Esemplare certificato conforme Tbilisi, il 25 giugno 2010 Il

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RISOLUZIONE OIV/ENO 206/2010
ANALISI MICROBIOLOGICA DI VINI E MOSTI – REVISIONE DELLA RISOLUZIONE ENO 8/95
L’ASSEMBLEA GENERALE
Visto l’articolo 2, paragrafo 2 IV, dell’accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione
dell’Organizzazione Internazionale della Vite e del Vino,
Considerata la risoluzione Oeno 8/1995 adottata nel 1995, riguardante l’Analisi microbiologica
di vini e mosti
Considerati i lavori del gruppo di esperti “Specifiche dei prodotti enologici” e del gruppo di
esperti “Microbiologia”
DECIDE di sostituire l’attuale risoluzione con il seguente metodo nella Raccolta dei metodi
internazionali di analisi del vino e dei mosti:
Analisi microbiologica di vini e mosti
Rilevazione, differenziazione e conteggio dei micro-organismi
Obiettivo:
L’analisi microbiologica è volta a seguire la fermentazione alcolica e/o la fermentazione malolattica e a
rilevare le infezioni microbiologiche, nonché a permettere la rilevazione di qualsiasi anomalia, non solo
nel prodotto finito, ma anche durante le varie fasi della produzione.
Commenti:
Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti nelle normali condizioni di asetticità microbiologica,
utilizzando materiale sterilizzato sulla fiamma di un becco Bunsen o in una camera a flusso laminare ed
esponendo alla fiamma le aperture di pipette, provette, beute ecc. Prima di eseguire l’analisi
microbiologica occorre assicurarsi che i campioni da analizzare siano prelevati correttamente.
Campo d’applicazione:
L’analisi microbiologica può essere applicata a vini, mosti, mistelle e a tutti gli analoghi prodotti, anche
quando siano stati mutati dall’attività batterica. Tali metodi sono inoltre adeguati all’analisi delle
preparazioni industriali di microrganismi selezionati, lieviti LSA e batteri lattici.
Tecniche di analisi microbiologica:
1.
2.
3.
4.
Reagenti e materiali:
Impianti e attrezzature
Campionatura
Test di qualità
4.1. Obiettivo
4.2. Principio
Esemplare certificato conforme
Tbilisi, il 25 giugno 2010
Il Direttore Generale dell’OIV
Secretario dell’Assemblea Generale
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2010
1
4.3 Modalità operativa
4.3.1 Test di tenuta all’aria
4.3.2. Test di qualità dell’incubatore
5.
Tecniche di microscopia per la rilevazione, differenziazione di micro-organismi e
conteggio diretto dei lieviti
5.1. Esame microscopico di liquidi o depositi
5.2. Colorazione di Gram per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo 6)
5.3. Test catalasi per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo 6)
5.4. Conteggio delle cellule di lievito - emocitometria
5.5. Conteggio delle cellule di lievito – colorazione al blu di metilene delle cellule di lievito
6. Conteggio dei micro-organismi per coltura
6.1 Rilevazione, differenziazione e conteggio dei micro-organismi (conta in piastra)
6.2. Coltura in ambiente liquido – “Numero più probabile” (MPN).
1. REAGENTI E MATERIALI
Normali attrezzature e dispositivi da laboratorio, come elencato in ISO 7218:2007 – Microbiologia del
cibo e dei mangimi per animali – Regole generali degli esami microbiologici.
Si raccomandano i seguenti:
- Normali materiali e vetreria da laboratorio, sterili (sterilizzati o sterili pronti all’uso).
- Provette (16x160 mm o simili) contenenti 9 mL di acqua al peptone sterile (Triptone: 1 g/l) o altri
diluenti da usare per le diluizioni in serie dei campioni.
- Etanolo per flambare spatole e pinzette.
- Soluzione al 3% di perossido di idrogeno.
- Micropipette con puntali sterili: da 1 mL e 0,2 mL.
- Bacchette di vetro piegate a L o a triangolo (“asta di Digralsky”) o spatole di plastica.
- Pinzette d’acciaio inossidabile a bordi piatti.
- Membrane sterili di porosità 0,2 e 0,45 µm di estere cellulosico (o equivalente), del diametro di 47 o
50 mm, possibilmente con una griglia stampata sulla superficie e confezionate singolarmente.
- Bicchieri sterili.
- Pipette sterili da 10 mL.
2. IMPIANTI E ATTREZZATURE
Normali attrezzature e dispositivi da laboratorio, come elencato in ISO 7218:2007 – Microbiologia del
cibo e dei mangimi per animali – Regole generali degli esami microbiologici.
Si raccomandano i seguenti:
- Camera sterile o cappa a flusso laminare. In mancanza di un tale dispositivo, lavorare il prossimità
(entro i 50 cm) di un Bunsen- Bilancia analitica con precisione di ± 0,01 g.
- Autoclave.
- Incubatore, regolabile da 25°C a 37°C.
- pH-metro, con precisione di ± 0,1 unità pH e soglia minima di misurazione di ± 0,01 unità pH.
- Frigorifero(i) regolato(i) su 5 ± 3°C, e congelatore(i) con temperatura inferiore ai –18°C,
preferibilmente pari a – 24 ± 2°C.
- Bagno termostaticamente controllato, regolato su 45 ± 1°C
- Forno a microonde.
- Microscopio ottico.
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- Bruciatore a gas.
- Dispositivo di conteggio delle colonie.
- Attrezzatura per la coltura in atmosfera modificata (una beuta sigillata entro il quale può avvenire
l’anaerobiosi).
- Dispositivo di filtrazione con filtri del diametro di 47 o 50 mm.
- Agitatore “Vortex” o equivalente.
- Incubatore per la sterilizzazione a secco;
- Centrifuga;
- Pompa da vuoto
3. CAMPIOMENTO
Il campione deve riprodurre la microbiologia dell’intera massa di mosto o vino da analizzare. Nei limiti
del possibile, la massa deve essere omogeneizzata prima della campionatura, per rimettere in
sospensione i micro-organismi che tendono a depositarsi sul fondo del contenitore. Qualora
l’omogeneizzazione non sia auspicabile, occorre prelevare i campioni là dove è probabile (o si suppone)
che siano presenti i micro-organismi (per esempio quando si cercano i lieviti sul fondo dei serbatoi o
delle botti); in questo caso, però, i risultati non sono quantitativi. Prima di prelevare un campione da un
rubinetto, occorre esporre quest’ultimo alla fiamma e farvi scorrere 2-3 litri di liquido. Il campione deve
essere posto in un contenitore sterile.
Il campione deve essere tenuto in luogo fresco e analizzato il più rapidamente possibile.
Per l’analisi microbiologica sono richieste le seguenti quantità di campioni:
Mosto, o mosto in fermentazione o vino in botte:
almeno 250 mL;
Vino in bottiglia o in pack:
almeno un’unità, indipendentemente dalla capacità;
4. TEST DI QUALITÀ
4.1 Obiettivo
Questi test sono volti alla rilevazione anticipata delle infezioni microbiche.
4.2 Principio
Questa tecnica si basa sui cambiamenti organolettici e d’aspetto (intorbidamento, pellicole, depositi,
colori insoliti) mostrati dal vino sottoposto a determinate condizioni di aerazione e temperatura che
possono provocare attività microbiologica. La natura dei cambiamenti deve essere confermata
dall’esame microscopico.
4.3 Procedura
4.3.1 Test di qualità dell’aria
Un campione di 50 mL di vino, dopo filtrazione su carta filtrante sterile di grana grossa, è posto in una
beuta conica sterile tappata con cotone e lasciato a temperatura ambiente per almeno 3 giorni. Durante
questo periodo di tempo se ne esamina la trasparenza, il colore e l’eventuale presenza di velature,
depositi e pellicole. In caso di velature, depositi, pellicole o cambiamento di colore, si esegue un esame
al microscopio.
4.3.2 Test di qualità dell’incubatore
Un campione di 100 mL di vino, dopo filtrazione su carta filtrante sterilizzata di grana grossa, è posto in
una beuta conica sterile da 300 mL tappata con cotone, inserito in un incubatore a 30°C ed esaminato
dopo almeno 72 ore. Gli eventuali cambiamenti organolettici o visivi possono indicare uno sviluppo
microbico. In questo caso si deve procedere a un esame al microscopio.
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5. TECNICHE MICROSCOPICHE PER LA RILEVAZIONE, LA DIFFERENZIAZIONE DI MICROORGANISMI E IL CONTEGGIO DIRETTO DEI LIEVITI
5.1 Esame microscopico di liquidi o depositi
Obiettivo:
L’esame microscopico sul fresco serve a rilevare e differenziare per dimensione e forma i lieviti dai
batteri eventualmente presenti. L’osservazione al microscopio non può distinguere tra micro-organismi
vitali e non vitali.
Nota:
Una valutazione dei lieviti vitali può essere realizzata con una colorazione adeguata (vedi oltre)
Principio:
Questa tecnica si basa sull’ingrandimento ottenuto con un microscopio che permette di osservare i
micro-organismi con dimensioni nell’ordine di un micron.
Procedura:
L’esame microscopico può essere eseguito direttamente sul liquido o sul deposito.
