baird-parker agar base

BAIRD-PARKER AGAR BASE
INTRODUZIONE
Terreno selettivo per la ricerca e il conteggio di Staphylococcus aureus in campioni biologici, prodotti farmaceutici,
cosmetici e alimentari.
Il Rabbit Plasma Fibrinogen (RPF) Agar (Baird-Parker Agar con R.P.F.) è utilizzato per la ricerca e il conteggio diretto
degli stafilococchi coagulasi positivi. Il terreno risultante ha il vantaggio di evidenziare direttamente sulla piastra la
presenza di stafilococchi coagulasi positivi, riducendo di conseguenza in modo considerevole le ulteriori prove di
conferma solitamente necessarie, anche quando su altri terreni selettivi si osservano colonie atipiche. Questo terreno
consente infatti di eseguire contemporaneamente il conteggio e la prova di conferma in una singola operazione.
STORIA
Il terreno, sviluppato da Baird-Parker nel 1962, risultò particolarmente idonea per il conteggio degli stafilococchi
coagulasi positivi. Nel 1964, Smith e Baird-Parker dimostrarono che aggiungendo sulfametazina al terreno, risultava
inibita la crescita di Proteus. Nel 1971, Tardio e Baer osservarono che la formulazione di Baird-Parker, tra 18 terreni
selettivi di isolamento testati, esercitava una minore azione inibitoria rispetto al terreno di Vogel-Johnson, usato
precedentemente con una certa frequenza.
La principale caratteristica che identifica la patogenicità degli stafilococchi, soprattutto Staphylococcus aureus, è la
produzione di coagulasi libera.
Le formulazioni iniziali, che prevedevano l’aggiunta del plasma al terreno di coltura solido, avevano rivelato
incongruenze tra i risultati ottenuti con il successivo test della coagulasi e la formazione del caratteristico alone di fibrina
attorno alle colonie. Le differenze erano dovute al fatto che certi ceppi possedevano una coagulasi in grado di attivare
anche il sistema plasminogeno-plasmina, inducendo una fibrinolisi e la scomparsa dell’alone di fibrina. Per superare
queste difficoltà si consigliò l’aggiunta dell’inibitore tripsinico della soia.
Per favorire la ricerca della coagulasi prodotta da Staphylococcus aureus, Devoyod e Coll. nel 1976 incorporarono nel
terreno di Baird-Parker plasma suino.
Hauschild migliorò successivamente il rendimento del terreno di Devoyod aggiungendo fibrinogeno bovino e un inibitore
della tripsina, con una relativa diminuzione della quantità di plasma.
Nel 1983, Beckers e Coll. modificarono il terreno di Hauschild sostituendo il plasma suino con plasma di coniglio,
tradizionalmente usato nel test della coagulasi. Questi autori suggerirono la semina per inclusione, anziché con la
tecnica a doppio strato utilizzata da Devoyod.
La formulazione è stata infine migliorata nel 1986 da Sawhney dopo alcuni studi riguardanti la tossicità del tellurito di
potassio nei confronti di Staphylococcus aureus in un terreno con fibrinogeno e plasma di coniglio.
PRINCIPI
Baird-Parker Agar con emulsione al tuorlo d’uovo e tellurito:
- La crescita degli stafilococchi è favorita dal piruvato di sodio e dalla glicina.
- La microflora associata è inibita dal litio cloruro e dal potassio tellurito, oltre che da una elevata concentrazione di
glicina.
- L’aggiunta di sulfametazina (facoltativa), dopo la sterilizzazione in autoclave, inibisce gran parte dei ceppi di Proteus,
limitando così l’invasione del terreno da parte di questa specie.
- L’arricchimento con tuorlo d’uovo favorisce l’identificazione dei microrganismi evidenziando l’azione della lecitinasi.
- La caratterizzazione di Staphylococcus aureus (colonie nere dovute alla riduzione della tellurito a telluride, circondate
da aloni di chiarificazione) può essere integrata dal test della coagulasi e, facoltativamente, dai test della
desossiribonucleasi e della fosfatasi.
