Indagine sulla infertilita` maschile nel territorio del

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UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA
FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca"
SIMONA MALACRIA
INDAGINE SULLA INFERTILITA’ MASCHILE NEL
TERRITORIO DEL RAGUSANO DETERMINATA
DALL’IMPIEGO DI FITOFARMACI IN AGRICOLTURA
Tesi di laurea in Biologia dello Sviluppo
Relatrice:
CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO
Correlatore:
DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA
ANNO ACCADEMICO 2004-05
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA
FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca"
INDAGINE SULLA INFERTILITA’ MASCHILE NEL
TERRITORIO DEL RAGUSANO DETERMINATA
DALL’IMPIEGO DI FITOFARMACI IN AGRICOLTURA
Si ringrazia il Centro Aster di Diagnosi e Cura della
Sterilità presso la Clinica del Mediterraneo di Ragusa
nelle persone del Dott. Giovanni Bracchitta e del
Dott. Nunzio Minniti per l’ospitalità dimostrata e le
informazioni ricevute
Relatrice:
CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO
Correlatore:
DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA
ANNO ACCADEMICO 2004-05
Indice
Premessa …………...………………………………………. Pag. 1
Introduzione ……….………………………………………. Pag. 2
Apparato genitale femminile ……………………….. Pag. 2
Apparato genitale maschile ……………………….... Pag. 3
Ciclo vitale della cellula ………………………….… Pag. 8
La riproduzione sessuata …………………………… Pag. 11
- Ovogenesi ……………………………….……... Pag. 13
- Spermatogenesi …………………………….…. Pag. 16
- Anomalie della spermatogenesi e sterilità ……. Pag. 25
L’agricoltura nella provincia di Ragusa …………….. Pag. 28
- Intossicazioni acute da fitosanitari ……………. Pag. 31
- Intossicazioni croniche da fitosanitari ………… Pag. 35
Materiali e Metodi ………………………………………… Pag. 36
Esame del liquido seminale ………………………… Pag. 36
Tecniche di procreazione medicalmente assistita .….. Pag. 45
- Inseminazione intrauterina ………………….…. Pag. 46
- Fertilizzazione in vitro …………………………. Pag. 48
- ICSI ……………………………………….……. Pag. 49
Crioconservazione dei gameti maschili …………….. Pag. 62
- Indicazioni cliniche ……………………….……. Pag. 63
- Tecnica di congelamento ……………………….. Pag. 63
- Tecnica di scongelamento ……………….……... Pag. 66
Risultati e Discussione …………………………….………. Pag. 68
Fertilità nei serricoltori …………………….……….. Pag. 68
- Confronto dati sull’infertilità …………...……….. Pag. 70
- Gruppo di controllo ………………….…………. Pag. 71
Motilità post congelamento …………….…………... Pag. 72
Conclusione ………………………………………………… Pag. 77
Allegati ……………………………………………….…….. Pag. I
Decreto 21 febbraio 2005 …………………….…….. Pag. I
Legge 19 febbraio 2004, n. 40 ……………….……... Pag. IX
Pazienti recatisi al centro nell’anno 2004/2005 …….. Pag. XX
Gruppo di controllo ………………………………… Pag. XXV
Liquido seminale sottoposto a congelamento ………. Pag.XXVI
Premessa
Il lavoro descritto nella presente tesi è scaturito dalla
constatazione che una consistente percentuale di lavoratori serricoli, di
sesso maschile, con alterazione dei parametri standard del liquido
seminale, si sono recati al Centro Aster di Diagnosi e Cura della
Sterilità presso la Clinica del Mediterraneo in Ragusa.
Prese in considerazione le analisi del liquido seminale effettuati
presso il Centro nell’anno 2004/2005, abbiamo appurato che esiste
una riduzione della fertilità nella suddetta categoria.
A questo punto siamo andati alla ricerca di dati sull’estensione,
nella provincia di Ragusa, delle coltivazioni agricole ed in particolare
serricole, al fine di rilevare le tipologie e i quantitativi di prodotti
chimici adoperati; ciò per verificare se tali prodotti potessero avere
influenza sulla fertilità degli operatori agricoli che ne fanno un uso
diretto.
Abbiamo, inoltre, congelato il liquido seminale di pazienti
patologici e normali, per riscontrare eventuali differenze di motilità
degli spermatozoi dopo la fase di scongelamento.
Tali informazioni danno importanti indicazioni sulla più adatta
tecnica di procreazione medicalmente assistita per questa categoria di
pazienti che, oltre ad avere alterazioni del liquido seminale,
necessitano del congelamento di quest’ultimo.
Introduzione
APPARATO GENITALE FEMMINILE
L’apparato genitale femminile è un complesso di organi, che
serve da una parte alla formazione dei gameti femminili, le uova, e
dall’altra a permettere la copula, la fecondazione dell’uovo, lo
sviluppo del prodotto della fecondazione e la sua espulsione nell’atto
del parto.
Figura 1- Apparato genitale della donna
L’apparato genitale femminile consta di due componenti:
• Un organo pari, l’ovaio detto anche gonade femminile, deputato
sia alla funzione gametogenetica (produzione di cellule uovo)
sia a quella endocrina (produzione di ormoni);
• Vie genitali, rappresentate da un lungo condotto che dalle
vicinanze dell’ovaio raggiunge la superficie esterna e in cui si
possono riconoscere tre diversi tratti: le trombe o tube del
Falloppio od ovidutti (organi pari), l’utero e la vagina (organi
impari). Quest’ultima si apre in superficie a livello di una
complessa formazione cui si dà il nome di organi genitali
esterni o vulva. Ovaio, tube, utero e vagina costituiscono per
contro, gli organi genitali interni.
APPARATO GENITALE MASCHILE
L’apparato genitale maschile consta delle seguenti strutture
fondamentali: le borse scrotali; i testicoli con i relativi epididimi; le
vie spermatiche, per mezzo delle quali gli spermatozoi raggiungono
l’organo copulatore; le formazioni annesse alle gonadi e alle vie
spermatiche, e l’organo della copulazione vale a dire il pene.
Figura 2- Sezione longitudinale del bacino maschile
I testicoli o didimi rappresentano le gonadi maschili in cui ha luogo la
formazione degli spermatozoi, cioè delle cellule sessuali maschili.
I testicoli in numero di due, di forma ovoidale, sono situati al di
sotto del pene, accolti in un sacco cutaneo, la borsa scrotale, che
mantiene tale organi ad una temperatura più bassa di quella presente
all’interno della cavità addominale.
Il testicolo è diviso in numerosi setti testicolari, i quali si
approfondano nell’organo con direzione radiale.
Figura 3- Costituzione del testicolo e dell'epididimo
I setti suddividono il parenchima testicolare in circa 250-290
lobuli, di grandezza diversa fra loro e di forma conica o piramidale.
Ogni lobulo testicolare è costituito da uno o più (fino a 4)
condottini, tubuli seminiferi, chiamati anche tubuli contorti perché
avvolti su loro stessi.
I tubuli seminiferi sono circondati da tessuto connettivo in cui
sono presenti le cellule interstiziali di Leydig che sotto l’azione
dell’LH sintetizzano, partendo dal colesterolo, ormoni androgeni
(testosterone), i quali hanno come compito principale quello di
promuovere la spermatogenesi, vasi sanguigni, vasi linfatici (assai
scarsi nell’uomo) e fibre nervose.
I tubuli contorti di una loggia testicolare convergono tutti verso
un solo tubulo, breve e rettilineo, che prende il nome di tubulo retto.
I tubuli retti che fuoriescono dalle logge testicolari si aprono in
un sistema di canalicoli tra loro anastomizzati a formare la rete testis.
La parete dei tubuli seminiferi è costituita dall’epitelio
germinativo e dalla lamina propria. Quest’ultima è separata
dall’epitelio mediante una lamina basale. L’epitelio germinativo è
costituito da cellule seminali e da cellule di sostegno e poggia sulla
lamina basale.
Le cellule seminali sono situate fra le cellule di sostegno e, nel
soggetto postpubere, si trovano in differenti stati maturativi a partire
dalle cellule più periferiche e immature, gli spermatogoni, che sono in
contatto con la lamina basale, per giungere, attraverso gli spermatociti
di I ordine e gli spermatociti di II ordine, agli spermatidi, che
occupano una posizione più centrale nel tubulo. Questi ultimi si
differenziano nei veri gameti maschili: gli spermatozoi.
Le cellule di sostegno o del Sertoli sono elementi allungati e si
estendono dalla lamina basale dei tubuli seminiferi fino al loro lume,
occupando perciò tutto lo spessore dell’epitelio germinativo.
Figura 4- Sezione trasversale di un tubulo seminifero
Dalla rete testis originano 8-12 condottini efferenti che
emergono dal margine posterosuperiore del testicolo per costituire la
testa dell’epididimo.
L’epididimo è un organo allungato, contenuto insieme al
testicolo nella borsa scrotale.
Presenta un’estremità superiore ingrossata (testa), una parte
intermedia cilindroide (corpo), e una estremità inferiore assottigliata
(coda).
La coda si spinge fino al polo inferiore del testicolo, in
corrispondenza del quale si incurva indietro e in alto per continuare
nel condotto deferente.
Vie spermatiche - Il condotto deferente origina dalla coda
dell’epididimo e termina alla base della prostata. Quindi il condotto
deferente prima di raggiungere l’uretra, riceve il condotto della
vescichetta seminale e diventa condotto eiaculatore.
Le vescichette seminali sono due piccole estroflessioni che
producono un liquido che ha la funzione di diluire lo sperma.
I
condotti eiaculatori avvolti in una guaina
fibrosa,
costituiscono la porzione terminale delle vie spermatiche.
La prostata è un voluminoso organo costituito da due lobi
laterali. È attraversata oltre che dall’uretra, anche dai dotti eiaculatori
che vi penetrano in corrispondenza della base.
Le ghiandole bulbo-uretrali di Cowper sono due piccoli
corpiccioli, piuttosto duri, posti simmetricamente a lato della linea
mediana dell’uretra. Il loro secreto è vischioso, opalino, a reazione
alcalina.
Il pene è costituito da una parte cilindroide, il corpo, e da una
parte conoide, il glande.
La struttura principale di entrambi è di tipo vascolare, ovvero è
una rete di vasi ampiamente comunicanti tra loro in cui il volume di
sangue e la rigidità della guaina di rivestimento sono le condizioni
fondamentali per la costituzione dell'erezione.
Il corpo presenta due cilindri laterali, i corpi cavernosi, avvolti
da una guaina di tessuto fibroso poco elastico, la tonaca albuginea, e
un cilindro mediano ventrale, il corpo spongioso, in cui trova posto
l'uretra.
I corpi cavernosi sono gli elementi erettili, l'uretra è il canale
per l'emissione dell'urina, pertanto connesso alla vescica, e dello
sperma, pertanto connesso ai dotti eiaculatori che raccolgono lo
sperma dalla prostata, dalle vescicole seminali e dai testicoli.
Figura 5- Sezione longitudinale e trasversale delle strutture riproduttive nel
maschio
Il glande costituisce la parte terminale del pene, utile per la sua
forma a favorire la penetrazione. La cute, con caratteri di elevata
elasticità, riveste tutto il corpo e al terzo distale (quasi al glande) si
ripiega formando il prepuzio che ricopre più o meno completamente il
glande e al cui vertice è connesso ventralmente dal frenulo o filetto.
CICLO VITALE DELLA CELLULA
La maggior parte delle cellule presenta una vita limitata nel
tempo, al termine della quale si divide in due cellule figlie che hanno
le stesse caratteristiche di quella iniziale.
Il periodo che intercorre tra una divisione e la successiva, costituisce il ciclo vitale della cellula, costituito da una regolare
successione delle fasi G1, S, G2, M.
Figura 6- Ciclo vitale di una cellula eucariotica
Come fase centrale del ciclo vitale si usa stabilire quella nella
quale la cellula duplica il proprio DNA nucleare: questa fase è detta
fase S o di sintesi.
Prima della fase S la cellula neoprodotta ha attraversato un
lungo periodo in cui ha accresciuto il citoplasma e raddoppiato il
proprio volume: questo periodo si chiama fase G1 (G sta per "gap" o
intervallo prima della fase S). La fase G1 è contraddistinta da attivi
fenomeni trascrizionali a livello del DNA e da sintesi proteiche nel
citoplasma.
Dopo la fase G2 la cellula è pronta per dividersi; entra nella
fase M (mitosi). La mitosi o divisione indiretta o cariocinesi si attua
attraverso quattro fasi: profase, metafase, anafase, telofase.
Figura 7- Mitosi in una cellula animale
Nel mondo animale le cellule che entrano in divisione mitotica
sono quelle somatiche, generalmente diploidi (2n): ciascuna di esse
produce due cellule figlie con 2n cromatidi (o cromosomi figli). Il
processo è altamente conservativo.
LA RIPRODUZIONE SESSUATA
Nella maggior parte degli animali e anche nell'uomo la
riproduzione sessuata presuppone il differenziamento di una
popolazione di cellule, detta linea germinale, i cui elementi sono
destinati a trasmettere ai discendenti le caratteristiche dell'individuo
diventando gameti. I gameti maschili sono gli spermatozoi, quelli
femminili sono le ovocellule.
I gameti dei due sessi, sono morfologicamente e funzionalmente
diversi, tuttavia essi hanno in comune una caratteristica fondamentale,
quella di essere aploidi, cioè di contenere, un numero di cromosomi
ridotto a metà (numero aploide n).
Ciò fa sì che, quando al momento della fecondazione il gamete
maschile e quello femminile si fondono, si ricostituisca nello zigote il
numero diploide (2n) di cromosomi, tipico di tutte le cellule somatiche
della specie.
Il processo durante il quale le cellule germinali riducono a metà
il loro corredo cromosomico è detto meiosi.
La divisione meiotica consta di due successive divisioni
nucleari precedute da una sola duplicazione del materiale genetico
(una sola fase S). Per questo, la quantità di DNA risulta dimezzata
nei gameti maturi.
Le due divisioni della meiosi si chiamano prima e seconda
divisione
meiotica.
Ognuna
si
può
suddividere
in
stadi
corrispondenti a quelli tipici della mitosi: profase, metafase, anafase
e telofase.
Figura 8- Stadi della meiosi di una cellula animale
Nella gametogenesi maschile i quattro nuclei vengono
contenuti in quattro cellule distinte che si differenziano in
spermatozoi.
Nella gametogenesi femminile invece uno solo dei nuclei
diventa il nucleo dell'ovocito, gli altri vengono espulsi insieme con
una piccola quantità di citoplasma in due o tre piccole cellule
abortive che sono dette globuli polari e che restano addossate
all'ovocito. Ciò ha il significato di non suddividere il citoplasma
del1'ovocito, la cui organizzazione è di fondamentale importanza
per il successivo sviluppo dello zigote.
Le cellule progenitrici delle cellule germinali (linea germinale)
si segregano molto precocemente da quelle dalle quali deriveranno le
cellule somatiche (linea somatica).
Una volta giunte nel territorio della gonade le cellule germinali,
dopo un periodo di quiescenza più o meno lungo, iniziano il loro
differenziamento in senso maschile o femminile.
I gameti dopo che hanno iniziato il loro differenziamento
sessuale, nella donna e nell’uomo, vanno incontro a processi ben
diversi, che si chiamano, rispettivamente, ovogenesi e spermatogenesi.
OVOGENESI
Dalla 9a settimana di sviluppo embrionale poche centinaia di
cellule germinali primordiali abbandonano il sacco vitellino e si
accrescono rapidamente per mitosi durante la loro migrazione verso le
creste genitali e, continuano a proliferare, durante la colonizzazione
delle gonadi, dove iniziano a differenziarsi in ovogoni.
Dalla 12a – 13a settimana, gli ovogoni proliferanti si
localizzano nella corticale profonda dell'ovaio, iniziando il loro
differenziamento in ovociti.
Immediatamente dopo la loro differenziazione gli ovociti
primari replicano il loro DNA, entrano nella profase della prima divisione meiotica, aumentano di dimensione e si arrestano allo stadio di
diplotene, fase nella quale possono restare anche per 40-50 anni.
Figura 9- Ovogenesi
Gli ovogoni e gli ovociti sono circondati da uno strato di cellule
appiattite, derivate dalle cellule somatiche del blastema ovarico.
Queste cellule, proliferando attivamente e intromettendosi tra le
cellule germinali, le racchiudono, alla fine, in una rudimentale
struttura prefollicolare, contenente spesso più di una cellula germinale.
Queste cellule prefollicolari continuano a circondare le cellule
germinali che sono tutte prossime a divenire ovociti, anche quando i
ponti intercellulari sono rimossi, e avviene una frammentazione dei
gruppi di cellule.
Con questi eventi morfologici inizia la vera follicologenesi. Il
processo della follicologenesi consiste dunque in una serie di
modificazioni strutturali progressive che conducono, attraverso gli
stadi
di
follicolo
primordiale,
follicolo
primario,
follicolo
secondario preantrale, follicolo secondario antrale e follicolo di
Graaf, al completo sviluppo del follicolo primordiale. Ciò avviene
generalmente nei feti umani alla 18a - 20a settimane di gestazione.
Al quinto mese il numero delle cellule germinali raggiunge
circa i 6-7 milioni. Durante i successivi mesi di sviluppo prenatale
avviene un'imponente riduzione di numero, dovuta ad un meccanismo
di degenerazione o di morte per apoptosi, per cui nella donna alla
nascita, nella porzione corticale di entrambe le ovaie, sono presenti
circa 1.500.000 follicoli primordiali. Molti di essi vanno incontro a
fenomeni di atresia che rappresentano il proseguimento dei fenomeni
degenerativi iniziati, come detto precedentemente, a partire dal quinto
mese di sviluppo intrauterino. Si calcola che il numero complessivo
dei follicoli primordiali all’inizio della pubertà sia di 30.000-40.000.
SPERMATOGENESI
La spermatogenesi è un processo di proliferazione e
differenziazione di cellule staminali in spermatozoi.
Osservando la sezione di un tubulo seminifero, si nota che le
cellule della linea seminale sono raggruppate in associazioni
cellulari. Le generazioni più giovani si trovano più in basso, vicino
alla membrana basale, mentre quelle più differenziate sono situate
più in alto, in vicinanza del lume del tubulo.
La spermatogenesi nell’uomo inizia nel periodo della pubertà
e si protrae fino a un'età molto avanzata.
Il processo spermatogenetico nell’uomo, dallo spermatogonio
allo
spermatozoo
maturo,
richiede
circa
72
giorni.
La
spermatogenesi si divide in tre fasi sequenziali: proliferazione degli
spermatogoni, meiosi e spermiogenesi.
Fase proliferativa
Gli spermatogoni differenziatisi dai gonociti sono indicati con
nomi diversi: gonociti di 2° tipo, prespermatogoni, spermatogoni
primitivi, spermatogoni di tipo A.
Gli spermatogoni primitivi rimangono inattivi per tutto il
periodo fetale e anche dopo la nascita, fino all'epoca della pubertà,
che nel maschio si verifica fra i 13 e i 16 anni.