L’osservazione diretta del liquido è utile solo in caso di popolazione sufficientemente grande (più di 5 x
105 cellule/mL).
Se il vino presenta una popolazione di micro-organismi inferiore, occorre concentrare il campione. A
questo scopo si centrifugano 10 mL di vino omogeneizzato a 3000 – 5000 giri/min per 5 – 15 minuti.
Dopo la decantazione del surnatante, il deposito deve tornare in sospensione nel liquido rimanente in
fondo al tubo da centrifuga.
Per eseguire l’osservazione al microscopio, si pone una goccia del campione di liquido o del deposito
omogeneizzato su un vetrino pulito con una pipetta Pasteur o con un filo metallico sterilizzato. Si copre
con un vetrino di protezione e si pone su una guida del piatto del microscopio. L’osservazione si esegue
a campo trasparente o, preferibilmente, a contrasto di fase per ottenere una migliore osservazione dei
dettagli. Si utilizza di solito un ingrandimento di 400x – 1000x.
5.2. Colorazione di Gram per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr.
paragrafo 6)
Obiettivo:
La colorazione di Gram è usata per differenziare i batteri lattici (Gram-positivi) dai batteri acetici
(Gram-negativi) e anche per osservarne la morfologia.
Nota:
Occorre ricordare che la colorazione di Gram non è conclusiva, dato che possono essere presenti anche
batteri diversi da quelli lattici e acetici.
Principio:
Questo colore è basato sulla differenza tra i batteri Gram-positivi e Gram-negativi dovuta alle differenze
di struttura e di composizione chimica delle loro pareti cellulari. Le pareti cellulari dei batteri Gramnegativi sono ricche di lipidi e molto povere di peptidoglicano che permette la penetrazione di alcool in
grado di dissolvere il complesso violetto di metile-iodio formatosi quando si lascia la cellula incolore che
è quindi ricolorata in rosso con safranina. Le pareti cellulari dei batteri Gram-positivi, invece,
contengono una grande quantità di peptidoglicano e una bassa concentrazione di lipidi. La spessa parete
di peptidoglicano e la deidratazione provocata dall’alcool non consentono perciò all’alcool di entrare
nella cellula, che conserva la colorazione violetta o blu scuro del complesso violetto di metile-iodio.
Esistono numerose modifiche alla tecnica di colorazione di Gram. Essa perde utilità se eseguita su una
coltura troppo vecchia. Il batterio deve perciò trovarsi in una fase di crescita esponenziale entro 24 – 48
ore. Si esegue la colorazione di Gram dopo aver isolato le colonie e messo in coltura liquida.
Soluzioni:
Si deve utilizzare acqua distillata.
1. Soluzione di violetto di metile
Preparazione: Pesare 2 g di violetto di metile e metterlo in una beuta da 100 mL, quindi sciogliere in 20
mL di alcool al 95% vol. Sciogliere 0,8 g di ossalato di ammonio in 80 mL d'acqua distillata. Mescolare
insieme le due soluzioni e usare solo dopo 24 ore. Filtrare con un filtro di carta al momento dell’uso.
Conservare in una beuta scura e al riparo dalla luce.
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2. Liquido di Lugol
Preparazione: Sciogliere 2 g di ioduro di potassio in una quantità minima d’acqua (da 4 a 5 mL) e
sciogliere 1 g di iodio in questa soluzione satura. Portare al volume di 300 mL con acqua distillata.
Conservare in una beuta scura e al riparo dalla luce.
3. Soluzione di safranina:
Preparazione: Pesare 0,5 g di safranina in una beuta conica da 100 mL, sciogliere con 10 mL di alcool al
95% vol. e aggiungere 90 mL d’acqua. Agitare. Conservare in una beuta scura e al riparo dalla luce.
Procedura:
Preparazione dello striscio
Realizzare una coltura dei batteri in terreno di coltura liquido o solido. Raccogliere la coltura giovane dei
batteri dal deposito (dopo centrifugazione della coltura liquida) o direttamente dal terreno di coltura
solido con un’ansao un filo metallico e mescolare in una goccia d’acqua sterilizzata.
Fare uno striscio su un vetrino, spalmando una goccia della sospensione microbica. Lasciare asciugare
lo striscio, quindi procedere a fissare, passando rapidamente il vetrino per 3 volte attraverso la fiamma
di un becco Bunsen o equivalente. Dopo il raffreddamento, eseguire la colorazione.
Colorazione
Versare qualche goccia di soluzione di violetto di metile sullo striscio fissato. Lasciare reagire per 2
minuti ed eliminare lavando con acqua.
Versare 1 o 2 gocce di liquido di Lugol. Lasciare reagire per 30 secondi. Lavare con acqua e asciugare
con carta da filtro.
Versare alcool al 95% vol. e lasciarlo per 15 secondi. Sciacquare con acqua e asciugare con carta da
filtro.
Versare alcune gocce di soluzione di safranina, lasciare reagire per 10 secondi. Lavare con acqua e
asciugare con carta da filtro.
Porre una goccia d’olio da immersione sullo striscio.
Osservare al microscopio, con l’obiettivo a immersione, in campo chiaro.
Risultati:
I batteri lattici restano colorati in violetto o blu scuro (Gram-positivi). I batteri acetici sono colorati in
rosso (Gram-negativi).
5.3 Test catalasi per la differenziazione dei batteri isolati a partire dalle colonie (cfr. paragrafo
6)
Obiettivo:
Questo test serve a distinguere i batteri acetici e quelli lattici. I lieviti e i batteri acetici hanno una
reazione positiva. I batteri lattici danno una risposta negativa.
Commenti:
Occorre considerare che il test della catalasi non è sufficiente, dato che possono essere presenti anche
batteri diversi da quelli lattici e acetici.
Principio:
Il test catalasi si basa sulla proprietà dei micro-organismi aerobici di decomporre il perossido di
idrogeno con rilascio di ossigeno:
catalasi
2H2O2
2H2O + O2
Reagente:
Soluzione di perossido di idrogeno a 12 volumi (3%).
Preparazione: Misurare 10 mL di perossido di idrogeno al 30% vol. in una beuta tarata da 100 mL e
riempire con acqua distillata appena bollita. Agitare e tenere in frigorifero entro una beuta scura. La
soluzione deve essere preparata al momento.
Procedura:
Mettere una goccia di perossido di idrogeno al 3% vol. su un vetrino e aggiungere un piccolo campione
di colonia giovane. In presenza di rilascio di gas, si può concludere che la coltura presenta attività di
catalasi. Qualche volta è difficile osservare immediatamente il rilascio del gas, soprattutto con le colonie
batteriche. Si consiglia perciò di osservare la coltura con un microscopio (obiettivo 10x).
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5.4. Conteggio delle cellule di lievito – Emocitometria
5.4.1 Campo d’applicazione
Determinazione della concentrazione delle cellule di lievito nei vini o nei mosti in fermentazione e del
LSA (lievito secco attivo). Occorre un’elevata concentrazione di cellule: almeno 5 × 106 cellule/mL. I
vini e i mosti in fermentazione possono essere conteggiati direttamente, mentre l’ADY deve essere
diluito 1000 o 10 000 volte. I mosti o i vini contenenti una quantità inferiore di cellule devono essere
centrifugati (3000 g per 5 minuti) e il sedimento va rimesso in sospensione in un volume noto .
5.4.2 Principio
Si mette una goccia di sospensione di cellule di lievito sulla superficie di un vetrino con una camera di
conteggio. La camera di conteggio ha un volume definito ed è suddivisa in quadrati sulla superficie del
vetrino. Il conteggio è eseguito sotto il microscopio in campo chiaro. In caso di cellule colorate,
l’osservazione in contrasto di fase non è indicata.
5.4.3 Reagenti e materiali
Emocitometro, camera contaglobuli, preferibilmente con fermagli: Bürker, Thoma, Malassez,
Neubauer.
Vetrino coprioggetti per emocitometro: I comuni vetrini di protezione scorrevoli (larghi 0,17
mm) non sono adatti a questo impiego, perché sono flessibili e non garantiscono la costanza della
larghezza della camera.
Pipette, puntali sottili, con volume di 1 e 10 mL.
Beute volumetriche, 100 mL.
Beaker, 250 mL.
5.4.4 Impianti e attrezzature
Microscopio con illuminazione a campo luminoso: ingrandimento 250-500x. Contrasto di fase
controindicato.
Piatto magnetico e barra di agitazione.
Sono disponibili haemocitometri con varie camere di conteggio: Bürker, Thoma, Malassez, Neubauer.
Confermare il tipo e il volume della camera di conteggio da utilizzare. Le camere Bürker, Thoma e
Neubauer hanno una profondità di 0,1 mm, la cellula di Malassez 0,2 mm.
La camera Thoma ha un unico, grande (1 mm2) quadrato centrale, perciò il suo volume è di 0,1 mm3
(10-4 mL). Questo grande quadrato è suddiviso in 16 quadrati, ciascuno dei quali è suddiviso in 16
quadrati più piccoli. Questi quadrati più piccoli hanno lati di 0,05 mm x 0,05 e profondità di 0,1 mm,
perciò il volume do ogni quadratino è di 0,00025 mm3 (25 x 10-8 mL). Si possono anche riconoscere dei
quadrati medi. Ogni quadrato medio ha 16 quadratini di lato 0,2 mm e volume di 0,004 mm3, pari a 4 x
10-6 mL.
