caffè olo

Microbiologia / Prodotti carnei
Microbiology / Meat products
Composti organici volatili di un sistema modello similprosciutto inoculato con lieviti autoctoni isolati da
prosciutti tipici
Volatile organic compounds of a ham-like model system
inoculated with autochthonous yeasts isolated from typical
dry-cured hams
Anna Pinna, Stefania Quintavalla, Nicoletta Simoncini, Tania Toscani*, Roberta Virgili
SSICA - Stazione Sperimentale per l’Industria delle Conserve Alimentari, V.le Tanara, 31/A - 43121 Parma, Italia
*Consorzio del Prosciutto di Parma, Via Marco dell’Arpa, 8/B - 43100 Parma, Italia
Abstract
Riassunto
Sono stati studiati i composti organici volatili (VOCs)
presenti nello spazio di testa di substrati di crescita a
base prosciutto crudo (sistema simil–prosciutto), inoculati con lieviti isolati da prosciutto di Parma e appartenenti alle specie Debaryomyces hansenii, Debaryomyces
maramus, Candida famata, Candida zeylanoides e Hyphopichia burtonii. Dopo 2, 5, 8 e 13 giorni di sviluppo, i
VOCs sono stati raccolti mediante la tecnica Head Space Solid-Phase Microextraction (HS-SPME) e analizzati in
GC-MS. I substrati inoculati con i lieviti hanno presentato
differenze in VOCs rispetto al substrato tal quale; in particolare sono risultati fortemente ridotti i prodotti di ossidazione lipidica (soprattutto le aldeidi) e si è osservata
una consistente produzione di alcoli. I lieviti studiati hanno mostrato differenze significative in VOCs qualificanti
per l’aroma dei prosciutti crudi. In particolare le specie
appartenenti al genere Candida producono alcoli in
quantità percentualmente maggiori, Debaryomyces
spp. ha prodotto più composti solforati, mentre Hyphopichia burtonii ha mostrato un profilo più ricco in chetoni
e idrocarburi aromatici. I ceppi di C. famata e H. burtonii
sono stati rispettivamente i maggiori e i minori produttori
di VOCs. Le differenze osservate nei VOCs possono fornire un criterio di valutazione e di scelta per l’impiego
di lieviti come starter di superficie per il miglioramento
dell’aroma dei prosciutti crudi.
A study was done on volatile organic compounds
(VOCs) present in the headspace of raw ham-based
growing medium (ham–like system), inoculated with
yeasts isolated from Parma ham and belonging to the
species Debaryomyces hansenii, Debaryomyces maramus,
Candida famata, Candida zeylanoides and Hyphopichia
burtonii. After 2, 5, 8 and 13 days of growth, the VOCs
were collected by means of the headspace Solid-Phase
Microextraction (HS-SPME) technique and analysed in GCMS. The substrates inoculated with the yeasts presented
differences in VOCs compared to the substrate as such;
in particular, the products of lipid oxidation proved to be
greatly reduced (above all the aldehydes) and a notable
production of alcohols was observed. The tested yeasts
showed significant differences in VOCs qualifying for the
aroma of the raw hams. In particular, the species belonging
to the Candida genus produced greater percentages of
alcohols and Debaryomyces spp. produced more sulphide
compounds, while Hyphopichia burtonii showed a profile
richer in ketones and aromatic hydrocarbons. The C.
famata and H. burtonii strains were the greatest and the
smallest vocs-producers, respectively. The differences
observed in the VOCs can provide a criterion of evaluation
and selection for the use of yeasts as surface starters for
improving the aroma of raw ham.
KEY WORDS: volatile organic compounds, yeasts, dry-cured
ham
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
– 93
INTRODUZIONE
Nel corso della stagionatura dei prosciutti crudi numerosi
composti organici volatili (VOCs) sono generati attraverso
meccanismi di natura chimica ed enzimatica (1-5). La
presenza di numerosi VOCs non implica necessariamente
un impatto sull’aroma, perché è stato verificato che solo
alcuni composti volatili vi contribuiscono, in misura legata
alla concentrazione e alla soglia olfattiva caratteristica di
ciascun composto in un dato mezzo. L’aroma dei prosciutti
crudi è stato ampiamente studiato negli ultimi anni, e l’analisi
dei composti volatili è stata condotta attraverso varie
tecniche analitiche; negli studi più recenti è stata utilizzata la
tecnica HS-SPME GC-MS (6-8). Si ritiene che anche i lieviti e le
muffe che si sviluppano sulla superficie dei salumi stagionati
contribuiscano alla produzione di composti aromatici;
l’importanza del loro ruolo è sottolineata da numerosi studi
(9-16). I lieviti si sviluppano nelle frazioni muscolari ed adipose
esterne del prosciutto, con il fenomeno detto di “patina
farinosa”. Quando si creano sulla superficie muscolare
condizioni di aw (0,85–0,92), di temperatura (10-28ºC) e di
umidità relativa favorevoli alla loro crescita, i lieviti prendono
il sopravvento sui batteri e formano un film, particolarmente
evidente sulla superficie muscolare scoperta del prosciutto
(17). Numerosi ceppi di lieviti appartenenti a più specie, tra
cui le predominanti sono Debaryomyces hansenii, Candida
zeylanoides, Debaryomyces maramus, Candida famata
e Hyphopichia burtonii, sono stati recentemente isolati
dalla superficie del prosciutto crudo di Parma durante la
lavorazione (18).
Recenti studi hanno messo in evidenza il contributo di
Debaryomyces spp. alla formazione di VOCs e all’aroma
dei prosciutti stagionati (12, 13, 19); questi studi sono stati
condotti con inoculi in substrati con limitate analogie con il
prosciutto stagionato (10, 11), oppure su prosciutti nei quali
l’abbondante sviluppo di lieviti anche nei controlli ha reso
difficile individuare i segnali da attribuire specificatamente
ai campioni inoculati (12). Nella maggior parte degli studi
riguardanti la produzione di VOCs da parte di lieviti sono
stati presi in considerazione solo ceppi di D. hansenii, ad
eccezione di uno studio molto recente che ha incluso
anche C. zeylanoides per l’inoculo in sistema modello (20).
Scopo di questo lavoro è valutare se e come la crescita
di lieviti tipici del prosciutto di Parma inoculati in un
substrato a base di prosciutto stagionato ne modifichi la
componente aromatica di base, se tali modifiche possano
essere influenzate dal tipo di lievito e compatibili con il
miglioramento del flavour del prosciutto crudo.
MATERIALI E METODI
Preparazione delle sospensioni di lieviti
Sono stati utilizzati cinque ceppi di lieviti isolati da prosciutti
crudi, selezionati tra le specie risultate più rappresentative
della popolazione micetica superficiale (18) e di cui è
stata verificata con test in vitro l’attitudine allo sviluppo su
substrato carneo con aw e pH rappresentativi della frazione
superficiale del prosciutto: D. hansenii GM147, D. maramus
TM51, C. famata GS78, C. zeylanoides GM97 e H. burtonii
94 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
GS120. Tali ceppi fanno parte della collezione SSICA (21)
e sono conservati in Malt Extract Broth (MEB, Oxoid) con
aggiunta del 15% di Glicerolo (Fluka) a -80°C. Siccome per
ogni specie è stato studiato un solo ceppo, sarà omessa nel
seguito la specifica relativa al ceppo.
