Red Cell EZ Type Rh DI

ISTRUZIONI PER L’USO
LIFECODES HLA EZ Type test
(A/B/C Low, DR/DQ Low)
REF
LR-ABC, LR-DRDQ
IVD
0843
Reagenti:
ABC (303371)
DR/DQ (303372)
E-Gels (303370)
ELENCO DEL CONTENUTO
USO ............................................................................................................................................................................... 2
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE ..................................................................................................................................... 2
PRINCIPIO ..................................................................................................................................................................... 2
REAGENTI ..................................................................................................................................................................... 2
AVVERTENZE ............................................................................................................................................................... 2
PRECAUZIONI .............................................................................................................................................................. 3
RACCOLTA CAMPIONI ................................................................................................................................................ 3
PROCEDURA ................................................................................................................................................................ 3
Materiale Fornito....................................................................................................................................................... 3
Materiale Richiesto (ma non fornito) ......................................................................................................................... 4
Metodica ................................................................................................................................................................... 4
CONTROLLO DI QUALITA ........................................................................................................................................... 6
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ........................................................................................................................... 7
LIMITI ............................................................................................................................................................................. 7
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST ............................................................................................................. 7
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................................................. 8
LIFECODES HLA EZ Type test
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USO
LIFECODES HLA EZ Type è un’ analisi molecolare per determinare gli alleli HLA di classe I e II a bassa risoluzione, utilizzando
l’amplificazione PCR su DNA genomico.
A/B/C per loci Classe I A, B, e C a bassa risoluzione.
DR/DQ per loci Class II DR, DQ a bassa risoluzione
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
Per molti anni il metodo stabilito per la determinazione degli antigeni HLA era la linfocitotossicità, l’arrivo della tecnologia PCR ha
1
introdotto nella routine di laboratorio tecniche di tipizzazione molecolare. Confrontato con il metodo sierologico, l’analisi in PCR offre
3,4
una semplice interpretazione dei risultati, grazie all’abilità di discriminare differenze a livello di un solo nucleotide. Inoltre l’impiego di
reagenti sintetici in questo kit basato sulla reazione PCR a portato ad un miglioramrentodella stabilità e qualità del prodotto tra i
differenti lotti.
La maggior parte delle metodiche di genotipizzazione HLA sono divise in fasi: l’amplificazione delle regioni HLA è seguita da una fase
di separazione (RFLP o SSOP) e una fase di rivelazione. Di contro, l’analisi PCR-SSP offre un’analisi migliore, veloce e con pochi
5
passaggi manuali. Le metodiche SSP-PCR richiedono solo due fasi di lavoro (amplificazione e rivelazione), l’amplificazione e la
6
discriminazione avvengono durante la PCR, la rivelazione avviene mediante elettroforesi su gel di agarosio. Un ulteriore vantaggio,
inerente a questa analisi, è dato dall’uso di un gel di agarosio già pronto all’uso (pre-cast E-Gels).
PRINCIPIO
Le analisi basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) permettono una moltiplicazione (amplificazione) di una sequenza
2
definita di DNA. Dopo l’amplificazione, il campione contiene una quantità di DNA bersaglio sufficiente per la sua rivelazione.
I primers (oligonucleotidi) sequenza specifica (SSP) descrivono una specifica amplificazione che avviene solo se è presente l’allele
3,4
bersaglio; campioni mancanti del target specifico per l’allele presente nel primer non danno luogo alla produzione di DNA amplificato.
Il metodo descritto in metodica inizia con una fase di denaturazione seguita da 10 cicli di PCR a due temperature, con una temperatura di
annealing a 65º C che garantisce una amplificazione specifica di tutte le reazioni SSP. Questa è seguita da 20 cicli di PCR a tre
temperature con una bassa temperatura di annealing per favorire ulteriori amplificazioni dei prodotti specifici di PCR. L’amplificazione dei
controlli interni è dovuta a primers specifici verso l’HGH (human growth hormone; ormone della crescita) dimostrando l’accettabilità delle
condizioni di reazione in ogni provetta PCR. Una provetta di controllo negativo rileva l’eventuale presenza di contaminazione da DNA
esogeno. I prodotti di PCR vengono separati mediante elettroforesi su gel di agarosio pronto all’uso (pre-cast E-Gels) durante la quale i
prodotti di PCR vengono a contatto con etidio bromuro, le bande di DNA separate vengono evidenziate da una luce ultravioletta visibile
su un transilluminatore. L’immagine del gel viene fotografata mediante una macchina digitale per documentare l’analisi. In base
all’amplificazione delle bande, visibili sul gel, viene registrata sui fogli di lavoro la specificità degli alleli, il pattern delle bande allelespecifiche viene confrontato al pattern indicato nelle tavole interpretative.
REAGENTI
Numero massimo di test per kit:


A/B/C Low:
DR/DQ Low:
8 tipizzazioni per kit, 96 provette per test
24 tipizzazioni per kit, 32 provette per test
REF
PP
HLAPR
E-Gel
A/B/C Low:
403906
DRDQ Low:
403907
Piastra Primer: piastra da 96-provette PCR con primer HLA allele-specifici e controllo interno (HGH).
Primer essiccati coperti da foglio di chiusura. Pronto all’uso.
403908
Reagenti HLA PCR: Buffer contenente magnesium chloride, free deoxynucleotide triphosphates
(dNTPs), glicerolo, rosso creasolo, e altri componenti. Diluire prima dell’uso.
403909
E-Gel: gel di agarosio pronto all’uso (96 pozzetti, 2%) usato per separare i prodotti di PCR. Pronto
all’uso.
AVVERTENZE





Non usare i reagenti e/o i gel dopo la data di scadenza.
Non usare reagenti se appaiono torbidi e/o contaminati.
Non usare il reagente PCR (master mix) se il suo colore è cambiato da rosso a giallo.
Non usare gel apparentemente incrinati, essiccati o con evidenti zone ghiacciate o contaminate.
Le provette per PCR e i reagenti contenuti nel kit non devono essere utilizzati con altri sistemi di analisi.
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




Variazioni sulle performance del test possono essere causate dai diversi termociclatori utilizzati, per ottenere risultati validi,
potrebbe quindi essere necessario stabilire i corretti parametri per i cicli di amplificazione. Può anche essere necessario utilizzare
un appropriato copri piastra in silicone per una corretta chiusura delle provette chiuse preventivamente dal foglio adesivo copri
piastra.
Non isolare campioni di DNA da sangue eparinato. L’eparina può interferire con l’amplificazione PCR.
La PCR è coperta da brevetto Roche Molecular Systems and F. Hoffmann-La Roche Ltd. Per informazioni sul brevetto contattare
il Director of Licensing at Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, o PCR Licensing
Manager, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Grenzacher Str. 124, CH-4070 Basel, Switzerland.
Le fasi di amplificazione devono essere preparate a temperatura ambiente (20 – 25°C). Una temperatura superiore può produrre
artefatti di PCR. In questo caso la Master Mix e la piastra tipizzante devono essere processate su box con ghiaccio o su piastra
fredda.
Pratica di laboratorio per PCR
La PCR è un metodo di amplificazione estremamente potente anche su piccolissime quantità di DNA, bisogna procedere con
estrema cautela per evitare la contaminazioni del DNA genomico e dei prodotti di PCR, soprattutto evitare di contaminare i prodotti
di PCR con amplificazioni precedenti. Le seguenti precauzioni sono molto importanti:
o Separare le aree di pre-PCR (isolamento e conservazione del DNA, preparazione della PCR) da quelle di post-PCR
(termociclatori, gel elettroforesi, valutazione). Strumenti e/o reagenti impiegati nell’ area post-PCR non devono essere utilizzati
nell’area pre-PCR.
o Usare pipette con puntali con protezione per aereosol (sterili) nelle aree di pre e post PCR.
o Il controllo negativo (NC, provetta PCR nr. 1 per kit DR/DQ Low; provette 1,25,73 per A/B/C Low) è un controllo ambientale
progettato per la ricerca di contaminazioni da DNA e deve essere sempre inserito in parallelo con le amplificazioni dei
campioni.
PRECAUZIONI



