Validazione biologica e amplificazione genomica. Parte quarta: un

Validazione biologica e amplificazione genomica.
Parte quarta: un anno di esperienza,
risultati e prospettive
Gianluca Gessoni, Paolo Barin, Maria Fezzi, Nevia Arreghini,
Giulia De Fusco, Alda Giacomini, Giorgio Marchiori
Centro Regionale di Coordinamento e Compensazione
Servizio Trasfusionale ULS 12 Veneziana, Venezia
(Responsabile: Dott. Giorgio Marchiori)
The Authors report the results obtained in an year
experience for HCV-RNA screening in blood donations.
From May 1999 to April 2000 each blood unit
collected in the Transfusional Service of ULS 12
"Veneziana" was tested for HCV-RNA by using minipool and a automated commercially available GAT test.
In these twelve months were collected 15,325 blood
units, with these units were prepared 1,278 mini-pool,
each mini-pool being prepared by pooling twelve
samples. These mini-pools were tested for HCV-RNA
using the Cobas Amplicor HCV Qualitative test, in 153
analytical sessions. The HCV-RNA screening was
executed without regard to the classical serological
test.
Among the 1,278 mini-pool tested for HCV-RNA we
observed 5 (0.4%) positive results; of these, four were
due to a cross-contamination and only one was a true
positive. This positive sample was positive for anti-HCV
too. Other 32 mini-pool (2.5%) gave us an uninterpretable
result because the negativity for both target and internal
control. All these 32 mini pools were tested again and
gave us a negative result. The Authors did not observed
any sample positive for HCV-RNA and anti-HCV
negative, nor observed any sample with a polymerase
chain reaction inhibitor.
The screening for HCV-RNA for each blood
donations is feasible without great questions in a
medium size Italian Transfusional Service.
Nevertheless, the low prevalence of post-transfusional
HCV infections suggest a careful evaluation of cost
and benefit before the implementation of this new
screening in each blood donations.
Parole chiave: HCV-RNA, screening , donazioni di
sangue, risultati
Key words: HCV-RNA, screening, blood donations, results
Ricevuto: 22 maggio 2000 – Accettato: 28 giugno 2000
Ccorrispondenza:
Dott. Gianluca Gessoni
Via Longhena 6
30175 Marghera (VE)
Introduzione
Il miglioramento delle procedure di selezione dei
donatori, l'adozione di test di screening sempre più sensibili
ed affidabili, quell'insieme di accorgimenti tecnici e scientifici
che vanno sotto il nome del buon uso del sangue hanno
fatto sì che i rischi connessi alla terapia trasfusionale
scendessero, in questi ultimi anni, a livelli assai bassi1,2. In
effetti il rischio di contrarre una infezione post- trasfusionale
è attorno a 1/100.000 per lo HBV, 1/300.000 per lo HCV, 1/
1.800.000 per lo HIV3-6. Tuttavia, l'opinione pubblica ed i
mezzi di comunicazione di massa enfatizzano l'entità del
rischio trasfusionale. Pertanto, nel secondo semestre del
1999 è stato introdotto l'obbligo per l'industria di ammettere
ai processi di frazionamento solo lotti di plasma che siano
risultati negativi per la ricerca di HCV-RNA con una
metodica di amplificazione genomica (GAT)7,8. Da questo
obbligo è scaturita una vivace discussione sulla
opportunità di applicare lo screening per HCV-RNA ad
ogni singola donazione, questo al fine di garantire livelli
assistenziali e di sicurezza uniformi per i pazienti, per
applicare comuni criteri di selezione dei donatori, per
assicurare la migliore qualità possibile alla terapia
trasfusionale9-14.