Ciascun lievito è stato fatto crescere su piastra per 72 ore
in substrato Yeast Peptone Dextrose Agar (YPD, Difco) a
25°C; partendo dalle colonie pure sono state preparate le
sospensioni di concentrazione pari a 106 ufc/mL in soluzione
fisiologica (SOF). Per ogni lievito sono state inoculate con il
3% v/v della sospensione due beute da 100 mL contenenti
25 mL di substrato Lablemco (10 g/L, Oxoid), glucosio (10
g/L) e acido lattico (10 g/L), portato a pH 6,7 con NaOH 1
M sterile, e sono state poste per 48 ore a 27°C in agitazione
a 90 rpm. Al termine, le cellule di lievito sono state raccolte
per centrifugazione (4°C, 10700 g per 10 minuti) e sono state
preparate le sospensioni in SOF di circa 106 ufc/mL.
Crescita di lieviti in sistema modello simil–prosciutto
Il substrato a base prosciutto per la crescita dei lieviti e
la produzione di VOCs è stato ottenuto dissolvendo 54 g di
prosciutto liofilizzato in 1 L di acqua distillata; la miscela è
stata portata all’ebollizione, filtrata per eliminare il precipitato
di proteine e sterilizzata in autoclave a 121°C per 10 minuti. Il
substrato ottenuto presentava un contenuto di azoto pari a
1,4%, una concentrazione di NaCl pari a 0,65% e pH = 6,10. Il
substrato non inoculato è stato utilizzato come riferimento.
Per ogni lievito, quattro beute contenenti 40 mL del sistema
modello sono state inoculate al 3% v/v con la sospensione
cellulare.
I lieviti sono fatti sviluppare a 25°C in agitazione 110
rpm per 2, 5, 8 e 13 giorni. Ad ogni scadenza il substrato è
stato raffreddato a 4°C e centrifugato (4°C, 15300 g per 15
minuti per 3 volte consecutive per separare le cellule dal
surnatante). Il surnatante è stato prelevato e 7 mL sono stati
introdotti in vials da 15 mL chiusi con setto PTFE (Supelco).
Una soluzione di clorobenzene in acqua distillata (0,1 mg/L,
Fluka) è stata utilizzata come standard interno (22). Sono stati
raccolti tre vials per ciascuna scadenza e ciascun tipo di
lievito e conservati a -20ºC fino al momento dell’analisi.
Lo sviluppo dei lieviti nel substrato simil-prosciutto è stato
quantificato ad ogni scadenza attraverso conteggi su
piastre di Malt Extract Agar (MEA, Oxoid) dopo incubazione
a 25°C per 4-5 giorni.
Analisi SPME-GC-MS
L’analisi dei composti organici volatili è stata eseguita con il
gascromatografo Trace GC Ultra abbinato allo spettrometro
di massa DSQ II (Thermo Electron). Il campionamento è stato
eseguito con un campionatore manuale costituito da una
base di piastra riscaldante, bagno ad acqua, una guida per
il corretto posizionamento della siringa SPME (Fiber holder for
Manual Sampling, Supelco), termosonda per il controllo della
temperatura.
La siringa utilizzata per la microestrazione in fase solida
(SPME) dei composti volatili è costituita da un ago che
supporta la fibra 75 μm CAR-PDMS (Supelco). La fibra è
stata condizionata a 300ºC per 30 minuti prima di ogni
analisi.
I campioni di substrato a base prosciutto, inoculati e non,
sono stati condizionati per 15 minuti a 35ºC, poi la fibra della
siringa SPME è stata esposta allo spazio di testa del vial per
30 minuti a 35ºC; i tempi di sosta dei campioni a 35°C sono
necessari al raggiungimento della concentrazione di
equilibrio dei componenti volatili nello spazio di testa del
vial (7, 12).
Successivamente, la fibra SPME è stata desorbita
nell’iniettore del gascromatografo in modalità splitless
per 1 minuto a 250ºC e i composti volatili iniettati in
colonna.
Per la separazione dei composti volatili è stata utilizzata
la colonna SLB 5-ms (Supelco), costituita da un polimero
5% phenyl-95% dimetil polisilossano (60 m × 0,25 mm ×
0,25 μm); è stato utilizzato elio come gas carrier, con un
flusso di 1,3 mL/min. La programmata di temperatura del
forno è stata: 36ºC per 15 minuti, 4ºC/min fino a 120ºC,
20ºC/min fino a 250ºC, mantenimento per 5 minuti. La
transfer line è stata mantenuta a 280ºC, la sorgente ad
impatto elettronico (70 eV) a 250ºC. L’intervallo di massa
analizzato è stato 35-350 amu in modalità full scan, con
scan time pari a 0,71s.
Periodicamente sono stati eseguiti i controlli sulla
linea del campionamento, verificando l’assenza di
contaminanti nel vial, nella fibra e nella colonna.
I parametri di acqua e aria nello spettrometro di
massa sono stati verificati giornalmente, monitorando gli
ioni massa/carica (m/z) 18, 28, 32 e 44, e la sensibilità
di rivelazione, mediante l’analisi dei frammenti ionici del
gas di riferimento (PFTBA, Fluarichem, GB). L’acquisizione
dei dati è stata realizzata mediante l’uso del software
Excalibur V 1.4 (Thermo Electron). I VOCs sono stati
identificati per confronto con gli spettri di massa della
libreria NIST MS Search 2.0 e confronto degli indici di
Kovats calcolati con riferimento a quelli riportati in
letteratura (23). L’area è calcolata per integrazione del
picco attraverso il metodo ICIS del software Excalibur V
1.4 (Thermo Electron).
I composti volatili identificati sono riportati come:
− quantità di ciascun composto volatile espresso rispetto
allo standard interno (SI) clorobenzene e calcolato
come rapporto tra l’area TIC (Total Ion Current) di ogni
composto e l’area TIC di SI;
− rapporto percentuale tra l’area TIC del singolo
composto volatile e la somma delle aree TIC di tutti i
VOCs attribuiti al campione;
− quantità di ciascun composto volatile espresso rispetto
allo standard interno (SI) clorobenzene e calcolato
come rapporto tra l’area SIM (Single Ion Monitoring)
dello ione caratteristico selezionato per ogni composto
e l’area SIM di SI.
Per la quantificazione in SIM, è stato selezionato uno ione
caratteristico per ogni composto volatile. La selezione
è stata condotta studiando il tipo di frammentazione
ottenuta nello spettro di massa ed identificando lo ione
(m/z) che discrimina maggiormente il composto dal
fondo (m/z = 44) e da eventuali picchi coeluenti.