Quando l’analisi è terminata, gettare i rifiuti biologici e decontaminare i materiali non “usa e getta” utilizzati (pipette, piano di lavoro,
ecc) con candeggina 10% o altri agenti inattivanti il DNA.
Il transilluminatore UV usato per evidenziare le bande prodotte dalla PCR emette luce ultravioletta che può essere dannosa per
occhi e pelle, quindi, usare sempre il vetro di chiusura e gli occhiali e/o schermo protettivi.
E-Gels contiene una piccola quantità di etidio bromuro per evidenziare il DNA. L’etidio bromuro è noto essere un agente
mutageno. Non aprire l’involucro del gel. Eliminare i gel secondo la normativa vigente per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
RACCOLTA CAMPIONI
Isolare il DNA genomico usando un metodo validato (pubblicato) o un kit commerciale.
Risospendere il DNA in acqua sterile o in 10 mM tris, ph 8-9. Il campione non deve essere reidratato in soluzione contenente quantità
di EDTA maggiore di 0.5 mM o altro agente chelante che può interferire con la PCR.
Il campione di DNA può essere analizzato immediatamente dopo l’isolamento o aliquotato in freezer a -20º C (senza sbrinamento
automatico; sino a 6 anni) senza interferire sul risultato.
Il campione di DNA può avere un range di concentrazione di 12.5 - 100 ng/µL, e purezza definita da un 260 nm/280 nm ratio ≥ 1.60.
Presenza o eccesso di proteine, RNA, eparina, EDTA o altri agenti chelanti possono interferire con l’amplificazione PCR o la purezza
del DNA.
PROCEDURA
Materiale Fornito
(da conservare a ≤ -20ºC): ABC (303371); DR/DQ (303372)
1. Otto piastre per tipizzazione PCR (da 96-provette colorate) chiuse con foglio adesivo contenenti primer allele specifici e
primer per il controllo interno.
2. 4 x 700 µL HLA PCR Reagent
3. 9 fogli copri piastra termici (403905)
TSF
(da conservare a 15 - 25°C): (303370)
1. 8 x 2% E-Gel
Copri piastra in silicone (1 mm). Non incluso nel kit; inviato con la spedizione.
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Materiale Richiesto (ma non fornito)
Per PCR

Taq Polymerase, nativa o ricombinante, 5U/µL. Non usare un’altra polimerasi termostabile o preparazioni “hot-start” della
Taq polimerasi.
I seguenti enzimi sono stati validati per l’uso con HLA EZ Type.
L’uso di altri enzimi deve essere validato dall’utlizzatore.
Fornitore
Prodotti
Applied Biosystems
AmpliTaq Taq polimerasi ricombinante
Genaxis
AxiTaq
Promega
GoTaq Flexi DNA Polimerasi










Termociclatore programmabile con porta piastra PCR da 96 pozzetti 0,2 mL.
Micropipette a volume variabile da 1 a 1000 µL e puntali sterili con filtro.
Acqua biologicamente pura senza DNA e DNAsi.
Box con ghiaccio e piastra porta piastra fredda.
Porta piastra PCR.
Vortex.
Provette con tappo in polipropilene per microcentrifuga (0,5 – 1,7 mL) senza DNA e DNAsi.
Candeggina 10% o un altro reagente inattivante il DNA.
Dispositivo di saldatura a caldo.
Rullo di chiusura
Per elettroforesi ed analisi

E-Base camera gel

Porta piastra PCR (0.2 mL)

Micropipette a volume variabile 1–20 µL e puntali con filtro sterile.

Carta assorbente

Transilluminatore UV

Candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.

Acqua deionizzata

Sistema di documentazione del gel.
Opzionali

Marcatore di bande DNA (405517).

Pipetta multicanale 8-12 canali da 5-20 µL.

