e metodi
I reagenti del commercio utilizzati sono il LeucoCount
(cat. 340502, lotto 81117, scadenza 22.7.99) e le provette
TruCount (cat. 340334, lotto 80936, scadenza 13.4.2000) della
Becton Dickinson ImmunoCytometry System (San José,
CA, USA).
Il reagente LeucoCount contiene Ioduro di Propidio
(PI), un colorante per acidi nucleici che, usato con la RNAsi,
si intercala solamente al DNA cellulare.
Pertanto il LeucoCount, colorando soltanto le cellule
nucleate, consente di discriminare con precisione i leucociti
dagli eritrociti e dalle piastrine.
Le provette TruCount, incluse nel kit, contengono
microsfere marcate con FITC che servono come riferimento
interno per determinare con precisione il conteggio assoluto
dei leucociti residui. Un volume di 100 µL di sangue viene
aggiunto al pellet liofilizzato nella provetta TruCount.
Subito dopo vengono aggiunti 400 µL di reagente
LeucoCount.
Dopo una incubazione di circa 5', i campioni vengono
analizzati su un citometro a flusso e i conteggi assoluti dei
leucociti vengono determinati mediante un semplice calcolo
basato sul numero delle microsfere dello standard e sul
volume del campione utilizzato.
È stato impiegato lo strumento FacScan della Becton
Dickinson con le impostazioni consigliate dalla Ditta, dopo
averne verificato le prestazioni con le microsfere CaliBrite.
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 45 - num. 4 luglio - agosto 2000 (209-212)
209
F. D'Erasmoet al.
Tabella I: basse concentrazioni di leucociti richiedono l'analisi di volumi di sangue più grandi (da Dzik3)
Volume di campione (µL) che deve essere analizzato per osservare n eventi
n° = numero
di WBC contati
1/ √n espressa
come una percentuale
se una unità di 300 mL
contiene 5 x 106 WBC
se una unità di 300 mL
contiene 106 WBC
se una unità di 300 mL
contiene 5 x 105 WBC
se una unità di 300mL
contiene 105 WBC
10
32%
<1
3
7
30
20
22%
1
6
13
61
30
18%
2
9
19
91
40
16%
3
12
25
121
50
14%
4
15
32
150
Nella tabella è mostrato il numero degli eventi WBC che deve essere contato in media per il sangue a differenti concentrazioni di
leucociti. Il valore non considera la perdita di cellule durante la preparazione del campione che contribuisce ad un errore (bias) di
sottostima. La tabella può essere usata come guida per valutare metodi pubblicati. Per esempio, un metodo che analizza 3µL di
campione originale e che non perde cellule durante la preparazione ci si aspetta che evidenzi soltanto 10 WBC in una unità di 300 mL
contenente 106 leucociti.
Sono state ben definite e separate le "finestre" dei leucociti
e delle microsfere ed il conteggio dei leucociti è stato così
calcolato:
n° eventi WBC
WBC/µL =
n° eventi microsfere
x
microsfere provetta TruCount *
volume di campione colorato (µL)
Moltiplicando il numero dei leucociti/µL ottenuti per il
volume della sacca, si ottiene il numero totale dei leucociti
presenti nell'intera unità leucodepleta.
La linearità della metodica è compresa in un range
clinicamente rilevante che va da 1x106 a 5x106 WBC contati,
corrispondente per una unità di globuli rossi concentrati di
300 mL ad un range che va da 3,3 a 16,7 WBC/µL. La
sensibilità dichiarata è di 1 WBC/µL.
Al fine di ottenere una maggiore sensibilità ed una
linearità per conteggi anche al di sotto di 106 WBC/unità,
necessaria alla valutazione delle performances dei filtri da
noi utilizzati normalmente in laboratorio, abbiamo apportato
una modifica alla metodica.
Ci si può, infatti, attendere che, quanti più leucociti si
contino, tanto maggiore sia la probabilità che la misura
osservata sia riproducibile.
In realtà, l'Intervallo di Confidenza (IC) che deriva da
tali misure è inversamente proporzionale alla
Radice Quadrata di n°, dove n° è il numero degli eventi
contati. La necessità statistica di contare un numero
ragionevolmente grande di leucociti corrisponde in pratica
ad effettuare il conteggio di un grosso volume di sangue
(Tabella I, tratta da Dzik3).