Analisi dei dati
I risultati sono stati elaborati attraverso il programma
SPSS 11.5.1 per Windows. Le distribuzioni percentuali dei
VOCs calcolati sulle aree TIC sono state rappresentate
mediante grafici a torta; le medie stimate (Least Significant
Means, LSM) delle quantità di VOCs prodotte da ciascun
tipo di lievito, sono state calcolate mediante General
Linear Model (GLM), includendo nel modello statistico
gli effetti “specie di lievito”, “scadenza di incubazione”,
l’interazione “specie” × “scadenza” e confrontando le
LSM per l’effetto “specie” mediante confronto multiplo a
coppie (Bonferroni t-test).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Incubazione nel substrato simil-prosciutto
I composti con un basso valore soglia di percezione
olfattiva quali aldeidi, terpeni, solfuri, alcuni alcoli e
chetoni possono avere un elevato impatto sull’aroma
complessivo del prosciutto crudo (5, 24). La valutazione di
dati quantitativi relativi ai VOCs può fornire dei parametri
oggettivi di qualità, consentendo di discriminare
tra tipologie di prosciutto o tra diversi trattamenti di
lavorazione (12, 25, 26) e di correlare dati sensoriali con
dati analitici (5, 24).
Per il prosciutto crudo, differenze nel microbiota sono
state prese in considerazione sia per spiegare variazioni
nell’aroma (11, 12) sia per indurre altri cambiamenti
sensorialmente percepibili (27).
In questo studio, messo a punto per valutare l’effetto
dello sviluppo di cinque diversi lieviti in un sistema modello
simil-prosciutto, sono stati complessivamente identificati
84 VOCs.
È stato inoltre verificato che le condizioni di sviluppo
realizzate fossero idonee all’accrescimento dei cinque
ceppi di lieviti inoculati. I risultati relativi alla crescita sono
riportati nella Tabella 1. Si osserva che la popolazione di lieviti
nel sistema modello simil-prosciutto aumenta di due ordini
logaritmici già dalla prima scadenza, e rimane costante
fino all’ultima scadenza nell’ordine di 106 – 107 ufc/mL.
TAB. 1 - Conteggi su piastra (log ufc/g) dei substrati simil-prosciutto inoculati con i cinque lieviti. I conteggi sono stati eseguiti alle scadenze T0 = dopo l’inoculo, T1 = 2 gg, T2 = 5 gg, T3 = 8 gg, T4 = 13 gg.
Lievito
T0
T1
T2
T3
T4
Candida famata
4.40
7.20
6.41
6.30
6.85
Candida zeylanoides
4.60
6.48
6.77
6.61
7.04
Debaryomyces hansenii
4.45
6.83
6.92
6.81
6.68
Debaryomyces maramus
4.62
7.45
6.70
6.86
6.72
Hyphopichia burtonii
4.56
7.30
7.04
7.04
7.00
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
– 95
Identificazione dei VOCs ed integrazione TIC
Nella Figura 1 sono riportati come esempio i
cromatogrammi del sistema modello simil-prosciutto non
inoculato (SSP) di C. famata e di H. burtonii dopo 5 giorni
dall’inoculo: è possibile notare la presenza di segnali
diversi in SSP e nei campioni inoculati con i lieviti, e una
differenza di intensità dei segnali tra il campione con C.
famata e quello con H. burtonii.
Si riportano appositamente due dei cromatogrammi
relativi a questi lieviti, che, tra le specie studiate in questa
sperimentazione, hanno prodotto rispettivamente la
maggiore e la minore quantità di VOCs. Il picco a 21,31,
21,34, 21,32 minuti nei tre cromatogrammi è quello del
clorobenzene (SI).
Relative Abundance
Relative Abundance
Relative Abundance
FIG. 1 - Profilo dei composti organici volatili (VOCs) nel substrato simil-prosciutto (SSP), nel substrato inoculato con C. Famata e con H. burtonii, analizzati mediante tecnica HS-SPME/GC-MS (cromatogramma TIC).
Tra gli 84 VOCs identificati, sono stati selezionati 52
segnali considerati correttamente risolti (senza interferenze
dovute a coeluizione e con rapporto segnale/rumore >
100), sottoposti ad integrazione secondo modalità TIC ed
utilizzati per la distribuzione percentuale dei segnali nelle
categorie chimiche di appartenenza dei composti.
Nella Figura 2 sono riportate, per SSP e per i cinque
lieviti, le distribuzioni percentuali dei VOCs nelle categorie
chimiche di appartenenza; nei sistemi inoculati si
osserva la quasi scomparsa delle aldeidi, un aumento
generalizzato di alcoli, di composti solforati e la comparsa
96 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
di eteri. I sistemi inoculati con C. famata e C. zeylanoides
si distinguono per la forte componente alcolica ed eterea,
quelli inoculati con D. hansenii e D. maramus per l’elevata
presenza di composti solforati, mentre il sistema inoculato
con H. burtoni è caratterizzato da una elevata componente
in chetoni. La prevalente composizione in aldeidi e chetoni
(prodotti di ossidazione) dello spazio di testa del sistema
modello simil-prosciutto (SSP) può risultare accentuata in
seguito ai trattamenti a cui la matrice originale prosciutto
è stata sottoposta (liofilizzazione, breve ebollizione e
sterilizzazione in autoclave).
FIG. 2 - Rappresentazione della distribuzione percentuale dei VOCs nelle categorie chimiche di appartenenza per i sistemi modello simil-prosciutto tal quale (SSP) ed inoculati con lieviti.
La produzione dei singoli composti volatili è stata
quantitativamente rilevata (in rapporto allo SI
clorobenzene) per ciascun lievito inoculato, alle quattro
scadenze esaminate, con riferimento al sistema modello
non inoculato (SPP); nelle Tabelle 2-9 sono riportati gli
intervalli di variazione (valori minimi e massimi) dei
composti organici volatili divisi per categorie chimiche
di appartenenza, riportando la scadenza a cui tali valori
sono stati raggiunti.
Alcoli
Sono stati complessivamente identificati 17 alcoli.
L’aumento degli alcoli è evidente nella Figura 2,
confrontando la distribuzione dei VOCs dei sistemi
inoculati con lieviti rispetto a SSP. La presenza di
amminoacidi nel substrato simil prosciutto ha portato
alla formazione di alcuni degli alcoli riportati nella
Tabella 2 tra cui 2-metil-propanolo (alcol isobutilico) e
3-metil-butanolo (alcol isoamilico). I lieviti sono in grado
di sintetizzare i chetoacidi precursori corrispondenti ossia
α-chetoisovalerianico e α-chetoisocapronico.
L’etanolo, presente anche in SSP, è stato consumato
durante l’incubazione nei sistemi inoculati, ed è stato
accumulato solo nel caso di C. zeylanoides; questo
alcol, che ha una nota olfattiva dolciastra, ha una
elevata soglia di percezione (30 mg/kg) (5), che porta
ad escludere una sua influenza sull’aroma.
Gli altri alcoli, assenti in SSP, sono prevalentemente
metil-alcoli ramificati, ottenuti per riduzione delle
corrispondenti aldeidi, grazie all’azione di enzimi
microbici del tipo alcol-deidrogenasi, con un impatto
positivo sull’aroma del prodotto (28). Gli alcoli erano
considerati poco importanti per l’aroma, ma è stato
dimostrato che la loro soglia di percezione si abbassa
ed il loro impatto olfattivo aumenta con il numero di
atomi di carbonio della catena (29). Studi recenti hanno
dimostrato che, anche grazie alla maggior presenza
di alcoli come 2-metil-propanolo, 3-metil-butanolo e
ottanolo, è stato possibile distinguere, sulla base del
profilo di VOCs, il prosciutto Iberico da prosciutti di
minore pregio prodotti con suini bianchi e stagionati in
altre zone geografiche (25).