Presso il Servizio della ULS 12 "Veneziana" è stato
deciso di valutare l'impatto dell'introduzione dello screening
per HCV-RNA mediante PCR in una struttura trasfusionale
italiana di medie dimensioni. In un primo tempo, abbiamo
steso un progetto operativo generale in grado di fungere
da cornice per le successive applicazioni pratiche15. In un
secondo tempo, abbiamo valutato alcuni dei principali punti
critici inerenti sia l'adozione dello screening per HCV-RNA
in ambito trasfusionale sia quelli inerenti i campioni (carica
virale nei soggetti non trattati, stabilità di HCV-RNA,
necessità di adottare particolari modalità di prelievo o di
trasporto), sia quelli più propriamente metodologici (tipo
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 1 gennaio-febbraio 2001 (17-22)
17
G Gessoni et al.
di test da adottare e la sua validazione per l'utilizzo su minipool di campioni, organizzazione di un laboratorio di biologia
molecolare), sia, infine, problematiche più squisitamente
tecniche quali il dimensionamento dei mini-pool, le loro
modalità costruttive, i controlli da adottare; per finire con
le problematiche relative all'interpretazione dei risultati
ottenuti16,17. Nel presente lavoro vengono riportati e
discussi i risultati ottenuti, in dodici mesi di ricerca di HCVRNA mediante PCR, su tutte le donazioni omologhe
conferite al SIT della ULS 12 "Veneziana".
Materiali e metodi
Casistica esaminata. Nei dodici mesi intercorrenti tra
l'inizio di maggio 1999 ed la fine di aprile 2000 sono state
conferite al Laboratorio di Biologia Molecolare del SIT della
ULS 12 "Veneziana" 15.325 provette corrispondenti ad
altrettante donazioni: più in dettaglio, 7.618 donazioni sono
state raccolte presso la sede di Mestre del SIT, 3.571
donazioni sono state raccolte presso la sede di Venezia e
4.136 donazioni sono state raccolte nelle uscite domenicali.
Dai campioni così ottenuti sono stati allestiti 1.278 minipool: 301 nel trimestre maggio-luglio, 321 nel trimestre
agosto-ottobre, 339 nel trimestre novembre-gennaio, 317
nel trimestre febbraio-aprile.
I mini-pool sono stati analizzati per la ricerca di HCVRNA con le metodiche sotto riportate, suddivisi in 153
sedute analitiche dedicate, eseguite di norma tre volte la
settimana, espletate separatamente rispetto a quelle dei
pazienti.
Procedura analitica. La ricerca di HCV-RNA con metodo
qualitativo è stata effettuata utilizzando il metodo Cobas
Amplicor HCV (Roche Molecular System, Branchburg, NJ,
USA) con la metodologia già descritta15,17. Il metodo è
accreditato di una sensibilità almeno inferiore a 2 log (100
copie di HCV-RNA/mL)18-20.
Utilizzando mini-pool formati da 12 unità, la metodica
avrebbe una sensibilità tale da identificare correttamente
un campione contaminante che presenta una viremia pari a
3 log. Ciascuna seduta analitica (estrazione + amplificazione
+ rivelazione), per ottimizzare il consumo dei reagenti, era
effettuata su batterie di 12 campioni così costituite: posizione
1 controllo positivo Roche, posizioni 2–10 mini-pool,
posizione 11 controllo HCV-RNA positivo a 3 log, posizione
12 controllo negativo Roche 15,17. L'esecuzione del test per
la ricerca di HCV-RNA è stata ottimizzata al fine del miglior
utilizzo dei reattivi, senza tenere in considerazione la
tempistica della validazione e dell'esecuzione degli esami
sierologici.
Le 153 sedute analitiche sono da considerare
18
comprensive di ripetizioni e controlli e sono state eseguite
nello stesso laboratorio ma in tempi separati, rispetto alle
sedute analitiche condotte su campioni di pazienti.
Elaborazione statistica. L'elaborazione statistica dei
risultati è stata effettuata utilizzando il foglio elettronico e
le formule presenti nel programma Excel con sistema
Windows 98.