In tale periodo gli spermatogoni entrano nella prima fase della
spermatogenesi, fase proliferativa, in cui gli spermatogoni primari,
che rappresentano le cellule staminali, si dividono ripetutamente per
mitosi, consentendo sia di mantenere un pool di cellule staminali, sia
di avere un rifornimento continuo di spermatogoni che, a seguito di
successive divisioni, sempre mitotiche, si avviano verso il primo passo
del processo spermatogenetico.
Gli spermatogoni secondari che derivano dalle ultime divisioni
mitotiche (spermatogoni maturi) perdono la capacità di dividersi e si
trasformeranno in spermatociti di 1 ° ordine.
Dalle mitosi degli spermatogoni primari derivano sempre
spermatogoni
liberi,
mentre
dalle
divisioni
mitotiche
degli
spermatogoni secondari derivano spermatogoni che restano uniti tra
loro da ponti citoplasmatici, per divisioni incomplete: ciò accade
perché alla divisione nucleare non segue quella citoplasmatica. Tale
condizione permane fino allo stadio di spermatidio ed è chiamata
sincizio.
Fra tutte le cellule germinali, gli spermatogoni risentono
maggiormente dell'influenza di fattori nocivi, come le radiazioni
ionizzanti, le malattie infettive, l'alcoolismo, un'alimentazione
inadeguata, sostante tossiche presenti nell’ambiente ecc.
Gli spermatogoni vengono classificati in tre tipi: tipo A scuro,
tipo A chiaro e tipo B.
Lo spermatogonio A di tipo scuro viene considerato cellula
staminale primitiva: da esso hanno origine gruppi di cellule staminali
che si rinnovano continuamente, perché la spermatogenesi possa
continuare indefinitamente, senza che si esaurisca il rifornimento di
spermatogoni.
Lo spermatogonio A di tipo chiaro è alquanto più
differenziato rispetto al tipo A scuro e dà origine al tipo B.
Gli spermatogoni di tipo B presentano nucleo sferico e molto
più piccolo rispetto ai precedenti tipi: esso contiene grosse zolle di
cromatina in vicinanza della membrana nucleare e inoltre un
evidente nucleolo situato al centro. Il citoplasma è scarsamente colorabile e contiene un numero maggiore di organuli rispetto agli
spermatogoni di tipo A.
Figura 10- Spermatogenesi
Fase meiotica
Gli spermatociti di 1 ° ordine o primari sono da principio molto
simili agli spermatogoni di tipo B dai quali derivano. Situati in un
primo tempo in prossimità della membrana basale dell'epitelio
seminifero vengono poi spinti verso l'alto dalle divisioni degli
spermatogoni.
Lo spermatocito di 1 ° ordine è ancora una cellula con corredo
cromosomico diploide. Man mano esso si accresce e, al termine della
fase di accrescimento, subisce la prima divisione meiotica (divisione
riduzionale), originando così due spermatociti di 2° ordine, aventi
ciascuno un numero aploide di cromosomi e uniti da ponti
citoplasmatici
A sua volta, i due spermatociti di 2° ordine entrano rapidamente
in divisione (seconda divisione meiotica o divisione equazionale)
dando origine a quattro spermatidi.
Gli spermatociti di 2° ordine o secondari appaiono meno
voluminosi di quelli primari. Poiché tale stadio ha una durata molto
breve (circa 8 ore), gli spermatociti secondari sono raramente
osservabili nelle sezioni dei tubuli seminiferi.
Gli spermatidi che si sono appena formati dalla divisione
dello spermatocita secondario appaiono più piccoli di quest'ultimo e
presentano una struttura abbastanza semplice, in parte simile agli
spermatociti.
Spermiogenesi
La spermiogenesi o spermioistogenesi consiste in una lunga serie
di cambiamenti morfologici che trasformano lo spermatidio in
spermatozoo.
I fatti più salienti del processo che porta alla differenziazione
dello spermatozoo sono sostanzialmente la modificazioni del nucleo e
la comparsa di organuli altamente specializzati che consentono il
trasferimento dello spermatozoo e la fecondazione.
Il processo di spermiogenesi viene generalmente distinto in
quattro fasi: fase del Golgi, fase del cappuccio, fase dell'acrosoma e
fase di maturazione.
La fase del Golgi è caratterizzata dalla comparsa, nel complesso
del Golgi, di granuli di natura polisaccaridica. Tali granuli sono
chiamati granuli preacrosomiali e ciascuno di essi è contenuto in una
vescicola.
Man mano essi si fondono tra loro per coalescenza, dando
origine a un unico grosso granulo, il granulo acrosomiale, che si
colloca nella porzione anteriore del nucleo, addossato alla membrana
nucleare.
Durante la fase del cappuccio la vescicola acrosomiale si
accresce notevolmente e si sviluppa un cappuccio che, sempre
adagiato sulla membrana nucleare, copre i due terzi anteriori del
nucleo.
Nella fase dell'acrosoma il nucleo dello spermatidio si porta
in vicinanza della membrana cellulare, si allunga e si appiattisce,
mentre la cromatina si condensa in grossi granuli che, per coalescenza,
originano una massa densa e omogenea in cui sono presenti aree
chiare di forma e grandezza variabile chiamate vacuoli nucleari.
Nella fase di maturazione si forma il segmento di connessione
tra il flagello e il nucleo e una guaina fibrosa costituita da 9 grosse
fibre disposte longitudinalmente lungo il flagello. Quindi i mitocondri
si dispongono a spirale intorno alla porzione prossimale del flagello.
Successivamente quasi tutto il citoplasma dello spermatidio
viene eliminato sotto forma di corpo residuo e fagocitato dalle cellule
del Sertoli che, per mezzo dei loro lisosomi, lo digeriranno
completamente.
Inoltre si dissolvono anche i ponti citoplasmatici tra gli
spermatidi, mentre una piccola porzione di citoplasma contenente
gocce lipidiche segue lo spermatozoo liberato nel lume dei tubuli, per
abbandonarlo in un momento successivo.
Completamento della maturazione dello spermatozoo
I cambiamenti maturativi iniziano nelle vie genitali maschili
e si completano in quelle femminili.
Dopo il distacco dalle cellule nutrici del Sertoli, gli spermatozoi
immessi nel lume dei tubuli seminiferi, non hanno né la proprietà di
muoversi né quella di fecondare e sono contenuti nel liquido secreto
dagli elementi sertoliani.
Sempre immersi in questo primo contingente di liquido
seminale essi vengono poi spinti nei tubuli retti.
I tubuli retti sono rivestiti da cellule che, con la loro funzione
secretoria, incrementano il quantitativo di liquido che circonda gli
spermatozoi, con l'aggiunta di nuovi componenti molecolari e di
potassio, necessari perché possa iniziare il processo di maturazione.
I tubuli retti confluiscono nella rete testis. Questo sistema
lacunare rappresenta una stazione di raccolta, di sosta e di smistamento degli spermatozoi verso i condotti efferenti che li trasportano
poi nel canale dell'epididimo.
Per l'attività secretiva delle cellule epiteliali dell'epididimo gli
spermatozoi completano la loro maturazione, oltre a raggiungere un
alto grado di motilità, ottiene anche la capacità di fecondare a causa
della particolare composizione chimica di tale ambiente.
Emissione degli spermatozoi
Gli spermatozoi contenuti nel liquido seminale secreto
dall'epididimo imboccano successivamente il canale deferente. Alla
estremità terminale del deferente è annesso un diverticolo laterale,
la vescichetta seminale. Deferente e vescichetta seminale si
continuano con il dotto eiaculatore. Quest'ultimo, dopo avere attraversato il parenchima della prostata, sbocca nell'uretra prostatica.
Il meccanismo mediante il quale gli spermatozoi contenuti nel
liquido seminale vengono immessi nelle vie genitali femminili è
detto eiaculazione. Tra una eiaculazione e l'altra il liquido seminale
sosta nella vescichetta seminale.
Infine il liquido seminale si arricchisce, al momento della
eiaculazione, del secreto elaborato da due ghiandole annesse
all'apparato genitale maschile: la prostata e le ghiandole bulbouretrali. La prima produce un liquido di aspetto lattescente, mentre
le seconde secernono un liquido chiaro e filante (simile a muco) che
riversano nel canale uretrale e che ha il compito di esercitare
un'azione lubrificante durante la copulazione.
I due condotti eiaculatori terminano aprendosi nell'uretra
prostatica. Nel suo ultimo tratto l'uretra percorre il pene per tutta la
sua estensione, aprendosi all'estremità del glande. Al momento
dell'accoppiamento lo sperma viene depositato nella vagina della
femmina.
Dopo che il seme è stato depositato nella vagina, in questa
sede si forma un coagulo gelatinoso, prodotto dagli enzimi
prostatici e favorito dall'ambiente acido della vagina stessa. Tale
coagulo, tuttavia, viene diluito nello spazio di un'ora appena, da un
altro enzima prodotto dalla stessa prostata sotto forma di proenzima e
da alcune ghiandole delle vie genitali femminili. Spesso, con il
coagulo, si ha la perdita di un certo numero di spermatozoi nella
vagina.
Capacitazione dello spermatozoo
Gli spermatozoi depositati in vagina vanno incontro all’ultima
tappa della maturazione: la capacitazione.
La capacitazione viene definita come il processo mediante il
quale lo spermatozoo acquisisce la capacità fecondante. Esso durante
questo periodo coincidente in vivo con l’attraversamento del muco
cervicale, subisce cambiamenti biochimici e ultrastrutturali che sono
un preludio alla reazione acrosomiale, la quale permette allo
spermatozoo il legame con la zona pellucida dell’oocita.
Reazione acrosomiale
Una volta terminata la capacitazione, gli spermatozoi sono
pronti per la reazione acrosomiale, che rappresenta un processo di
esocitosi con fusioni localizzate tra la membrana acrosomiale esterna
e la membrana plasmatica dello spermatozoo con formazione di
vescicole.
Il primo spermatozoo che raggiunge l’ovulo trova rapidamente i
recettori leganti lo spermatozoo presenti sulla membrana e fonde la
sua membrana con quella dell’ovocita. La zona fusa della membrana
si apre e il nucleo dello spermatozoo penetra nel citoplasma
dell’ovulo.
Figura 11- La fecondazione
Un altro processo innescato dalla fusione ovulo spermatozoo è
la reazione corticale. Questa reazione chimica è finalizzata ad
impedire la polispermia, cioè la fecondazione da parte di più di uno
spermatozoo.
Strutture definite granuli corticali, legati al versante interno
della membrana dell’ovulo, rilasciano il loro contenuto all’esterno
della membrana dell’ovocita.
Queste sostanze chimiche modificano la membrana e la zona
pellucida circostante in modo da impedire la penetrazione o il legame
di altri spermatozoi.
Quando l’ovulo è stato fecondato e diventa uno zigote, inizia la
divisione mitotica, mentre si avvicina lentamente all’utero, dove si
impianta per tutto il periodo della gestazione.
ANOMALIE DELLLA SPERMATOGENESI E
STERILITA’
I
difetti
della
maturazione
dei
gameti
quindi
della
spermatogenesi sono le cause più frequenti d’infertilità maschile.
Concentrazione,
vitalità,
morfologia
e
motilità
degli
spermatozoi sono i parametri più specifici che ci consentono di
classificare i seguenti quadri clinici:
• Normospermia;
• Azoospermia: completa assenza di spermatozoi nel
liquido seminale;
• Oligozoospermia: riduzione del numero di spermatozoi
(<20mil/ml);
• Teratozoospermia: alterazione di forma degli spermatozoi
(>30%);
• Astenozoospermia:
alterazione
della
motilità
degli
spermatozoi (<50% a+b);
• Oligoastenoteratozoospermia: associazione dei quadri
sopra descritti.
L’uomo è forse l’unico tra i mammiferi che presenti un elevato
grado di eterogeneità tra i suoi gameti, quindi lievi anomalie si
presentano anche in un uomo fertile.
Secondo una prima definizione la sterilità, almeno nella donna,
andrebbe distinta dall’infertilità, intesa come incapacità di condurre la
gravidanza fino all’epoca di vitalità fetale. Nell’uomo, invece, essendo
il concetto di aborto ovviamente estraneo alla patologia della
riproduzione, i due termini sono largamente utilizzati come sinonimi.
Secondo un’altra definizione, una coppia è considerata infertile
quando non è stata in grado di concepire e di procreare un bambino
dopo un anno o più di rapporti sessuali non protetti, mentre è sterile la
coppia nella quale uno o entrambi i coniugi sono affetti da una
condizione fisica permanente che non rende possibile la procreazione.
Secondo questa interpretazione il termine “sterilità” si riferisce,
quindi, ad una condizione più grave e comunque assoluta di
“infertilità” riguardante la coppia e non il singolo membro di essa.
Ai fini della presente trattazione i due termini, infertilità e
sterilità, saranno usati come sinonimi.
Tutte le coppie che non ottengono gravidanza nei termini sopra
definiti costituiscono la popolazione delle coppie infertili. I dati
relativi all’incidenza ed alle principali cause di sterilità sono simili a
livello mondiale.
Non esiste alcuno standard di riferimento nella misurazione
dell’infertilità. In Italia si calcola oggi che ogni anno 60000-80000
nuove coppie si trovino a dover affrontare problematiche di infertilità,
il che rappresenta il 20-25% delle 300000 nuove unioni.
Nella nostra società motivazioni molteplici di ordine sociale,
economico e culturale portano molte donne a rinviare oltre la terza
decade di vita la ricerca di un concepimento.
Dagli ultimi dati relativi alla natalità in Europa, infatti, emerge
che l’età media in cui la donna italiana partorisce il primo figlio è 30
anni, dato aumentato rispetto al precedente rilievo del 1990 dove
risultava essere di 29 anni.
E’ interessante rilevare come da uno studio eseguito presso il
Laboratorio del Centro di Andrologia di Pisa, confrontando i valori
medi riscontrati negli esami odierni con quelli eseguiti venti anni
orsono, sia stato rilevato un marcato decremento sia a carico della
concentrazione sia della motilità e della morfologia spermatica.
Non è, però, solamente il trascorrere degli anni che comporta la
riduzione della capacità riproduttiva, che stiamo osservando, ma è
anche l’influenza combinata di molti fattori esterni, presenti nel
mondo che ci circonda.
L’aumento dell’infertilità maschile è imputabile, infatti, a tutto
un insieme di cause, prima tra tutte quella ambientale, intendendo per
ambientali sia quei fattori legati all’inquinamento dell’ambiente in cui
viviamo oggigiorno, sia alle mutate abitudini di vita, alle quali la
società odierna ci costringe.
In particolare si è studiata e si continua a studiare l’esposizione
a sostanze tossiche sia prima della nascita, nel ventre materno, sia
dopo la nascita. Sotto accusa sono sostanze molto diverse come
fitofarmaci agricoli, policlorobifenili, certi detergenti e altre ancora.
Infine, è innegabile che stiamo assistendo ad una recrudescenza
di molte forme di patologia dell’apparato riproduttivo maschile, in
primo luogo di quelle flogistiche-infettive legate alle mutate abitudini
sessuali di oggi.
In Italia ogni anno 500000 coppie chiedono un consulto per
infertilità e il fenomeno sembra inoltre in aumento.
L’AGRICOLTURA NELLA PROVINCIA DI
RAGUSA
Il comparto ortoflorovivaistico rappresenta la voce più
importante per lo sviluppo economico e sociale della provincia di
Ragusa, una provincia di soli 12 comuni accomunati da una spiccata
vocazione per le produzioni legate al settore agricolo che sempre più
spesso si evolvono in veri e propri distretti di eccellenza, tanto è vero
che la provincia di Ragusa rappresenta l’area territoriale d’Italia con la
più alta concentrazione di serre.
Per fare qualche considerazione sulla dimensione, in termini
economici e occupazionali, del comparto agricolo della provincia di
Ragusa possiamo notare che in termini percentuali mentre la
popolazione della provincia di Ragusa costituisce solo il 6%
dell’intera popolazione siciliana (303.000 Ab.), di contro la sua
produzione agricola lorda vendibile rappresenta più del 20% di quella
regionale, con 10186 aziende agricole che occupano 18.000 lavoratori
agricoli e 12000 lavoratori serricoli.
La coltivazione in serra è stata introdotta in Sicilia intorno agli
anni ’50. Già da allora le colture protette si sono localizzate
soprattutto lungo il litorale mediterraneo ed in particolare in provincia
di Ragusa dove negli ultimi anni hanno raggiunto un alto grado di
innovazione tecnologica.
In provincia di Ragusa sono presenti il 56% degli impianti
terricoli siciliani, mentre il 20% si trovano nel siracusano, il 12% in
provincia di Caltanissetta e l’8% in provincia di Trapani.
PROVINCIA DI RAGUSA
Estensione territoriale
Kmq 1.614
Popolazione generale
Ab. 303.000
Superficie coltivata a serre
Ha 8.000
Popolazione lavorativa agricola stimata
N° 18.000
Popolazione lavorativa in sericoltura
N° 12.000
Aziende agricole
N° 10.186
Consumo medio di antiparassitari
t. 6000/anno
Per tali coltivazioni nel ragusano c’è un elevato consumo di
antiparassitari pari a 6000 t/anno.