La camera Bürker contiene 9 quadrati grandi con lati di 1 mm², suddivisi in 16 quadrati medi con lati di
0,2 mm separati da doppie linee distanti 0,5 mm. La superficie di ogni quadrato medio è di 0,04 mm² e
il loro volume di 0,004mm3. I quadratini formati dalle doppie linee hanno una superficie di 0,025mm².
I quadrati grandi, medi e piccoli delle camere Neubauer, Thoma e Bürker hanno le stesse dimensioni. I
quadrati medi della camera Bürker non contengono altre linee all’interno, perciò sono probabilmente
quelli che consentono il conteggio più facile.
5.4.5 Tecniche di esame
La camera di conteggio e il vetrino coprioggetti devono essere puliti e asciutti prima dell’uso. Potrebbe
essere necessario strofinare l’area quadrettata, poiché le camere sporche influenzano il volume del
campione. Pulire con acqua demineralizzata o etanolo e asciugare con carta morbida.
Se si deve eseguire il conteggio su lievito flocculento, il terreno di sospensione deve essere acido
solforico allo 0,5%, per evitare la flocculazione, ma in questo modo si compromette la possibilità di
colorazione al blu di metilene e di conteggiare le cellule vitali e quelle morte. La nuova immissione in
sospensione può essere effettuata mediante sonicazione.
Porre il campione sul vetrino servendosi di una pipetta a puntale sottile, secondo una delle due
procedure seguenti.
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Procedura 1
Mescolare bene la sospensione di lievito. Se occorre diluire, ottenere le solite diluizioni decimali. Per
eseguire una colorazione al blu di metilene, applicarla al campione più diluito e mescolare 1 mL di
campione con 1 mL di soluzione di blu di metilene.
Agitare costantemente la sospensione del lievito. Prelevare un campione con una pipetta a puntale
sottile, espellere 4-5 gocce di sospensione e depositare una piccolo goccia di sospensione di lievito
(eventualmente diluita) su ciascuna delle due aree quadrettate del vetrino. Coprire con il vetrino
coprioggetti entro 20 secondi e premere saldamente con i fermagli. L’area di conteggio deve essere
completamente piena, ma il liquido non deve assolutamente giungere alla depressione circostante.
Procedura 2
Porre il vetrino rigido di protezione in modo che entrambe le camere di conteggio siano ugualmente
coperte. Usare i fermagli per premere il vetrino coprioggetti contro le superfici di contatto, fino al
comparire di linee iridescenti (anelli di Newton). In assenza di fermagli, non spostare il vetrino
coprioggetti durante il riempimento della camera.
Agitare costantemente la sospensione del lievito. Prelevare un campione con una pipetta a puntale
sottile, espellere 4-5 gocce di sospensione e lasciare fluire una piccola goccia di campione tra
l’emocitometro e il vetrino coprioggetti. Fare lo stesso sull’altra parte della striscia. L’area di conteggio
deve essere completamente piena, ma il liquido non deve assolutamente giungere alla depressione
circostante.
Lascare riposare per tre minuti il vetrino preparato, per consentire alle cellule di lievito di stabilizzarsi,
quindi porlo sotto il microscopio.
Conteggiare 10 quadrati medi in ciascuna area quadrettata; occorre stabilire procedure standardizzate
per evitare di contare due volte lo stesso quadrato. Non si contano le cellule che toccano o attraversano
le linee di delimitazione in alto o a destra dei quadrati; si contano quelle che toccano o attraversano le
linee di delimitazione in basso o a sinistra. Le cellule di lievito in fase di gemmazione si contano come
una cellula unica se le dimensioni della gemma sono inferiori alla metà della cellula madre, altrimenti si
contano come due cellule.
Per ottenere conteggi precisi delle cellule, è consigliabile contare in media 200 – 500 cellule di lievito in
tutto. I conteggi sulle due facce del vetrino devono concordare entro il 10%. Se si utilizza una
diluizione, occorre usare nel calcolo il fattore di diluizione.
5.4.6 Espressione dei risultati
Per la camera Thoma
Sia C il numero medio di cellule contate in un quadrato medio con lati di 0,02 mm; la popolazione T
totale nel campione è allora:
Espressa in cellule/mL T= C x 0,25 x106 x fattore di diluizione
Per la camera Bürker
Sia C il numero medio di cellule contate in un quadrato piccolo con lati di 0,05 mm; la popolazione T
totale nel campione è allora:
Espressa in cellule/mL T= C x 4 x106 x fattore di diluizione
5.4.7 Riferimenti
European Brewery Convention. Analitica Microbiologica – EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001
5.5 Conta delle cellule di lievito – Colorazione al blu di metilene delle cellule di lievito
Questo metodo consente di valutare rapidamente la percentuale di cellule vitali di lievito, che non
assumono colorazione, dato che le cellule morte si colorano di blu. Questo metodo è applicabile a tutti i
campioni contenenti lieviti, tranne i mosti contenenti più di 100 g/l di zucchero. I batteri sono troppo
piccoli, perciò la loro colorazione non è rilevabile con questo metodo.
Nota: è importante la focalizzazione delle cellule a varie profondità, per visualizzarne correttamente la
colorazione con il blu di metilene..
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5.5.2 Principio
Il blu di metilene è trasformato nel suo derivato incolore dall’attività riduttrice delle cellule di lievito
vitali. Le cellule di lievito morte assumeranno la colorazione blu.
La vitalità si calcola sulla base del rapporto tra cellule vitali e le cellule totali. Questo metodo sovrastima
la vitalità “reale” se le cellule vitali sono meno dell’80%, poiché esso non fa distinzione tra le cellule
"vive" e la loro capacità di riprodursi (Cellule vitali ma non adatte a coltura).
Se la concentrazione di zucchero supera i 100 g/l, quasi tutte le cellule sono celesti, rendendo
sconsigliabile questo metodo.
Il colorante non può funzionare correttamente con i vini a basso pH e fortemente tamponati. In questi
casi il conteggio va eseguito almeno sulla prima diluizione decimale.
Soluzione A: Soluzione di blu di metilene in acqua distillata, 0,1 g/500 mL.
Soluzione B: Soluzione di KH2PO4,in acqua distillata, 13,6 g/500 mL.
Soluzione C: Soluzione in acqua distillata di Na2HPO4 x 12 H2O, 2,4 g/100 mL
Soluzione D: 498.75 mL di Soluzione B + 1,25 mL di soluzione C.
Soluzione E: Mescolare i 500 mL di soluzione D con 500 mL di soluzione A per ottenere la soluzione
finale tamponata di blu di metilene, con pH 4,6 circa.
Microscopio, 250-500 x ingrandimenti. Contrasto di fase controindicato.
Vetrini e vetrini di protezione scorrevoli per microscopio o emocitometro (camera di Thoma, Bürker o
Neubauer).
Provette da test e asta agitatrice.
Pipette, puntali sottili.
Determinazione della vitalità
Diluire il lievito in sospensione con la soluzione di blu di metilene in una provetta da test, fino a che la
sospensione non abbia circa 100 cellule di lievito in un campo microscopico. Deporre una piccola goccia
di sospensione ben mescolata su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino coprioggetti.
Esaminare al microscopio con un ingrandimento di 400 x entro 10 minuti dal contatto con il colorante.
Contare un totale di 400 cellule, annotando il numero di cellule morte, rotte, avvizzite e plasmolizzate
colorate di blu. Le cellule di lievito in fase di gemmazione si contano come una cellula unica se le
dimensioni della gemma sono inferiori alla metà della cellula madre. Se le dimensioni della gemma sono
uguali o maggiori di metà di quelle della cellula madre, si contano entrambe le cellule. Le cellule
colorate di celeste vanno considerate vive.
Siano T il numero totale delle cellule e C il numero delle cellule colorate di blu; la percentuale delle
cellule vitali è allora
T C
x100
T
5.5.7 Riferimenti
European Brewery Convention. Analitica Microbiologica – EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001
6. CONTA DEI MICRO-ORGANISMI PER COLTURA
Obiettivo:
Lo scopo del conteggio dei micro-organismi per coltura è di valutare il livello di contaminazione del
campione, valutandone cioè la prodotto quantità di microrganismi coltivabili. Secondo il terreno di
coltura usato e le condizioni di coltura, si possono contare tre tipi di micro-organismi: i lieviti, i batteri
lattici e i batteri acetici e muffe.
Principio:
Il conteggio per coltura si basa sul fatto che i micro-organismi viventi sono in grado di moltiplicarsi in
terreno nutriente e in adeguate condizioni d’incubazione per formare delle colonie sul mezzo solidificato
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da agar o un intorbidamento in ambiente liquido. In ambiente agar una cellula produce mediante
moltiplicazione un ammasso di cellule visibile a occhio nudo chiamato colonia.