Il 2-metil-propanolo è stato prodotto dai lieviti
nelle prime scadenze, poi consumato nell’ultima,
probabilmente a causa dell’impoverimento del sistema
modello dei substrati necessari; solo D. hansenii forma
scarse quantità di questo alcol, caratterizzato da una
nota aromatica forte di vino. Il 2-metil-2-propanolo è
prodotto dai lieviti C. famata, C. zeylanoides, D. hansenii
e D. maramus nelle prime scadenze, mentre il lievito H.
burtonii lo ha prodotto più lentamente. Ha un odore
simile alla canfora. Il 2-butanolo è un alcol prodotto
unicamente da C. zeylanoides nell’ultima scadenza
(13 giorni); questo alcol conferisce un sentore dolce. Il
2-metil-2-butanolo è stato prodotto da tutti i lieviti (in
minor quantità da D. hansenii); ha un odore pungente.
Il 3-metil-butanolo è l’alcol rilevato in maggiore
quantità e la sua abbondanza è dovuta anche alla
riduzione enzimatica dell’aldeide 3-metil-butanale
generata per degradazione di Strecker nel prosciutto
(7); è stato riconosciuto come alcol abbondante in
prosciutti di elevata qualità (25). È caratterizzato da
un aroma erbaceo, fruttato, legnoso; la formazione
di questo alcol nel sistema modello è aumentata con
il tempo di incubazione documentando la presenza di
substrato e di attività enzimatica utile per la sua sintesi.
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
– 97
Gli alcoli 3-metil-3-buten-1-olo, 3,3-dimetil-butanolo,
1-penten-3-olo e 2,6-dimetil-6-epten-2-olo sono stati
prodotti nei sistemi inoculati con lieviti in quantità
pressoché costante nel corso delle scadenze; hanno
note olfattive alcoliche o di verde (1-penten-3-olo).
Gli altri alcoli identificati ed integrati (SIM) sono stati 2-metil1-butanolo, 3-metil-3-buten-2-olo, pentanolo, 2-metil-1pentanolo, esanolo, 4-metil-3-esanolo, otten-3-olo.
TAB. 2 - Evoluzione degli alcoli nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides, DH =
Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata la media di
tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo e minimo raggiunti. I
numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 = 13 giorni (3 replicati/scadenza).
La quantità di ciascun alcol presente nello spazio di testa dei campioni è espressa come rapporto tra area TIC alcoli/
area TIC SI.
Alcoli
Etanolo
2-metil-propanolo
2-metil-2-propanolo
2-butanolo
2-metil-2-butanolo
3-metil-butanolo
3-metil-3-buten-1-olo
3,3-dimeti-butanolo
1-penten-3-olo
2,6-dimetil-6-epten-2-olo
SSP
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
25892
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
CF
CZ
nd 2,3,4
39698
1
DH
nd1,3
DM
2304
220244
4
14706
HB
nd2,3,4
1
nd
61341
113474
50513
12064
91354
43204
36243
3
36636
5757
24923
364883
101554
34083
149461
169533
3
2
1
nd1,2,3
nd
106164
29744
33937
3
1
1
29273
04
21983
147062
1
nd
31792
1
nd
678833
nd
21363
17723
21884
12001
38018
5663
24322
154253
1
1
1
5950281
157541
190581
1008771
1622571
917965
36185
137762
512982
5753343
3
nd1
3
nd2
5519
493
nd1
18231
1800
4551
2374
1642
2284
2174
1039
573
330
478
1
4013
3
2
4
1
4687
4
3
1
1952
4
4
61253
1671
1643
1844
1391
3361
200
413
242
325
4764
2
4
2
4
20274
17704
10742
15803
20494
5296
3268
3112
2666
39533
3
2
4
4
nd = non determinabile
Aldeidi
Sono state identificate ed integrate complessivamente
11 aldeidi. Le vie di formazione più comuni per le aldeidi
possono essere l’ossidazione di acidi grassi insaturi ad aldeidi
lineari (28), e il catabolismo degli aminoacidi che produce
aldeidi ramificate (30).
Nei prodotti carnei le aldeidi ramificate sono generate
attraverso la degradazione non enzimatica di Strecker di
valina, leucina e isoleucina (2, 30, 31), ma possono anche
essere prodotte per deamminazione e decarbossilazione
dei corrispondenti amminoacidi ad opera di enzimi
microbici (32, 33).
Le aldeidi sono note per l’elevato contributo all’aroma
di stagionato a causa della loro rapida formazione per
ossidazione lipidica e della loro bassa soglia olfattiva (34);
le aldeidi apportano note aromatiche caratteristiche come
burro, dolce, floreale e verde (35, 36), ma anche rancido,
pungente, di ghianda e noce, di tostato, salato (24).
Dai risultati ottenuti (Tabella 3) si osserva che il contenuto
di aldeidi nei campioni inoculati rispetto a SSP si abbassa
drasticamente.
Pentanale, esanale e eptanale derivano dall’ossidazione
lipidica, con note olfattive che variano dal fruttato
98 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
(pentanale), al rancido (esanale), al grasso (eptanale) e
vengono completamente rimosse dai lieviti. L’esanale, in
particolare, ha origine dalla perossidazione di acidi grassi
ω-6 (30) ed è associato ad off-flavor; questa aldeide è stata
completamente eliminata dallo spazio di testa dei sistemi
inoculati. Tale comportamento indica che la presenza
di lieviti in campioni a base carnea svolge un’importante
funzione antiossidante; l’effetto antiossidante svolto dai
lieviti osservato anche seguendo il consumo di ossigeno
e la degradazione dei perossidi (37), è confermato dalla
diminuzione delle aldeidi e dall’aumento dei corrispondenti
alcoli. Questi risultati sono in accordo con le osservazioni
riportate in altri studi (9, 11), su salami prodotti con lieviti
e muffe come starter, ma l’impiego di un sistema modello
ricco di prodotti di ossidazione ha consentito di focalizzare
l’effetto antiossidante esercitato dai lieviti, essendo assenti
o trascurabili le interferenze dovute ad altri microrganismi
e mancando il ripristino di substrati tipo aldeidi come
verosimilmente accade nei prodotti carnei.
Il 2-metil-propanale è stato consumato dai lieviti nel
corso dell’incubazione. Ha un aroma di tostato, fruttato,
pungente. Questo composto è ritenuto molto attivo come
aroma per il prosciutto crudo (24).
Le aldeidi 2- e 3-metil-butanale derivano dalla
decarbossilazione e deamminazione degli amminoacidi
isoleucina e leucina attraverso la via di Erlich (18). È stata
osservata una progressiva riduzione del loro contenuto da
parte dei lieviti, accompagnata dal progressivo aumento
dei corrispondenti alcoli. Il consumo di 2- e 3-metil-butanale
in substrati inoculati con lieviti è stato osservato anche in
precedenza (11); tale comportamento è probabilmente da
attribuire alla degradazione degli amminoacidi precursori
disponibili nel sistema modello, da parte di popolazioni di
lieviti elevate (Tabella 1). Queste aldeidi sono tra quelle
che caratterizzano maggiormente l’aroma del prosciutto
(24) e l’aroma di salume stagionato. Il 3-metil-butanale ha
note aromatiche descritte come formaggio e salato (32)
oppure fruttato, nocciola, tostato (24), il 2-metil-butanale
di cacao e caffè ma anche fruttato, nocciola, tostato
(24). Questa aldeide è considerata molto importante per
la percezione dell’aroma di stagionato, ma alcuni studi
ne mettono in evidenza anche il contributo all’aroma di
rancido (5, 32).