PRODOTTI FITOSANITARI DI MAGGIORE USO
AGRICOLO NEL RAGUSANO
Nome
Principio attivo
commerciale
Utilizzo
Classificazione
Rubrum
Acidi naftilenici
Fitoregolatore
Nocivo
Giberellina
Acido giberellinico
Fitoregolatore
Nocivo
Galben
Benalaxil
Fungicida
Non classificato
Furacon
Benfuracarb
Insetticida
Non classificato
Applaud
Buprofezin
Regolatore di crescita
Irritante
Aldicarb
Carbaryl
Insetticida
Tossico
Bavistin
Carbendazim
Fungicida
Tossico/nocivo
Benzim
Carbendazim
Antibotritici
Tossico
Mocap
Chloprophos
Nematocida/insetticida
Tossico/nocivo
Dursban
Chlorpyrifos
Insetticida
Tossico
Geodinfos
Chlorpyrifos
Insetticida
Tossico
Lorsban
Chlorpyrifos
Insetticida
Tossico
Dormex
Cianammide
Fitoregolatore
Nocivo
Curzate
Cymoxanil
Anticrittogamico
Nocivo
Vitene
Cymoxanil
Fungicida
Tossico
Vitex
Cymoxanil
Fungicida
Tossico
Euparen
Dichlofluamid
Fungicida
Irritante
Telone
Dichloropropene
Fumigante
Tossico
Sclerosan
Diclogan
Fungicida
Irritante
Dinocol PB
Dinocap
Antioidico
Irritante
Fenocap 25
Dinocap
Antioidico
Irritante
Rumitane PB
Dinocap
Antioidico
Irritante
Seccatutto
Paraquat dicloruro
Diserbante
Nocivo
Thiodan
Endosulfan
Insetticida
Tossico
Nemacur
Fenamiphos
Nematocida
Nocivo
Glifosan
Glyphosate
Erbicida
Non classificato
Fungicida
Nocivo
Agrocillina
Idrossichinolina solfato
Confidor
Imidacloprid
Insetticida
Nocivo
Match
Lufenuron
Insetticida
Irritante
Ridomil
Metalaxil-rameici
Fungicida
Nocivo
Fumigante
Nocivo
Fumigante
Nocivo
Fumarate
Vapam
Metam-sodium
anidro
Metam-sodium
anidro
Carakol
Methaldehyde
Molluschicida
Non classificato
Tamifun
Methamidophos
Insetticida/caricida
Tossico
Mesurol
Methiocarb
Acaricida/insetticida
Tossico
Metham
Methomyl
Insetticida
Molto tossico
Agrolene
Methomyl
Insetticida
Molto tossico
Lannate
Methomyl
Insetticida
Molto tossico
Systane
Miclobutanil
Antioidico
Irritante
Vydate
Oxamil
Insetticida/nematocida
Tossico
Topas
Penconazolo
Fungicida
Nocivo
Cereweed
Pendimethalin
Erbicida
Nocivo
Fungicida
Irritante
Fitocarb
Propamocarb
hidroclorito
Acarion
Propargite
Acaricida
Tossico
Bayfidan
Triadimenol
Fungicida
Nocivo
Tiovit
Zolfo
Fungicida
Poco tossico
I principi attivi in grassetto sono quelli più frequentemente associati alle
intossicazioni acute e croniche da prodotti fitosanitari di uso agricolo
INTOSSICAZIONI ACUTE DA FITOSANITARI
Dal momento che, nell’area del ragusano oltre l’elevato
consumo di antiparassitari, c’è una considerevole manovalanza a
basso livello culturale rappresentata dai lavoratori extracomunitari che
ormai rappresenta il 30% della manodopera attiva e la tipologia
prevalente delle aziende è di piccola dimensione e a conduzione
familiare, l’area è stata scelta come territorio ideale per portare avanti
un progetto pilota per la rilevazioni delle intossicazioni acute da
antiparassitari al fine di programmare delle iniziative di prevenzione e
di tutela mirate.
Il principale problema emerso in tale iniziativa è stato ed è
tuttora il flusso informativo sui singoli eventi. Di fatto, esiste una
procedura di segnalazione dei casi, in ottemperanza alla legge
638/1975, all’ufficiale sanitario e da questi al medico provinciale e
successivamente al ministero della salute. In realtà tale obbligo, in
passato, è stato largamente disatteso.
Nell’ambito dei piani triennali di controllo delle vendite, del
consumo e dell’uso di fitofarmaci, nel corso del 2004, la Regione
Siciliana ha avviato un piano di rilevazione dei casi di intossicazione
acuta da antiparassitari statuito dalla Circolare Assessoriale n° 1142
del 23/06/04 e che vede la collaborazione dei P.S., delle Direzioni
Sanitarie Ospedaliere, dei SIAN e dei CAV e che assegna agli
SPreSAL (Servizio Prevenzione e Sicurezza Ambienti di Lavoro) un
ruolo centrale nella monitorizzazione dei casi.
Questo meccanismo risulta essere in fase di rodaggio, per cui a
tutt’oggi, il dato nazionale complessivo del fenomeno risulta
approssimativo ed è basato sui calcoli delle segnalazioni e delle
ricerche di consulenza che pervengono ai centri antiveleni e sulle
sporadiche segnalazioni spontanee ai servizi dei dipartimenti di
prevenzione delle ASL.
Direttamente legata alla difficoltà delle segnalazioni spontanee
è sicuramente la nazionalità dei lavoratori.
NAZIONALITA’ DEI LAVORATORI
2001
2002
2003
2004
Italiani
88%
76%
88%
90%
Extracomunitari
12%
24%
12%
10%
Nella larga maggioranza dei casi si tratta di lavoratori
dipendenti. I casi che interessano lavoratori extracomunitari sono
sottostimati: si ritiene, infatti, che il numero dei soggetti
extracomunitari coinvolti in eventi acuti sia molto maggiore, in quanto
i lavoratori clandestini o comunque non in regola con il permesso di
soggiorno non si reca al Pronto Soccorso e comunque non denuncia la
vera causa del malore.
Al fine di riuscire ad intercettare anche questi casi è stata
avviata alla fine del 2004 una collaborazione con Medici Senza
Frontiera che, grazie alla presenza sul territorio con due ambulatori a
Vittoria e S. Croce Camerina, sono in grado di rilevare gli eventi che
normalmente sfuggono all’osservazione del Sistema Sanitario
Nazionale.
Un altro parametro importante per la valutazione dei rischi è la
fascia di età dei lavoratori.
FASCE DI ETA’
2001
2002
2003
2004
Minori
1
2
0
3
18 – 30 anni
21
17
15
5
31 – 40 anni
21
16
24
16
41 – 50 anni
5
10
12
5
51 – 60 anni
11
3
3
7
> 60 anni
4
1
3
5
Si conferma la fascia di età (18 – 40 anni) come quella a
maggior rischio di infortuni, quella maggiormente rappresentata nella
forza lavoro del settore; da segnalare i sei casi relativi a minori dovuti
ad iniziative personali non sufficientemente vigilati da adulti. Il
fenomeno colpisce quasi esclusivamente la popolazione maschile.
25
20
15
2001
2002
2003
2004
10
5
0
Minori 18-30
31-40
41-50
51-60
> 60
Figura 12- Intossicazioni da fitosanitari 01/04 - Fasce di età
Nel seguente grafico guardiamo alle sostanze che hanno
maggiormente causato intossicazioni.
35
30
25
2001
2002
2003
2004
20
15
10
Cianammide
Dichloropropene
Methomyl
Imidacloprid
Cymoxanil
Fenamiphos
Endosulfan
0
Chlorpyrifos
5
Figura 13- Intossicazione da fitosanitari 01/04 - Principi Attivi
Il methomyl si conferma, come il presidio sanitario più
frequentemente
coinvolto
nelle
intossicazioni
da
fitosanitari;
sicuramente è uno dei fitosanitari più utilizzato nei trattamenti, sia da
solo che in associazione con altri prodotti.
INTOSSICAZIONI CRONICHE DA FITOSANITARI
Per
intossicazioni
croniche
intendiamo
tutte
quelle
intossicazioni che hanno effetti a lungo termine. Gli apparati
maggiormente colpiti sono il sistema polmonare, il sistema nervoso
centrale e periferico e anche il sistema oggetto del nostro studio vale a
dire l’apparato genitale maschile.
Gli studi precedentemente riportati sull’età dei lavoratori più
colpiti, sul sesso di questi e sui principi attivi più frequentemente
associati alle intossicazioni da prodotti fitosanitari di uso agricolo
possono essere riproposti a riguardo delle intossicazioni croniche.
In più dall’indagine statistica effettuata all’interno del Centro si
evince con chiarezza che la categoria di pazienti con patologiche
alterazioni dei parametri del liquido seminale sono proprio i lavoratori
serricoli.
Materiali E Metodi
ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE
L’esame del liquido seminale, o spermiogramma, è il caposaldo
dell’attività del laboratorio di andrologia, poiché rappresenta il punto
di partenza dello studio della capacità fecondante di un uomo.
RACCOLTA E CONSEGNA DEL CAMPIONE
Il campione deve essere raccolto dopo un periodo di astinenza
sessuale di non meno di 48 ore e non più di 7 giorni.
Sul modulo di accompagnamento di ogni analisi dovranno
essere registrati il nome del paziente, il periodo di astinenza, il giorno
e l’ora della raccolta, e l’intervallo intercorso tra la raccolta e l’analisi.
Preferibilmente, il campione andrà raccolto in un’apposita
stanza nei pressi del laboratorio. Altrimenti, dovrà essere consegnato
al laboratorio entro 1 ora dalla raccolta.
Il campione dovrà essere ottenuto per masturbazione e raccolto
in un contenitore etichettato con il nome del paziente, con la data e
l’ora della raccolta.
ESAME MACROSCOPICO INIZIALE
Liquefazione
Un campione normale subisce il processo di liquefazione in un
tempo variabile dai 10 ai 60 minuti a temperatura ambiente. In alcuni
casi, la liquefazione completa non avviene entro 60 minuti e questo
fatto dovrà essere registrato. Campioni normali di liquido seminale
possono contenere corpi gelatinosi che non si liquefanno, ma non
sembrano avere nessun rilevanza clinica.
Aspetto
L’aspetto del campione viene valutato immediatamente dopo la
liquefazione o dopo un’ora dall’eiaculazione, secondo la sua
opacità/trasparenza.
Il colore fisiologico del seme è avorio opalescente. Un colore
giallastro può essere espressione di una rilevante presenza di globuli
bianchi. Un colore rosato o rosso intenso è invece, indicativo della
presenza di sangue.
Volume
Il volume dell’eiaculato viene considerato normale se è
superiore ai 2ml e inferiore a 5 ml
Viscosità
La viscosità del campione liquefatto potrà essere valutata
aspirando delicatamente il liquido seminale in una pipetta da 5 ml
dall’imboccatura
ampia,
e
lasciatolo
gocciolare
per
gravità,
osservando la lunghezza del filamento ottenuto: un campione normale
lascia la pipetta come piccole gocce distinte.
In caso di anormale viscosità la goccia formerà un filamento
superiore ai 2 cm
pH
Una goccia di liquido seminale deve essere uniformemente
stesa su un’apposita cartina indicatrice. Dopo 30 secondi, il colore
della zona bagnata diventa uniforme e deve essere confrontato con la
scala delle colorazioni per leggere il valore di pH.
Il pH seminale, anche se patologico, non è comunque, come
valore limite, superiore a 8,0 o inferiore a 7.2.
ESAME MICROSCOPICO INIZIALE
Determinazione della concentrazione di spermatozoi
Con l’ausilio di una micropipetta vengono posti 10 µl di liquido
seminale sul portaoggetti della camera di Makler, preriscaldata e
coperti con uno speciale vetrino coprioggetti dotato di ghiera
metallica, che consente di creare un monostrato di 10 µm di spessore.
Messa a fuoco la griglia, si procede alla conta degli spermatozoi.
Valutazione della motilità
E’ consigliabile un semplice sistema di classificazione, che
permetta la valutazione delle motilità degli spermatozoi.
E’ necessario osservare e registrare almeno 5 campi in modo
sistematico per classificare 200 spermatozoi. La motilità di ogni
spermatozoo è definita:
“a” motilità progressiva rapida,
“b” motilità progressiva lenta o irregolare,
“c” motilità non progressiva,
“d” immobili.
Vitalità degli spermatozoi
La vitalità degli spermatozoi è definita dalla percentuale di
cellule vive, determinata dall’esclusione del colorante o dal test di
swelling (rigonfiamento) ipoosmotico. Essa dovrebbe essere valutata
quando la percentuale degli spermatozoi immobili supera il 50%.
VALUTAZIONE DELLA MORFOLOGIA SPERMATICA
Per valutare la morfologia dobbiamo effettuare una colorazione;
miscelando 70microlitri di liquido seminale, 70microlitri di terreno e
10microlitri di colorante Gimsa, quindi si depone una piccola goccia
del preparato colorato su di un vetrino e utilizzando un obiettivo in
campo chiaro 100x ad immersione di olio si valuta la morfologia
esaminando almeno 100 spermatozoi.
Morfologia dello spermatozoo normale
Lo spermatozoo umano, normale e maturo, osservato al
microscopio ottico, appare costituito da una porzione apicale, detta
“testa”, di forma ovalare appiattita, le cui dimensioni standard sono
descritte nella seguente tabella.
Dimensione standard della testa nemaspermatica normale
(criteri del WHO, 1987, 1992, 1999)
WHO 1987
WHO 1992
WHO 1999
Lunghezza da 3,0 a 5,0 µ
Larghezza da 2,0 a 3,0 µ
Rapporto Larghezza/Lunghezza da 0,5 a 0,7
La testa è per gran parte occupata dal nucleo contenente DNA
(con assetto cromosomico aploide). Nella parte anteriore si trova il
complesso acrosomiale o “acrosoma”, una struttura a forma di
cappuccio.
La coda spermatica è inserita in maniera simmetrica in una lieve
depressione alla base della testa.
Morfologia degli spermatozoi anomali
Anomalie della testa
Le anomalie più frequenti sono:
-
Testa larga (macrocefalia);
-
Testa piccola (microcefalia);
-
Testa amorfa;
-
Testa a punta detta a sigaro;
-
Testa piriforme;
-
Testa vacuolata;
-
Testa a palla;
-
Testa doppia o multipla;
-
Assenza della testa (acefalia);
-
Difetti dell’acrosoma.
Figura 14- Disegni schematici delle anomalie della testa
Anomalia del collo:
-
Collo angolato;
-
Tratto sottile (assenza della guaina mitocondriale);
-
Tratto spesso e irregolare;
-
Inserzione asimmetrica della coda.
Figura 15- Disegni schematici delle anomalie del collo
Il segmento di connessione si presenta a volte particolarmente
assottigliato oppure la testa risulta ripiegata ad angolo retto sul
flagello. Ne consegue movimento anomalo non direzionale dello
spermatozoo.
Tale anomalia non è descritta in realtà come isolata, ma si
associa ad altre alterazioni strutturali dello spermatozoo ed è
presente generalmente in eiaculati oligoastenoteratozoospermici.
Un’anomalia generalizzata ed isolata del segmento di
connessione è la separazione della testa dalla coda. Tale difetto ha
una base genetica essendo presente in più componenti della stessa
famiglia.
Anomalie della coda:
-
Coda assente;
-
Coda mozza;
-
Coda rigonfia
-
Coda arrotolata;
-
Coda angolata;
-
Coda doppia o multipla.
Figura 16- Disegni schematici delle anomalie della coda
Residuo citoplasmatico:
E’ presente negli spermatozoi immaturi, la sua grandezza è
circa metà della testa di uno spermatozoo.
Figura 17- Disegno schematico di spermatozoo con residuo citoplasmatico
L’esame a fresco o su striscio colorato del liquido seminale
permette di evidenziare, la componente cellulare non nemaspermatica,
rappresentata dai seguenti elementi figurati:
• Elementi della linea spermatogenetica. Possono essere
presenti spermatidi; spermatociti primari e secondari e
spermatogoni; gli spermatidi e gli spermatociti primari
sono gli elementi più frequentemente rappresentati;
• Globuli bianchi, costituiti prevalentemente da granulociti,
linfociti e macrofagi;
• Emazie;
• Cellule
di
sfaldamento
derivanti
dalle
ghiandole
accessorie, dai dotti e canali dell’apparato genitourinario;
• Cristalli di spermina e corpuscoli prostatici.
Un’importanza
particolare
assume,
nella
diagnostica
differenziale delle azoospermie, la ricerca delle cellule germinali;
infatti, la presenza di tali cellule nell’eiaculato permette di escludere
un’ostruzione bilaterale delle vie genitali e indirizza la diagnosi verso
la presenza di un blocco maturativi a livello dell’epitelio seminifero.
Altre anomalie
Oltre
alle
anomalie
della
forma,
nel
corso
della
spermatogenesi si possono osservare anche delle aberrazioni
cromosomiche.
Il caso più frequente è quello che si verifica nel corso della
prima divisione meiotica, quando i cromosomi omologhi devono
separarsi, raggiungere i poli opposti della cellula e ripartirsi ognuno
in ciascuna delle due cellule figlie. Se i cromosomi omologhi non
riescono a separarsi (fenomeno noto con il termine di non
disgiunzione), le due cellule figlie conterranno una 24 cromosomi e
l'altra 22. All'atto della fecondazione si possono così avere cellule
con 47 (24 + 23) o con 45 (22 + 23) cromosomi.
Le aberrazioni dei cromosomi sessuali sono molto più
frequenti di quelle degli autosomi. La più frequente alterazione è
quella del cariotipo 47 (XXY) seguita dall'assetto XYY Queste
anomalie, in particolare quella del cromosoma Y, conducono
all'azoospermia.
Altra aberrazione riguarda la formazione dei bivalenti nel
corso della meiosi, quando il mancato appaiamento dei cromosomi
sessuali e degli autosomi provoca l'arresto della spermatogenesi.
Studi compiuti sull'uomo e sul topo hanno accertato che in
molti casi le aberrazioni degli autosomi provocano arresto della
spermatogenesi.
Al pari di tutti i processi differenziativi, la spermatogenesi
avviene sotto il diretto controllo dell'espressione genica. Infatti, nel
genoma sono presenti alcuni geni i quali sono deputati alla
regolazione della spermatogenesi. La presenza di geni mutanti
omozigoti nei tratti di genoma implicati nella regolazione della
spermatogenesi è causa di imperfezioni di sviluppo.
TECNICHE DI PROCREAZIONE
MEDICALMENTE ASSISTITA (PMA)
Secondo l’Articolo 4, Legge 40/2004 il ricorso alle tecniche di
procreazione medicalmente assistita è consentito solo quando sia
accertata l'impossibilità di rimuovere altrimenti le cause impeditive
della procreazione ed è comunque circoscritto ai casi di sterilità o di
infertilità inspiegate o accertata documentate da atto medico.
Le tecniche di procreazione medicalmente assistita devono
essere applicate in base ai seguenti principi:
1. Gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi
un grado di invasività tecnico e psicologico più gravoso
per i destinatari, ispirandosi al principio della minore
invasività;
2. Consenso informato, da realizzare ai sensi dell'articolo 6
3. Inoltre è vietato il ricorso a tecniche di procreazione
medicalmente assistita di tipo eterologo.
Per tecniche di procreazione medicalmente assistita si intendono
tutti quei procedimenti che comportano il trattamento di ovociti
umani, di spermatozoi o embrioni nell’ambito di un progetto
finalizzato a realizzare una gravidanza.
Questi procedimenti includono: l’inseminazione omologa, la
fecondazione in vitro ed il trasferimento embrionale, il trasferimento
intratubarico dei gameti, il trasferimento intratubarico degli zigoti, il
trasferimento intratubarico degli embrioni, la crioconservazione dei
gameti.
Delle suddette tecniche noi ci occuperemo soltanto di:
1. Inseminazione intrauterina (IUI);
2. Fertilizzazione in vitro ed embriotransfer (IVF-ET/ICSI);
3. Crioconservazione dei gameti maschili.
INSEMINAZIONE INTRAUTERINA (IUI)
Indicazioni
•
Oligoastenospermia;
• Fallimento eiaculatorio;
• Fattore femminile;
• Endometriosi.
Materiale utilizzato
• Vasetti da urinocoltura;
• Guanti monouso sterili senza talco;
• Micropipette sterili; Camera di Makler;
• Provette tappo bianco a 2 posizioni da 5 ml;
• Ham’s F10 con rosso fenolo, senza glutamina, per
lavaggio spermatozoi;
• Provette Falcon da 15 ml sterili (tappo blu);
• Centrifuga;
• Pasteur in vetro sottile;
• Tettarelle in gomma (sterilizzate);
• Siringhe da 1ml;
• Catetere per inseminazione Gynetics IUI 4220.