Piastra fredda o box con ghiaccio per provette da 0,2 mL (vedere avvertenze).
Metodica
In precedenza
1.
Isolare il DNA genomico da tutti i campioni da testare. Ogni campione deve avere una concentrazione di DNA nel range
12.5-100 ng/µL e assorbanza 260 nm/280 nm, ratio ≥ 1.60.
2.
Programmare il termociclatore con il programma per PCR HLA EZ Type test, uguale per tutti i kit del sistema. Il programma è il
seguente:
NOTA:
96º C
120 secondi
96º C
65º C
15 secondi
60 secondi
96º C
61º C
72º C
15 secondi
50 secondi
30 secondi
4º C
Hold
10 cicli
20 cicli
Questo programma è stato testato con termociclatori Applied Biosystems (PE9700, PE9600, PE2720), Bio-Rad (PTC100, PTC-200), e Eppendorf (Mastercycler, Mastercycler EP). Il rate del Ramping in termociclatori veloci (Mastercycler,
o
Mastercycler EP, PTC-200, PE9700 con blocco in oro/argento) deve essere portato a 1.0 – 1.5 /sec riscaldamento e
raffreddamento.
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PCR
3.
Prima di iniziare il test accendere il termociclatore e accertarsi che venga raggiunta la temperatura richiesta.
4.
Preparare il piano di lavoro e le pipette. Pulire prima con candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.
5.
Determinare il numero di campioni da testare. Prendere le piastre tipizzanti necessarie, Taq Polimerasi e PCR master mix dal
congelatore e portarle a temperatura ambiente. Mettere, se necessario, in ghiaccio o piastra fredda il DNA campione, PCR
master mix e Taq Polimerasi.
6.
Accendere il dispositivo di chiusura a caldo e attendere il raggiungimento della temperatura operativa (~ 5 – 7 min).
7.
Usare la tavola sottostante per la preparazione della Master Mix per tutti i campioni. Porre la Master Mix in ghiaccio o in box
freddo.
NOTA: Le fasi di amplificazione devono essere preparate a temperatura ambiente (20 – 25°C). Temperature differenti possono
produrre artefatti di PCR che possono rendere complicata la fase di interpretazione. Se vengono identificati artefatti di PCR,
la Master MIX e la piastra tipizzante devono essere processate in box con ghiaccio o in piastra fredda.
Preparazione della Master Mix
Numero di
provette per
tipizzaz.
Acqua per
analisi
molecolare (µL)
Rimuovere il Controllo Negativo e aggiungere
DNA
Volume di
Reagente per
PCR (µL)
Volume di Taq
Polimer-asi (µL)
Volume di
master PCR
Mix (µL)
Volume dopo
aggiunta del
controllo
negativo (µL)
Volume di
DNA
campione (µL)
Volume finale
di campione e
PCR mix (µL)
Per campioni con range di 25 – 100 ng/µL
24
163
81
2.2
246.2
236.2
26
262.2
32
219
108
3.0
330
320
35
355
48
310
154
4.5
468.5
458.5
50
508.5
96
638
319
8.5
965.5
935.5
103
1038.5
Per campioni tra 12.5 – 25 ng/µL, set up descritto dopo
24
137
81
2.2
220.2
210.2
52
262.2
32
184
108
3.0
295
285
70
355
48
260
154
4.5
418.5
408.5
100
508.5
96
535
319
8.5
862.5
832.5
206
1038.5
8.
Rimuovere la carta adesiva sigillante dalla piastra tipizzante HLA. Dispensare 10l della PCR Master Mix nelle provette per
controllo negativo (come indicato nel foglio di lavoro) prima di aggiungere la quantità richiesta di DNA campione nella Master Mix.
9.
Aggiungere il DNA campione nella Master Mix. Miscelare e dispensare in ogni provetta della piastra tipizzante HLA come da
formato corrispondente (31 provette DR/DQ Low e 93 provette A/B/C Low). Fare attenzione a non dispensare il campione nelle
provette del controllo negativo.
10. Porre la piastra PCR tipizzante nel rack portacampione dell’ heat sealing device. Centrare un foglio copri piastra termico sulla