Il 2-metil-2-butenale è stato completamente consumato
da parte dei lieviti; le sue note olfattive sono di frutta
acerba. Il 3-metil-2-butenale è stato consumato alla
prima scadenza, e poi è aumentato leggermente: la nota
olfattiva caratteristica è di fruttato, mandorla e ciliegia.
L’aldeide solforata metil-tio-propanale, che deriva dalla
decarbossilazione degli amminoacidi metionina e cisteina,
è stata completamente consumata dai lieviti, ha un aroma
di vegetali ammuffiti.
La benzaldeide e la benzenacetaldeide derivano dal
catabolismo della fenilalanina; la benzaldeide può contribuire
all’aroma del prosciutto, per la bassa soglia di percezione
(0,06 mg/kg), con un aroma penetrante di mandorle amare.
Questa conversione è mediata dall’azione microbica (38),
ma in questo test è stato osservato un netto consumo
rispetto al substrato di controllo.
TAB. 3 - Evoluzione delle aldeidi nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides,
DH = Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata
la media di tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo
e minimo raggiunti. I numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 = 13
giorni (3 replicati/scadenza). La quantità di ciascuna aldeide presente nello spazio di testa dei campioni è
espressa come rapporto tra area TIC aldeide/area TIC SI.
Aldeidi
2-metil-propanale
2-metil-butanale
3-metil-butanale
2-metil- 2-butenale
3-metil-2-butenale
pentanale
esanale
eptanale
metil-tio-propanale
benzaldeide
benzenacetaldeide
SSP
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
129050
139569
411370
27620
3652
CF
CZ
24734
7186
1
39884
14120
4
46454
25532
1
nd
4918
2
4
DM
13274
22094
6911
8409
2
101813
39061
28734
2
41014
6125
8423
4
44131
12274
4
3010
2
65204
20586
2
nd
8951
3
HB
12584
28071
nd
14821
3251
DH
nd4
2
14387
43762
64663
39174
34872
2
nd
14952
2144
4
85403
nd
7321
2505
2
14594
31053
31643
nd
nd
nd
nd
nd
195837
nd
nd
nd
nd
nd
12075
nd
nd
nd
nd
nd
12071
nd
nd
nd
nd
nd
45758
15612
41381
6550
3
5854
9723
81344
24815
1
nd2,4
21423
26261
2937
4
19184
11952
3
5163
nd4
11094
6732
47191
84892
nd1,2
14114
nd = non determinabile
Chetoni
Sono stati complessivamente identificati 20 chetoni. Ai
chetoni sono attribuite note speziate ma anche floreali (5).
I sistemi modello inoculati con lieviti presentano un profilo
in chetoni modificato rispetto a SSP. Nella Tabella 4 sono
presenti numerosi metilchetoni, prodotti per β-ossidazione
degli acidi grassi e decarbossilazione β-chetoacida (39). La
formazione di metilchetoni può avvenire per via chimica
e, in presenza di popolazioni microbiche elevate, per via
microbica (40). I metilchetoni aumentano o si mantengono
nei sistemi modello inoculati con i lieviti. Il 2-propanone
(acetone) è un composto che si trova in numerosi alimenti
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
– 99
tra cui il prosciutto crudo (30); la sua quantità è stata
costante in C. famata, C. zeylanoides, D. hansenii, mentre
è aumentata nelle ultime scadenze per D. maramus
e H. burtonii. I metilchetoni 2-butanone e 2-pentanone
sono stati prodotti dai lieviti soprattutto verso le ultime
scadenze; il 2-eptanone non ha mostrato grande
variabilità rispetto al controllo, fatta eccezione per D.
maramus che ne ha consumato la maggior parte alle
ultime scadenze. Il 2-ottanone è aumentato alla prima
scadenza, per poi essere consumato nelle fasi successive.
Il 2-nonanone, assente nel substrato non inoculato, è stato
prodotto ed è rimasto costante nelle quattro scadenze. Di
norma questi composti sono associati a note aromatiche
legnose e contribuiscono all’aroma di “blue cheese”
(41), per cui una grande intensità nella percezione di
questa nota olfattiva produce un abbassamento della
qualità del prosciutto (40). Altri chetoni (es. dichetoni)
presenti nel sistema non inoculato, non sono stati più
rilevati in presenza di lieviti: il 2,3-butandione o diacetile è
un composto aromatico con un aroma forte e pungente
di burro e crema, ed è stato consumato totalmente
nei sistemi inoculati con i lieviti. 3-pentanone, 5-metil-2eptanone, 4-metil-2-eptanone sono stati prodotti dai
lieviti e non erano presenti in SSP: questi chetoni hanno
note olfattive gradevoli, di tipo etereo o fruttato. 2,3octandione e 3-octen-2-one derivano dall’ossidazione
lipidica e sono stati completamente consumati dai lieviti;
il 3-octen-2-one ha un aroma di funghi o spezie, mentre
il 2,3 octandione ha un aroma di ossidato. 6-octen-2one è stato prodotto dai lieviti in quantità simili (minore
produzione per D. hansenii), ma non sono note né le
proprietà olfattive né la soglia di percezione.
Gli altri chetoni identificati ed integrati (SIM) sono
stati:
3-metil-2-butanone,
4-sec-butossi-2-butanone,
2,3-pentandione, 4,4-dimetil-2-pentanone, 2-esanone,
cicloesanone, 4-etil-cicloesanone.
TAB. 4 - Evoluzione dei chetoni nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides, DH =
Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata la media di
tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo e minimo raggiunti. I
numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 = 13 giorni (3 replicati/scadenza).
La quantità di ciascun chetone presente nello spazio di testa dei campioni è espressa come rapporto tra area TIC
chetone/area TIC SI.
Chetoni
2-propanone
2,3-butandione (diacetile)
2-butanone
2-pentanone
3-pentanone
2-eptanone
5-metil-2-eptanone
4-metil-2-eptanone
2,3-octandione
6-octen-2-one
2-ottanone
3-octen 2-one
2-nonanone
SSP
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
nd = non determinabile
100 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
325469
11033
71627
3574
nd
25976
nd
nd
9292
nd
4572
4298
nd
CF
CZ
DH
DM
3237921
3105584
2561452
547590
446976
337182
3
nd
nd
1070911
300917
4
97311
21448
4
24292
5383
3
134722
22305
1
307584
85578
3
44362
13395
3
nd
3
68793
24418
1
nd
3
112361
25734
3
nd2
3062
3
89124
20766
1
96304
61054
1
3
4
81102
14175
4
5741
3524
4
100212
16438
1
72812
15141
2157435
4
nd
956121
164603
2786241
1
11519924
nd
731351
451938
3327781
1009551
3
5457224
63831
178581
3
15174
414073
nd1
9751
3
4679
61353
65923
100104
2
18353
175393
119174
131164
53961
1
230613
25364
17132
38271
30104
5846
3102
6237
45042
2
54584
17096
3
73884
28548
1
nd
1
nd
5142
1383
511644
169360
4
nd
nd
81121
15524
3
HB
nd
53652
7779
3
82674
15073
3
1
nd
nd
91871
19160
59554
2
199803
68953
55424
18017
2
nd
233752
nd
4554
2332
4344
4011
654
433
768
6892
3
4
3
Acidi organici
Sono stati identificati ed integrati in modalità SIM tre acidi
organici: 2-metil-butanoico, 3-metil-butanoico e 4-metil-3pentenoico. Gli acidi carbossilici a catena corta (C2-C4) non
sono stati identificati perché altamente volatili e non trattenuti
durante l’analisi. Gli acidi 2- e 3-metil-butanoico derivano
dall’ossidazione delle corrispondenti aldeidi generate dal
catabolismo degli amminoacidi isoleucina e leucina ad opera
dei lieviti, o derivate da questi amminoacidi attraverso la
degradazione di Strecker (via non enzimatica). A questi composti
organici si attribuisce un aroma pungente di formaggio, e
vengono riportati, anche se con un ruolo secondario, nella
componente aromatica dei prosciutti crudi (5) e nei prodotti
volatili di D. hansenii (11).