Risultati
Sono stati esaminati 15.325 campioni raggruppati in 1.278
mini-pool. Nel primo trimestre considerato (maggio-luglio
1999), sono stati esaminati 301 mini-pool: di questi, 11, pari
al 3,6%, sono stati ripetuti perché ritenuti non interpretabili
dato che si era ottenuto un risultato negativo sia dal
campioni che dal controllo interno. Un mini-pool (0,3%) ha
dato un risultato positivo: si è, quindi, proceduto ad
esaminare singolarmente i campioni costituenti, ottenendo
un risultato costantemente negativo. Si trattava di una
contaminazione in fase di estrazione, come confermato dal
risultato negativo ottenuto dalla ripetizione del test nel minipool dopo una nuova fase di estrazione. Nel secondo
trimestre considerato (agosto-ottobre 1999), sono stati
esaminati 321 mini-pool: di questi, 9, pari al 2,8%, sono stati
ripetuti perché ritenuti non interpretabili dato che si era
ottenuto un risultato negativo sia dal campioni che dal
controllo interno. Due mini-pool (0,6%) hanno dato un
risultato positivo: si è, quindi, proceduto ad esaminare
singolarmente i campioni. In un caso si trattava di una
contaminazione in fase di estrazione, come confermato dal
risultato negativo ottenuto dalla ripetizione del test dal minipool dopo una nuova fase di estrazione. Nell'altro caso, si
trattava di una vera positività, come confermato dal risultato
positivo ottenuto in un campione costituente il mini-pool
dopo il test in singolo. Si trattava di una sieroconversione
tra l'esecuzione degli esami preventivi e la prima donazione;
il campione, comunque, era positivo anche alla ricerca degli
anti-HCV. Nel terzo trimestre considerato (novembre 1999–
gennaio 2000), sono stati esaminati 339 mini-pool: di questi,
7, pari al 2,1%, sono stati ripetuti perché ritenuti non
interpretabili dato che si era ottenuto un risultato negativo
sia dal campioni che dal controllo interno. Un mini-pool
(0,3%) ha dato un risultato positivo: si è, quindi, proceduto
ad esaminare singolarmente i campioni costituenti,
ottenendo un risultato costantemente negativo. Si trattava
di una contaminazione in fase di estrazione, come
confermato dal risultato negativo ottenuto dalla ripetizione
del test dal mini-pool dopo una nuova fase di estrazione.
Nel quarto trimestre considerato (febbraio-aprile 2000),
sono stati esaminati 317 mini-pool: di questi, 5, pari al 1,6%,
Screening per HCV-RNA: un anno di esperienza
Tabella I: descrizione dei risultati ottenuti
Riportiamo, suddivisi per trimestre, i risultati ottenuti sottoponendo a screening per HCV-RNA tutte le 15.325 donazioni omologhe
conferite al SIT della ULS 12 Veneziana nei 12 mesi compresi tra il maggio 1999 e l'aprile 2000.
I Trimestre
Mini-pool testati
Mini-pool positivi
II Trimestre
III Trimestre
IV Trimestre
Totale
301
321
339
317
1.278
1 (0,3%)
2 (0,6%)
1 (0,3%)
1 (0,3%)
5 (0,4%)
Mini-pool
Confermati
Mini-pool contaminati
0
0
1(0,1%)
1(0,3%)
0
1 (0,3%)*
1 (0,3%)
1(0,3%)
1 (0,3%)
4 (0,3%)
11 (3,6%)
9 (2,8%)
7 (2,1%)
5 (1,6%)
32 (2,5%)
Mini-pool
Non validi
Come si può osservare, sono stati testati 1.278 mini-pool, ciascuno formato da 12 campioni. Cinque mini-pool (0,4%) sono stati
trovati inizialmente positivi per HCV-RNA: per quattro di questi si è trattato di una contaminazione durante l'esecuzione del test; infatti i
campioni costituenti il mini-pool, testati singolarmente, hanno dato esito negativo; parimenti un risultato negativo si è ottenuto ritestando
un seconda aliquota del mini-pool originale. Un solo mini-pool (evidenziato dall'asterisco) ha dato un risultato positivo confermato ed è
stato individuato un campione HCV-RNA positivo, che peraltro era positivo anche al test anticorpale. In 32 casi (2,5%) è stato necessario
ripetere il test sul mini-pool perché il risultato non era interpretabile per negatività del controllo interno; in tutti i casi la ripetizione del test
ha dato un risultato negativo.
sono stati ripetuti perché ritenuti non interpretabili dato
che si era ottenuto un risultato negativo sia dal campioni
che dal controllo interno. Un mini-pool (0,3%) ha dato un
risultato positivo: si è, quindi, proceduto ad esaminare
singolarmente i campioni costituenti, ottenendo un risultato
costantemente negativo. Si trattava di una contaminazione
in fase di estrazione, come confermato dal risultato negativo
ottenuto dalla ripetizione del test dal mini-pool dopo una
nuova fase di estrazione. In definitiva, quindi, nessuno dei
15.325 campioni provenienti da altrettante donazioni è stato
ritrovato HCV-RNA positivo e negativo per gli anticorpi
anti-HCV. I risultati ottenuti sono riassunti nella Tabella I.