piastra . Orientare il foglio in modo tale da non lasciare nessuna fila di provette PCR scoperte.Se si chiude una piastra PCR di
dimensioni diverse tagliare il foglio prima dell’applicazione. Conservare la parte rimanente del foglio per analisi successive.
NOTA: I fogli copri piastra termici hanno due lati differenti, uno opaco (da orientare sulla piastra PCR) e uno lucido. Attenzione
conservare la parte di foglio termico inutilizzato. La disposizione errata dei fogli copri piastra può comportare il fallimento del
test.
11. Dopo aver posizionato correttamente il foglio copri piastra termico, abbassare l’elemento riscaldato e premere per 3-5 secondi.
Rilasciare l’elemento riscaldato e rimuovere la piastra. Utilizzare immediatamente il rullo di chiusura per far aderire perfettamente
il foglio alla piastra.
NOTA: Nell’ utilizzo dell’ heat sealing device, fare attenzione a non esercitare una forza eccessiva o lasciare la piastra per oltre 5
secondi a contatto con l’elemento riscaldato dell’ heat sealing device perchè questo potrebbe causare la deformazione delle
provette PCR nella piastra rendendo difficile l’ aspirazione del prodotto amplificato.
12. Esaminare la piastra PCR dopo averla chiusa verificando per la presenza di bolle o di residui sulle pareti delle provette che, se
presenti, potranno essere eliminate mediante una breve centrifugazione o picchiettando con le dita le singole provette.
13. Far partire il programma specifico HLA EZ Type nel termociclatore, trasferire la piastra tipizzante dall’apposito porta campione al
termociclatore.
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14. Porre il cuscinetto di silicone sulla piastra precedentemente chiusa con il foglio copri piastra e assicurarsi che non venga
spostato alla chiusura del coperchio del termociclatore.
15. Alla fine dei cicli quando il termociclatore raggiunge i 4°C togliere la piastra e controllare che il volume di ogni provetta non sia
variato. Volumi ridotti potrebbero indicare unascarsa amplificazione in queste provette PCR. Se la fase di elettroforesi non viene
eseguita immediatamente si possono conservare gli amplificati a 2-8°C fino a 3 gg. o a – 20°C fino a una settimana.
Rilevazione
NOTA: La fase di rilevazione deve avvenire in un’area separata da quella usata per la pre-PCR. La strumentazione non deve
essere trasportata tra le due aree per evitare contaminazioni.
16. Se le provette tipizzanti sono conservate in freezer, prendere la piastra e scongelarla a temperatura ambiente prima dell’uso.
17. Preparare il piano di lavoro utilizzando carta assorbente da laboratorio, la camera gel (E-Base), acqua deionizzata e pipette.
18. Estrarre un E-Gel 2% dalla confezione di alluminio e rimuovere il pettine proteggi pozzetto. Se necessario pulire la parte
superiore asciugando con carta assorbente da laboratorio.
19. Annotare sulla superficie del gel i dati identificativi.
20. Dispensare 16 µL di acqua deionizzata in ogni pozzetto del gel, tranne che nei pozzetti M.
21. Se si desidera introdurre il marcatore di bande, caricarlo in ogni pozzetto M. Aggiungere acqua se necessario per portare il
volume totale in ogni pozzetto M a 15 – 20 µL.
22. Forare il foglio di chiusura termico dalla prima provetta (Provetta A1) e dispensare 6 µL nel primo pozzetto dell’ E-Gel. Ripetere
questo procedimento per tutte le provette della piastra tipizzante in corrispondenza dei pozzetti del gel. Cambiare i puntali dopo
ogni dispensazione.
NOTA: Questa fase è notevolmente facilitata mediante l’uso di una pipetta multicanale (8-12 canali) con capacità 5-20 µL.