6.1 Rilevazione, differenziazione e conta dei micro-organismi (conta in piastra).
Questo standard fornisce una guida generale al conteggio dei lieviti, delle muffe e dei batteri lattici e nei
batteri acetici nei mosti, nei mosti concentrati, nei mosti parzialmente fermentati, nei vini (compresi i vini
spumanti) durante la loro produzione e dopo l’imbottigliamento, contando le colonie cresciute su un terreno
di coltura solido dopo adeguata incubazione. Lo scopo dell’analisi microbiologica è di controllare il processo
di vinificazione per prevenire il deterioramento microbico di mosti o vini.
6.1.2 Terminologia e definizioni
I termini “piastra” e “scatola di Petri” sono usati come sinonimi.
CFU = Unità formanti colonie (Colony Forming Units).
6.1.3 Metodo
Il numero dei micro-organismi vitali presenti nei mosti o nei vini si determina spalmando un piccolo
volume noto di campione sulla superficie di un terreno di coltura o con l’aggiunta secondo il metodo di
incorporazione (vedere par. 6.1.7.4), e incubando le piastre per il tempo necessario nelle condizioni
migliori per la crescita dei micro-organismi. Ogni cellula - o ammasso di cellule – si suddivide e cresce
in un ammasso, diventando visibile come colonia. Il numero di colonie trovate sulla superficie di una
piastra indica le cellule presenti nel campione originale, perciò i risultati sono espressi come CFU. Se si
suppone che il campione abbia un numero elevato di cellule, occorre realizzare le opportune diluizioni
decimali in serie per ottenere colonie in numero variante tra 10 e 300 per ogni piastra. Se si suppone
che il campione abbia un basso numero di CFU, occorre raccogliere queste ultime sulla superficie di un
filtro sterile da 0,45 a 0,88 µm per i lieviti e da 2,22 a 0,45 µm per i batteri, che va quindi posto nella
scatola di Petri sulla superficie del terreno di coltura.
Il campo di variabilità della misurazione con questo metodo passa da < 1 CFU/(volume analizzato) a
109 CFU/mL o 1010 CFU/g nel campione originale.
Quelli indicati nel paragrafo 1 della risoluzione, più:
Provette (16x160 mm o simili) contenenti 9 mL di acqua al peptone sterile (Triptone: 1 g/l) o altri
diluenti da usare per le diluizioni dei campioni (Allegato 4). Un numero di massima delle provette necessarie
per i seguenti campioni è fornito qui sotto:
Mosti non fermentati: 4 / campione.
Mosti in fermentazione: 7 / campione.
Vini immagazzinati:
2 / campione.
Micropipette con puntali sterili: da 1 mL e 0,2 mL.
Aste di vetro piegate a L o a triangolo (“aste di Digralsky”) o spatole di plastica.
Scatole di Petri con diametro di 90 mm (con 15-20 ml di terreno di coltura) (56 cm2) per la tecnica
di coltura in piastra, e piastre con diametro di 90 mm o 60 mm (con 6-8 ml si terreno di coltura) per la
tecnica della membrana filtrante, riempite 18-24 ore prima con 15-20 mL di terreno di coltura (semplice o in
duplicato scatole per ogni campione testato):
Per conteggi dei lieviti e delle muffe: YM, YEPD, Agar nutriente WL, Agar per lieviti o Agar TGY
(Triptone-glucosio-estratto di lievito) o equivalente se convalidato. Se si cercano lieviti diversi dai
Saccharomyces Agar alla lisina e piastre con Agar differenziale WL (allegato 1) o equivalente se
convalidato se si cercano lieviti non Saccharomyces (Allegato 5 terreno di coltura).
Per i conteggi dei batteri acetici: Agar GYC, G2 o terreno di coltura Kneifel (Allegato 5 terreno di
coltura) o equivalente se convalidato.
Per i conteggi dei batteri lattici: MRS più 20% di succo di pomodoro (o di mela o d’uva), o Agar
ATB modificato (terreno di coltura dell’Oenococcus oeni), o Agar TJB plus, o terreno di coltura di LafonLafourcade, terreno di coltura 104, Agar MTB (Allegato 5 terreno di coltura) o equivalente se
convalidato.
Per il conteggio dei funghi filamentosi si usano l’Agar modificato di Czapek-Dox, Agar DRBC o
MEA addizionato con tetraciclina (100 mg/l) e streptomicina (100 mg/l). (Allegato 5 terreno di coltura)
o equivalente se convalidato
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Occorre aggiungere antibiotici per rendere il conteggio selettivo, poiché nel vino tutti i microorganismi si trovano insieme (vedere Allegato I terreni di coltura)
Quelli indicati nel paragrafo 2 della risoluzione.
6.1.6 Campionatura
Come indicato nel paragrafo 3 della risoluzione.
Per la conta in piastra sono richieste le seguenti quantità di campioni:
Mosto, o mosto in fermentazione o vino in botte:
almeno 250 mL;
Vino in bottiglia o in pack:
almeno un’unità, indipendentemente dalla capacità;
6.1.7.1 Prerequisiti
Tutti i materiali e le attrezzature usati nei test devono essere sterili, e tutte le operazioni devono essere
eseguite in condizioni asettiche.
La cappa a flusso laminare deve essere messa in funzione 5 minuti prima di iniziare il lavoro, in modo da
avere un flusso sterile e stabile.
6.1.7.2 Sterilizzazione
I terreni di coltura devono essere sterilizzati in autoclave a 121°C per almeno 15 minuti (20 minuti per
grandi volumi). I materiali sterili monouso e la vetreria devono essere aperti e utilizzati sotto la cappa a
flusso laminare. Le pinzette e le spatole devono essere immerse in etanolo e passate alla fiamma prima
dell’uso. Gli imbuti d’acciaio inossidabile devono essere passati alla fiamma con etanolo dopo ogni
utilizzo, mentre gli imbuti di vetro o di policarbonato devono essere messi in autoclave prima dell’uso,
in modo da averne a disposizione tanti quanti sono i campioni testati.
6.1.7.3 Diluizione del campione (Allegato 1)
Un mL di campione è trasferito con una pipetta in una provetta sterile con 9 mL di acqua e peptone. La
provetta è agitata con un agitatore “Vortex” per 20 secondi. Questa è la prima diluizione decimale, 1 mL
della quale è trasferito nella successiva provetta sterile con 9 mL di acqua e peptone, a formare la seconda
diluizione. Dopo 20 secondi di agitazione, si ripete l’operazione per tutte le volte necessarie.
Un numero di massima delle diluizioni in serie necessarie per i seguenti campioni è fornito qui sotto:
Mosti non fermentati:
4 diluizioni decimali.
Mosti in fermentazione:
Vini non filtrati durante la maturazione (conteggi dei lieviti):
Vini non filtrati durante la maturazione (conteggi dei batteri lattici):
Vini filtrati o in pack (imbottigliati)
Nessuna diluizione.
Mosti concentrati
Diluire 10 mL in 100 mL di acqua e peptone (o 100 mL in 1000 mL).
I vini imbottigliati o filtrati e i mosti concentrati dopo diluizione in acqua e peptone sterile si analizzano con
la tecnica della membrana filtrante.
6.1.7.4 Preparazione delle piastre
Occorre preparare le diluizioni in serie necessarie per il numero di campioni da coltivare in piastra. Se si
devono coltivare in piastra molti campioni, si possono preparare più diluizioni in serie, ma ogni diluizione
deve essere coltivata in piastra entro 20 minuti.
Inoculare ciascuna piastra con 0,1 o 0,2 mL delle tre diluizioni più basse preparate, nel modo seguente:
Mosti non fermentanti
diluizioni -2; -3; -4.
Mosti in fermentazione
diluizioni -5; -6; -7.
Vini non filtrati durante la maturazione
diluizioni 0; -1; -2.
In caso di dubbio, inoculare un numero maggiore di diluizioni, mai inferiore.
In condizioni asettiche (preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare) spalmare il campione sulla
superficie del terreno di coltura prima dell’assorbimento del liquido (di solito entro 1-2 minuti) con un’asta
ripiegata di vetro sterile (“asta di Digralsky") o con un’astina monouso. Per ciascuna piastra si deve
utilizzare un “asta di Digralsky ” separato, oppure si devono spalmare i campioni sulle piastre partendo dal
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campione più diluito e procedendo con quelli via via meno diluiti. Lasciare le piastre per alcuni minuti sotto il
flusso di aria sterile, finché il liquido non sia assorbito.
Nota 1: La coltura su piastra di 0,2 mL invece di 0,1 mL, come spesso indicato, consente una
spalmatura più facile e ritardata. Occorre tenerne conto nei calcoli.
Nota 2: Per il conteggio del lievito, si evita l’accrescimento batterico aggiungendo 50 mg/l di
cloramfenicolo (o equivalente se convalidato) al terreno di coltura dopo averlo passato in autoclave, e
l’accrescimento delle muffe aggiungendo 150 mg/L di difenile (o equivalente se convalidato).
Nota 3: Per il conteggio dei batteri lattici, si evita l’accrescimento dei lieviti aggiungendo natamicina
(pimaricina) (0,1 g/L) (o equivalente se convalidato) e l'accrescimento dei batteri acetici con
l’incubazione anaerobica.
Nota 4: Per il conteggio dei batteri acetici, si evita l’accrescimento del lievito aggiungendo natamicina
(pimaricina) (0,1 g/L) (o equivalente se convalidato) e quello dei batteri lattici aggiungendo penicillina
(12,5 mg/L). (o equivalente se convalidato)
Gli antibiotici devono essere aggiunti dopo la sterilizzazione in autoclave.