Discussione
La decisione di introdurre lo screening per HCV-RNA
su ogni singola donazione potrà comportare per una
struttura trasfusionale delle problematiche il cui impatto
sulla funzionalità del Servizio e sulla disponibilità di
emocomponenti debbono essere valutate con estrema
attenzione21. Da un punto di vista organizzativo vanno
valutati, in primo luogo, i costi diretti, in parte legati alla
necessità di allestire un laboratorio per l'esecuzione dei
test in biologia molecolare e in parte riconducibili alle spese
di acquisto dei reattivi. Tra i costi indiretti, quello forse più
ingente è quello legato alla necessità di adeguare le
dotazioni organiche. Infatti, presso la nostra struttura
l'esecuzione dello screening per HCV-RNA condotto con
le metodiche descritte ha comportato l'impiego di un tecnico
e di un biologo a tempo pieno, con la supervisione di un
medico. Questo personale, peraltro, non è sufficiente a
garantire l'esecuzione degli esami ai fini della validazione
quotidiana delle unità trasfusionali ma solo l'esecuzione
del test di screening, dopo ottimizzazione delle sedute
analitiche. Se si dovesse garantire l'esecuzione dello
screening per HCV-RNA in maniera da poter disporre delle
unità entro le 24 ore, al fine di non creare effetti negativi
sulla disponibilità di concentrati piastrinici, sarebbe
necessario disporre di almeno una seconda unità tecnica a
tempo pieno dedicata al laboratorio di biologia molecolare15.
Se non dovesse essere disponibile ulteriore personale e
persistendo la necessità di effettuare lo screening per HCVRNA, si potranno delineare due differenti scenari a seconda
della politica adottata dal Servizio Trasfusionale. Infatti, se
si dovesse decidere che lo screening per HCV-RNA
costituisce un test indispensabile per la validazione
biologica delle unità, che, quindi, non potranno essere rese
disponibili per i pazienti sino all'espletamento, con esito
negativo, di tale test, si potranno avere dei problemi nella
disponibilità degli emocomponenti, in particolare dei
concentrati piastrinici22,23. D'altro canto, se si dovesse
decidere che le unità possono essere trasfuse dopo
l'esecuzione dei soli esami di sierologia, senza quindi
attendere l'esito dei test in biologia molecolare, non si
avrebbe nessun effetto sulla disponibilità di
emocomponenti ma, in caso si evidenziasse una donazione
HCV-RNA positiva ma anti-HCV negativa dopo l'infusione
degli emocomponenti, le implicazioni di tipo medico legale
potrebbero essere assai gravi24,25.
19
G Gessoni et al.
Presso il Servizio Trasfusionale della ULS 12
"Veneziana" nel periodo compreso tra maggio 1999 e aprile
2000 sono state raccolte 15.325 unità omologhe, tutte da
donatori abituali o che avevano eseguito un completo
screening sierologico e biochimico nei 30-90 giorni
antecedenti. Per tutti i campioni esaminati si disponeva,
quindi, almeno di un precedente esame per anti-HCV con
esito negativo. Di queste unità, 7.618 provenivano dalla
Unità di Raccolta Ospedaliera (URO) di Mestre, 3.571 dalla
URO di Venezia e 4.136 dalle raccolte effettuate durante le
uscite domenicali. Come già descritto, per ciascuna unità è
stata ottenuta una provetta contenente 5 mL di sangue
intero anticoagulato con EDTA, che è stata trasportata e
conservata a +4 °C. Queste condizioni di trasporto e
conservazione sono ampiamente compatibili con la stabilità
di HCV-RNA26-30. Ciascuna provetta era munita di una
etichetta riportante i dati necessari all'identificazione
dell'unità. Da queste 15.325 unità sono stati allestiti 1.278
mini-pool, ciascuno costituito da dodici unità, che sono
stati esaminati in 153 sedute analitiche dedicate. In ciascuna
di queste sedute analitiche, che di norma venivano eseguite
tre volte la settimana, venivano esaminati dodici campioni:
tre controlli (due positivi ed uno negativo) e nove minipool. I criteri di validazione dei risultati ottenuti nelle sedute
analitiche e nei singoli mini-pool, sono stati descritti
altrove16,17. In breve, basta ricordare che il nostro protocollo
prevede la ripetizione della seduta analitica in caso di
negatività di entrambi i controlli positivi, la ripetizione del
test su mini-pool in caso di negatività del controllo interno,
la apertura del mini-pool con valutazione in singolo di
ciascun campioni in caso di reattività (in questo caso si
ripeterà anche il test sul mini-pool). Dei 1.278 mini-pool
esaminati 1.246, pari al 97,1% sono risultati negativi per
HCV-RNA e questo risultato è stato confermato dalla
positività del risultato ottenuto dal controllo interno. In 32
mini-pool, (pari al 2,5%) il risultato ottenuto è stato
considerato non interpretabile poiché di fronte ad un
risultato negativo per HCV-RNA si era ottenuto un risultato
parimenti negativo per il controllo interno. In questi casi, è
stato ripetuto il test sul mini-pool, utilizzando la seconda
porzione della aliquota già preparata. In tutti i casi si è
ottenuto un risultato negativo correttamente interpretabile.