23. Collegare la camera gel all’alimentatore si accenderà una luce rossa e sul display compare il tempo di corsa in minuti. Usare il
tasto power (tasto destro) per selezionare la modalità EG (invece della modalità EP).
24. Introdurre il gel facendolo scorrere sulla E-Base della camera gel permettendo ai relativi elettrodi il contatto con gli elettrodi del
dispositivo.
25. Usare il tasto di sinistra e impostare il tempo su 9 minuti. Premere il tasto power (tasto destro) per iniziare l’ elettroforesi. Durante
la migrazione la luce rossa diventa verde.
26. Alla fine della elettroforesi la luce verde diventa rossa lampeggiante e compare un allarme sonoro. Premere il tasto power e la
luce rossa lampeggiante diventerà fissa. Disconnettere il dispositivo e rimuovere il gel dalla camera.
27. Porre il gel sul transilluminatore ed esaminare le bande entro 20 minuti. Se si desidera archiviare il gel, fotografare utilizzando un
sistema di documentazione di immagine.
CONTROLLO DI QUALITA
Il controllo interno (430, 800, o 1070 bp, a seconda della provetta) deve essere rilevato in tutti gli amplificati tranne nella provetta del
controllo negativo. Va considerato però che l’amplificazione allele specifica compete con il controllo interno, così che nelle reazioni di
amplificazioni allele specifiche positive, la banda controllo interno può essere soppressa, debole o assente. Questo non deve essere
causa di preoccupazione. Se per il DNA caricato dalla provetta non si osserva la banda di controllo o la banda allele specifica,
l’amplificazione è fortemente compromessa. Il fallimento di tale amplificazione può essere il risultato di deterioramento dei reagenti,
programmazione errata del termociclatore, un cattivo grado di purezza del DNA, una insufficiente quantità di DNA caricato, una
chiusura non corretta della provetta di reazione, una omissione nel caricamento di un reattivo nella formazione della miscela di
reazione.
La provetta del controllo negativo non dovrebbe avere nessuna banda rivelabile. La presenza di un prodotto di PCR in questa
provetta indica una contaminazione della MasterMix. Per ogni analisi HLA EZ Type, i primer per il controllo della PCR sono presenti in
tutte le provette, e sono distribuiti secondo pesi specifici differenti seguendo uno schema all’inteno della piastra dei primer. Questa
distribuzione è verificabile all’interno dei fogli di lavoro permettendo anche una comparazione con le bande sul gel verificando la
corretta distribuzione degli amplificati.
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INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I prodotti della PCR vengono osservati utilizzando un transilluminatore UV e sono composti da prodotti HLA allele specifici, controllo
interno e, raramente, artefatti non specifici. Per ogni banda il prodotto del controllo interno risulta essere più grande; mentre i prodotti
HLA specifici o artefatti risultano essere sempre di inferiori per dimensioni rispetto al controllo interno. Far riferimemto alla tavola dei
“Commenti”, specifica per ogni lotto, alla pagina 5 del foglio di lavoro, per informazioni relative ad artefatti caratterizzati da bande non
specifiche, amplificazioni multiple, reazioni deboli e possibile cross reattività.
Registrare le bande allele specifiche nella griglia del foglio di lavoro. Le provette positive vengono interpretate tramite l’apposita
tavola interpretativa che permette di identificare gli alleli corrispondenti.
LIMITI