Quando si esegue una ricerca specifica del lievito non-Saccharomyces, inoculare come descritto in
precedenza tre piastre di Agar lisina e tre piastre di Agar differenziale WL con le opportune diluizioni.
- Metodo di incorporazione (metodo alternativo).
Preparare e sterilizzare 15 mL di terreno di coltura in provette e tenere le provette a bagnomaria (o
equivalente se convalidato) a 471°C.
Versare 1 mL di campione o diluizione in una scatola di Petri vuota.
Aggiungere 15 mL di terreno di coltura e agitare delicatamente la scatola di Petri, in modo da ottenere una
distribuzione omogenea di micro-organismi all’interno della massa del terreno di coltura.
Lasciare raffreddare e solidificare mettendo le scatole di Petri su una superficie orizzontale fredda (il tempo
di solidificazione dell’agar non deve superare i 10 minuti).
6.1.7.5 Conteggio con concentrazione mediante filtrazione con membrana
La porosità della membrana deve essere di 0,45 o 0,8 µm per il conteggio dei lieviti; di 0,2 o 0,45 µm per il
conteggio dei batteri. La superficie della membrane deve essere preferibilmente coperta da una
quadrettatura per facilitare il conteggio delle colonie.
Le piastre sulle quali si pongono le membrane possono contenere un terreno di agar nutriente o un
tampone, nel quale va disperso il terreno di coltura secco, imbevuto di acqua sterile immediatamente prima
dell’uso. Alcuni fornitori offrono piastre sterili contenenti un cuscinetto sterile, sul quale si versa il contenuto
di un terreno di coltura liquido sterile monouso da 2 mL immediatamente prima dell’uso.
Assemblare asetticamente l’attrezzatura di filtrazione, sterilizzare l’imbuto come indicato in 9.2 e collegare
alla pompa da vuoto.
Mettere in funzione la pompa da vuoto.
Immergere le pinzette nell’etanolo ed esporle alla fiamma: una volta spenta la fiamma, aspettare qualche
secondo e, servendosi delle pinzette, mettere la membrana sul suo supporto nell’unità di filtrazione.
Prima di aprire la bottiglia, agitarla per bene; immergere il collo della bottiglia capovolto in etanolo (per 1-2
cm) ed esporlo alla fiamma per sterilizzarlo.
Prelevare tre quantità di ciascun campione: 10 mL con una pipetta sterile da 10 mL, 100 mL con una
provetta cilindrica sterile da 100 mL, e il resto direttamente dalla bottiglia se applicabile. Per filtrare, versare
il vino nell’imbutomLmL e attivare il vuoto. Una volta filtrato il quantitativo di vino desiderato, disattivare il
vuoto, esporre le pinzette alla fiamma, aprire l’imbuto, tenere la membrana con le pinzette, deporne il lato
opposto sul terreno di coltura solido di una piastra e farla aderire alla superficie del terreno di coltura,
evitando la formazione di bolle sotto la membrana.
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6.1.7.6 Incubazione del campione
Incubare anaerobicamente le piastre capovolte per 4 giorni a 25 ± 2C per i lieviti e i batteri acetici. Se
la temperatura è < 23°C, prolungare l'incubazione di un altro giorno; se la temperatura è < 20°C
prolungare di altri tre giorni. La temperatura massima non deve superare i 28°C.
Nel caso dei conteggi dei lieviti Brettanomyces o Dekkera, raddoppiare il tempo di incubazione.
In caso di conteggio dei LAB, disporre le piastre in un vaso o sacco anaerobico e incubarle capovolte per
10 giorni a 30 ± 2C. Se la temperatura è < 28°C, prolungare l’incubazione di un altro giorno; se è <
25°C, prolungarla di altri tre giorni. La temperatura massima non deve superare i 33°C.
6.1.8.1 Conta delle colonie di lievito e batteri:
Contare le colonie cresciute in 4 giorni per i lieviti e i batteri acetici (8 giorni per i lieviti
Brettanomyces/Dekkera), e 10 giorni per i eventualmente servendosi di un contatore di colonie e ignorando
la diversa morfologia delle colonie se si esegue un conteggio dei lieviti totali, o tenendone conto se
necessario.
I terreni e le condizioni d’incubazione sono sufficientemente specifici affinché le colonie visibili ad occhio
nudo permettano il conteggio dei vari tipi di micro-organismi .
6.1.8.2 Calcolo dei risultati.
I risultati più affidabili provengono dalle piastre di conteggio contenenti 10-300 colonie (ISO 7218:2007 –
Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Regole generali degli esami microbiologici).
Calcolare il numero N di micro-organismi presenti nel campione testato come media ponderata di due
successive diluizioni decimali servendosi dell’equazione seguente:
N
C
V  1,1 d
dove:
C
è la somma delle colonie contate sulle due piastre tenute da due successive diluizioni decimali,
almeno una delle quali contiene un minimo di 10 colonie.
V è il volume in millilitri dell’inoculo immesso in ciascuna piastra.
d è la diluizione corrispondente alla prima diluizione tenuta [d=1 se si tiene il prodotto liquido non
diluito (campione di test)].
In altre parole, se le piastre di due diluizioni decimali consecutive contengono 10-300 colonie, calcolare il
numero di CFU/mL per ciascuna diluizione, quindi la media dei due valori: questo è il valore CFU/mL del
campione. Se uno dei due valori è più del doppio dell’altro, considerare il più basso come CFU/mL.
Arrotondare i risultati alla seconda cifra significativa solo al momento della conversione in CFU/mL ed
esprimere i risultati come un numero tra 1,0 e 9,9 moltiplicato per l’opportuna potenza di 10 (ISO
7218:2007 – Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Regole generali degli esami
microbiologici).
Se i campioni sono stati inoculati in serie duplicate e una o due piastre, inoculate con la stessa diluizione,
contengono colonie, per ottenere il numero di CFU/mL calcolare la media del numero di colonie e
moltiplicarla per il reciproco del fattore di diluizione.
Se nessuna piastra contiene da 10 a 300 colonie e tutte le piastre contengono più di 300 colonie, contare
quelle meno affollate. Se contengono meno di 10 colonie/cm², conteggiare 12 quadrati di 1 cm2 e
moltiplicare la media per 56 (l’area di una piastra del diametro di 90 mm); se le colonie sono più affollate,
conteggiare 4 quadrati di 1 cm2 e moltiplicare la media per 56. Esprimere i risultati come “CFU/mL stimate”.
Esprimere i risultati come TNTC (Troppo numerose per poterle contare) solo in assenza di ogni alternativa.
Se le uniche piastre contenenti colonie ne contengono meno di 10, ma almeno 4, calcolare il risultato come
nel caso generale e indicarlo come “CFU/mL stimate”.
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Se il totale è compreso tra 3 e 1, la precisione del risultato è troppo bassa e occorre riportarlo come “(i
micro-organismi cercati) sono presenti, ma meno di 4 × d CFU/mL”.
Se le piastre di tutte le diluizioni di un qualsiasi campione non presentano colonie, riferire il risultato come
“meno di 1/d CFU/mL”, ma non escludere la possibile presenza di inibitori nel campione.
Nel caso in cui si applica la tecnica di filtrazione su membrana, esprimere i risultati rispetto alla quantità di
liquido filtrata, per esempio CFU/bottiglia, CFU/100 mL o CFU/10 mL.
6.1.9 Incertezza della misura
6.1.9.1 Criteri di controllo dei risultati.
Per ciascuna serie di terreni di coltura, una piastra è usata come controllo di sterilità dopo la
sterilizzazione. Una piastra per ogni terreno di coltura usato durante i test è lasciata aperta sotto la
cappa a flusso laminare durante tutte le operazioni, come controllo di sterilità dell’ambiente di lavoro.
Tale piastra sarà incubata come quelle inoculate.
Periodicamente, un campione è inoculato in doppio e il Kp sperimentale si calcola con la seguente
equazione:
Kp 
| C1  C 2 |
C1  C 2
dove C1 e C2 sono i risultati dei due conteggi.
Se Kp < 1,96 ≈ 2,0 i risultati sono accettabili: la media dei due conteggi può essere usata come
risultato.
Se 2,0<Kp ≤ 2,576 ≈ 2,6 la differenza dei due conteggi è critica e deve essere attentamente valutata
prima di accettare i risultati come media dei due conteggi.
Se Kp >2,6 la differenza dei due conteggi è anomala. Il risultato va scartato e occorre ripetere il test. In
tal caso, il responsabile del laboratorio deve esaminare tutti i risultati ottenuti dopo gli ultimi accettabili.
6.1.9.2 Incertezza della misura
Se il numero delle colonie contate nella piastra conteggiabile è inferiore a 10, il risultato è accettabile, ma si
considera che la popolazione delle colonie segua la distribuzione di Poisson. La tabella seguente riporta il
livello di confidenza del 95%, e pertanto l’incertezza della misura, del conteggio stimato su una singola
scatola di Petri.