Tecnica
Il campione seminale viene prodotto dal paziente all’interno del
centro in un locale apposito, il contenitore viene fornito al paziente
con su scritto nome, cognome e data di nascita suo e della partner e
viene portato da un’infermiera in laboratorio.
Il campione viene lasciato liquefare per 30-60 minuti su piastra
riscaldata o stufa a 36°C.
Avvenuta la fluidificazione se ne prelevano 10 µl con una
micropipetta sterile e si effettua la conta degli spermatozoi mobili in
camera di Makler, in base al risultato di questa prima conta
l’embriologo decide il tipo di trattamento da effettuare al campione:
Swim-up da pellet Swim-up da strato.
Tecnica dello Swim-up da strato:
Un’aliquota di terreno di coltura (0,3-0,5 ml) viene stratificato
sopra il liquido seminale (circa 1 ml) in una provetta Falcon a fondo
conico, sterile, da 15 ml; si pone la provetta in incubatore, o sul
termoblock per 45’.
Si controlla la concentrazione degli spermatozoi mobili alla
sommità del terreno stratificato e si trasferisce un’aliquota di questo
terreno (0,5-0,6 ml), contenente gli spermatozoi selezionati, in una
provetta tappo bianco da 5 ml, poi si procede al caricamento del
catetere.
Tecnica dello Swim-up da pellet:
Un’aliquota di medium Ham’s F10, o altro terreno di lavaggio,
(1-2-3 ml) viene stratificato sopra il liquido seminale (circa 1 ml) in
una provetta Falcon a fondo conico, sterile, da 15 ml. Si miscelano le
due frazioni con agitazione delicata (o pipetman), si centrifuga a 1500
RPM per 10’, si elimina il surnatante con una pasteur in vetro sterile,
si stratificano 300 µl di terreno di coltura e si pone in incubatore, o sul
termoblock per 45’. Si controlla la concentrazione degli spermatozoi
mobili alla sommità del terreno stratificato e si trasferisce un’aliquota
di questo terreno (0,5-0,6 ml), contenente gli spermatozoi selezionati,
in una provetta tappo bianco da 5 ml, poi si procede al caricamento del
catetere.
Si collega il catetere da inseminazione ad una siringa da 1ml, si
aspira dalla punta del catetere un’aliquota del terreno contenente gli
spermatozoi selezionati (circa 0,5 ml), quindi si porta il catetere al
ginecologo che provvede all’inseminazione.
Tale trattamento non comporta l’esecuzione di anestesia; è
completamente indolore; si esegue nel periodo fecondo.
È il meno costoso e ripetibile; se ne eseguono circa due ogni
ciclo e statisticamente dà una percentuale di successo del 15/20%. La
maggiore percentuale di gravidanze avviene in media al 3°/4° ciclo,
ma non si continua per più di sei cicli.
Condizioni necessarie sono: presenza di ovulazione, tube libere
e funzionanti, spermatozoi nella normalità o modicamente ipomobili.
FERTILIZZAZIONE IN VITRO (IVF)
Indicazioni
• Patologia tubarica;
• Endometriosi;
• Infertilità inspiegata;
• Fattore maschile;
•
Fallimenti di 3-6 cicli di IUI.
Oggi la FIVET è indicata in molta situazioni: che vanno dalla
sterilità tubarica alla subfertilità maschile. È una metodica che dà
buone possibilità di successo ma non è priva di limiti; inoltre è
complessa, costosa e comporta scelte di tipo etico.
ICSI
Indicazioni
Sperma eiaculato
• Oligozoospermia;
• Astenozoospermia;
• Teratozoospermia;
• Ripetuti fallimenti della fertilizzazione FIVET;
• Disordini eiaculatori.
Sperma epididimario
• Assenza congenita bilaterale dei deferenti;
• Ostruzione di entrambi i dotti eiaculatori;
• Fiasche sterili da 50 ml;
• Fiasche da 500 ml;
• Piastre Petri medie nunc cod. 153066 (dischi di coltura);
• Piastre nunc a 4 pozzetti;
• Piastre Petri grandi Falcon cod. 3004 (Pick-up);
• Pipette Pasteur di vetro;
•
Forbici ;
•
Pinzette;
• Tettarelle in gomma (sterilizzate);
• Puntali da 100 e da 1000 µl;
• Vetrini coprioggetto grandi (TESE);
• Garze e telini;
• Guanti in lattice senza talco;
• Aghi di aspirazione ovocitaria Wallace o altra marca;
• Guanti monouso sterili senza talco;
• Provette Falcon da 15 ml sterili (tappo blu);
• Vasetti da urinocoltura;
• Piastre Petri piccole Falcon cod. 1006 (dischi ICSI);
• Aghi per micromanipolazione COOK, Eppendorf o
Humagen: ICSI e Holding;
• Catetere per embryo transfer COOK – Wallace.
Soluzioni e Terreni di coltura Utilizzati
• H2O Bidistillata (Carlo Erba);
• Olio Minerale Sterile (Medicult): Olio di copertura per
colture cellulari per evitare un’eccessiva evaporazione del
terreno di coltura e per creare un filtro protettivo sulla
coltura stessa agendo anche come riserva di CO2. Deve
essere equilibrato in incubatore O.N. a 37 °C e 5% CO2;
• Hearle con rosso fenolo: terreno di coltura di gameti
utilizzabile per primo lavaggio ovociti dopo pick-up;
• IVF (Medicult) con rosso fenolo: Terreno di coltura di
gameti
ed
embrioni,
contiene
bicarbonato
viene
equilibrato a 37°C e 5% CO2 prima dell’utilizzo;
• Ham’s F10 con rosso fenolo, senza glutamina, per
flushing ovocitario e per lavaggio spermatozoi;
• Sperm Prep (Medicult) con rosso fenolo: Terreno di
coltura di gameti, contiene bicarbonato e HEPES per
migliorare la stabilità fuori dall’incubatore dove viene
equilibrato a 37°C e 5% CO2 prima dell’utilizzo;
• PVP, 7% - ready to use solution;
• Hyaluronidase 80 U/ml in HTF w/hepes;
• PVP (Medicult) con rosso fenolo (Medium PVP 10 %):
Soluzione ad alta viscosità per immobilizzare gli
spermatozoi da prelevare per procedura ICSI
Preparazione laboratorio
Prima dell’inizio di un ciclo di fecondazione assistita il
laboratorio viene accuratamente disinfettato e monitorato per
accertarsi del corretto funzionamento delle apparecchiature.
Tecnica
L’ICSI è una tecnica che comporta la microiniezione di un
singolo spermatozoo in un ovocita maturo allo scopo di ottenerne la
fertilizzazione.
Perché ciò avvenga la donna si deve sottoporre ad una
stimolazione
della
crescita
follicolare
con
dei
farmaci
(gonadotropine). È una tecnica che permette di avere una gravidanza a
quelle coppie dove il partner maschile è affetto da grave infertilità.
DAY –2
Si preparano 50 ml di olio minerale sterile + 5 ml di terreno di
coltura (IVF, Hearle o altro) per paziente in una o più fiasche, e si
mettono in incubatore senza tappo per far sedimentare il terreno di
risciacquo e far equilibrare l’olio (non mettere i tappi nell’incubatore).
DAY –1
Alla sera si prepara per ogni paziente una provetta da 15 ml con
terreno Ham’s F 10 per il pick-up ovocitario e delle provette vuote in
funzione del numero di follicoli e si mettono sotto cappa a
temperatura ambiente.
Si mettono in incubatore delle provette contenenti terreno di
coltura (IVF o Fert) e alcune contenenti Sperm Prep (o altro terreno
con Hepes), in base al numero di pazienti da trattare, come riserve di
terreno.
Si preparano 5 Piastre (Nunc 153066) per paziente, si scrive il
nome della paziente al centro della piastra, sul fondo esterno, con una
penna vetrografica e si riempiono con 4,2 ml di olio minerale. Si
dispongono le piastre in incubatore in file frontali all’apertura e senza
coperchio.
Si prepara, per ogni paziente, una piastra nunc a 4 pozzetti, (o
più, in base al n° di follicoli da aspirare) di raccolta ovocitaria, con
all’interno 500 µl di terreno di coltura (FERT), ricoperto da olio
minerale, per pozzetto, e la si pone in incubatore.
Si posizionano le piastre per il Pick-up (Falcon 3004), in
confezione, sul termoblock già dalla sera prima.
Si preparano Pasteur in vetro sterili in numero di 20 circa per
paziente.
Si sterilizzano: forbici, pinzette, tettarelle, puntali da 100 e da
1000 µl, vetrini coprioggetto grandi (TESE), garze e telini.
DAY 0
Prima dell’inizio dei pick-up si mettono a temperatura ambiente
il PVP e la Hyaluronidase.
Aspirazione dei follicoli
Figura 18- Prelievo ovocitario
L’aspirazione dei follicoli è eseguita per mezzo di un ago
(Wallace o equivalente) a singolo lume ecoguidato. All’ago è
applicata una pressione negativa (-80 / -100 millibar) regolata da una
pompa di aspirazione (pompa di Kraft).
Gli ovociti recuperati sono raccolti nelle provette tappo bianco
sterili da 15 ml, o alternativamente in fiasche sterili da 50 ml, e
trasferiti in laboratorio.
I tubi contenenti gli ovociti vengono svuotati in piastre Falcon
(cod. 3004) grandi poste su piano riscaldato all’interno della cappa
sterile a flusso laminare orizzontale e il liquido viene controllato allo
stereomicroscopio per la ricerca degli ovociti. Si controlla allo
stereomicroscopio il fondo della provetta prima di buttarla.
A questo punto gli ovociti vengono trasferiti nella piastra nunc a
4 pozzetti contenenti ognuno 500 µl di terreno di coltura ricoperto
d’olio, in numero di 2/3 per ogni pozzetto, in incubatore e ivi
mantenuti per circa 1 ora.
Cognome moglie – Cognome marito
1
3
2
4
Figura 19- Piastra nunc a quattro pozzetti
Affinchè la procedura ICSI possa aver luogo, gli ovociti devono
essere privati del cumulo ooforo e della corona radiata.
Si preparano piastre nunc 35 x 10 con microgocce di 50 µl,
preparando 4 microgocce di terreno di coltura (FERT) e una goccia di
terreno + hyaluronidase (40 UI/ml finale), o solo hyaluronidase (80
UI/ml finale) da segnare con un cerchio sotto la piastra mediante la
matita vetrografica.
50 µl di FERT + 50 µl di hyaluronidase
50 µl di FERT
1
2
6
6
2
paziente
3
1
5
3
5
4
Figura 20- Piastra I (percorso ovociti)
riposo)
4
Figura 21- Piastra II (disco di
Le piastre vengono rimesse in incubatore (down) per 15’, si
preparano intanto delle Pasteur assottigliate e si dispongono sotto
cappa in ordine di diametro decrescente.
Si utilizza prima la piastra I che viene uscita dall’incubatore
insieme alla nunc a 4 pozzetti, contenente gli ovociti, che vengono
prelevati dal pozzetto e messi in una goccia di FERT (1) e poi passati
in hyaluronidase (2), spipettati dolcemente fino all’eliminazione del
cumulo (utilizzando Pasteur normale), e poi passati tutti assieme nelle
gocce di lavaggio (3-4-5-6) mediante pipette assottigliate per
allontanare il più possibile ogni traccia di enzima dagli ovociti.
Spipettamento con pasteur assottigliate, si ottiene la rimozione
delle cellule follicolari, e gli ovociti vengono lasciati nella goccia di
lavaggio (6).
A fine trattamento si aspira la goccia di Hyaluronidase. La
procedura deve essere effettuata velocemente per non esporre gli
ovociti alla soluzione di Hyaluronidase per più di 30 secondi.
Dopo l’eliminazione del cumulo ooforo gli ovociti vengono
trasferiti nella piastra II, uno per goccia, classificati all’invertoscopio,
e rimessi in incubatore.
Alternativamente la decoronizzazione può essere effettuata in
piastre nunc a 4 pozzetti, contenenti nel pozzetto n°1 500 µl di
hyaluronidase (80 UI/ml finale), contrassegnato con un puntino nero,
e nei pozzetti n° 2-4 500 µl di terreno di coltura con hepes (HTF
w/hepes). La piastra viene riscaldata sul termoblock a +37 °C, non in
incubatore, e il procedimento di decoronizzazione è uguale.
Hyaluronidasi 80UI/ml finale
HTF con hepes
Cognome moglie – Cognome marito
1
4
2
3
Figura 22- Piastra nunc (1-4: percorso degli ovociti)
Preparazione del campione seminale
Il campione seminale viene prodotto, subito dopo la
constatazione del recupero di almeno un ovocita.
Il campione verrà trattato come già visto per l’inseminazione
intrauterina.
Fertilizzazione
FIVET:
Le piastre nunc a 4 pozzetti contenenti gli ovociti vengono
prelevate dopo circa 4 ore di incubazione e ad ogni pozzetto
contenente gli ovociti (max 3 per pozzetto) viene aggiunta una
quantità di seme trattato tale da contenere 40.000 – 50.000
spermatozoi per ovocita. Le piastre vengono quindi rimesse in
incubatore.
ICSI:
Dopo la pulizia degli ovociti si preparano piastre Falcon 1006
(con indicato sul fondo il cognome della paziente) con 3 gocce da 10
µl di terreno di coltura (Fert), e, sopra, due gocce con un volume <10
µl di PVP, si ricopre di olio minerale. Si aggiungono 2 µl di seme
trattato in una goccia di PVP, si mette la piastra in incubatore per 30’
a 37°C e 5% CO2.
PVP (Medium PVP 10 %) + Spermatozoi
PVP
Fert
Nome Paziente
1
2
3
Figura 23- Piastra Falcon per ICSI
Si utilizza il PVP perchè grazie alla sua alta viscosità riduce la
mobilità degli spermatozoi e ne permette una facile cattura e una
agevole immobilizzazione.
Si trasferiscono gli ovociti nelle microgocce di terreno con una
Pasteur assottigliata rispettando la numerazione iniziale.
Si procede alla microiniezione. Al momento della ICSI si pone
la piastra sull’invertoscopio e si fa equilibrare la pressione della
micropipetta Injecting immergendola nella goccia contenente PVP ma
non spermatozoi.
Si immobilizza uno spermatozoo toccando la coda con la
micropipetta, e lo si aspira con la testa rivolta verso l’estremità aperta
della micropipetta.
Si sposta la piastra per inquadrare nel campo visivo la goccia
con l’ovocita, lasciando la micropipetta Injecting abbassata; si abbassa
la micropipetta Holding e si blocca l’ovocita aspirandolo leggermente,
si sta attenti ad orientarlo con il globulo polare a ore 6 (zona
disorganizzata dell’ovocita).
Si perfora l’ovocita con la micropipetta Injecting, si aspira un
po’ di citoplasma, al fine di capire se si è perforata la zona pellucida.
Dopo si espelle lo spermatozoo all’interno del citoplasma,
questa procedura permette anche di attivare l’ovocita per l’afflusso di
ioni Ca++ dal terreno di coltura al citoplasma.
Si blocca subito il flusso dalla micropipetta Injecting e la si
estrae lentamente dall’ovocita.
Dopo ogni microiniezione si sollevano leggermente le
micropipette e si riposiziona il campo nella goccia con gli spermatozoi
e si procede con una nuova iniezione.
A fine procedura si pongono gli ovociti microiniettati nelle
goccie di una terza piastra Nunc 35 x 10 con FERT, rispettando la
numerazione iniziale e si mette la piastra in incubatore.
1
2
3
Figura 24- Piastra nunc III
A fine giornata si prepara una nuova piastra di coltura, per
paziente, con gocce di terreno (cleavage) per il cambio di terreno da
effettuarsi a day +1 dopo il controllo dell’avvenuta fertilizzazione e si
pone in incubatore.
DAY 1
Il controllo dell’avvenuta fertilizzazione degli ovociti, mediante
osservazione dei 2 pronuclei all’invertoscopio, viene effettuato 15-19
ore dopo l’inseminazione in caso di procedura IVF classica, in caso di
procedura ICSI il controllo può essere effettuato 12-18 ore dopo
l’iniezione intracitoplasmatica in quanto i pronuclei appaiono prima.
Gli ovociti fertilizzati, provenienti da FIVET o ICSI, vengono
classificati e trasferiti in una nuova piastra di coltura (nunc 153066)
con gocce di terreno (cleavage), rispettando l’eventuale numerazione.
DAY2
La seconda osservazione viene effettuata 40 - 48 ore
dall’inseminazione. In questa fase si fa una valutazione embrionale e
una classificazione.
Gli embrioni vengono valutati per il numero totale e la
regolarità dei blastomeri, presenza di frammentazione, presenza di
granulazioni nel citoplasma dei blastomeri e soprattutto per il rispetto
dei tempi di divisione; gli embrioni dopo osservazione possono essere
riposti in incubatore, oppure trasferiti in terreno fresco.
DAY 3
La
terza
osservazione
viene
effettuata
66
-
74
ore
dall’inseminazione. Si controlla la divisione degli embrioni al mattino
mediante osservazione allo stereomicroscopio su piano riscaldato.
Figura 25- Embrione a quattro cellule
Si procede al transfer embrionale. Si prepara una siringa da
insulina, si riempie di terreno di caricamento (cleavage) e si tiene sul
termoblock riscaldato in una provetta sterile da 15 ml.
Si porta il catetere in sala operatoria dove si lascia al ginecologo
la guida affinché sia inserita nel canale cervicale e si ritorna in
laboratorio con il catetere e l’astuccio.
Si taglia l’astuccio di 2-3 cm per far uscire la punta del catetere,
lo si connette alla siringa da 1 ml e lo si sciacqua con il terreno di
coltura dell’embrione da trasferire lasciando circa 20 µl di terreno
nella siringa. Gli embrioni vengono trasferiti con una Pasteur nella
goccia centrale della piastra di coltura. Si aspirano all’interno del
catetere in sequenza, gli embrioni entro una quantità di terreno pari a
20 µl, una bolla d'ari paria 10 µl e, nella punta del catetere, una
quantità di terreno pari a 5-10 µl, si ripone il catetere così preparato
nella confezione sterile e si porta in sala per il transfer.
Il ginecologo inserisce il catetere nella guida e, finito il
posizionamento, l’embriologo o il ginecologo, aziona lo stantuffo
della siringa. Si attende circa 1 minuto e, successivamente, il
ginecologo estrae delicatamente il catetere dalla guida e lo consegna
all’embriologo che lo riporta in laboratorio.
Qui, sotto cappa, si poggia la punta del catetere su una piastra
sterile con una goccia di terreno fresco e si controlla la presenza di
embrioni sulla punta del catetere. In caso di esito negativo si comunica
al ginecologo di estrarre la guida altrimenti si ripete l’operazione.
CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI
MASCHILI
Gli spermatozoi sono organismi mobili unicellulari: è nota dai
primi anni del XX secolo la loro proprietà di sopravvivere al
congelamento, riacquistando in buona parte con lo scongelamento, la
loro capacità di movimento e fertilizzante.