Baird-Parker Agar con fibrinogeno e plasma di coniglio:
- Il plasma di coniglio è stato scelto per la sua eccellente specificità verso la coagulasi stafilococcica e per la sua
attitudine a portare rapidamente alla formazione del coagulo formando stafilotrombina dalla protrombina.
- Il plasma di coniglio è rinforzato con fibrinogeno bovino. La stafilotrombina scinde i fibrinopeptidi A e B del
fibrinogeno, iniziando in tal modo un processo di polimerizzazione che provoca la comparsa degli aloni di fibrina
attorno alle colonie.
- L’inibitore tripsinico della soia previene la fibrinolisi.
- La colorazione nera delle colonie stafilococciche è dovuta alla riduzione del tellurito a telluride. La presenza di tellurito
favorisce inoltre l’inibizione della microflora contaminante Gram-positiva.
PREPARAZIONE
- Sospendere 58,0 g di terreno disidratato in 950 mL di acqua distillata o deionizzata.
- Portare lentamente a ebollizione, agitando fino a completa soluzione.
- Distribuire in flaconi da 150 mL, dispensando:
- 95 mL di terreno per flacone, se usato con Egg Yolk Tellurite Enrichment (S001-30-K) con o senza sulfametazina
(Sulfamethazine Selective Supplement - S028-70-K).
- 90 mL di terreno per flacone, se usato con Rabbit Plasma Fibrinogen (R.P.F.) Supplement (S034-80-K; S038-70-K).
- Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti.
ISTRUZIONI PER L’USO
- Fondere il terreno (se preparato anticipatamente).
- Raffreddare e mantenere il terreno a 47°C.
Baird-Parker Agar con tuorlo d’uovo e tellurito:
- Asetticamente, addizionare 5 mL di Egg Yolk Tellurite Enrichment (S001-30-K) a 95 mL di Baird-Parker Agar Base e,
facoltativamente (qualora si sospetti la presenza di Proteus), 1 mL di Sulfamethazine Selective Supplement (S028-70-K),
precedentemente ricostituito.
- Mescolare rapidamente e con cura.
- Versare in piastre Petri sterili.
- Lasciare solidificare su una superficie fredda.
- Asciugare la superficie dell’agar ponendo le piastre in termostato con i coperchi parzialmente aperti per il tempo
strettamente necessario.
- Trasferire 0,1 mL del campione in esame e le sue diluizioni seriali o della brodocoltura di arricchimento in ButtiauxBrogniart Hypersalted Broth (M081-17-K) o in Giolitti e Cantoni Broth (M080-17-K), nelle piastre contenenti il terreno.
- Seminare l’inoculo sulla superficie dell’agar con una spatolina di vetro sterile.
- Incubare a 37°C per 48 ore.
Baird-Parker Agar con fibrinogeno e plasma di coniglio:
-
Addizionare 10 mL di R.P.F. Supplement ricostituito (SM034-70-K; S038-80-K) a 90 mL di terreno base.
Mescolare con cura. Usare immediatamente.
Trasferire 1 mL del campione in esame e le sue diluizioni seriali in piastre Petri sterili, vuote.
Versare 10-15 mL di terreno completo.
Omogenare con movimenti circolari.
Lasciare solidificare su una superficie fredda.
Incubare a 37°C per 24 e 48 ore.
RISULTATI
Su Baird-Parker Agar con tuorlo d’uovo e tellurito di potassio, Staphylococcus aureus è caratterizzato dalla formazione di
colonie nere (riduzione del tellurito a telluride), che appaiono brillanti, convesse e circondate da aloni trasparenti (Ø 2-5
mm) di proteolisi (reazione del tuorlo d’uovo). All’interno dell’alone può apparire una zona opaca dovuta all’azione della
lecitinasi.
Gli altri batteri, in linea generale, risultano inibiti. E’ tuttavia possibile osservare colonie marroni di micrococchi, colonie
bianche di lieviti e colonie marrone opaco di Bacillus.