HLA EZ Type contiene materiale per l’amplificazione delle sequenze di DNA genomico mediante reazione a catena della
polimerasi con conseguente rivelazione a bassa risoluzione degli alleli per HLA di classe I e di classe II mediante elettroforesi su
gel di agarosio. Varianti sconosciute nella sequenza del gene possono portare a risultati contrastanti.
Per assicurare risultati ottimali delle analisi con HLA EZ Type, il campione di DNA dovrebbe avere una concentrazione tra 12.5
ng/µL e 100 ng/µL con assorbanza 260 nm/280 nm ratio ≥ 1.60. Una amplificazione scarsa potrebbe essere il risultato dell’
aggiunta di una quantità insufficiente di DNA, oppure del basso grado di purezza dello stesso.
Risultati falsamente negativi possono derivare da campioni non correttamente conservati, errori procedurali, presenza di inibitori
dell’amplificazione, oppure dal basso grado di purezza del DNA.
Risultati falsamente negativi possono derivare dall’uso di una Taq polimerasi diversa da quelle riportate nella tabella dei materiali
richiesti (ma non forniti).
Contaminazione da carryover di acidi nucleici, DNA genomico in eccesso, l’uso di temperature diverse da quelle indicate
possono dare reazioni falsamente positive.
Il programma di amplificazione indicato è stato testato con termociclatori PE 9600, PE 9700 e PE2720 (tutti Perkin Elmer/Applied
Biosystems), con PTC-100 e PTC-200 (BioRad) e con Mastercycler, Mastercycler EP (Eppendorf). Per altri termociclatori
possono essere richiesti alcuni aggiustamenti ai parametri indicati.
I termociclatori dovrebbero essere calibrati e controllati in accordo alle istruzioni del produttore.
I risultati derivanti da questa analisi non dovrebbero essere usati come sola base per decisioni cliniche.
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST
NOTA: Set di primer per un particolare locus di Classe I o Classe II sono presenti in tutti i prodotti HLA EZ Type. Quindi, le
caratteristiche descritte per i test A/B/C Low e DR/DQ Low sono applicabili a tutti i kit HLA EZ Type a bassa-risoluzione.
Studio comparativo tra metodiche
La concordanza tra HLA EZ Type a metodi comparativi è stata esaminata in tre diversi studi:
Comparazione del test HLA EZ Type a un test molecolare di tipizzazione
I risultati sono stati comparati in due studi. Nel primo, sono stati tipizzati 50 campioni coprenti un range di alleli HLA Classe I comuni,
e 51 campioni con un range di alleli HLA Classe II comuni, con i kit HLA EZ Type A/B/C Low o DR/DQ Low. I campioni sono stati
testati anche per alleli Classe I o Classe II con un altro metodo PCR a bassa risoluzione in una valutazione esterna indipendente.
Tra i due metodi si è ottenuta una concordanza de l00% sia per i loci di Classe I che di Classe II. Nel secondo studio sono stati
tipizzati 52 campioni coprenti un range di alleli HLA Classe I e II, con i kit HLA EZ Type A/B/C Low o DR/DQ Low. I campioni sono
stati testati anche per alleli Classe I o Classe II con un altro metodo PCR in alcuni casi a bassa risoluzione in altri ad alta risoluzione.
Anche in questo caso, tra questi metodi si è ottenuta una concordanza de l00% sia per i loci di Classe I che di Classe II.
Comparazione dei risultati HLA EZ Type tsequenziamento del DNA
Sono stati testati 30 campioni coprenti un adeguato range di alleli HLA Classe I o Classe II con i kit HLA EZ Type A/B/C Low o DR/DQ
Low. I risultati sono stati comparati con quelli ottenuti in alta risoluzione (sequeziamento o PCR SSP alta risoluzione). La concordanza
tra i due metodi è stata del 100%.
Precisione del test
E’ stata determinata la riproducibilità del test HLA EZ Type In breve, due campioni rappresentanti un ampio range di alleli sono stati
testati con 20 test separati per l’A/B/C Low; due campioni per DR/DQ Low sono stati testati in triplicato con 10 test separati. I risultati
dimostrano concordanza del 100% inter-test e, nel caso del DR/DQ intra-test.
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BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Terasaki PI, Bernoco D, Park MS, Ozturk G, Iwaki Y: Microdroplet testing for HLA-A, -B, -C, and –D antigens. American Journal
of Clinical Pathology 1978; 69: 103 – 120.
Mullis KB, Faloona F: Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase catalysed chain reaction. Meth. Enzymology.
1987;155:335-350.
Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF: Analysis of any point
mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research 1989; 17:2503-2516.
Olerup O, Zetterquist H: HLA DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR SSP) in two hours: An
alternative to serological DR typing in clinical practice including donor recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue
Antigens 1992; 39:225-235.
Bunce M, O´Neill CM, Barnardo MC, Krausa P, Browning MJ, Morris PJ, Welsh KI: Phototyping: comprehensive DNA typing for
HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCRSSP). Tissue Antigens 1995; 46:355-367.
Bunce M, Young NT, Welsh KI: Molecular HLA Typing – The brave new world. Transplantation 1997; 64:1505-1513.
Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, Bontrop RE, Dupont B, Erlich HA, Geraghty DE, Hansen JA, Mach B, Mayr WR, Parham P,
Petersdorf EW, Sasazuki T, Schreuder GM, Strominger JL, Svejgaard A, Terasaki PI: Nomenclature for factors of the HLA
system, 2002. Tissue Antigens 2002; 60:407-464.
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