Su un campione di sangue è stato eseguito l'emocromo
mediante un contaglobuli Sysmex SF 3000 (Dasit SpA,
Cornaredo, MI). Abbiamo diluito per raddoppio il suddetto
* Il conteggio di microsfere per il lotto utilizzato è indicato
sul sacchetto che contiene le provette TruCount.
210
campione con sangue omogruppo filtrato due volte
mediante filtri Pall BP F4 (Pall Corporation, Covina, CA,
USA) ottenendo una serie di diluizioni con range di
conteggio leucocitario compreso tra 7,49 WBC/µL e 0,12
WBC/µL.
Per ogni campione da esaminare abbiamo effettuato un
conteggio miscelando il contenuto di due provette TruCount già preparate (100 µL di sangue + 400 µL di reagente
LeucoCount), aumentando così il volume totale di sangue
da contare da 100 a 200 µL. Per valutare l'IC abbiamo
effettuato quattro repliche per ogni diluizione. Il campione
utilizzato per diluire i leucociti è stato, anch'esso, contato
per valutare il conteggio di fondo.
L'IC al 95% offre informazioni circa la probabilità che
una unità di sangue sia considerata leucoridotta in maniera
non corretta e che la tecnica di conteggio possa in maniera
consistente sovra o sottostimare.
Quando non riconosciuto, l'errore di sottostima può
considerare leucoridotta una unità che non lo sia, mentre
l'errore di sovrastima può valutare erroneamente una
procedura di deplezione o dare una interpretazione non
corretta di trials clinici.
Risultati e discussione
I risultati in tabella II mostrano che i valori ottenuti per
ogni diluizione sono, con una leggerissima sovrastima,
corrispondenti ai valori attesi (r = 0,99939), che la ripetibilità
del metodo, espressa come Coefficiente di Variazione (CV)
è molto buona. Infatti, il CV alle diluizioni maggiori non
supera il 27 %.
L'aumento del volume di conteggio ci ha consentito
quindi di aumentare il numero dei WBC contati, migliorando
la sensibilità del metodo. L'IC calcolato al 95% è tale che
Conteggio leucociti residui in emocomponenti filtrati
Tabella II: risultati delle misurazioni effettuate sui WBC diluiti, come descritto nel testo
Valori attesi
7,49
3,75
1,87
0,94
0,47
0,23
0,12
Fondo
Media valori trovati
7,71
3,98
2,13
1,16
0,47
0,32
0,19
0,08
Deviazione Standard
0,39
0,271
0,225
0,105
0,077
0,070
0,044
0,061
Coefficiente di Variazione (%)
5,05
6,80
10,56
9,05
16,38
21,87
23,16
76
Intervallo di Confidenza
0,12
0,091
0,076
0,031
0,023
0,020
0,013
0,020
ogni conteggio leucocitario residuo di una sacca è
nettamente distinto dal conteggio delle diluizioni precedenti
e successive, ovverossia che, quando si dice che una sacca
deleucocitata da 300 mL ha un conteggio residuo di 0,196
WBC/µL, corrispondente a 58.800 WBC totali residui, questo
conteggio è nettamente separato dal conteggio di fondo.
Lo stesso vale quando vogliamo stabilire se una unità
di emazie filtrate e deleucocitate ha un conteggio totale di
leucociti inferiore a 500.000.
Se una sacca deleucocitata da 300 mL presenta 1,16
WBC/µL, cioè 348.000 eventi totali, considerando l'IC al
95 %, possiamo dire che i nostri conteggi sono compresi
tra 338.520 e 357.480, asserendo, con una probabilità del
95 %, che il nostro conteggio è corretto ed inferiore a
500.000, senza alcuna sovrapposizione né con il valore di
500.000, né con il valore del conteggio di fondo.
Pertanto, il kit della Becton Dickinson che abbiamo
valutato, pur con qualche piccola modifica necessaria per
la valutazione dei filtri da noi normalmente utilizzati, si è
presentato come un kit semplice da utilizzare e di ottima
affidabilità.
Riassunto
È descritta una modifica apportata ad un metodo del
commercio che consente di valutare con buona precisione
ed accuratezza il numero dei leucociti residui dopo
filtrazione di sacche di sangue, allo scopo di effettuare
un controllo di qualità costante.