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Numero di
colonie
Limite di confidenza al 95%
Errore percentuale del limite*
Inferiore
Superiore
Inferiore
1
<1
6
-97
2
<1
7
-88
3
<1
9
-79
4
1
10
-73
5
2
12
-68
6
2
13
-63
7
3
14
-60
8
3
16
-57
9
4
17
-54
10
5
18
-52
11
6
20
-50
12
6
21
-48
13
7
22
-47
14
8
24
-45
15
8
25
-44
* Rispetto al conteggio dei micro-organismi (1ª colonna)
Superiore
457
261
192
156
133
118
106
97
90
84
79
75
71
68
65
Se il conteggio delle colonie è >10, il limite di confidenza a un livello p di probabilità si calcola con la
seguente equazione:
C = Ci  Kp √Ci,
dove Ci è il numero di colonie sulla piastra e Kp è il fattore di copertura. Il fattore di copertura è di solito
2 o 1,96. Il valore C è calcolato su ogni piastra e moltiplicato per il numero di diluizioni, insieme al
risultato del conteggio.
6.2. Coltura in terreno di coltura liquido – “Numero più probabile” (MPN).
6.2.1 Obiettivo
Questa tecnica serve a valutare il numero di micro-organismi vitali nei vini a elevato contenuto di
particelle solide in sospensione e/o a elevata incidenza di tampone.
6.2.2 Principio
Questa tecnica si basa sulla stima del numero di micro-organismi vitali in un terreno di coltura liquido,
partendo dal principio della sua normale distribuzione nel campione.
6.2.3 Diluenti e terreni di coltura liquidi (Allegati 4 e 5)
6.2.4 Procedura
Si preparano parecchie soluzioni quantitative e successive; dopodiché, dopo l’incubazione, una certa
percentuale di test non porterà ad alcun accrescimento (test negativi), mentre altri inizieranno a
presentare accrescimento (test positivi). Se il campione e le diluizioni sono omogenei e se il numero di
diluizioni è sufficientemente elevato, i risultati possono essere elaborati statisticamente, utilizzando
opportune tabelle (tabelle basate cui calcoli di probabilità di McCrady), ed estrapolati al campione
iniziale.
6.2.5 Preparazione delle diluizioni
1
Partendo da un campione di vino omogeneizzato, preparare una serie di diluizioni decimali ( /10) nel
diluente.
Prendere 1 mL di vino e aggiungerlo a 9 mL di diluente nella prima provetta. Omogeneizzare. Prendere
1 mL di questa diluizione e aggiungerla a 9 mL di diluente nella seconda provetta. Continuare seguendo
questo protocollo di diluizione fino all’ultima diluizione adatta, in base alla popolazione microbica
presunta, servendosi di pipette sterilizzate per ogni diluizione. Le diluizioni devono essere eseguite fino
all’estinzione, cioè all’assenza di sviluppo nelle diluizioni più basse (Allegato 2).
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6.2.6 Preparazione delle inoculazioni
Inoculare 1 mL di vino e 1 mL di ciascuna delle diluizioni preparate, mescolati al momento,
rispettivamente in 3 provette contenenti l’opportuno terreno di coltura (Allegato 5). Mescolare
accuratamente.
Incubare le provette inoculate nell’incubatore a 25°C per i lieviti (3 giorni, fino a 10 giorni), in
condizioni aerobiche e, per i batteri lattici, in condizioni anaerobiche o microaerofile (8 giorni, fino a 10
giorni), eseguendo osservazioni periodiche fino all’ultimo giorno di incubazione.
6.2.7 Risultati
Tutte le provette che presentano uno sviluppo microbico sotto forma di deposito biancastro, più o meno
evidente e/o con un più o meno marcato disturbo, si considerano positive. I risultati devono essere
confermati tramite osservazione al microscopio. Indicare il periodo di incubazione.
La lettura delle provette si effettua annotando il numero di provette positive o negative in ogni
combinazione di tre provette (per ogni diluizione). Per esempio, “3-1-0” significa: 3 provette positive
nella diluizione 100 (vino), 1 nella diluizione 10-1 e zero nella diluizione 10-2.
Per un numero di diluizioni superiore a 3, solo 3 di questi risultati sono significativi. Per scegliere i
risultati che permettono di determinare il “MPN”, occorre determinare il “numero tipico” sulla base degli
esempi riportati nella seguente tabella:
Tabella
Numero di provette positive per ciascuna diluizione
Esempio
10
3
3
3
3
3
3
2
0
10
3
3
2
0
2
2
2
1
10
3
2
1
1
2
1
2
0
10
1
0
0
0
1
1
2
0
10
0
0
0
0
0
0
0
0
Numero tipico
3-1-0
3-2-0
3-2-1
3-0-1
3-2-3
3-2-3
3-2-2
2-2-2
0-1-0
a
a
a
a
b
b
c
d
Esempio a: prendere la diluizione maggiore per la quale tutte le provette sono positive e le
due successive.
Esempio b: se un risultato positivo spicca per una diluizione maggiore rispetto all’ultima
scelta, è necessario aggiungerlo a questa.
Esempio c: se nessuna diluizione fornisce tre provette positive, prendere le diluizioni
corrispondenti alle ultime tre provette positive.
Esempio d: caso in cui il numero di provette positive è molto ridotto, scegliere il numero
tipico affinché la diluizione positiva occupi la riga delle decine
Adattato da Bourgeois, C.M. e Malcoste, R. in : Bourgeois, C.M. et Leveau, J.Y. (1991).
Calcolo del Numero più probabile (MPN)
Tenendo conto del numero tipico ottenuto, il MPN si determina tramite la Tabella A (Allegato 3) basata
sui calcoli di probabilità di McCrady, considerando la diluizione effettuata. Se la serie delle diluizioni è
100 ; 10-1 ; 10-2, la lettura è diretta. Se la serie delle diluizioni è 101; 100; 10-1, la lettura è pari a 0,1
volte questo valore. Se la serie delle diluizioni è 10-1; 10-2; 10-3, la lettura è pari a 10 volte questo
valore.
Nota:
Se occorre aumentare la sensibilità, si può usare una concentrazione 101 del vino. Per ottenere questa
concentrazione di micro-organismi in 1 mL, centrifugare 10 mL di vino, prelevare 1 mL di deposito
(dopo avere prelevato 9 mL di liquido in eccesso) e inoculare secondo il metodo precedentemente
descritto.
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Il contenuto di micro-organismi del vino deve essere espresso in cellule per mL, in notazione scientifica
con una cifra decimale. Se il contenuto è inferiore a 1,0 cellule per mL, il risultato deve essere
presentato come “<1,0 cellule/mL”.
(Vedere gli allegati nelle pagine seguenti)
7. BIBLIOGRAFIA
ISO 4833:2003. Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Terreno di coltura
orizzontale per il conteggio dei micro-organismi – Tecnica di conteggio delle colonie a 30°C.
ISO 7218:2007 – Microbiologia degli alimenti e del mangime per animali – Regole generali degli
esami microbiologici.
ISO 7667:1983. Microbiologia – Schema standard per i metodi di esame microbiologico.
-
Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills and L. F. Bisson. 2001. Use of WL
medium to profile native flora fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203;
-
A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica di mosti e vini.
Vignevini, 9-1992 17-20.ANDREWS, W. et MESSER, J. (1990). Microbiological Methods. in: AOAC
Official Methods of Analysis, 15th edition, 1, 425-497, Association of Analytical Chemist, Washington.
BIDAN, P. (1992). Analisi microbiologiche del vino. F.V. O.I.V. nº 910, Parigi.
BOURGEOIS, C.M. et LEVEAU, J.Y. (1991). Techniques d'analyse et de contrôle dans les
industries agro alimentaires, 2ème édition, 3. Le Contrôle Microbiologique Lavoisier, Tec. & Doc., APRIA
Ed. Paris.
CARR, J. G. (1959). Acetic acid bacteria in ciders. Ann. Rep. Long Ashton Res. Sta., 160.
DE MAN, J. C. (1975). The probability of most probable number. European Journal of Applied
Microbiology, 1, 67-78.
LAFON-LAFOURCADE, S. et al. (1980). Quelques observations sur la formation d'acide acétique
par les bactéries lactiques. Conn. Vigne Vin, 14, 3, 183-194.
MAUGENET, J. (1962). Les Acétobacter du cidre. Identification de quelques souches. An.
Technol. Agric., 11, 1, 45-53.
PLARIDIS et LAFON-LAFOURCADE, S. (1983). Controllo microbiologico dei vini. Boll. O.I.V.,
618, 433-437, Parigi.
RIBÉREAU-GAYON, J. et PEYNAUD, E. (2004). Traité d'Oenologie, Tome 2, Librairie
Polytechnique CH. Béranger, Paris et Liège.
Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1976). 14th edition,
American Public Health Association, Incorporated, New York.
Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1985). 16th edition,
American Public Health Association, DC 20005, Washington.
VAZ OLIVEIRA, M., BARROS, P. e LOUREIRO, V. (1995). Analisi microbiologica del vino. Tecnica
delle provette multiple per il conteggio dei micro-organismi nei vini – «Numero più probabile" (MPN),
F.V. O.I.V. n° 987, Parigi.
VAZ OLIVEIRA, M., e LOUREIRO, V. (1993). Il conteggio dei micro-organismi nei vini con indice
di colmatura elevato, Resoconto dei lavori del gruppo di esperti "Microbiologia del Vino" dell'O.I.V., 12ª
sessione, allegato 2, Parigi.