Esteri
Sono stati complessivamente identificati tre esteri. Recenti
studi (11) hanno dimostrato la capacità di specie di lieviti
di produrre etil esteri che contribuiscono al tipico aroma di
prodotti carnei fermentati, in cui aggiungono note fruttate e
mascherano gli odori di rancido. Gli esteri con catena corta
(acetato, propionato, butanoato) presentano note fruttate
e bassa soglia olfattiva e sono importanti per l’aroma di
stagionato (30). Nel test condotto in vitro, sono stati prodotti
tre esteri (Tabella 5): il ter butil acetato, il ter pentil acetato e
il dimetil butanoato di etile (in piccola quantità). Questi esteri
sono stati identificati ed integrati nei sistemi inoculati con lieviti,
mentre sono assenti in SSP.
TAB. 5 - Evoluzione degli esteri nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides,
DH = Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata
la media di tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo
e minimo raggiunti. I numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 = 13
giorni (3 replicati / scadenza). La quantità di ciascun estere presente nello spazio di testa dei campioni è
espressa come rapporto tra area TIC estere/area TIC SI.
Esteri
tert-butil-acetato
tert-pentil-acetato
dimetil-etil-butanoato
SSP
min
max
min
max
min
max
nd
nd
nd
CF
612
CZ
DH
395
4
3
DM
149
3
HB
553
0 1,2
4
32903
25861
23841
24521
17403
2189
1090
478
1041
1
7042
54442
21193
4
4
69233
67441
nd
nd
2,3,4
7371
3
20801
nd
3,4
7772
nd
nd3,4
3,4
11101
4412
nd = non determinabile
Eteri
Sono stati complessivamente identificati sei eteri. Gli eteri
sono composti volatili prodotti dai lieviti, in quanto non si
trovano nel substrato di controllo. La loro produzione è elevata,
soprattutto per C. famata e C. zeylanoides. Per quanto siano
stati rilevati in salumi spagnoli (pork loins) inoculati con lieviti e
muffe (D. hansenii e P. chrysogenum) (13), non sono comuni nei
prodotti carnei, per cui la loro formazione può essere favorita
oltre che dalla presenza dei lieviti e di elevate concentrazioni
di alcoli, anche dalle modificazioni indotte nel sistema
modello dai trattamenti di preparazione. Il meccanismo più
probabile di formazione può essere dovuto a reazioni tra
alcoli o tra alcoli e alogenuri alchilici o di addizione di alcoli
ad alcheni; la presenza di eteri a scheletro terz-butilico indica
la formazione intermedia di carbocationi stabili su atomi di
carbonio terziari. La loro soglia olfattiva è abbastanza elevata,
quindi non contribuiscono in maniera rilevante all’aroma finale
del prodotto. L’etere prodotto in maggiore quantità è stato il
2-metil-2-etossi propano (Tabella 6).
Gli altri eteri identificati ed integrati sono stati: 2-metil-2metossi propano, 2-metil-2-metossi butano, 2-metil-2-(1-metiletossi)-propano, di-ter-butossi-metano e 1-butossi-pentene.
TAB. 6 - Evoluzione degli eteri nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides,
DH = Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata
la media di tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo
e minimo raggiunti. I numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 =
13 giorni (3 replicati/scadenza). La quantità di ciascun etere presente nello spazio di testa dei campioni è
espressa come rapporto tra area TIC etere/area TIC SI.
Eteri
2-metil-2-metossipropano
2-metil-2-etossi-propano
2-metil-2-metossi-butano
2-metil-2-(1-metil-etossi)propano
SSP
min
max
min
max
min
max
min
max
nd
nd
nd
nd
CF
13891
CZ
4
672933
163865
4
11839953
3892
4
7249
DH
3
7676
DM
3
635151
244431
89909
51418
4
11204871
2552
4
3
3159221
1764
3
8177
HB
4
74682
618801
393333
4
104665
503062
9941481
4738883
2744
4
18202
177053
185741
67371
165651
86496
3087
1752
1144
2086
4
25121
130641
68263
4
148433
4
155641
3
53981
nd = non determinabile
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
– 101
Composti solforati
Sono stati complessivamente identificati tre composti solforati.
I composti solforati generano off-odours e a causa della loro
bassa soglia olfattiva (1-60 µg/kg) possono determinare un
aroma sgradevole negli alimenti, per cui la loro presenza deve
essere controllata. Tra questi sono presenti tioli (es. disolfuro
di carbonio), tioeteri (es. dimetilsolfuro), disolfuri organici (es.
dimetil-disolfuro).
I composti solforati sono comuni nei prodotti a base di carne;
la loro origine è dovuta alla decarbossilazione e deamminazione
di aminoacidi solforati, come la cisteina e la metionina (42).
Alcuni composti solforati, tra cui il metantiolo, sono stati indicati
come componenti estremamente attive nell’aroma del
prosciutto crudo (24). Questi composti possono essere anche
generati senza il contributo di microrganismi, per degradazione
spontanea degli aminoacidi; diversi studi hanno attribuito ai
lieviti la produzione di alcuni di questi composti per biosintesi
enzimatica in presenza di metionina (43); dalla metionina, in un
processo catalizzato da riboflavina, si genera metionale (3-metiltio-propanale) che si degrada ad acroleina e metilsolfuro,
precursore di tioeteri e disolfuri organici.
Dalla Tabella 7 si può osservare una notevole produzione
di dimetil-disolfuro da parte di D. maramus e D. hansenii, in
aumento con il tempo di incubazione. Questo composto
influenza marcatamente il profilo dei composti volatili di
questi lieviti, in quanto rappresenta circa il 50% del totale dei
segnali integrati in TIC (Figura 2). Occorre però considerare
che in carenza o apporto non equilibrato di nutrienti azotati
(soprattutto di amminoacidi assimilabili) alcuni ceppi di lieviti
possono dare luogo ad una sovrapproduzione di composti
solforati, per cui l’abbondanza rilevata nel sistema similprosciutto potrebbe non verificarsi o avere entità molto
minore nel prosciutto, altamente proteico e proteolizzato,
naturalmente molto ricco di nutrienti azotati e amminoacidi
assimilabili anche per popolazioni di lieviti elevate. C. famata
è stato il maggior produttore di sulfanil-2-propanone la cui
quantità è massima nella prima scadenza e si riduce fino
all’ultima; lo stesso andamento è stato osservato nei campioni
inoculati con C. zeylanoides e D. hansenii, mentre per D.
maramus si è osservato un accumulo nel corso dell’incubazione.