Bibliografia
1) Rebulla P, Wenz B: Counting and typing of leucocytes in
leucocyte-depleted blood components. Curr. Stud Hematol
Blood Transf, 60, 101, 1994.
2) Masse M: Measurement of low number of leucocytes: How
should it be done. In: Högman CF (ed). Leucocyte Depletion
of Blood Components. 77, VU University Press, Amsterdam,
1994.
3) Dzik S: Principles of counting low numbers of leukocytes in
leukoreduced blood components. Transf Med Rev, 1, 44, 1997.
4) Lutz P, Dzik WH: Large-volume hemocytometer chamber
for accurate counting of white cells (WBCs) in WBC-reduced
platelets: validation and application for quality control of WBCreduced platelets prepared by apheresis and filtration .
Transfusion, 33, 409, 1993.
5) Masse M,Naegele C, Pellegrini N et al.: Validation of a simple
method to count very low white cell concentrations in filtered
red cells or platelets. Transfusion, 32, 565, 1992
6) Moroff G, Eich J, Dabay M: Validation of use of the Nageotte
hemocytometer to count low levels of white cells in white
cell-reduced platelet component. Transfusion, 34, 35, 1994.
7) Rebulla P, Dzik WH: Multicenter evaluation of methods for
counting residual white cells in leukocyte-depleted red blood
cells. Vox Sang, 66, 25, 1994.
8) Brecher ME, Harbaugh CA, Pined AA: Accurate counting of
low numbers of leukocytes. Use of flow cytometry and a
manual low-count chamber: Am J Clin Pathol, 97, 872, 1992.
9) Dzik WH, Szuflad P: Method for counting white cells (WBCs)
in WBC-reduced red cell concentrates. Transfusion, 33, 272,
1993.
10) Greenwalt TJ, Allen CM: A method for counting leukocytes in
filtered components. Transfusion, 30, 377, 1990.
11) Sadoff BJ, Dooley DC, Kapoor V et al.: Method for measuring
a 6 log10 white cell depletion in red cells. Transfusion, 31,
150, 1991.
12) Takahashi TA, Hosoda M, Abe H et al.: Comparison of highly
sensitive methods used to count residual leucocytes in filtered
red cell and platelets concentrates. In: Sekiguchi S (ed).
Clinical Application of Leucocyte Depletion, 77, Blackwell
Scientific Publications, Oxford, 1993.
13) Kao KJ, Scornick JC: Accurate quantitation of the low
numbers of white cells in white cell depleted blood
components. Transfusion, 29, 774, 1989.
14) Fizet D, Bouzgarrou R, Piquet Y et al.: Measurement of
residual leukocytes in platelet concentrate units. Ann Biol
Clin, 51, 807, 1993.
15) Borzini P, Riva M, Dessi M et al.: A very simple method for
counting white cells in platelets units collected by apheresis.
Transfusion, 35, 884, 1995.
16) Prati D, Brandwein H, Capelli C et al.: Multicenter evaluation
of the 3% paraformaldehyde method for white cell counting
in leukocyte-reduced red blood cells . Vox Sang, 70, 241,
1996.
17) Kao KJ, Mickel M, Braine HG et al.: White cell reduction in
platelet concentrates and packed red cells by filtration: a
multicenter clinical trial. Transfusion, 35, 13, 1995.
211
F. D'Erasmoet al.
18) Dzik WH, Ragosta A, Cusak WF: Flow cytometric method
for counting very low numbers of leukocytes in platelet
concentrates. Vox Sang, 59,153, 1990.
19) Sheckler VL, Loken MR: Routine quantitation of white cells
as low as 0,001 per µL in platelet concentrates. Transfusion,
33, 256, 1993.
20) Lombardo JF, Cusack NA, Rajagopalan et al.: Flow cytometric
analysis of residual white blood cell concentration and platelet
activation antigens in double filtered platelet concentrates. J
Lab Clin Med, 122, 557, 1993.
21) Deneys V, Masson AM, Robert A et al.: Reliable and very
sensitive flow cytometric method for counting low
leukocyte numbers in platelet concentrates. Vox Sang, 67,
172, 1994.
22) Garritsen HSP, Krakowitzky P, Hartel K et al.: Comparison
between Nageotte hemocytometer and flow cytometer
counting method for the detection of residual leucocytes in
plateletapheresis products. In: Högman CE (ed). Leucocyte
Depletion of Blood Components, 131, VU University Press,
Amsterdam, 1994.