VAZ OLIVEIRA, M., e LOUREIRO, V. (1993). Il conteggio dei micro-organismi nei vini con indice
di colmatura elevato, 2ª parte, Doc. di lavoro del gruppo di esperti "Microbiologia del Vino" dell'O.I.V.,
13ª sessione, Parigi.
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Allegato 1
Preparazione di diluizioni e inoculi
Diluizione
Campione
Diluizione ottenuta
Inoculo delle piastre
Quantità di campione
Allegato 2
Preparazione di diluizioni e inoculi
Campione
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Allegato 3 - (ENO 8/95)
Tabella A
«Numero più probabile» (MPN) per 1 mL di campione utilizzando 3 provette
con 1 mL, 0,1 mL e 0,01 mL
Provette positive
1
mL
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
0,1
mL
0
0
1
1
2
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0,01
mL
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
Provette positive
MPN
1 mL
0,0
0,3
0,3
0,6
0,6
0,4
0,7
1,1
0,7
1,1
1,1
1,5
1,6
0,9
1,4
1
mL
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
0,1
mL
0
1
1
1
2
2
2
2
3
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3
0
0
0
1
0,01
mL
2
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
Provette positive
MPN
1 mL
2,0
1,5
2,0
3,0
2,0
3,0
3,5
4,0
3,0
3,5
4,0
2,5
4,0
6,5
4,5
1
mL
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0.1
mL
1
1
1
2
2
2
2
3
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3
0,01
mL
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
MPN
1 mL
7,5
11,5
16,0
9,5
15,0
20,0
30,0
25,0
45,0
110,0
>140,0
Adattamento da “Metodi standard di esame dell’acqua e delle acque reflue” (1976).
Allegato 4
Diluenti:
I diluenti sono indicati a titolo di esempio. Si deve usare acqua distillata, bidistillata o deionizzata, senza
tracce di metalli, inibitori o altre sostanze antimicrobiche.
1. Soluzione fisiologica
Preparazione: Pesare 8,5 g di cloruro di sodio in una beuta tarata da 1000 mL. Dopo il suo scioglimento
nell’acqua, regolare il volume di riferimento. Mescolare accuratamente. Filtrare. Distribuire 9 mL nelle
provette per il test. Chiudere con cotone cardato e mettere in autoclave per 20 minuti a 121°C.
2. Soluzione di Ringer 1/4
Preparazione: Pesare 2,250 g di cloruro di sodio, 0,105 g di cloruro di potassio, 0,120 g di cloruro di
calcio (CaCl2.6H2O) e 0,050 g di idrogenocarbonato di sodio in una beuta tarata da 1000 mL. Dopo lo
scioglimento in acqua, portare a livello. Mescolare accuratamente. Distribuire 9 mL nelle provette per il
test. Chiudere con cotone cardato e mettere in autoclave per 15 minuti a 121°C. (Questa soluzione è
disponibile in commercio)
3. Acqua peptonata
Preparazione: Pesare 1g di peptone in una beuta tarata da 1000 mL. Dopo il suo scioglimento
nell’acqua, regolare il volume di riferimento. Mescolare accuratamente. Distribuire 9 mL nelle provette
del test. Chiudere con cotone cardato e mettere in autoclave per 20 minuti a 121°C.
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Allegato 5
Terreni di coltura
I terreni di coltura e gli antimicrobici sono indicati a titolo di esempio.
Si deve usare acqua distillata, bidistillata o deionizzata, senza tracce di metalli, inibitori o altre sostanze
antimicrobiche.
1. Terreni di coltura solidi
Salvo diverse indicazioni, il pH di tutti i terreni di coltura deve essere regolato a pH 5,5 – 6,0
1 TERRENI DI COLTURA PER IL CONTEGGIO DEI LIEVITI
1.1 YM
Glucosio
50 g
Peptone
5g
Estratto di lievito
3g
Estratto di malto
3g
Agar-agar
20 g
Acqua: fino a
1000 mL
Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare l’accrescimento batterico e 150 mg di
difenile per eliminare l’accrescimento delle muffe.
1.2 YEPD
Glucosio
20 g
Peptone
20 g
Estratto di lievito
10 g
Agar-agar
20 g
Acqua: fino a
1000 mL
Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare l’accrescimento batterico e 150 mg di
difenile per eliminare l’accrescimento delle muffe.
1.3 Agar nutriente WL
Glucosio
Peptone
Estratto di lievito
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)
Cloruro di potassio (KCl)
Cloruro di calcio (CaCl2)
Solfato di magnesio (MgSO4)
Cloruro ferrico (FeCl3)
Solfito di manganese (MnSO4)
Verde di bromocresolo
Agar batteriologico
Acqua: fino a
pH
50 g
5g
4g
0,55 g
0,425 g
0,125 g
0,125 g
0,0025 g
0,0025 g
0,022 g
12 g
1000 mL
5.5
L’agar differenziale WL si ottiene aggiungendo 4 mg/l di cycloheximide all’Agar nutriente WL. Se
necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare la crescita batterica.
1.4 Agar lisina ASBC
Soluzione A:
Base di carbonio del lievito
2,35 g
Acqua: fino a
100 mL
Sterilizzare con filtrazione a membrana
Soluzione B:
Lisina HCl
0,5 g
Agar-agar
4g
Acqua: fino a
100 mL
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Sterilizzare per 20 minuti a 121°C.
Se necessario, aggiungere 100 mg di cloramfenicolo per eliminare la crescita batterica.
2 TERRENI DI COLTURA PER CONTEGGIO BATTERI LATTICI
2.1 M.R.S. + succo di pomodoro (o di mela).
Glucosio
20 g
Peptone
10 g
Estratto di carne bovina
8g
Estratto di lievito
4g
Fosfato di potassio dibasico (KH2PO4)
2g
Acetato di sodio · 3H2O
5g
Citrato di ammonio
2g
Solfato di magnesio  6H2O
0,2 g
Solfato di manganese  4H2O
0,05 g
"Tween 80"
1 mL
Agar-agar
12 g
Succo di pomodoro (o di mela, o d’uva)
200 mL
Acqua per fare
1000 mL
Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire
l’accrescimento dei lieviti, immediatamente prima dell’uso.
2.2 Agar al succo di pomodoro
Succo di pomodoro (estratto secco da 400 mL) 20 g
Peptone
10 g
Latte peptonizzato
10 g
Agar-agar
14 g
Acqua: fino a
1000 mL
pH
6.1
2.3 Terreno di coltura ATB modificato, o terreno di coltura Oenococcus oeni (in precedenza terreno di
coltura Leuconostoc oenos)
Soluzione A:
Glucosio
Estratto di lievito
Peptone
Solfato di magnesio
Solfato di manganese
Succo di pomodoro (o di mela, o d’uva)
Agar-agar
Acqua
Sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 121°C.
10 g
5g
10 g
0,2 g
0,050 g
250 mL
12 g
750 mL
Soluzione B:
Cisteina HCl
1g
Acqua: fino a
100 mL
pH
4.8
Sterilizzare con filtrazione a membrana
Aggiungere 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire l’accrescimento dei lieviti, immediatamente
prima dell’uso.
Aggiungere 1 mL di soluzione B a 20 mL di soluzione A al momento dell’uso
2.4 Terreno di coltura di Lafon-Lafourcade
Glucosio
20 g
Estratto di lievito
5g
Estratto di carne bovina
10 g
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Peptone
10 g
Acetato di sodio
5g
Citrato triammonico
2g
0,2 g
0,05 g
"Tween 80"
1 mL
Agar-agar
20 g
Acqua: fino a
1000 mL
pH
5.4
2.5 Terreno di coltura di Dubois (Terreno di coltura 104)
Succo di pomodoro
250 mL
Estratto di lievito
5g
Peptone
5g
Acido malico
3g
0,05 g
0,05 g
Agar-agar
20 g
Acqua: fino a
1000 mL
pH
4.8
2.6 MTb.
Glucosio
15 g
Polvere Lab-Lemco (Oxoid)
8g
Caseina idrolizzata
1g
Estratto di lievito
5g
Succo di pomodoro
20 mL
Acetato di sodio
3g
Citrato di ammonio
2g
Acido malico
6g
Solfato di magnesio
0,2 g
Solfato di manganese
0,035 g
"Tween 80"
1 mg
TC Vitamins Minimal Eagle, 100x (BD-Difco)
10 mL*
pH (con KOH)
5.0
Acqua per fare
1000 mL
* aggiungere dopo la sterilizzazione.
3 TERRENI DI COLTURA PER CONTA BATTERI ACETICI
3.1 GYC
Glucosio
50 g
Estratto di lievito
10 g
Carbonato di calcio (CaCO3)
3g
Agar
25 g
Acqua: fino a
1000 mL
Aggiungere dopo il passaggio in autoclave 100mg / L di natamicina (pimaricina) per inibire lo sviluppo
dei lieviti, nonché 12,5 mg/L di pennicillina per eliminare la crescita dei batteri lattici immediatamente
prima dell’uso.