Una banca per il congelamento dei gameti maschili è costituita
da un contenitore criogenico per i gameti (contenitore n° 1) e da un
contenitore di stoccaggio per l’azoto liquido (contenitore n° 2), come
riserva per i rabbocchi periodici.
Per ogni contenitore criogenico, contenente gameti, è presente
un registro contenente la suddivisione interna dello stesso, e il
contenuto in paillettes, con i riferimenti ai pazienti proprietari del
materiale crioconservato.
Al termine del congelamento viene rilasciata, da parte del
Centro, al paziente, una relazione conclusiva del trattamento dove
viene riportato il numero di paillettes congelati.
Tutti i contenitori criogenici vengono ispezionati con frequenza
quindicinale al fine di accertarne il livello di azoto liquido all’interno
ed eventalmente effettuarne il rabbocco; le operazioni di pulizia dei
contenitori criogenici vengono effettuate con cadenza annuale.
INDICAZIONI CLINICHE
Le indicazioni cliniche per cui un paziente si rivolge ad un
centro per la crioconservazione del liquido seminale sono molteplici:
1. Crioconservazione per inseminazione artificiale omologa
in alcune forme di ipofertilità maschile in cui il
trattamento farmacologico o chirurgico determinano un
peggioramento transitorio o definitivo.
2. Crioconservazione per inseminazione artificiale eterologa
(nei paesi dov'è consentito);
3. Crioconservazione per inseminazione artificiale omologa
in pazienti (anche con parametri normali) che presentano
difficoltà alla raccolta nei tempi stabiliti, mettendo così a
rischio l’intera procedura;
4. Crioconservazione del seme per pazienti che devono
sottoporsi a terapie antineoplastiche o comunque a terapie
spermiotossiche;
5. Crioconservazione
del
seme
in
pazienti
che
si
sottopongono a vasectomia.
TECNICA DI CONGELAMENTO
Terreno di crioconservazione
Freezing Medium Test Yolk Buffer (TYB) with Glycerol
(IRVINE Scientific):
12 % v/v Glycerol;
20 % egg yolk;
1.000 units/ml Penicillin G;
1.000 µg/ml Streptomycin Sulfate;
Il glicerolo ha la funzione di proteggere la cellula dai danni
dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio intracitoplasmatici.
Il tuorlo d’uovo, contiene fosfolipidi, che proteggono la
membrana dello spermatozoo, e lipoproteine che hanno un’azione
protettiva durante lo shock termico che avviene nella prima fase del
congelamento.
Paillettes per liquido seminale (0,25-0,5 ml);
Pipetman;
Pipette monouso sterili;
Puntali sterili;
Siringa da 1 ml;
LN2;
Tecnica
Al paziente viene illustrato il consenso informato, nel quale è
specificato che i campioni di sperma sono di esclusiva proprietà del
paziente e che, in caso di morte, verranno distrutti.
Il paziente viene istruito sulle corrette modalità per la raccolta
del campione seminale, che deve essere fatta "in loco".
Subito dopo la raccolta il liquido seminale viene posto a 37° e
dopo la liquefazione vengono valutati i parametri fondamentali:
volume
dell’eiaculato,
spermatozoi.
numero,
motilità
e
morfologia
degli
Si preparano delle paillettes per liquido seminale con su scritto,
cognome, nome, codice del paziente, n° scheda di congelamento e il
numero relativo di paillette, si determina la posizione in cui si
dovranno conservare in banca e si mette ad equilibrare a temperatura
ambiente il terreno di congelamento
Si diluisce a temperatura ambiente un ugual volume di liquido
seminale e terreno con crioprotettore (TYB + Glicerolo) (Rapporto
1:1) aggiungendolo goccia a goccia e miscelando bene, utilizzando il
Pipetman.
Si riempiono le paillettes collegandole ad una siringa per mezzo
di un puntale sterile e si chiude l’estremità aperta con la plastilina; dal
momento in cui si inizia la diluizione del liquido seminale con il
crioprotettore, al momento in cui le paillettes verranno poste a
contatto con i vapori di azoto liquido, non devono passare più di 10
minuti, per evitare l’azione tossica del crioprotettore.
Le paillettes sono dei tubicini in plastica della lunghezza di
circa 10 cm e del diametro di circa 2-3 mm che possono contenere
circa 0.25 ml di liquido. In media, sono sufficienti 2 o 3 campioni di
liquido seminale per ottenere la conservazione di circa 50-60 paillettes
per paziente.
Si ripongono le paillettes in un cestello forato, poste
orizzontalmente in modo ordinato, e si inserisce il cestello in un
contenitore di LN2 a circa 8 cm dal livello di LN2. Si mantiene il
cestello in quella posizione per 10 minuti, dove, dopo una prima fase
in cui la temperatura cala velocemente e il campione passa dallo stato
liquido a quello solido, la temperatura cala progressivamente fino ad
equilibrarsi con quella dei vapori di azoto (-150°).
Successivamente si procede con l’immersione delle paillettes
direttamente nell’azoto liquido e solo successivamente si trasferiscono
in banca nella posizione determinata.
Tutti i contenitori e le provette utilizzati portano scritti sul lato il
nome, il cognome e il codice del paziente proprietario dei gameti.
Il giorno dopo si procede ad uno "scongelamento di prova" per
registrare il numero di spermatozoi e la motilità residua.
Al paziente viene consegnata una relazione con il numero totale
di paillettes congelate e con la descrizione del campione seminale
prima e dopo lo scongelamento.
TECNICA DI SCONGELAMENTO
La
procedura
di
scongelamento
del
liquido
seminale
crioconservato è rapida.
Pipetman
Pipette monouso sterili
Forbici sterilizzate
Tubi Falcon da 15 ml monouso sterili
La tecnica di scongelamento, è un punto altrettanto importante
perché deve consentire alle cellule di recuperare le normali attività
biologiche limitando quanto più possibile rapide differenze di
temperatura. Infatti, al fine di evitare bruschi sbalzi termici è
necessario estrarre lentamente le paillettes dall’azoto liquido e
consentire il raggiungimento dell’equilibrio termico tra materiale
cellulare e ambiente esterno, si mantengono a temperatura ambiente
per 10 minuti e poi a 37 °C per altri 10 minuti; si tagliano le due
estremità delle paillettes e si fa fuoriuscire il liquido per gravità in un
tubo Falcon da 15 ml preriscaldato sul termoblock a +37°C.
Il liquido seminale così scongelato viene trattato prima
dell’utilizzo (vedi trattamento del liquido seminale).
Uno studio portato avanti da ricercatori polacchi e belgi
suggerisce di utilizzare la tecnica della "crioconservazione" per
'selezionare' gli spermatozoi migliori, quelli più vitali, per garantirsi
maggiore successo in caso di fecondazione con la tecnica dell'ICSI
(iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi) e, ciò che più fa
meditare, è la loro ulteriore conclusione che - nella fecondazione
assistita - gli spermatozoi congelati hanno lo stesso potenziale
riproduttivo di quelli freschi.
Gli studiosi hanno analizzato oltre duecento pazienti con liquido
seminale a ridotta fertilità. Il tasso di gravidanze per il ciclo di
trattamenti avviati è stata di quasi il 30% dopo l'ICSI con spermatozoi
freschi e quasi del 39% con spermatozoi congelati. Nei cicli successivi
il tasso è stato del 23% per quelli freschi e il 35% per quelli congelati.
Gli autori dello studio, sostengono che, la crioconservazione,
negli uomini con una 'cattiva' qualità del liquido seminale, non
influisce negativamente sul successo della fecondazione e gravidanze
dopo l'ICSI.
Risultati e Discussione
FERTILITA’ NEI SERRICOLTORI
Nel corso dell’anno 2004/2005, si sono rivolti al Centro di
Diagnosi e Cura della sterilità 133 pazienti di cui, 40 appartenenti alla
classe lavorativa “serricoltori” e 93 distribuiti nelle altre classi
lavorative non soggetti ad inquinamento da fitofarmaci.
Professioni
Impiegati
20
15,0%
Professionisti
13
9,8%
Serricoltori
40
30,1%
Operai
39
29,3%
Commercianti
14
10,5%
Altro
7
5,3%
Totale pazienti
133
DISTRIBUZIONE PROFESSIONI
11%
5%
15%
10%
29%
30%
Impiegati
Professionisti
Serricoltori
Operai
Commercianti
Altro
Dei 40 pazienti serricoltori 32 esami sono risultati patologici
(80%) e 8 (20%) rientravano nei canoni standard della normalità.
Dei 93 pazienti appartenenti ad altre classi lavorative 60 esami
sono patologici (64.5%) e 33 esami sono normali (35.5%).
Normali
Patologici
Altro
1
1%
6
6%
Commerciante
7
8%
7
8%
Impiegato
7
8%
13
14%
Operaio
14
15%
25
27%
Professionista
4
4%
9
10%
Serricoltore
8
20%
32
80%
DISTRIBUZIONE TRA PATOLOGICI E NORMALI
ALL'INTERNO DELLE CATEGORIE
LAVORATIVE
40
35
30
25
25
32
20
15
10
5
0
Patologici
Normali
13
7
14
6
1
7
7
9
4
8
tro iante egato eraio nista ltore
Al
pi
rc
Op essio rrico
Im
me
m
of
Se
Pr
Co
Dati i risultati ottenuti, la nostra ipotesi è che i lavoratori
appartenenti alla classe dei serricoltori hanno disturbi della
spermatogenesi maggiori rispetto alle altre classi lavorative.
Nonostante
i
dati ottenuti
abbiano dato
una
corretta
distribuzione Gaussiana e risultano dei dati con un’alta influenza,
applicato il test del χ2 P > 0.10, ξ=0.05 quindi P > ξ la nostra
probabilità di errore è del 10% per cui l’indagine non ha una
significatività statistica per via del limitato numero di casi.
CONFRONTO DATI SULL’INFERTILITÀ
Dati standard pubblicati qualche anno fa da Collins e Spira, ci
dicono che le cause d’infertilità sono attribuibili per circa il 50% alla
donna e per il 25% circa all’uomo.
CAUSA DI STERILITA’
SPIRA
COLLINS
Frequenza
Frequenza
Fattore Femminile
57 %
54 %
Difetto ovulatorio
29 %
27 %
Fattore tubarico
16 %
22 %
Endometriosi
7%
5%
Fattore Cervicale
2%
/
Fattore Uterino
3%
/
Fattore Maschile
21 %
25 %
Sterilità inspiegata
4%
17 %
Fattore Masch-Femm.
18 %
/
Altri
4%
/
Dai dati in nostro possesso relativi, ad individui di sesso
maschile residenti nella provincia di Ragusa, possiamo dire che
l’infertilità in tale zona è invece spostata verso il maschio.
Infatti, dei 133 pazienti maschi analizzati, il 69% sono
patologici.
Patologici
92
69%
Normali
41
31%
Totale Pazienti
133
DISTRIBUZIONE TRA PAZIENTI PATOLOGICI E
NORMALI
31%
Patologici
Normali
69%
GRUPPO DI CONTROLLO
Abbiamo inoltre preso in considerazione un gruppo di controllo
formato da coppie che hanno concepito un figlio nell’ultimo anno.
Fatto l’esame del liquido seminale abbiamo costatato che questi
pazienti hanno valori che rientrano nella normalità ad esclusione di 3
pazienti che hanno un’anomalia ma solo in uno dei tre parametri
(numerico, cinetico e morfologico) e i loro valori sono molto vicini
alla normalità.
Anche in questo gruppo ci sono 3 serricoltori, ma guardando le
caratteristiche di tali pazienti vediamo che sono individui molto
giovani e molto probabilmente lavorano nel settore da poco tempo.
MOTILITA’ POST CONGELAMENTO
Viste le richieste sempre più in aumento di pazienti, con un
liquido seminale di partenza già patologico, ma con necessità di
congelamento di questo, abbiamo condotto delle sperimentazione per
vedere la resistenza degli spermatozoi alle tecniche di congelamento.
Esaminato il liquido seminale di 51 pazienti di età compresa tra
i 20 e i 64 anni abbiamo rilevato che 24 pazienti sono patologici e 27
normali.
Allo scongelamento si osserva una differenza di sopravvivenza
tra gli spermatozoi mobili di tipo (a+b) e gli spermatozoi mobili di
tipo (c) indipendentemente dalla qualità del liquido seminale. Più
precisamente diciamo che gli spermatozoi (a+b) resistono meglio
degli spermatozoi (c) perché evidentemente presentano caratteristiche
chimico-fisiche che consentono allo spermatozoo di resistere alle
drastiche condizioni cui sono sottoposti con il congelamento.
CONFRONTO TRA SOPRAVVIVENZA DEI
MOBILI (a+b) E DEI MOBILI ( c)
23%
Media soprav (a+b)
34%
Media soprav ( c)
Abbiamo poi separato i liquidi seminali patologici dai normali
confrontando la rispettiva sopravvivenza dei mobili (a+b) al
congelamento.
Guardando ai dati pubblicati in European Journal of Obstetrics
Gynecology,
and
Reproductive
Biology in
seguito
ad
una
sperimentazione eseguita nel 2000, in cui sono stati congelati, con
tecniche diverse, i liquidi seminali di 63 pazienti ottenendo i seguenti
risultati di motilità post congelamento: 49+/-15.7, 43+/-15.2 e 52+/16.8%, abbiamo fissato intorno al 40% il parametro di buona motilità
post congelamento.
I nostri risultati ci dicono che il numero di spermatozoi mobili
(a+b) con motilità superiore al 40%, nei pazienti normali è del 63%
nei pazienti con liquido seminale patologico la percentuale scende al
25%.
Pazienti Patologici
24
47%
Pazienti normali
27
53%
51
Liquidi seminali
Patologici
Liquidi seminali
Normali
6
Patologici con motilità
post
congelamento>40%
25%
18
post
congelamento<40%
75%
17
Normali con motilità
post
congelamento>40%
63%
10
post
congelamento<40%
37%
DIFFERENZA DI SOPRAVVIVENZA TRA PAZIENTI
PATOLOGICI E NORMALI
100%
80%
60%
40%
20%
post
congelamento<40%
post
congelamento>40%
post
congelamento<40%
post
congelamento>40%
37%
75%
63%
25%
0%
Liquidi
seminali
Patologici
Liquidi
seminali
Normali
Ricordiamo che tra i pazienti patologici in questo database di 51
pazienti il 30% sono lavoratori serricoli.
Professioni
Impiegati
6
25,0%
Professionisti
2
8,3%
Serricoltori
7
29,2%
Operai
6
25,0%
Commercianti
2
8,3%
Altro
1
4,2%
Totale pazienti Patologici
24
DISTRIBUZIONE PROFESSIONI TRA PAZIENTI
PATOLOGICI
8%
4%
Impiegati
25%
Professionisti
Serricoltori
25%
Operai
8%
Commercianti
30%
Altro
Tra i pazienti con liquidi seminali nella norma la categoria
incide solo per il 15% quindi esattamente la metà, mentre per le altre
categorie di lavoratori le percentuali tra patologici e normali oscillano
di pochi punti percentuali.
Professioni
Impiegati
7
25,9%
Professionisti
3
11,1%
Serricoltori
4
14,8%
Operai
8
29,6%
Commercianti
2
7,4%
Altro
3
11,1%
Totale Pazienti Normali
27
DISTRIBUZIONE PROFESSIONI TRA PAZIENTI
NORMALI
7%
11%
26%
11%
30%
15%
Impiegati
Professionisti
Serricoltori
Operai
Commercianti
Altro
Per questo motivo possiamo concludere dicendo che i
serricoltori, nella provincia di Ragusa sono una delle categorie
lavorative più a rischio di infertilità; molto probabilmente a causa dei
prodotti tossici con cui vengono costantemente a contatto.
Tutte le informazioni raccolte a completamento di tale studio,
sono importanti per dare ai pazienti patologici e non (che si rivolgono
al centro con una richiesta di congelamento del liquido seminale)
indicazioni precise sulla tecnica di fecondazione medicalmente
assistita più adatta alle condizioni generali del liquido seminale.
Pertanto anche se ci troviamo dinanzi ad un paziente con
liquido seminale patologico che allo scongelamento presenta una
ridotta percentuale di spermatozoi mobili (a+b), possiamo ricorrere
alla tecnica ICSI che richiede esclusivamente uno spermatozoo.
Conclusione
I dati ottenuti ci danno modo di pensare che le motivazioni per
cui abbiamo cominciato questo tipo di sperimentazione cioè il
sospetto di una consistente incidenza dell’infertilità nei serricoltori
della provincia di Ragusa sia confermato, nonostante a causa del basso
numero di pazienti non risulti statisticamente significativo.
Nonostante ciò possiamo sicuramente richiamare l’attenzione
sul fatto che l’inquinamento ambientale causato da fitosanitari di uso
agricolo sia un fenomeno da monitorare e tenere sempre sotto
controllo.
A tale proposito dobbiamo dire che il lavoro svolto nella
provincia dal SPreSAL (Servizio Prevenzione e Sicurezza Ambienti di
Lavoro) sia lodevole in quanto rilevata una grande carenza di
formazione sui rischi specifici causato dai fitosanitari ed in particolare
su:
• Danni a breve e lungo termine alla salute;
• Corretto utilizzo degli indumenti di protezione (tute o
guanti resistenti ad agenti chimici);
• Corrette tecniche di utilizzo dei fitosanitari;
• Presidi sanitari di emergenza a cui rivolgersi in caso di
malessere da esposizione a fitosanitari;
• Incapacità, per scarsa formazione o professionalità, dei
rivenditori di fitosanitari ad essere un valido supporto
all’attività degli agricoltori.
Il SpreSAL si è impegnato in collaborazione con l’I.P.A., alla
organizzazione dei corsi di aggiornamento previsti prima dal D.P.R.
290/01 ed ora dal Decreto 29 luglio 2003 della Regione Siciliana
fornendo docenza su argomenti medico – igienico - prevenzionali.
Così come stabilito dall’art.5 del succitato decreto, l’IPA
rilascia l’attestazione di partecipazione e solo dopo il superamento di
un colloquio avanti una commissione esaminatrice l’autorizzazione
(Patentino Fitosanitario) all’acquisto per l’uso di fitosanitari e loro
coadiuvanti classificati molto tossici, tossici o nocivi.
Dal 2003 ad oggi sono stati formati n° 2270 operatori e sono
stati già rilasciati n° 1733 nuovi patentini e rinnovati n° 900 patentini.
C’è anche da dire che il Ministero della Salute risulta attento agli
effetti dei fitosanitari a dimostrazione di questo possiamo citare
l’ultimo Decreto del 21 febbraio 2005 in cui si impone la sospensione,
in via cautelativa, dell’autorizzazione all’immissione in commercio e
all’impiego dei prodotti fitosanitari a base delle sostanze attive
carbendazim e dinocap, in considerazione della classificazione di
queste sostanze attive in categoria 2 di tossicità per la riproduzione
(sono inserite nella categoria 2 tutte le sostanze considerate in grado di
danneggiare la fertilità negli esseri umani, oppure le sostanze che
provocano effetti tossici sullo sviluppo umano) recentemente attribuita
e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria. (GU n.