23) Bodensteiner DC: A flow cytometric technique to accurately
measure post-filtration white blood cell counts. Transfusion,
31, 651, 1991.
30) Stienstra S, de Vos D: Quality control of leucocyte depletion
in blood banking with a flow cytometer:flow cytometer to
determine low concentrations of white cells in leucocytepoor platelet concentrates. In: Sekiguchi S (ed). Clinical
Application of Leucocyte Depletion. Blackwell Scientific
Publications, 63, Oxford, 1993.
31) Lee TH, Stromberg RR, Heitman J et al.: Quantitation of
residual leukocytes in filtered blood components by
polymerase chain reaction amplification of HLA DQ-alpha
DNA: Transfusion, 34, 986, 1994.
32) Prati D, Rawal BD, Dang C et al.: DNA enzyme immunoassay
of the PCR-amplified HLA-DQ alpha gene for estimating
residual leukocytes in filtered blood. Clin. Diag Lab Immun, 2,
182, 1995.
33) Takahashi TA, Abe H, Hosoda M et al.: Polymerase chain
reaction method to count residual leucocytes in red cell
concentrates prepared with a high-efficiency leucocyte
removal filter, in Högman CE. Leucocyte Depleted Blood
Componens, 137, VU University Press, Amsterdam, 1994.
34) Adams MR, Hirschkorn D, Johnson DK et al.: Enumeration
of WBC in leukocyte reduced plateletapheresis components
by volumetric capillary cytometry. Proc 24th Congress ISBT,
Makuhari Messe (Japan), 88 (abstr), 1996.
24) Wenz B, Burns ER, Lee V et al.: A rare-event analysis model
for quantifying white cells in white cell-depleted blood.
Transfusion, 31, 156, 1991.
35) Dumont DF, Hamstra A, Pritchett R et al.: Evaluation of an
automated device for counting leukocytes in leuko-reduced
platelets. Proc 24th Congress ISBT, Makuhari Messe (Japan),
88 (abstr), 1996.
25) Al EMJ, Visser SCE, Prins HK, et al: A flow cytometric method
for determination of white cell subpopulations in filtered red
cells. Transfusion, 31, 835, 1991.
36) Friedman LI, Sadoff BJ, Stromberg RR: White cell counting
in red cells and platelets: how few can we count? Transfusion,
30, 387, 1990.
26) Vachula M, Simpson SJ, Martinson JA et al.: A flow cytometric
method for counting very low levels of white cells in blood
and blood components. Transfusion, 33, 262, 1993.
37) Mogi Y, Takahashi TA, Hosoda M et al: Flow cytometric analysis
of residual leucocytes in filtered blood components, in
Sekiguchi S (ed). Clinical Application of Leucocyte Depletion,
92, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1993.
27) Lambrey Y, Creuzenet C, Bougy F et al.: Description and
validation of a flow cytometric method to estimate residual
leukocyte in leukocyte-depleted red cell concentrates
(French). Rev Fr Trasfus Hemobiol, 36, 375, 1993.
28) Takahashi TA, Hosoda M, Abe H et al.: Comparison of highly
sensitive methods used to count residual leukocytes in filtered
red cells and platelets concentrates , in Sekiguchi S(ed):
Clinical Application of Leucocyte Depletion, 77, Blackwell
Scientific Publications, Oxford.
29) Dumont LJ, Dumont DF: An enhanced flow cytometric method
for counting very low numbers of WBCs in platelet products .
Proc 24th Congress ISBT, Makuhari Messe (Japan), 87
(abstr), 1996.
212
38) Dzik WH: Granulocytes contaminate ficoll preparations of
stored blood. Transfusion, 23, 538, 1983.
39) Prati D, Capelli C, Bonsoni P et al.: An improved method for
white cell countig in white cell-reduced red cells. Transfusion,
34, 453, 1994.
40) Szuflad P, Dzik WH: Simple method for processing large
volumes of leukoreduced blood for counting WBCs.
Transfusion, 35 (10S),19S (abstr), 1995.
41) D'Erasmo F, Zaccaro F, de Stasio G: Leucodeplezione dei
concentrati eritrocitari: valutazione di alcuni filtri del
commercio. La Trasf del Sangue, 40, 33, 1995.