In 5 mini-pool, (pari allo 0,4%) abbiamo osservato un
risultato positivo per HCV-RNA. In tutti cinque i casi
abbiamo ripetuto il test sul mini-pool, utilizzando la seconda
porzione della aliquota già preparata, ottenendo in 4 casi
un risultato negativo ed in un caso un risultato
ripetutamente positivo. Comunque, per tutti cinque i minipool si è provveduto a testare i singoli campioni costituenti:
è stato, quindi, possibile individuare il campione viremico
responsabile della positività del mini-pool. Si trattava di
20
una prima donazione ottenuta da un soggetto che aveva
contratto una infezione da HCV dopo l'esecuzione degli
esami di idoneità. Questo soggetto era, peraltro, già positivo
per la ricerca degli anticorpi anti-HCV. Quindi, per sottoporre
a screening 15.325 unità è stato necessari esaminare 1.278
mini-pool e si sono dovute eseguire 153 sedute analitiche
pari 1.836 test (comprensivi di ripetizioni e controlli) con
una efficienza di 1,4: si sono cioè dovuti eseguire 1,4 test
per ottenere 1 risultato. In altri termini, con il protocollo da
noi adottato, ciascun test eseguito per validare un minipool viene caricato di un ulteriore costo pari al 40%, per
l'esecuzione dei controlli analitici e delle ripetizioni dei
risultati aberranti. È chiaro che tale quota è destinata ad
aumentare se si dovrà ottimizzare la cadenza delle sedute
analitiche non alla massima utilizzazione dei test, ma tenendo
presente la necessità di rendere disponibili le unità secondo
le esigenze cliniche15-17. Nella nostra realtà operativa,
comunque, il numero dei campioni che hanno dato risultati
dubbi o positivi è stato assai basso: infatti, oltre il 97% dei
mini-pool è risultato negativo. Trentadue mini-pool sono
risultati non interpretabili; la percentuale di questi è
costantemente diminuita. Esaminando i dati ottenuti
trimestre per trimestre, si passa dal 3,6% del primo trimestre
al 1,6% del quarto trimestre. Si tratta di un effetto del
miglioramento delle procedure adottate e dal fatto che il
personale ha acquisito una maggiore esperienza. Abbiamo
osservato solo quattro episodi di cross-contaminazione
(0,3%), probabilmente verificatisi durante la fase di
estrazione, poiché amplificazione e rilevazione sono state
eseguite utilizzando lo strumento Cobas Amplicor che
dovrebbe garantire la assenza di contaminazione in queste
due fasi. Questo buon risultato è stato da noi attribuito in
parte alla strutturazione del laboratorio di biologia
molecolare e, in parte, alle rigorose procedure utilizzate. Per
finire, ci preme sottolineare come l'unico campione trovato
HCV-RNA positivo fosse positivo al test anticorpale e che
quindi tutto il lavoro eseguito, all'atto puramente pratico,
non ha permesso di evitare nessun caso di epatite posttrasfusionale da HCV.