60 del 14-3-2005). Riguardando la tabella dei prodotti maggiormente
utilizzati nella provincia, insieme a tanti altri sono presenti anche i su
citati prodotti.
Bibliografia
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Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus
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Cambridge.
MINISTERO DELLA SALUTE
DECRETO 21 febbraio 2005
Sospensione, in via cautelativa, dell'autorizzazione all'immissione
in commercio e all'impiego dei prodotti fitosanitari a base della
sostanza attiva dinocap.
IL DIRETTORE GENERALE
della sanita' veterinaria e degli alimenti
Visto l'art. 6 della legge 30 aprile 1962, n. 283, modificato dall'art.
4 della legge 26 febbraio 1963, n. 441, concernente la disciplina
igienica degli alimenti;
Vista la circolare del Ministero della sanita' 3 settembre 1990, n. 20,
concernente «Aspetti applicativi delle norme vigenti in materia di
registrazione dei presidi sanitari»;
Visti i decreti con i quali i prodotti fitosanitari di cui all'allegato
al presente decreto sono stati autorizzati per essere immessi in
commercio;
Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, che detta norme
generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle
amministrazioni pubbliche;
Visto il regolamento (CEE) n. 3600/92, recante disposizioni
d'attuazione della prima fase del programma di lavoro di revisione
comunitaria delle sostanze attive presenti sul territorio della
comunita' europea alla data del 26 luglio 1993, tra le quali e'
compresa la sostanza attiva dinocap;
Visto il decreto legislativo 17 marzo 1995, n. 194, di attuazione della
direttiva n. 91/414/CEE, relativo alla immissione in commercio di
prodotti fitosanitari;
Vista la circolare del Ministero della sanita' 10 giugno 1995, n. 17,
concernente gli aspetti applicativi delle nuove norme in materia di
autorizzazione di prodotti fitosanitari;
Visto, in particolare, il comma 1, lettera b) dell'art. 4 della citata
direttiva n. 91/414/CEE, che stabilisce che un prodotto puo' essere
autorizzato solo se, tra l'altro, non produce effetti nocivi in maniera
diretta o indiretta sulla salute dell'uomo o degli animali o sulle acque
sotterranee;
Visto il decreto legislativo 14 marzo 2003, n. 65, modificato dal
decreto legislativo 28 luglio 2004, n. 260, di attuazione delle
direttive
n.
1999/45/CE e n. 2001/60/CE relative alla
classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura dei preparati
pericolosi;
Visto il decreto del Ministro della salute del 14 giugno 2002 di
recepimento della direttiva n. 2001/59/CE del 6 agosto 2001, recante
il ventottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n.
67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione,
imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose;
Visto il paragrafo 4.2 dell'allegato VI del citato decreto
ministeriale 14 giugno 2002 e in particolare le definizioni secondo le
quali: le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di
danneggiare la fertilita' negli esseri umani» oppure le «sostanze che
dovrebbero essere considerate in grado di provocare effetti tossici
sullo sviluppo umano» sono classificate in categoria 2 di tossicita' per
la riproduzione,
Vista la direttiva n. 2004/73/CE del 29 aprile 2004, che dovra'
essere recepita entro il 31 ottobre 2005, recante il ventinovesimo
adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del
27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed
etichettatura delle sostanze pericolose, secondo la quale alla
sostanza attiva dinocap e' attribuita la categoria 2 di tossicita' per la
riproduzione;
Visto l'art. 11 della direttiva n. 91/414/CEE, secondo il quale uno
Stato membro puo' limitare o proibire provvisoriamente l'uso e la
vendita nel proprio territorio di un prodotto fitosanitario da esso
autorizzato se ha motivo valido per ritenere che tale prodotto
costituisca un rischio per la salute umana o degli animali o per
l'ambiente;
Visto l'art. 7 del regolamento (CE) n. 178/2002 che definisce il
principio di precauzione secondo il quale, in situazioni di
incertezza sul piano scientifico, possono essere adottate misure
provvisorie di gestione del rischio necessarie per garantire
l'elevato livello di tutela della salute che la Comunita' persegue;
Acquisiti i pareri espressi dall'Istituto Superiore di Sanita' in merito
alla riclassificazione dei prodotti fitosanitari attualmente autorizzati
in Italia in attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE,
di cui l'ultimo in data 3 gennaio 2005, secondo i quali i prodotti
fitosanitari contenenti la sostanza attiva dinocap non possono essere
commercializzati;
Sentita l'impresa titolare della documentazione presentata per la
revisione
comunitaria della sostanza attiva dinocap, che
nell'audizione del 28 aprile 2004 ha rappresentato la propria
posizione alla Commissione consultiva per i prodotti fitosanitari di
cui all'art. 20 del citato decreto legislativo n.194/1995;
Acquisito il parere del 28 aprile 2004 della sopra citata
Commissione consultiva che ha comunque proposto l'eliminazione
dal commercio dei prodotti fitosanitari contenenti dinocap, in
considerazione della classificazione della sostanza attiva in
categoria 2 di tossicita' per la riproduzione;
Sentita l'associazione di categoria Agrofarma che nell'audizione del
16 settembre 2004 ha illustrato alla sopra citata Commissione
consultiva la posizione delle imprese in merito alle problematiche
relative alle sostanze attive di categoria 2 di cancerogenesi,
mutagenesi o tossicita' per la riproduzione;
Considerato quanto esposto dal Ministro della salute con la nota del
14 luglio 2004 diretta al Commissario europeo per la salute e la
protezione dei consumatori al fine di definire criteri armonizzati
sulla valutazione e la gestione delle problematiche legate ai
prodotti fitosanitari contenenti sostanze attive che presentano
preoccupazioni di tipo sanitario, anche in applicazione del principio di
precauzione;
Considerato quanto esposto nella nota del 12 ottobre 2004 dal
Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori
nella quale, tra l'altro, viene indicato che gli Stati membri possono
continuare ad autorizzare prodotti contenenti sostanze attive gia'
presenti sul mercato europeo alla data del 26 luglio 1993 in base ai
criteri generali di cui al citato art. 4 della direttiva n.
91/414/CEE, in attesa della conclusione della procedura di revisione
comunitaria delle sostanze stesse;
Acquisito l'ulteriore parere espresso in data 16 dicembre 2004
dall'Istituto Superiore di Sanita' che, tenuto conto delle
indicazioni espresse dal Commissario europeo per la salute e la
protezione dei consumatori e in applicazione del principio di
precauzione, ha tra l'altro riaffermato la non ammissibilita' dei
prodotti contenenti sostanze attive di categoria 1 o 2 di
cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione per le
quali e' ancora in corso il processo di revisione comunitaria;
Considerato che non si e' ancora conclusa la revisione comunitaria
della sostanza attiva dinocap ai sensi del citato regolamento (CEE) n.
3600/92;
Ritenuto di dare applicazione al citato principio di precauzione
attraverso l'adozione di misure provvisorie che consentano di
raggiungere un elevato livello di tutela della salute;
Ritenuto pertanto di dover sospendere, in via cautelativa,
l'immissione in commercio e l'impiego di prodotti fitosanitari
contenenti la sostanza attiva dinocap, in considerazione della
classificazione tossicologica recentemente attribuita e in attesa della
conclusione della sua revisione comunitaria;
Decreta:
1. Le autorizzazioni all'immissione in commercio e all'impiego di
tutti i prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente
decreto, contenenti la sostanza attiva dinocap sono sospese in
considerazione della attuale classificazione in categoria 2 di
tossicita' per la riproduzione di tale sostanza attiva e in attesa
della conclusione della revisione comunitaria.
2. Alle
imprese titolari delle autorizzazioni dei prodotti
fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto viene
concesso un periodo di novanta giorni per provvedere al ritiro
delle scorte giacenti sia presso i magazzini che presso gli esercizi
di vendita.
3. Le medesime imprese sono tenute ad adottare nei confronti degli
utilizzatori ogni iniziativa idonea ad assicurare una corretta
informazione in merito ai prodotti fitosanitari di cui trattasi.
Il presente decreto sara' pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana ed entra in vigore il giorno successivo alla sua
pubblicazione.
Roma, 21 febbraio 2005
Il direttore generale: Marabelli
DECRETO 21 febbraio 2005
Sospensione, in via cautelativa, dell'autorizzazione all'immissione
in commercio e all'impiego dei prodotti fitosanitari a base della
sostanza attiva carbendazim.
IL DIRETTORE GENERALE
della sanita' veterinaria e degli alimenti
Visto l'art. 6 della legge 30 aprile 1962, n. 283, modificato dall'art.
4 della legge 26 febbraio 1963, n. 441, concernente la disciplina
igienica degli alimenti;
Vista la circolare del Ministero della sanita' 3 settembre 1990, n. 20,
concernente «Aspetti applicativi delle norme vigenti in materia di
registrazione dei presidi sanitari»;
Visti i decreti con i quali i prodotti fitosanitari di cui all'allegato
al presente decreto sono stati autorizzati per essere immessi in
commercio;
Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, che detta norme
generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle
amministrazioni pubbliche;
Visto il regolamento (CEE) n. 3600/92, recante disposizioni
d'attuazione della prima fase del programma di lavoro di revisione
comunitaria delle sostanze attive presenti sul territorio della
comunita' europea alla data del 26 luglio 1993, tra le quali e'
compresa la sostanza attiva carbendazim;
Visto il decreto legislativo 17 marzo 1995, n. 194, di attuazione della
direttiva n. 91/414/CEE, relativo alla immissione in commercio di
prodotti fitosanitari;
Vista la circolare del Ministero della sanita' 10 giugno 1995, n. 17,
concernente gli aspetti applicativi delle nuove norme in materia di
autorizzazione di prodotti fitosanitari;
Visto, in particolare, il comma 1, lettera b) dell'art. 4 della citata
direttiva n. 91/414/CEE, che stabilisce che un prodotto puo' essere
autorizzato solo se, tra l'altro, non produce effetti nocivi in maniera
diretta o indiretta sulla salute dell'uomo o degli animali o sulle acque
sotterranee;
Visto il decreto legislativo 14 marzo 2003, n. 65, modificato dal
decreto legislativo 28 luglio 2004, n. 260, di attuazione delle
direttive
n.
1999/45/CE e n. 2001/60/CE relative alla
classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura dei preparati
pericolosi;
Visto il decreto del Ministro della salute del 14 giugno 2002 di
recepimento della direttiva n. 2001/59/CE del 6 agosto 2001, recante
il ventottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n.
67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione,
imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose;
Visto il paragrafo 4.2 dell'allegato VI del citato decreto
ministeriale 14 giugno 2002 e in particolare le definizioni secondo le
quali: le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di
danneggiare la fertilita' negli esseri umani» oppure le «sostanze che
dovrebbero essere considerate in grado di provocare effetti tossici
sullo sviluppo umano» sono classificate in categoria 2 di tossicita' per
la riproduzione,
Vista la direttiva n. 2004/73/CE del 29 aprile 2004, che dovra'
essere recepita entro il 31 ottobre 2005, recante il ventinovesimo
adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del
27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed
etichettatura delle sostanze pericolose, secondo la quale alla
sostanza attiva carbendazim e' attribuita la categoria 2 di tossicita'
per la riproduzione;
Visto l'art. 11 della direttiva n. 91/414/CEE, secondo il quale uno
Stato membro puo' limitare o proibire provvisoriamente l'uso e la
vendita nel proprio territorio di un prodotto fitosanitario da esso
autorizzato se ha motivo valido per ritenere che tale prodotto
costituisca un rischio per la salute umana o degli animali o per
l'ambiente;
Visto l'art. 7 del regolamento (CE) n. 178/2002 che definisce il
principio di precauzione secondo il quale, in situazioni di
incertezza sul piano scientifico, possono essere adottate misure
provvisorie di gestione del rischio necessarie per garantire
l'elevato livello di tutela della salute che la Comunita' persegue;
Acquisiti i pareri espressi dall'Istituto Superiore di Sanita' in merito
alla riclassificazione dei prodotti fitosanitari attualmente autorizzati
in Italia in attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE,
di cui l'ultimo in data 3 gennaio 2005, secondo i quali i prodotti
fitosanitari contenenti la sostanza attiva carbendazim non possono
essere commercializzati;
Sentita l'impresa titolare della documentazione presentata per la
revisione comunitaria della sostanza attiva carbendazim, che
nell'audizione del 28 aprile 2004 ha rappresentato la propria
posizione alla Commissione consultiva per i prodotti fitosanitari di
cui all'art. 20 del citato decreto legislativo n.194/1995;
Acquisito il parere del 28 aprile 2004 della sopra citata
Commissione consultiva che ha comunque proposto l'eliminazione
dal commercio dei prodotti fitosanitari contenenti carbendazim,
in considerazione della classificazione della sostanza attiva in
categoria 2 di tossicita' per la riproduzione;
Sentita l'associazione di categoria Agrofarma che nell'audizione del
16 settembre 2004 ha illustrato alla sopra citata Commissione
consultiva la posizione delle imprese in merito alle problematiche
relative alle sostanze attive di categoria 2 di cancerogenesi,
mutagenesi o tossicita' per la riproduzione;
Considerato quanto esposto dal Ministro della salute con la nota del
14 luglio 2004 diretta al Commissario europeo per la salute e la
protezione dei consumatori al fine di definire criteri armonizzati
sulla valutazione e la gestione delle problematiche legate ai
prodotti fitosanitari contenenti sostanze attive che presentano
preoccupazioni di tipo sanitario, anche in applicazione del principio di
precauzione;
Considerato quanto esposto nella nota del 12 ottobre 2004 dal
Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori
nella quale, tra l'altro, viene indicato che gli Stati membri possono
continuare ad autorizzare prodotti contenenti sostanze attive gia'
presenti sul mercato europeo alla data del 26 luglio 1993 in base ai
criteri generali di cui al citato art. 4 della direttiva n.
91/414/CEE, in attesa della conclusione della procedura di revisione
comunitaria delle sostanze stesse;
Acquisito l'ulteriore parere espresso in data 16 dicembre 2004
dall'Istituto Superiore di Sanita' che, tenuto conto delle
indicazioni espresse dal Commissario europeo per la salute e la
protezione dei consumatori e in applicazione del principio di
precauzione, ha tra l'altro riaffermato la non ammissibilita' dei
prodotti contenenti sostanze attive di categoria 1 o 2 di
cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione per le
quali e' ancora in corso il processo di revisione comunitaria;
Considerato che non si e' ancora conclusa la revisione comunitaria
della sostanza attiva carbendazim ai sensi del citato regolamento
(CEE) n. 3600/92;
Ritenuto di dare applicazione al citato principio di precauzione
attraverso l'adozione di misure provvisorie che consentano di
raggiungere un elevato livello di tutela della salute;
Ritenuto pertanto di dover sospendere, in via cautelativa,
l'immissione in commercio e l'impiego di prodotti fitosanitari
contenenti la sostanza attiva carbendazim, in considerazione della
classificazione tossicologica recentemente attribuita e in attesa della
conclusione della sua revisione comunitaria;
Decreta:
1. Le autorizzazioni all'immissione in commercio e all'impiego di
tutti i prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente
decreto, contenenti la sostanza attiva carbendazim sono
sospese in considerazione della attuale classificazione in
categoria 2 di tossicita' per la riproduzione di tale sostanza attiva
e in attesa della conclusione della revisione comunitaria.
2. Alle
imprese titolari delle autorizzazioni dei prodotti
fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto viene
concesso un periodo di novanta giorni per provvedere al ritiro
delle scorte giacenti sia presso i magazzini che presso gli esercizi
di vendita.
3. Le medesime imprese sono tenute ad adottare nei confronti degli
utilizzatori ogni iniziativa idonea ad assicurare una corretta
informazione in merito ai prodotti fitosanitari di cui trattasi.
Il presente decreto sara' pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana ed entra in vigore il giorno successivo alla sua
pubblicazione.
Roma, 21 febbraio 2005
Il direttore generale: Marabelli
Legge 19 febbraio 2004, n. 40
"Norme in materia di procreazione medicalmente assistita"
pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n. 45 del 24 febbraio 2004
CAPO I
PRINCÌPI GENERALI
ART. 1.
(Finalità).
1. Al fine di favorire la soluzione dei problemi riproduttivi derivanti
dalla sterilità o dalla infertilità umana è consentito il ricorso alla
procreazione medicalmente assistita, alle condizioni e secondo le
modalità previste dalla presente legge, che assicura i diritti di tutti i
soggetti coinvolti, compreso il concepito.
2. Il ricorso alla procreazione medicalmente assistita è consentito
qualora non vi siano altri metodi terapeutici efficaci per rimuovere
le cause di sterilità o infertilità.
ART. 2.
(Interventi contro la sterilità e la infertilità).
1. Il Ministro della salute, sentito il Ministro dell'istruzione,
dell'università e della ricerca, può promuovere ricerche sulle cause
patologiche, psicologiche, ambientali e sociali dei fenomeni della
sterilità e della infertilità e favorire gli interventi necessari per
rimuoverle nonché per ridurne l'incidenza, può incentivare gli studi
e le ricerche sulle tecniche di crioconservazione dei gameti e può
altresí promuovere campagne di informazione e di prevenzione dei
fenomeni della sterilità e della infertilità.
2. Per le finalità di cui al comma 1 è autorizzata la spesa massima di 2
milioni di euro a decorrere dal 2004.
3. All'onere derivante dall'attuazione del comma 2 si provvede
mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai
fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità
previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato
di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno
2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento
relativo al Ministero della salute. Il Ministro dell'economia e delle
finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti
variazioni di bilancio.
ART. 3.
(Modifica alla legge 29 luglio 1975, n. 405).
1. Al primo comma dell'articolo 1 della legge 29 luglio 1975, n. 405,
sono aggiunte, in fine, le seguenti lettere:
"d-bis) l'informazione e l'assistenza riguardo ai problemi della sterilità
e della infertilità umana, nonché alle tecniche di procreazione
medicalmente assistita;
d-ter) l'informazione sulle procedure per l'adozione e l'affidamento
familiare".
Dall'attuazione del presente articolo non devono derivare nuovi o
maggiori oneri a carico della finanza pubblica.
CAPO II
ACCESSO ALLE TECNICHE
ART. 4.
(Accesso alle tecniche).
1. Il ricorso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita è
consentito solo quando sia accertata l'impossibilità di rimuovere
altrimenti le cause impeditive della procreazione ed è comunque
circoscritto ai casi di sterilità o di infertilità inspiegate documentate
da atto medico nonché ai casi di sterilità o di infertilità da causa
accertata e certificata da atto medico.
2. Le tecniche di procreazione medicalmente assistita sono applicate
in base ai seguenti princípi:
a) gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi un grado
di invasività tecnico e psicologico più gravoso per i destinatari,
ispirandosi al principio della minore invasività;
b) consenso informato, da realizzare ai sensi dell'articolo 6.