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3.2 Terreno di coltura G2
Estratto di lievito
1,2 g
Fosfato di ammonio
2g
Succo di mela
500 mL
Agar
20 g
Acqua: fino a
1000 mL
pH
5.0
l’accrescimento dei lieviti, nonché 12,5 mg/L di pennicillina per eliminare la crescita dei batteri lattici
immediatamente prima dell’uso.
3.3 Terreno di coltura di Kneifel
Estratto di lievito
30 g
Etanolo
20 mL*
Agar
20 g
Verde di bromocresolo 2,2%
1 mL
Acqua: fino a
1000 mL
* da aggiungere dopo la sterilizzazione.
l’accrescimento dei lieviti, nonché 12,5 mg/L di pennicillina per eliminare la crescita dei batteri lattici
immediatamente prima dell’uso.
Colonie blu: Acetobacter, Gluconacetobacter
Colonie verdi: Gluconobacter
4 TERRENI DI COLTURA PER IL CONTEGGIO DELLE MUFFE
4.1 Czapek-Dox, Modificato
Saccarosio
30 g
3g
NaNO3
1g
K2HPO4
0,5 g
MgSO4
KCl
0,5 g
0,01g
FeSO4
Agar
15 g
pH finale (a 25°C) 7,3 ± 0,2
Aggiungere 10 mg/l di cycloheximide per eliminare l’accrescimento dei lieviti (l’accrescimento dei lieviti
resistenti al cycloheximide è di norma più lento dell’accrescimento delle muffe).
Nota: Questo terreno di coltura permette solo l’accrescimento delle muffe che si sviluppano con nitrati.
Aggiungere tetraciclina (100 mg/l) e streptomicina (100 mg/l) per eliminare l’accrescimento dei batteri.
4.2 Agar Dichloran Rosa Bengala Cloramfenicolo (DRBC Agar)
Glucosio
10 g
Peptone
5g
1g
KH2PO4
0,5 g
MgSO4
Rosa Bengala
0,025 g
Dicloran (2,6 dicloro-4-nitroanilina)
0,002g
Soluzione di cloramfenicolo (0,1 g/10 mL)*
10 mL
Agar
15 g
pH finale (a 25°C)
5,6 ± 0,2
* Da aggiungere dopo la sterilizzazione.
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4.3 Agar all’estratto di malto (MEA)
Glucosio
20 g
Estratto di malto
20 g
Peptone
5g
Agar
15 g
pH finale (a 25°C)
5,5 ± 0,2
Aggiungere tetraciclina (100 mg/l) e streptomicina (100 mg/l) per eliminare l’accrescimento dei batteri.
2. Terreni di coltura liquidi
2.1. Per lieviti
Terreno di coltura YEPD (estratto di malto, peptone, destrosio) + cloramfenicolo
Preparazione: Pesare 10,0 g di estratto di lievito (Difco o equivalente), 20 g di peptone, 20 g di glucosio
e 100 mg di cloramfenicolo. Sciogliere, portare al volume di 1000 mL con acqua e mescolare.
Distribuire porzioni di 5 mL di questo terreno di coltura nelle provette dei test e passare in autoclave
per 15 minuti a 121°C.
2.2. Per i batteri lattici
Terreno di coltura MTJ (50% terreno di coltura MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth" + 50%
terreno di coltura TJB "Tomato Juice Broth") + actidione
Preparazione: Pesare 27,5 g di MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth" (Difco o equivalente).
Aggiungere 500 mL di acqua, scaldare fino all’ebollizione per consentire il completo scioglimento e
aggiungere 20,5 g di TJB "Tomato Juice Broth" (Difco o equivalente). Aggiungere 50 g di actidione.
Sciogliere in acqua per ottenere 1000 mL di soluzione, correggendo prima il pH a 5 con 1N di acido
cloridrico e mescolare.
Distribuire porzioni di 10 mL di questo terreno di coltura3) nelle provette e passare in autoclave per 15
minuti a 121°C.
3) Si usa un volume di 10 mL, invece del volume di 5 mL come per i lieviti, a causa della maggiore sensibilità
all’ossigeno dei batteri dell’acido lattico.
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ALLEGATO 6: RICONOSCIMENTO DI MICRO-ORGANISMI SPECIFICI
6.1 Riconoscimento delle colonie di lieviti su Agar nutriente WL.
L’uso di questo terreno di coltura non costituisce un metodo di identificazione delle specie, ma può
fornire ai laboratori non specializzati un metodo rapido ed economico per predire il genus dei lieviti vitali
e adatti alla coltura. Dopo un’incubazione di 4 giorni, valutare la morfologia delle colonie come segue
(Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills and L. F. Bisson. 2001. Use of WL
medium to profile native flora fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203;
A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica di mosti e vini. Vignevini, 91992 17-20):
-
Saccharomyces spp.: Le colonie crescono bene in 4 giorni sull’Agar nutriente WL, presentando
colonie circolari di colore dal crema al verde pallido. Diverse sfumature di colore non indicano
necessariamente la presenza di ceppi diversi, ma la presenza di alcuni mutanti; le colonie si presentano
umbonate, con superficie regolare e uniforme, la consistenza è burrosa. Non cresce sull’Agar lisina.
-
lisina.
Torulaspora spp.: le colonie sono simili a quelle del Saccharomyces spp. Cresce sull’Agar
-
Hanseniaspora spp. (Kloeckera spp.) Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando
colonie verde scuro opaco, regolari e burrose. Cresce sull’Agar lisina e sull’Agar differenziale WL.
-
Candida stellata Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie verde pisello,
regolari e burrose che, con il tempo, si scuriscono al centro. Cresce sull’Agar lisina.
Saccharomycodes spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie verde
chiaro convesse, regolari e burrose. Cresce dull’Agar lisina e non sull’Agar differenziale WL.
Nota: le sue cellule, viste al microscopio, sono molto grandi (fino a 25 m).
-
Schizosaccharomyces pombe Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie
verde scuro, di dimensioni puntiformi, regolari e burrose. Cresce sull’Agar lisina.
Nota: le sue cellule sono facilmente riconoscibili al microscopio a causa della tipica divisione di scissione.
-
Rhodotorula spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie burrose con
superficie rosa scuro, regolare e mucosa. Cresce sull’Agar lisina.
-
Metschnikowia spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando piccole colonie
chiare, regolari e burrose. Nel terreno di coltura sotto le colonie si diffonde un pigmento rossastro.
Cresce sull’Agar lisina.
-
Pichia membranifaciens Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando colonie
convesse scabre e polverose di tonalità grigiastre o bluastre. Cresce sull’Agar lisina.
Pichia anomala (in precedenza Hansenula anomala) cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni,
presentando colonie di colore crema o bluastro, nettamente bluastro dopo 8 giorni. Le colonie sono
circolari, la superficie è regolare e la consistenza è burrosa, ma qualche volta nettamente mucosa.
Cresce sull’Agar lisina.
-
Dekkera spp. o Brettanomyces spp. Cresce sull’Agar nutriente WL in 8 giorni, presentando
piccole colonie a forma di cupola, di colore crema, regolari e burrose. Produce grandi quantità di acido
acetico, nettamente percepibile all’olfatto, che rende giallo il terreno di coltura. Cresce sull’Agar lisina e
sull’Agar differenziale WL. La crescita su quest’ultimo terreno di coltura permette di distinguerlo dallo
Zygosaccharomyces bailii.
Nota: una conferma è possibile con l’esame microscopico: il Dekkera presenta cellule piccole, alcune
delle quali dalla tipica sagoma ogivale.
-
Zygosaccharomyces bailii Cresce sull’Agar nutriente WL in 4 giorni, presentando piccole
colonie circolari, di colore crema, regolari e burrose. Cresce sull’Agar lisina, ma non sull’Agar
differenziale WL. Intorno alle colonie giovani è spesso presente un alone giallastro.
Nota: quando cresce sul vino imbottigliato, produce grappoli marrone di 0,5-1 mm. Le sue cellule non
hanno forma ogivale.
-
Batteri acetici crescono sull’Agar nutriente WL in colonie piccole o puntiformi verde scuro e
brillanti, fortemente positive al test di catalasi. (Nota: Questo terreno di coltura non è adatto al loro
conteggio).
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-
Batteri lattici crescono sull’Agar nutriente WL in 10 giorni in colonie puntiformi chiare negative
alla catalasi. (Nota: Questo terreno di coltura non è adatto al loro conteggio).
6.2 Riconoscimento delle colonie di batteri lattici.
Le colonie di LAB hanno dimensioni da puntiformi a qualche mm e sono traslucide. Sono Gram-positive
e catalasi-negative. Oenococcus oeni crescono in brevi catene, i pediococchi formano tetradi e i
diplococchi e i lactobacilli formano bacilli lunghi o corti.
6.3 Riconoscimento delle colonie di batteri acetici.
Le colonie di AAB sono catalasi-positive e Gram-negative e sono forti produttrici di acido: questo può
essere rilevato dalla zona chiara del terreno di coltura intorno alle loro colonie, contenente carbonato di
calcio, o da un diverso colore se il terreno di coltura contiene un indicatore di pH. Le loro cellule sono
cocchi o bacilli, di solito un leggermente più grandi dei LAB.
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Esemplare certificato conforme Tbilisi, il 25 giugno 2010 Il

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