Conclusioni
Allo stato attuale è possibile introdurre nel sistema
trasfusionale italiano lo screening per HCV-RNA per ogni
singola donazione omologa. Tale provvedimento, tuttavia,
sembra difficilmente giustificabile in un'ottica di pura
valutazione del rapporto costi/benefici, tenendo conto delle
risorse che saranno necessarie per eseguire il test e del
basso numero di infezioni post-trasfusionali che si potranno
evitare. In un Sevizio Sanitario cronicamente a corto di
Screening per HCV-RNA: un anno di esperienza
risorse per la costante sottostima dei fabbisogni e, quindi,
conseguente sottodimensionamento degli stanziamenti,
sarebbe forse più utile dedicare tali fondi alla soluzione di
altre complicanze post-trasfusionali, altrettanto gravi e senza
dubbio meno rare della trasmissione dell'epatite di tipo C:
pensiamo, ad esempio, alle infezioni batteriche od alla
trasmissione di HBV31-34. I dati da noi ottenuti nel presente
studio confermano la ridotta probabilità di imbattersi in
una donazione ottenuta da un soggetto infetto ed infettante
(HCV-RNA positivo), ma ancora non rilevabile dai test
sierologici (anti-HCV negativo)35,36. Va, inoltre, tenuto
presente che anche introducendo uno screening basato
sulla amplificazione genomica non sarà mai possibile
azzerare del tutto il rischio di una infezione posttrasfusionale da HCV (o da HBV e HIV)37. Se, comunque, si
decidesse di rendere obbligatoria l'esecuzione dello
screening per HCV-RNA, sarà assolutamente necessario
provvedere il Servizio Trasfusionale del personale
necessario alla sua esecuzione, in maniera da evitare una
grave diminuzione della disponibilità di concentrati piastrinici,
che potrebbe avere conseguenze anche assai gravi.
Riassunto
Nel presente lavoro gli Autori riportano e discutono i
risultati ottenuti in un anno di esperienza utilizzando
uno screening per HCV-RNA su tutte le donazioni
omologhe.
Dal maggio 1999 all'aprile 2000, ogni unità omologa raccolta presso il Servizio Trasfusionale della ULS 12
"Veneziana", è stata testata per HCV-RNA utilizzando il
metodo Cobas Anplicor HCV prodotto dalla ditta Roche.
A partire dalle 15.325 unità raccolte sono stati allestiti
1.278 mini-pool, ciascuno composta da 12 unità. Questi
mini-pool sono stati esaminati in 153 sedute analitiche
dedicate, eseguite separatamente rispetto a quelle in cui
venivano testati i campioni dei pazienti; tali sedute analitiche dedicate venivano eseguite, di norma, tre volte la
settimana. Lo screening per HCV-RNA è stato eseguito in
maniera indipendente rispetto ai classici esami di
validazione di sierologia virale.
Nei dodici mesi considerati sono stati testati per HCVRNA 1.278 mini-pool, di questi, 5 (pari allo 0,4%) sono
risultati inizialmente reattivi. In quattro casi si era trattato di una contaminazione, in un caso si trattava di un
vero positivo: nel mini-pool era stato compreso un campione positivo sia per HCV-RNA che per gli anticorpi
anti-HCV. È stato necessario ripetere il test in 32 minipool (2,5%): in questi casi si era osservata negatività sia
per il test che per il controllo interno e il risultato era
stato, quindi, giudicato non interpretabile. In dodici mesi
di esperienza e dopo aver testato per HCV-RNA tutte le
unita di sangue raccolte, gli Autori non hanno identificato nessun campione HCV-RNA positivo ma negativo
per il test anticorpale; inoltre, non è stato individuato
nessun campione presentante un inibitore della polimerasi
in grado di inficiare l'esecuzione del test.
In ambito trasfusionale, anche in strutture di medie
dimensioni, l'introduzione dello screening per HCV-RNA
è possibile senza particolari problematiche né di ordine
tecnico né di ordine organizzativo. Tuttavia, la bassa prevalenza delle infezioni post trasfusionali da HCV suggerisce una attenta valutazione del rapporto tra i costi necessari per l'esecuzione di questo nuovo test (reattivi,
strumentazione, personale) ed i benefici (numero delle
infezioni che sarà possibile prevenire).
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