Questo composto volatile non è mai stato determinato in
H. burtonii. Il disolfuro di carbonio è stato rilevato solamente
nei campioni inoculati con D. maramus e C. zeylanoides
rispettivamente nella prima e nella seconda scadenza.
TAB. 7 - Evoluzione dei composti solforati nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides,
DH = Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata la media
di tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo e minimo raggiunti.
I numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 = 13 giorni (3 replicati/scadenza).
La quantità di ciascun composto solforato presente nello spazio di testa dei campioni è espressa come rapporto tra
area TIC composto solforato/area TIC SI.
Solforati
disolfuro di carbonio
sulfanil-2-propanone
min
max
min
max
min
dimetil-disolfuro
max
SSP
CF
nd
nd
29922
21246
10571
2
5263
196681
269500
HB
nd2,3,4
7141
1
58924
307201
608841
3756688
nd
108181
4833
2
3
DM
nd
2
5281
1
3854811
683702
DH
nd1,3,4
6192
nd
11768
CZ
9946235
4
nd
741581
3114103
4
nd = non determinabile
Furani
Sono stati complessivamente identificati tre furani. I furani
si trovano comunemente in prosciutti crudi (3), ma non
rientrano tra i VOCs di aroma intenso (24). Il 2-pentil-furano
ha un aroma fruttato verde con una soglia di percezione di
0,10 mg/kg ed è annoverato tra i VOCs che hanno permesso
di discriminare il prosciutto Iberico da altre produzioni di
minore pregio (5). I furani sono prodotti per autossidazione
(35) e, nelle condizioni sperimentali realizzate, il tetrametiltetraidrofurano è assente in SSP mentre è presente in
quantità variabile nei substrati con lieviti (Tabella 8).
Il furfurale, che ha un’estremità aldeidica, segue
l’andamento delle altre aldeidi ed è stato consumato
completamente già dalla prima scadenza; il tetrametil
-tetraidro-furano invece è stato abbondantemente
prodotto soprattutto da C. famata e C. zeylanoides.
TAB. 8 - Evoluzione dei furani nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides, DH =
Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP è riportata la media di
tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori massimo e minimo raggiunti. I
numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni, 4 = 13 giorni (3 replicati/scadenza).
La quantità di ciascun furano presente nello spazio di testa dei campioni è espressa come rapporto tra area TIC
furano/area TIC SI.
Furani
tetrametil-tetraidro-furano
furfurale
SSP
min
max
min
max
nd = non determinabile
102 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
nd
30013
CF
CZ
59494
46357
nd
3
DH
35503
45861
nd
1
DM
7073
11309
nd
1
HB
51714
42056
nd
1
20592
144763
nd
Idrocarburi
Sono stati complessivamente identificati 17 idrocarburi.
L’origine degli idrocarburi può essere attribuita
all’ossidazione lipidica che gioca un ruolo decisivo nella
formazione di idrocarburi lineari e ramificati nel prosciutto
crudo (3). I metilalcheni, assenti in SSP (Tabella 9), possono
essere sintetizzati dai lieviti attraverso una degradazione
secondaria dei trigliceridi, come già ipotizzato per le
muffe (33). Questi composti non sono inclusi tra i principali
componenti dell’aroma del prodotto (29) e sono prodotti
da tutti i lieviti saggiati.
Toluene e idrocarburi aromatici ramificati potrebbero
derivare dalla ciclizzazione di catene carbossiliche insature
prodotte dalla degradazione lipidica (44). Hanno un aroma
tipo plastica, solvente, affumicato; per questi composti è
stato osservato un andamento crescente nella quantità
alle prime scadenze, per poi essere consumati nelle ultime;
questo comportamento può essere attribuito al consumo
nel sistema modello dei precursori necessari alla loro
formazione.
Gli altri idrocarburi identificati ed integrati in SIM sono
stati: benzene, etilbenzene, p-xylene, o-xylene, 1,3-dietilbenzene, 1-etil-3,5 dimetil benzene, 1-etil-2,4-dimetilbenzene, n-propil-toluene.
TAB. 9 - Evoluzione degli idrocarburi nei substrati inoculati con lieviti. CF = Candida famata, CZ = Candida
zeylanoides, DH = Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii. In SSP
è riportata la media di tre replicati del substrato non inoculato. Per i substrati inoculati sono presentati i valori
massimo e minimo raggiunti. I numeri apicali rappresentano le scadenze: 1 = 2 giorni, 2 = 5 giorni, 3 = 8 giorni,
4 = 13 giorni (3 replicati/scadenza). La quantità di ciascun idrocarburo presente nello spazio di testa dei
campioni è espressa come rapporto tra area TIC idrocarburo/area TIC SI.
Idrocarburi
2-metil-pentene
2,4-dimetil-eptene
toluene
trimetil-benzene1
trimetil-benzene1
trimetil-benzene1
etil-metil-benzene1
etil-metil-benzene1
metil-(metil-etil)-benzene
SSP
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
min
max
nd
nd
1457
1327
17861
nd
nd
197
341
CF
CZ
139704
54265
2
81464
17430
3
108211
37517
3
8191
4357
4
nd4
11609
1
nd4
4991
1
nd1
4706
2
nd4
3674
1
nd4
2018
1
DH
63713
63100
4
59784
16777
3
98114
20848
3
nd4
4510
1
nd3,4
13197
2
nd3,4
5371
2
nd3,4
7320
2
nd3,4
3545
1
nd3,4
2164
1
DM
55913
24020
1
70504
18817
2
79673
14389
1
1152
5852
4
45055
215683
63391
82752
2
15126
109814
97854
137211
16396
2
nd3
216754
nd3,4
47131
nd3,4
nd
43312
384
2
164
1
44062
1
116241
nd
294
53064
nd3,4
nd
612
HB
nd3
3454
1
nd3,4
17741
218973
nd
nd
nd
nd
nd4
10842
nd
: il metodo di identificazione utilizzato non permette di distinguere gli isomeri, che eluiscono con tempi di ritenzione diversi.
Altri VOCs
mediante il quale ogni segnale è stato integrato) e rapportati
In SIM è stato identificato ed integrato il 2-acetil tiazolo, per il
all’area SIM dello standard interno clorobenzene (m/z = 112).
quale non sono conosciute note olfattive specifiche.
Per ciascun VOC inserito nella Tabella 10 è riportata la media
stimata (Least Significant Mean) della quantità prodotta, sulla
Confronto tra i VOCs prodotti dai cinque ceppi di lieviti nel
base di un modello in cui sono stati considerati come effetti
sistema simil prosciutto
principali il tipo di lievito, la scadenza di incubazione (effetto
Tra gli 84 VOCs identificati ed integrati in SIM sono stati presi in
non riportato nella Tabella) e la loro interazione (dato non
considerazione i composti volatili ai quali gli studi più recenti (5,
riportato).