3. È vietato il ricorso a tecniche di procreazione medicalmente
assistita di tipo eterologo.
ART. 5.
(Requisiti soggettivi).
1. Fermo restando quanto stabilito dall'articolo 4, comma 1, possono
accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita
coppie di maggiorenni di sesso diverso, coniugate o conviventi, in
età potenzialmente fertile, entrambi viventi.
1.
2.
3.
4.
5.
ART. 6.
(Consenso informato).
Per le finalità indicate dal comma 3, prima del ricorso ed in ogni
fase di applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente
assistita il medico informa in maniera dettagliata i soggetti di cui
all'articolo 5 sui metodi, sui problemi bioetici e sui possibili effetti
collaterali sanitari e psicologici conseguenti all'applicazione delle
tecniche stesse, sulle probabilità di successo e sui rischi dalle stesse
derivanti, nonché sulle relative conseguenze giuridiche per la
donna, per l'uomo e per il nascituro. Alla coppia deve essere
prospettata la possibilità di ricorrere a procedure di adozione o di
affidamento ai sensi della legge 4 maggio 1983, n. 184, e
successive modificazioni, come alternativa alla procreazione
medicalmente assistita. Le informazioni di cui al presente comma e
quelle concernenti il grado di invasività delle tecniche nei confronti
della donna e dell'uomo devono essere fornite per ciascuna delle
tecniche applicate e in modo tale da garantire il formarsi di una
volontà consapevole e consapevolmente espressa.
Alla coppia devono essere prospettati con chiarezza i costi
economici dell'intera procedura qualora si tratti di strutture private
autorizzate.
La volontà di entrambi i soggetti di accedere alle tecniche di
procreazione medicalmente assistita è espressa per iscritto
congiuntamente al medico responsabile della struttura, secondo
modalità definite con decreto dei Ministri della giustizia e della
salute, adottato ai sensi dell'articolo 17, comma 3, della legge 23
agosto 1988, n. 400, entro tre mesi dalla data di entrata in vigore
della presente legge. Tra la manifestazione della volontà e
l'applicazione della tecnica deve intercorrere un termine non
inferiore a sette giorni. La volontà può essere revocata da ciascuno
dei soggetti indicati dal presente comma fino al momento della
fecondazione dell'ovulo.
Fatti salvi i requisiti previsti dalla presente legge, il medico
responsabile della struttura può decidere di non procedere alla
procreazione medicalmente assistita, esclusivamente per motivi di
ordine medico-sanitario. In tale caso deve fornire alla coppia
motivazione scritta di tale decisione.
Ai richiedenti, al momento di accedere alle tecniche di
procreazione medicalmente assistita, devono essere esplicitate con
chiarezza e mediante sottoscrizione le conseguenze giuridiche di
cui all'articolo 8 e all'articolo 9 della presente legge.
ART. 7.
(Linee guida).
1. Il Ministro della salute, avvalendosi dell'Istituto superiore di sanità,
e previo parere del Consiglio superiore di sanità, definisce, con
proprio decreto, da emanare entro tre mesi dalla data di entrata in
vigore della presente legge, linee guida contenenti l'indicazione
delle procedure e delle tecniche di procreazione medicalmente
assistita.
2. Le linee guida di cui al comma 1 sono vincolanti per tutte le
strutture autorizzate.
3. Le linee guida sono aggiornate periodicamente, almeno ogni tre
anni, in rapporto all'evoluzione tecnico-scientifica, con le
medesime procedure di cui al comma 1.
CAPO III
DISPOSIZIONI CONCERNENTI LA TUTELA DEL NASCITURO
ART. 8.
(Stato giuridico del nato).
1. I nati a seguito dell'applicazione delle tecniche di procreazione
medicalmente assistita hanno lo stato di figli legittimi o di figli
riconosciuti della coppia che ha espresso la volontà di ricorrere alle
tecniche medesime ai sensi dell'articolo 6.
ART. 9.
(Divieto del disconoscimento della paternità e dell'anonimato della
madre).
1. Qualora si ricorra a tecniche di procreazione medicalmente assistita
di tipo eterologo in violazione del divieto di cui all'articolo 4,
comma 3, il coniuge o il convivente il cui consenso è ricavabile da
atti concludenti non può esercitare l'azione di disconoscimento
della paternità nei casi previsti dall'articolo 235, primo comma,
numeri 1) e 2), del codice civile, né l'impugnazione di cui
all'articolo 263 dello stesso codice.
2. La madre del nato a seguito dell'applicazione di tecniche di
procreazione medicalmente assistita non può dichiarare la volontà
di non essere nominata, ai sensi dell'articolo 30, comma 1, del
regolamento di cui al decreto del Presidente della Repubblica 3
novembre 2000, n. 396.
3. In caso di applicazione di tecniche di tipo eterologo in violazione
del divieto di cui all'articolo 4, comma 3, il donatore di gameti non
acquisisce alcuna relazione giuridica parentale con il nato e non
può far valere nei suoi confronti alcun diritto né essere titolare di
obblighi.
CAPO IV
REGOLAMENTAZIONE DELLE STRUTTURE AUTORIZZATE
ALL'APPLICAZIONE DELLE TECNICHE DI PROCREAZIONE
MEDICALMENTE ASSISTITA
ART. 10.
(Strutture autorizzate).
1. Gli interventi di procreazione medicalmente assistita sono
realizzati nelle strutture pubbliche e private autorizzate dalle
regioni e iscritte al registro di cui all'articolo 11.
2. Le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano
definiscono con proprio atto, entro tre mesi dalla data di entrata in
vigore della presente legge:
a) i requisiti tecnico-scientifici e organizzativi delle strutture;
b) le caratteristiche del personale delle strutture;
c) i criteri per la determinazione della durata delle autorizzazioni e dei
casi di revoca delle stesse;
d) i criteri per lo svolgimento dei controlli sul rispetto delle
disposizioni della presente legge e sul permanere dei requisiti
tecnico-scientifici e organizzativi delle strutture.
ART. 11.
(Registro).
1. È istituito, con decreto del Ministro della salute, presso l'Istituto
superiore di sanità, il registro nazionale delle strutture autorizzate
all'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente
assistita, degli embrioni formati e dei nati a seguito
dell'applicazione delle tecniche medesime.
2. L'iscrizione al registro di cui al comma 1 è obbligatoria.
3. L'Istituto superiore di sanità raccoglie e diffonde, in collaborazione
con gli osservatori epidemiologici regionali, le informazioni
necessarie al fine di consentire la trasparenza e la pubblicità delle
tecniche di procreazione medicalmente assistita adottate e dei
risultati conseguiti.
4. L'Istituto superiore di sanità raccoglie le istanze, le informazioni, i
suggerimenti, le proposte delle società scientifiche e degli utenti
riguardanti la procreazione medicalmente assistita.
5. Le strutture di cui al presente articolo sono tenute a fornire agli
osservatori epidemiologici regionali e all'Istituto superiore di sanità
i dati necessari per le finalità indicate dall'articolo 15 nonché ogni
altra informazione necessaria allo svolgimento delle funzioni di
controllo e di ispezione da parte delle autorità competenti.
6. All'onere derivante dall'attuazione del presente articolo,
determinato nella misura massima di 154.937 euro a decorrere
dall'anno 2004, si provvede mediante corrispondente riduzione
dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006,
nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo
speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e
delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando
l'accantonamento relativo al Ministero della salute. Il Ministro
dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri
decreti, le occorrenti variazioni di bilancio.
CAPO V
DIVIETI E SANZIONI
ART. 12.
(Divieti generali e sanzioni).
1. Chiunque a qualsiasi titolo utilizza a fini procreativi gameti di
soggetti estranei alla coppia richiedente, in violazione di quanto
previsto dall'articolo 4, comma 3, è punito con la sanzione
amministrativa pecuniaria da 300.000 a 600.000 euro.
2. Chiunque a qualsiasi titolo, in violazione dell'articolo 5, applica
tecniche di procreazione medicalmente assistita a coppie i cui
componenti non siano entrambi viventi o uno dei cui componenti
sia minorenne ovvero che siano composte da soggetti dello stesso
sesso o non coniugati o non conviventi è punito con la sanzione
amministrativa pecuniaria da 200.000 a 400.000 euro.
3. Per l'accertamento dei requisiti di cui al comma 2 il medico si
avvale di una dichiarazione sottoscritta dai soggetti richiedenti. In
caso di dichiarazioni mendaci si applica l'articolo 76, commi 1 e 2,
del testo unico delle disposizioni legislative e regolamentari in
materia di documentazione amministrativa, di cui al decreto del
Presidente della Repubblica 28 dicembre 2000, n. 445.
4. Chiunque applica tecniche di procreazione medicalmente assistita
senza avere raccolto il consenso secondo le modalità di cui
all'articolo 6 è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da
5.000 a 50.000 euro.
5. Chiunque a qualsiasi titolo applica tecniche di procreazione
medicalmente assistita in strutture diverse da quelle di cui
all'articolo 10 è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria
da 100.000 a 300.000 euro.
6. Chiunque, in qualsiasi forma, realizza, organizza o pubblicizza la
commercializzazione di gameti o di embrioni o la surrogazione di
maternità è punito con la reclusione da tre mesi a due anni e con la
multa da 600.000 a un milione di euro.
7. Chiunque realizza un processo volto ad ottenere un essere umano
discendente da un'unica cellula di partenza, eventualmente
identico, quanto al patrimonio genetico nucleare, ad un altro essere
umano in vita o morto, è punito con la reclusione da dieci a venti
anni e con la multa da 600.000 a un milione di euro. Il medico è
punito, altresí, con l'interdizione perpetua dall'esercizio della
professione.
8. Non sono punibili l'uomo o la donna ai quali sono applicate le
tecniche nei casi di cui ai commi 1, 2, 4 e 5.
9. È disposta la sospensione da uno a tre anni dall'esercizio
professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria
condannato per uno degli illeciti di cui al presente articolo, salvo
quanto previsto dal comma 7.
10.L'autorizzazione concessa ai sensi dell'articolo 10 alla struttura al
cui interno è eseguita una delle pratiche vietate ai sensi del presente
articolo è sospesa per un anno. Nell'ipotesi di più violazioni dei
divieti di cui al presente articolo o di recidiva l'autorizzazione può
essere revocata.
CAPO VI
MISURE DI TUTELA DELL'EMBRIONE
ART. 13.
(Sperimentazione sugli embrioni umani).
1. È vietata qualsiasi sperimentazione su ciascun embrione umano.
2. La ricerca clinica e sperimentale su ciascun embrione umano è
consentita a condizione che si perseguano finalità esclusivamente
terapeutiche e diagnostiche ad essa collegate volte alla tutela della
3.
a)
b)
c)
d)
4.
5.
salute e allo sviluppo dell'embrione stesso, e qualora non siano
disponibili metodologie alternative.
Sono, comunque, vietati:
la produzione di embrioni umani a fini di ricerca o di
sperimentazione o comunque a fini diversi da quello previsto dalla
presente legge;
ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei
gameti ovvero interventi che, attraverso tecniche di selezione, di
manipolazione o comunque tramite procedimenti artificiali, siano
diretti ad alterare il patrimonio genetico dell'embrione o del gamete
ovvero a predeterminarne caratteristiche genetiche, ad eccezione
degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche, di cui al
comma 2 del presente articolo;
interventi di clonazione mediante trasferimento di nucleo o di
scissione precoce dell'embrione o di ectogenesi sia a fini
procreativi sia di ricerca;
la fecondazione di un gamete umano con un gamete di specie
diversa e la produzione di ibridi o di chimere.
La violazione dei divieti di cui al comma 1 è punita con la
reclusione da due a sei anni e con la multa da 50.000 a 150.000
euro. In caso di violazione di uno dei divieti di cui al comma 3 la
pena è aumentata. Le circostanze attenuanti concorrenti con le
circostanze aggravanti previste dal comma 3 non possono essere
ritenute equivalenti o prevalenti rispetto a queste.
È disposta la sospensione da uno a tre anni dall'esercizio
condannato per uno degli illeciti di cui al presente articolo.
ART. 14.
(Limiti all'applicazione delle tecniche sugli embrioni).
1. È vietata la crioconservazione e la soppressione di embrioni, fermo
restando quanto previsto dalla legge 22 maggio 1978, n. 194.
2. Le tecniche di produzione degli embrioni, tenuto conto
dell'evoluzione tecnico-scientifica e di quanto previsto dall'articolo
7, comma 3, non devono creare un numero di embrioni superiore a
quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo
impianto, comunque non superiore a tre.
3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti
possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa
4.
5.
6.
7.
8.
9.
allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della
fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni
stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena
possibile.
Ai fini della presente legge sulla procreazione medicalmente
assistita è vietata la riduzione embrionaria di gravidanze plurime,
salvo nei casi previsti dalla legge 22 maggio 1978, n. 194.
I soggetti di cui all'articolo 5 sono informati sul numero e, su loro
richiesta, sullo stato di salute degli embrioni prodotti e da trasferire
nell'utero.
La violazione di uno dei divieti e degli obblighi di cui ai commi
precedenti è punita con la reclusione fino a tre anni e con la multa
da 50.000 a 150.000 euro.
È disposta la sospensione fino ad un anno dall'esercizio
condannato per uno dei reati di cui al presente articolo.
È consentita la crioconservazione dei gameti maschile e femminile,
previo consenso informato e scritto.
La violazione delle disposizioni di cui al comma 8 è punita con la
sanzione amministrativa pecuniaria da 5.000 a 50.000 euro.
CAPO VII
DISPOSIZIONI FINALI E TRANSITORIE
ART. 15.
(Relazione al Parlamento).
1. L'Istituto superiore di sanità predispone, entro il 28 febbraio di
ciascun anno, una relazione annuale per il Ministro della salute in
base ai dati raccolti ai sensi dell'articolo 11, comma 5, sull'attività
delle strutture autorizzate, con particolare riferimento alla
valutazione epidemiologica delle tecniche e degli interventi
effettuati.
2. Il Ministro della salute, sulla base dei dati indicati al comma 1,
presenta entro il 30 giugno di ogni anno una relazione al
Parlamento sull'attuazione della presente legge.
ART. 16.
(Obiezione di coscienza).
1. Il personale sanitario ed esercente le attività sanitarie ausiliarie non
è tenuto a prendere parte alle procedure per l'applicazione delle
tecniche di procreazione medicalmente assistita disciplinate dalla
presente legge quando sollevi obiezione di coscienza con
preventiva dichiarazione. La dichiarazione dell'obiettore deve
essere comunicata entro tre mesi dalla data di entrata in vigore
della presente legge al direttore dell'azienda unità sanitaria locale o
dell'azienda ospedaliera, nel caso di personale dipendente, al
direttore sanitario, nel caso di personale dipendente da strutture
private autorizzate o accreditate.
2. L'obiezione può essere sempre revocata o venire proposta anche al
di fuori dei termini di cui al comma 1, ma in tale caso la
dichiarazione produce effetto dopo un mese dalla sua presentazione
agli organismi di cui al comma 1.
3. L'obiezione di coscienza esonera il personale sanitario ed esercente
le attività sanitarie ausiliarie dal compimento delle procedure e
delle attività specificatamente e necessariamente dirette a
determinare l'intervento di procreazione medicalmente assistita e
non dall'assistenza antecedente e conseguente l'intervento.
ART. 17.
(Disposizioni transitorie).
1. Le strutture e i centri iscritti nell'elenco predisposto presso l'Istituto
superiore di sanità ai sensi dell'ordinanza del Ministro della sanità
del 5 marzo 1997, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n. 55 del 7
marzo 1997, sono autorizzati ad applicare le tecniche di
procreazione medicalmente assistita, nel rispetto delle disposizioni
della presente legge, fino al nono mese successivo alla data di
entrata in vigore della presente legge.
2. Entro trenta giorni dalla data di entrata in vigore della presente
legge, le strutture e i centri di cui al comma 1 trasmettono al
Ministero della salute un elenco contenente l'indicazione numerica
degli embrioni prodotti a seguito dell'applicazione di tecniche di
procreazione medicalmente assistita nel periodo precedente la data
di entrata in vigore della presente legge, nonché, nel rispetto delle
vigenti disposizioni sulla tutela della riservatezza dei dati personali,
l'indicazione nominativa di coloro che hanno fatto ricorso alle
tecniche medesime a seguito delle quali sono stati formati gli
embrioni. La violazione della disposizione del presente comma è
punita con la sanzione amministrativa pecuniaria da 25.000 a
50.000 euro.
3. Entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge il
Ministro della salute, avvalendosi dell'Istituto superiore di sanità,
definisce, con proprio decreto, le modalità e i termini di
conservazione degli embrioni di cui al comma 2.
ART. 18.
(Fondo per le tecniche di procreazione medicalmente assistita).
1. Al fine di favorire l'accesso alle tecniche di procreazione
medicalmente assistita da parte dei soggetti di cui all'articolo 5,
presso il Ministero della salute è istituito il Fondo per le tecniche di
procreazione medicalmente assistita. Il Fondo è ripartito tra le
regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano sulla base di
criteri determinati con decreto del Ministro della salute, da emanare
entro sessanta giorni dalla data di entrata in vigore della presente
legge, sentita la Conferenza permanente per i rapporti tra lo Stato,
le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano.
2. Per la dotazione del Fondo di cui al comma 1 è autorizzata la spesa
di 6,8 milioni di euro a decorrere dall'anno 2004.
3. All'onere derivante dall'attuazione del presente articolo si provvede
mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai
fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità
previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato
di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno
2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento
relativo al Ministero medesimo. Il Ministro dell'economia e delle
finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti
variazioni di bilancio.
CARATTERISTICHE PAZIENTI RECATISI AL CENTRO NELL'ANNO 2004/2005
Pazienti
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Professione
Serricoltore
Serricoltore
Serricoltore
Operaio
Professionista
Altro
Impiegato
Operaio
Serricoltore
Serricoltore
Impiegato
Operaio
Professionista
Serricoltore
Altro
Serricoltore
Serricoltore
Serricoltore
Serricoltore
Commerciante
Operaio
Professionista
Impiegato
Professionista
Professionista
Serricoltore
Impiegato
Operaio
Diagnosi
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Età
41
37
42
27
32
33
45
45
41
27
34
30
32
33
27
35
33
25
31
35
27
36
39
31
37
34
33
32
N° Spz Tot.