Le proprietà patogene delle colonie caratteristiche devono essere verificate con il test della coagulasi per confermarne la
presenza (fare riferimento alla scheda tecnica del prodotto Coagulase Rabbit Plasma, R002-70-K).
Gli stafilococchi coagulasi negativi sono generalmente inibiti. Tuttavia, in caso di crescita non mostrano i tipici aloni di
chiarificazione.
Su Baird-Parker Agar con R.P.F., gli stafilococchi coagulasi positivi sono caratterizzati dalla formazione di colonie grigie o
nere circondate da un alone opaco di fibrina che appare nitido, stabile e ben evidente.
Si raccomanda di eseguire il conteggio solo sulle piastre che contengono meno di 150 colonie caratteristiche.
L’uso del terreno con RPF elimina la necessità di confermare i risultati mediante il test della coagulasi.
COMPOSIZIONE TIPICA (rettificabile per ottenere un rendimento ottimale)
Per 950 mL di terreno:
- Triptone ................................................................................................. 10,0 g
- Estratto di carne.......................................................................................... 5,0 g
- Estratto di lievito ......................................................................................... 1,0 g
- Sodio piruvato.......................................................................................... 10,0 g
- Glicina ................................................................................................... 12,0 g
- Litio cloruro ............................................................................................... 5,0 g
- Agar batteriologico..................................................................................... 15,0 g
pH del terreno pronto per l’uso a 25°C: 7,2 ± 0,2.
500 g di polvere consentono la preparazione di 8,2 litri di terreno.
CONTROLLO DI QUALITA’
- Terreno disidratato: polvere di colore bianco-crema, omogenea e priva di grumi.
- Terreno preparato (completo, con tuorlo d’uovo + tellurite di potassio): agar di colore giallastro opaco.
- Tipica risposta della coltura con tuorlo d’uovo + tellurite di potassio dopo 48 ore di incubazione a 37°C:
Microrganismi
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Crescita
ATCC ® 6538P
ATCC ® 25923
ATCC ® 12228
ATCC ® 6633
ATCC ® 25922
Buona-eccellente
Caratteristiche
Colore
Aloni
delle colonie
di chiarificazione
Nero
Presenti
Buona-eccellente
Nero
Presenti
Lenta
Parzialmente inibita
Nero
Marrone
Assenti
Assenti
Inibita
CONSERVAZIONE/STABILITA’
- Terreno disidratato:
2-30°C.
La data di scadenza è indicata sull’etichetta.
- Terreno preparato (valore indicativo):
- Terreno di base in flacone: 6 mesi a 2-8°C.
- Piastre con terreno di Baird-Parker con tuorlo d’uovo, tellurito di potassio e sulfametazina: 5 giorni a 2-8°C.
- Flaconi con terreno di Baird-Parker addizionato con R.P.F. Supplement: usare subito dopo la preparazione.
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- ISO 6888-2. Feb. 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
(Staphylococcus aureus and other species) - Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium.
PRESENTAZIONE
BAIRD-PARKER AGAR BASE
Confezione
Codice
500 g (8,2 litri di terreno finale)
M055-17-K
EGG YOLK TELLURITE ENRICHMENT
Confezione
Codice
50 mL
S001-30-K
SULPHAMETHAZINE SELECTIVE SUPPLEMENT
Confezione
Codice
10 flaconi (per 500 mL ciascuno)
S028-70-K
RABBIT PLASMA FIBRINOGEN (R.P.F.) SUPPLEMENT
Confezione
Codice
8 flaconi (per 100 mL ciascuno)
S034-80-K
RABBIT PLASMA FIBRINOGEN (R.P.F.) SUPPLEMENT
Confezione
Codice
1 flacone (per 500 mL)
S038-70-K
Le informazioni e le specifiche contenute in questa scheda tecnica, datate 30.09.1999, sono suscettibili di modifica in qualsiasi momento, senza preavviso.
Le informazioni riportate sull’etichetta del prodotto hanno la precedenza sulle formulazioni o le istruzioni illustrate in questo documento.