24, 25) hanno assegnato un ruolo prevalente, per quantità, nota
L’analisi statistica di confronto riportata nella Tabella 10
olfattiva e soglia di percezione, nella definizione dell’aroma del
conferma quanto mostrato nella Figura 2. C. famata produce
prosciutto crudo e che hanno mostrato un’associazione con
nel sistema simil-prosciutto un profilo di VOCs importanti per
lo sviluppo di lieviti nel substrato simil-prosciutto (Tabelle 2-9).
l’aroma in cui sono presenti maggiori quantità di alcoli seguiti
Pertanto i composti considerati sono quelli il cui sviluppo ed i
da chetoni e acidi organici, mentre è scarsa la produzione
cui rapporti reciproci sono ritenuti determinanti per l’aroma del
di solfuri; C. zeylanoides non è un forte produttore di VOCs e
prosciutto crudo.
prevale sugli altri lieviti solo per benzaldeide e 2-ottanone. D.
I VOCs sono stati semi-quantificati mediante integrazione
maramus e D. hansenii risultano al primo posto per produzione
SIM (nella Tabella 10 è stato riportato il rapporto m/z dello ione
di solfuri, di acetone (D. maramus) e di acidi organici; anche
1
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
– 103
mediamente prodotte risultano differenti. D. maramus
mostra anche predisposizione alla produzione di alcoli, ma in
misura inferiore a Candida spp. H. burtonii è risultato il minore
produttore di VOCs, e prevale sugli altri lieviti per 2-pentanone,
2-eptanone e 2-ottanone (come riportato nella Figura 2)
e idrocarburi aromatici; anche tali specifiche dovrebbero
indurre a cautela nel favorire il sovrasviluppo di questo lievito,
peraltro non specifico delle carni, ma introdotto attraverso la
sugna (18).
se l’elevata produzione di solfuri può essere dovuta ad un
apporto di nutrienti azotati ed amminoacidi inadeguato per
queste specie, la tendenza espressa deve indurre ad una certa
cautela nel favorire lo sviluppo di popolazioni elevate di questi
lieviti. D. maramus ha generato nelle condizioni sperimentali
realizzate livelli molto elevati ma anche molto variabili di acido
3-metil-butanoico (Tabella 10): l’elevata variabilità di questo
acido riscontrata per ciascun lievito giustifica la mancanza
di differenze significative tra i lieviti, anche se le quantità
TAB. 10 - Effetto del tipo di lievito sulla produzione, in un substrato simil-prosciutto, di composti organici volatili importanti per
l’aroma di stagionato (medie stimate mediante analisi General Linear Model, confronto a coppie eseguito mediante
Bonferroni t-test). I substrati inoculati con i lieviti sono indicati come: CF = Candida famata, CZ = Candida zeylanoides,
DH = Debaryomyces hansenii, DM = Debaryomyces maramus, HB = Hyphopichia burtonii.
Composti organici Ione
volatili1
(m/z)
CF
CZ
DH
DM
HB
Signif. P
Pooled
SEM2
Soglia di odore
(mg/kg)*
Nota olfattiva
Alcoli
3-metilbutanolo
55
93814a
6498d
15501c
53598b
46969b
0,000
1494
0,1
legno, ghianda, verde
pentanolo
55
75a
51a,b,c
27c
58a,b
39b,c
0,000
3,37
0,47
pungente, forte,
balsamico
esanolo
56
1857a
1480a,b
684c
1177b,c
610c
0,000
73,7
0,4
frutta, grasso, dolciastro,
verde
otten-3-olo
57
863a
547b
299c
604b
510b
0,000
17,5
-
funghi, terra, polvere
2-metil-propanale
72
63a,b
51b
61a,b
52b
74a
0,037
2,95
-
tostato, frutta, pungente
3-metil-butanale
58
86a,b
64b,c
98a
104a
51c
0,000
4,03
0,08
ghianda, frutta, salato,
formaggio
benzaldeide
106
25c
107a
9d
56b
27c
0,000
1,67
0,06
mandorle amare,
penetrante
2-propanone
43
9740c
7227c
6898c
35953a
17239b
0,000
561
500
solvente, fruttato, pera,
mela
2-pentanone
58
45b
52b
31c
36c
76a
0,000
1,47
-
dolce, frutta, verde
2-eptanone
58
190a,b
175b
125c
150b,c
231a
0,000
5,63
0,3
tostato, nocciola, spezie,
ghianda, “blue cheese”
2-ottanone
58
184b,c
295a
108d
168c,d
238a,b
0,000
7,85
0,51
frutta, fiori, verde, fresco
2-nonanone
58
29a
17b,c
11d
18b
15c
0,000
0,46
0,1
floreale, frutta, “blue
cheese”
76
36035c
1662c
0,000
8.80
0,008
sgradevole, aglio, vegetali
putrefatti
acido-2-metilbutanoico
74
447a
69b
238a,b
554a
33b
0,000
45,3
0,65 **
pungente, formaggio,
rancido
acido-3-metilbutanoico
60
246
49
175
4571
13
0,245
939
0,65 **
formaggio, fermentato
138
16a
9a,b
14a
2b
8a,b
0,031
1,48
0,1
frutta verde, terra,
metallico
metil-benzene
(toluene)
91
123a
104b
72c
94b,c
103b,c
0,000
2,29
0,33
plastica, colla, forte
12
11
11
26
a
Aldeidi
Chetoni
Composti solforati
dimetil disolfuro
14582c 288163b 499383a
Acidi
Furani
2-pentil furano
Idrocarburi
p-xilene
91
14
0,000
0,92
-
aromatico, dolce
o-xilene
91
13b
11b,c
10b,c
9c
17a
0,000
0,44
-
aromatico, dolce
etil-benzene
91
35b
30b
35b
26b
99a
0,000
2,82
-
secco, colla, sgradevole
b
b
b
b
-: non è nota la soglia di odore. 1: lettere diverse lungo le righe indicano differenze significative (P <0,05); 2: errore standard della media “pooled”
calcolato sul modello elaborato; * tratto da: riferimento [16]; **soglia di odore dell’acido butanoico.
104 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.2, anno 84, 2009
CONCLUSIONI
Il test eseguito in sistema modello, ha permesso di verificare
lo specifico contributo dei lieviti nel modificare il profilo di
VOCs del substrato simil-prosciutto. Questo contributo è
sinteticamente stato:
la generazione di molecole appartenenti a numerose
categorie chimiche di riconosciuta importanza per
l’aroma del prosciutto (es. una significativa produzione di
alcoli apportatori di note olfattive gradevoli);
la rimozione dei composti di ossidazione (consumo dei
composti volatili derivanti dall’ossidazione lipidica, in
particolare aldeidi, alcuni dei quali caratterizzati da note
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ofattive rancide e sgradevoli);
l’individuazione di una specifica predisposizione dei diversi
lieviti studiati alla generazione di VOCs, permettendo
di ipotizzare una diversa attitudine per tipo di lievito al
miglioramento dell’aroma del prosciutto.
Questi risultati sono promettenti per la produzione di
prosciutti arricchiti superficialmente di lieviti tipici con funzione
di miglioramento dell’aroma, tenendo però conto della
maggiore complessità della matrice nel prodotto reale, della
durata del ciclo di lavorazione e delle interazioni con gli altri
microrganismi naturalmente presenti nell’alimento.
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