12
16
2
7
13
32
57
0
4
54
31
38
22
1
22
33
4
22
6
2
22
24
15
29
22
33
0
22
Mobili A
3
9
0
4
2
12
13
0
0
20
4
12
9
0
18
10
1
10
2
1
10
7
4
20
4
4
0
9
Morfologia N
35
12
31
9
26
15
35
0
29
37
24
35
36
13
15
15
7
36
12
30
34
27
43
31
28
32
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49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
Impiegato
Operaio
Operaio
Operaio
Professionista
Impiegato
Operaio
Commerciante
Operaio
Operaio
Operaio
Serricoltore
Serricoltore
Professionista
Serricoltore
Serricoltore
Professionista
Impiegato
Impiegato
Operaio
Impiegato
Operaio
Operaio
Operaio
Professionista
Serricoltore
Impiegato
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Pato
Normo
Pato
Normo
Normo
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
32
30
32
42
42
28
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42
31
33
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32
39
43
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36
53
17
36
37
25
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38
35
32
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20
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4
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33
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7
15
6
48
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2
22
27
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8
8
9
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4
17
6
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2
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17
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6
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3
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35
36
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0
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32
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1
1
1
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
Serricoltore
Altro
Professionista
Serricoltore
Serricoltore
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Operaio
Operaio
Serricoltore
Impiegato
Operaio
Serricoltore
Impiegato
Operaio
Commerciante
Serricoltore
Altro
Commerciante
Operaio
Professionista
Serricoltore
Operaio
Operaio
Commerciante
Impiegato
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Pato
Pato
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Normo
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Normo
Normo
Pato
27
32
36
37
32
41
30
42
39
29
35
36
27
30
35
37
33
41
35
45
27
31
29
33
31
25
37
27
29
34
10
37
51
0
41
0
7
0
35
34
17
53
49
0
40
7
22
28
38
0
12
3
39
18
0
35
44
56
47
11
3
16
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0
15
0
2
0
10
5
7
19
18
0
2
3
7
20
20
0
1
1
10
1
0
19
5
15
10
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10
37
0
34
0
31
0
36
39
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38
36
0
31
36
30
35
33
0
30
11
19
32
0
34
34
36
38
5
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0
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0
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0
1
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1
1
0
1
0
0
0
0
1
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
Operaio
Impiegato
Operaio
Impiegato
Operaio
Altro
Impiegato
Serricoltore
Operaio
Operaio
Operaio
Operaio
Serricoltore
Impiegato
Commerciante
Impiegato
Serricoltore
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Serricoltore
Operaio
Impiegato
Professionista
Impiegato
Commerciante
Serricoltore
Serricoltore
Operaio
Altro
Normo
Pato
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Normo
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Normo
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
49
33
20
32
46
22
38
28
40
39
34
32
29
34
40
47
28
37
38
41
31
31
31
35
40
39
32
32
30
28
58
7
33
26
59
19
22
16
22
51
43
59
22
1
45
3
6
0
2
27
43
6
51
27
8
36
14
0
34
22
15
2
12
6
22
4
2
7
4
12
12
24
12
1
15
1
2
0
1
11
19
2
21
5
3
12
3
0
0
5
31
22
35
30
38
5
41
10
35
19
32
35
40
10
37
31
18
0
32
26
34
17
33
30
34
35
5
0
8
8
0
1
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0
0
1
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1
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0
0
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0
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1
1
2
1
0
0
1
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0
1
0
1
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1
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
1
1
2
1
0
0
1
0
1
1
0
1
2
1
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
0
0
1
0
0
1
1
0
1
0
1
0
1
0
0
1
1
1
1
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
Operaio
Serricoltore
Serricoltore
Serricoltore
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Professionista
Serricoltore
Commerciante
Commerciante
Serricoltore
Serricoltore
Operaio
Altro
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Pato
Pato
Pato
Pato
Normo
Normo
Normo
Pato
Normo
Pato
Asimmetria età
Asimmetria Numerica
Asimmetria Cinetica
Asimmetria Morfologica
Conteggio di Condizione
Condizione
Normo
Pato
Totale complessivo
42
34
29
31
32
30
27
36
32
28
32
39
21
32
25
29
6
17
29
39
35
22
33
11
53
38
47
19
58
31
9
1
6
7
10
9
13
6
8
17
10
18
2
21
11
32
10
40
9
35
10
30
25
20
32
34
33
25
37
8
0
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
1
0
1
0,46
0,34
0,62
-0,72
Professione
Altro
Commerciante
1
7
6
7
7
14
Normo
Pato
Totale
Impiegato
7
13
20
Altre Profess Serricoltore
33
8
60
32
93
40
Operaio Professionista Serricoltore Totale complessivo
14
4
8
41
25
9
32
92
39
13
40
133
GRUPPO DI CONTROLLO
Pazienti
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Professione
Impiegato
Serricoltore
Operaio
Altro
Commerciante
Operaio
Professionista
Impiegato
Serricoltore
Operaio
Professionista
Impiegato
Impiegato
Impiegato
Altro
Serricoltore
Operaio
Operaio
Commerciante
Impiegato
Impiegato
Commerciante
Professionista
Operaio
Tabella Pivot
Conteggio di
Condizione
Condizione
Normo
Pato
Totale
complessivo
Diagnosi Età
Normo
35
Normo
23
Normo
30
Normo
35
Normo
25
Normo
31
Normo
40
Pato
30
Pato
27
Normo
45
Pato
36
Pato
42
Normo
29
Normo
24
Normo
32
Normo
25
Normo
30
Normo
37
Normo
27
Normo
37
Normo
31
Pato
33
Normo
35
Normo
40
N° Spz Tot.
60
45
65
30
90
115
25
31
35
100
18
150
54
110
26
120
43
90
30
105
70
19
85
135
Mobili A
20
15
30
11
38
40
11
16
12
27
11
50
15
30
11
40
15
20
16
30
27
10
18
24
Morfologia N
34
33
34
35
35
34
33
27
28
34
35
28
36
34
37
32
35
40
33
32
39
35
34
36
Numerica
Cinetica
Morfologica
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Professione
Altro
Commerciante Impiegato
Operaio
Professionista Serricoltore
Totale
complessivo
2
0
2
1
5
2
6
0
2
1
2
1
19
5
2
3
7
6
3
3
24
%
Patologici
20,83
% Normo
79,17
PAZIENTE
ETA'
DIAGNOSI
PROFESSIONE
MOT(a+b)
A FRESCO
MOT(a+b)
DOPO
SCONG
MOT( c ) A
FRESCO
MOT( c )
DOPO
SCONG
SOPRAV
(a+b)
SOPRAV
(c)
1
7
9
14
17
12
30
38
24
64
36
A
O/A
A/T
A/T
O/A/T
A/T
Impiegato
Serricoltore
Operaio
Altro
Impiegato
Serricoltore
10,0%
4,9%
11,1%
3,2%
6,5%
20,3%
5,2%
2,9%
4,3%
0,0%
0,0%
3,1%
47,5%
54,7%
43,7%
15,6%
38,7%
7,2%
8,1%
7,2%
15,9%
0,0%
0,0%
1,4%
52,0%
58,7%
39,0%
0,0%
0,0%
15,1%
17,1%
13,2%
36,5%
0,0%
0,0%
18,8%
19
21
5
24
37
41
22
48
44
2
50
46
31
11
40
23
25
47
40
34
41
48
44
32
A
O/A
A/T
A/T
O/A/T
A/T
A
O/A/T
A
A/T
O/A/T
A/T
O/A
O/A
O/A/T
O/A/T
A/T
O/A
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Impiegato
Serricoltore
Impiegato
Professionista
Operaio
Serricoltore
Impiegato
Serricoltore
Impiegato
Operaio
Operaio
Serricoltore
Professionista
Operaio
Commerciante
13,7%
13,9%
32,0%
3,9%
22,2%
16,4%
14,0%
13,3%
4,3%
11,7%
11,4%
15,5%
45,5%
35,0%
0,0%
16,4%
13,4%
17,0%
7,0%
9,1%
4,2%
1,0%
0,0%
3,7%
2,7%
5,3%
1,4%
2,8%
3,3%
2,4%
13,0%
20,1%
0,0%
7,3%
4,0%
2,5%
20,3%
37,0%
54,0%
50,4%
40,7%
53,6%
54,0%
52,0%
50,8%
21,5%
37,1%
21,1%
18,2%
50,0%
7,7%
24,6%
44,6%
34,1%
4,7%
22,7%
6,3%
3,1%
0,0%
6,0%
8,1%
6,7%
5,7%
2,5%
7,7%
2,9%
0,0%
19,1%
0,0%
8,1%
11,1%
6,3%
51,1%
65,5%
13,0%
26,1%
0,0%
22,4%
19,2%
40,0%
32,7%
23,9%
29,0%
15,6%
28,7%
57,5%
0%
44,3%
29,9%
14,7%
23,0%
61,4%
11,6%
6,1%
0,0%
11,3%
14,9%
12,8%
11,1%
11,7%
20,8%
13,8%
0,0%
38,3%
0,0%
32,8%
25,0%
18,3%
N
N
Serricoltore
Impiegato
57,6%
50,2%
26,5%
22,0%
20,1%
15,2%
7,2%
6,4%
46,0%
43,8%
35,5%
42,5%
20
49
36
43
34
40
37
29
40
56
33
43
37
25
33
34
36
29
4
27
16
38
30
42
10
32
36
39
3
34
45
35
8
43
33
15
28
6
51
18
26
13
30
30
47
36
37
30
30
32
39
27
32
25
57
42
29
32
35
30
39
27
27
31
20
25
35
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
Professionista
Operaio
Impiegato
Operaio
Altro
Commerciante
Impiegato
Impiegato
Professionista
Impiegato
Operaio
Serricoltore
Operaio
Operaio
Impiegato
Altro
Serricoltore
Operaio
Commerciante
Operaio
Serricoltore
Professionista
Impiegato
Operaio
Altro
51,1%
53,4%
47,1%
54,1%
82,4%
80,0%
50,8%
54,9%
88,6%
33,5%
65,1%
80,6%
44,6%
70,3%
41,8%
36,8%
49,1%
59,6%
37,3%
60,8%
45,9%
71,1%
37,9%
71,2%
59,4%
30,2%
20,4%
17,1%
25,2%
43,1%
42,1%
10,7%
23,5%
38,4%
13,3%
17,7%
18,0%
23,2%
32,3%
10,7%
0,0%
19,9%
27,6%
8,5%
33,6%
2,2%
33,4%
17,2%
40,5%
28,7%
34,0%
31,4%
33,3%
29,2%
11,0%
14,0%
15,9%
31,3%
5,1%
41,6%
21,7%
14,8%
23,2%
21,1%
21,7%
8,1%
21,4%
12,8%
13,6%
29,1%
17,6%
10,0%
27,0%
20,1%
9,8%
15,1%
10,0%
8,6%
11,1%
4,0%
4,8%
1,7%
10,9%
1,3%
11,9%
4,3%
1,9%
9,3%
7,8%
7,2%
0,0%
8,5%
3,2%
2,0%
12,0%
0,9%
2,5%
7,9%
6,4%
1,5%
59,2%
38,2%
36,4%
46,6%
52,2%
52,7%
21,0%
42,8%
43,4%
39,8%
27,2%
22,4%
52,0%
46,0%
25,5%
0,0%
40,5%
46,4%
22,9%
55,2%
4,8%
47,0%
45,4%
56,9%
48,4%
44,4%
32,0%
25,7%
38,2%
36,8%
34,4%
10,5%
34,9%
24,8%
28,6%
19,6%
12,7%
40,1%
37,1%
33,2%
0,0%
39,8%
25,1%
14,7%
41,2%
5,0%
25,1%
29,3%
32,0%
15,7%
1
2
3
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Mob. Progressivi
(a+b)
4,0
1,9
13
3,1
100,0
22,2
Mob. non Progressivi
(c)
19,0
3,0
24
2,8
18,3
2,3
Immobili
(d)
17,0
32,0
74,5
105,2
5,7
98,6
40,0
36,9
112
111
124,0
123,1
5,2%
11,7%
2,8%
80,6%
18,0%
8,1%
21,5%
2,5%
14,8%
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
10,0%
Motilità%
(c)
47,5%
4
5
1,9%
6
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
(a+b)
35
13,2
16,0
2,0
10,2
0,5
(c)
20,6
6,5
27,0
3,0
3,9
0,2
Immobili
(d)
10
45
7,0
43,0
8,1
22,0
66
65
Mob. Progressivi
Spermatozooi Totali
50,0
48,0
22,2
22,7
Motilità%
(a+b)
53,4%
20,4%
32,0%
4,2%
45,9%
2,2%
Motilità%
(c)
31,4%
10,0%
54,0%
6,3%
17,6%
7
8
0,9%
9
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Mob. Progressivi
(a+b)
1,2
0,6
10,0
0,0
14,0
5,5
(c)
13,3
1,5
2,2
0,0
55,0
20,2
Immobili
(d)
9,8
18,6
15,0
27,0
57,0
101,2
24,3
20,7
27,2
27,0
126,0
126,9
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
4,9%
2,9%
36,8%
0,0%
11,1%
4,3%
Motilità%
(c)
54,7%
7,2%
8,1%
0,0%
43,7%
15,9%
10
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
11
12
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
(a+b)
20
8,6
70
40
5,6
0,9
(c)
11,4
4
100
38
2,0
0,4
(d)
5
24
30
120,6
20,0
28,0
36
37
Spermatozooi Totali
200
199
27,6
29,3
Motilità%
(a+b)
54,9%
23,5%
35,0%
20,1%
20,3%
3,1%
Motilità%
(c)
31,3%
10,9%
50,0%
19,1%
7,2%
13
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
14
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
15,8
7,5
2,7
0,0
19,0
4,3
2,6
0,4
13,0
0,0
6,9
1,0
8,2
18,2
67,5
80,0
25,0
45,0
26,6
26,1
83,2
80,0
50,9
50,3
28,7%
3,2%
0,0%
37,3%
8,5%
1,5%
15,6%
0,0%
13,6%
Motilità%
(a+b)
59,4%
Motilità%
(c)
9,8%
16
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
1,4%
15
17
2,0%
18
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
20,0
9,5
1,0
0,0
27
12
10,8
4,2
6,0
0,0
19,2
5,5
6,2
24,0
8,5
15,0
25
52,2
37,0
37,7
15,5
15,0
71
70
Motilità%
(a+b)
54,1%
25,2%
6,5%
0,0%
37,9%
17,2%
Motilità%
(c)
29,2%
11,1%
38,7%
0,0%
27,0%
7,9%
19
20
21
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Mob. Progressivi
(a+b)
15,5
7,5
40
18,5
1,5
1,0
(c)
23,0
5,0
14
5
4,0
2,5
Immobili
(d)
75,0
95,0
15,5
46,4
5,3
7,5
113,5
107,5
70
70
10,8
11,0
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
13,7%
7,0%
57,6%
26,5%
13,9%
9,1%
Motilità%
(c)
20,3%
4,7%
20,1%
7,2%
37,0%
22,7%
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
22
23
24
Mob. Progressivi
(a+b)
8
1,5
4
1,8
3,8
1,0
(c)
30,8
4,5
6
2
48,5
3,0
Immobili
(d)
18,2
49,8
14,4
21
44,0
93,0
57
56
24
25
96,3
97,0
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
14,0%
2,7%
16,4%
7,3%
3,9%
1,0%
Motilità%
(c)
54,0%
8,1%
24,6%
8,1%
50,4%
3,1%
25
26
27
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Mob. Progressivi
(a+b)
15,0
4,5
160,0
90,0
12,0
4,2
(c)
50,0
12,5
45,2
14,3
8,5
2,1
Immobili
(d)
47,0
95,2
19,6
118,0
5,0
18,2
Spermatozooi Totali
112,0
112,2
224,8
222,3
25,5
24,5
Motilità%
(a+b)
13,4%
4,0%
71,2%
40,5%
47,1%
17,1%
Motilità%
(c)
44,6%
11,1%
20,1%
6,4%
33,3%
8,6%
28
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
29
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
(a+b)
180
86,2
120,0
70,0
80,0
42,0
(c)
86,2
30,8
80,0
35,0
14,0
4,8
(d)
30
139,8
35,0
126,5
6,0
52,9
296
257
235,0
231,5
100,0
99,7
33,6%
51,1%
30,2%
80,0%
42,1%
12,0%
34,0%
15,1%
14,0%
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
60,8%
Motilità%
(c)
29,1%
31
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
32
4,8%
33
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
(a+b)
1
0,3
35,0
15,3
26,0
12,0
(c)
0,4
0
2,0
0,5
5,6
1,4
(d)
0,8
2
2,5
24,0
12,0
30,0
2
2
39,5
39,8
43,6
43,4
13,0%
88,6%
38,4%
59,6%
27,6%
0,0%
5,1%
1,3%
12,8%
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
45,5%
Motilità%
(c)
18,2%
34
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
30
Lettura a
fresco
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
35
3,2%
36
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
50,0
26,2
25,0
6,2
7,0
2,8
26,0
10,5
13,0
4,2
8,7
2,5
36,1
76,3
21,8
47,8
5,2
15,7
112,1
113,0
59,8
58,2
20,9
21,0
Motilità%
(a+b)
44,6%
23,2%
41,8%
10,7%
33,5%
13,3%
Motilità%
(c)
23,2%
9,3%
21,7%
7,2%
41,6%
11,9%
37
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
38
39
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
0,6
0,0
154
80
55
15
1,1
0,0
20,5
7,5
18,3
3,6
1,0
2,0
12,3
98,3
11,2
66
2,7
2,0
187
186
85
85
Motilità%
(a+b)
22,2%
0,0%
82,4%
43,1%
65,1%
17,7%
Motilità%
(c)
40,7%
0,0%
11,0%
4,0%
21,7%
4,3%
40
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
41
42
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
0
0
11,0
2,5
16,0
3,2
0,5
0
35,9
4,1
5,0
0,5
6
6,5
20,1
61,4
10,5
26,3
7
7
67,0
68,0
31,5
30,0
Motilità%
(a+b)
0,0%
0,0%
16,4%
3,7%
50,8%
10,7%
Motilità%
(c)
7,7%
0,0%
53,6%
6,0%
15,9%
43
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
44
1,7%
45
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
(a+b)
60
24
4
1,3
120
54,6
(c)
26,2
10,3
47
5,2
36
13,2
(d)
36
86,3
41,5
85,4
14,6
101
122
121
93
92
171
169
Spermatozooi Totali
Motilità%
(a+b)
49,1%
19,9%
4,3%
1,4%
70,3%
32,3%
Motilità%
(c)
21,4%
8,5%
50,8%
5,7%
21,1%
7,8%
46
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
47
48
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
22
3,4
1,5
0,2
2
0,8
30
4,1
3,0
0,5
7,8
1
90
133
4,3
7,3
5,2
13,2
142
141
8,8
8,0
15
15
Motilità%
(a+b)
15,5%
2,4%
17,0%
2,5%
13,3%
5,3%
Motilità%
(c)
21,1%
2,9%
34,1%
6,3%
52,0%
49
Mob. Progressivi
Mob. non
Progressivi
Immobili
(a+b)
(c)
(d)
Spermatozooi Totali
50
6,7%
51
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
Lettura a
fresco
Lettura dopo
scongelamento
58,0
24,6
2
0,6
30,0
13,4
17,5
7,2
6,5
1,4
4,2
1,0
40,0
80,0
9
16,1
8,0
25,7
115,5
111,8
18
18
42,2
40,1
Motilità%
(a+b)
50,2%
22,0%
11,4%
3,3%
71,1%
33,4%
Motilità%
(c)
15,2%
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Indagine sulla infertilita` maschile nel territorio del

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