ACTICLOT® dPT - Sekisui Diagnostics

M
Sekisui Diagnostics, LLC
FINALITÀ D'USO
500 West Avenue, Stamford, CT 06902
Tel. (203) 602-7777 • Fax (203) 602-2221
Email: [email protected]
www.sekisuidiagnostics.com
ACTICLOT® dPT™ è un test previsto per la determinazione qualitativa di anticoagulanti lupici (LA) in campioni
di plasma umano. Il test può essere eseguito con coagulometri semi- o completamente automatici. Il test è per
uso diagnostico in vitro e non è previsto per uso interno negli esseri umani o negli animali.
SPIEGAZIONE DEL TEST
Gli anticoagulanti lupici (LA) sono autoanticorpi fosfolipidi-dipendenti associati a patologie del sistema
autoimmunitario come la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS).1,2 L’APS primaria è una condizione
patologica caratterizzata da fenomeni trombotici inspiegabili, aborti ricorrenti, trombocitopenia e/o alterazioni
neurologiche. L’APS secondaria si verifica in presenza di LA associati a malattie autoimmuni, quali il lupus
sistemico eritematoso (LES), come nei casi descritti inizialmente da Conley e Hartmann 3.
ACTICLOT® dPT™
REF 824
Test del tempo di protrombina diluito per
la determinazione di
Lupus Anticoagulants (LA)
 C i
l
8C
2C
Gli anticoagulanti lupici sono anticorpi contro complessi eterogenei di fosfolipidi anionici (per esempio
cardiolipina, fosfatidilinositolo, fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina)4 e proteine che legano i fosfolipidi5 nel
plasma. I principali componenti proteici degli autoantigeni LA comprendono la β2-glicoproteina I (β2GPI), la
protrombina e l’annessina V. Gli anticorpi antifosfolipidi sono caratterizzati dalla capacità di prolungare i tempi
di coagulazione dei test in vitro che si basano sulla coagulazione, come l’aPTT lupus-sensibile, il tempo di
coagulazione al caolino (KCT), il test al veleno di vipera di Russell (dRVVT) e il tempo di protrombina diluito
(dPT).6-8 Data l’eterogenicità degli autoanticorpi patologici fosfolipidi-dipendenti, è ampiamente riconosciuto che
non esiste alcun singolo test della coagulazione che identifichi tutti gli anticorpi LA. Nel 1995, il sottocomitato
scientifico sugli anticorpi antifosfolipidi della società internazionale di trombosi ed emostasi (ISTH) ha
raccomandato che ogni plasma in cui si sospetti la presenza di LA debba essere testato con almeno due test
diagnostici per gli LA e con uno studio di mixing con plasma da pool normali per stabilire la presenza di un
autoanticorpo o la carenza di un fattore.9 Inoltre, il sottocomitato scientifico dell’ISTH ha stabilito che la diagnosi
di LA richiede la dimostrazione della natura fosfolipide-dipendente degli autoanticorpi. Ciò è possibile
eseguendo un test di coagulazione di conferma in presenza di elevate quantità di fosfolipidi. La presenza di LA
è “confermata” da una riduzione significativa del tempo di coagulazione plasmatico in presenza di un’elevata
concentrazione di fosfolipidi rispetto alla ridotta concentrazione di fosfolipidi presente nel test di “screening” per
LA.
Studi clinici dimostrano che il tempo di protrombina diluito è un test di coagulazione efficace per gli LA e può
identificare gli LA che non vengono rilevati da altri test, quali l'aPTT lupus-sensibile e il dRVVT.10-12 In alcuni
campioni di pazienti l’aggiunta del test del tempo di protrombina diluito a un pannello di test per gli LA ha
aumentato la sensibilità degli esami diagnostici per gli LA.8,13 ACTICLOT dPT è un test del tempo di
protrombina diluito completamente integrato per lo screening e la conferma della presenza di autoanticorpi LA
fosfolipide-dipendenti. Questo protocollo di screening utilizza un reagente attivatore che contiene una
formulazione unica a base di fattore tissutale ricombinante rilipidato e calcio. L’utilizzo del fattore tissutale
ricombinante nella formulazione del test dPT aumenta le prestazioni del test stesso.12 Nel protocollo di
conferma, viene utilizzata una formulazione unica di un reagente fosfolipidico per dimostrare la natura
fosfolipide-dipendente degli LA individuati nei campioni risultati positivi alla procedura di screening.
PRINCIPIO DEL METODO
(codice CPT n. 85705)
EC
Sekisui Diagnostics GmbH
Kaplaneigasse 35, D-64319 Pfungstadt, Germany
Tel. + 49 61 57 / 99 08 99  Fax + 49 61 57 / 99 08 08
REP
ACTICLOT dPT è un test di coagulazione che identifica la presenza di LA nel plasma. La coagulazione si
innesca per attivazione del fattore tissutale della via coagulativa (estrinseca) che interagisce con il fattore
tissutale in presenza di calcio ioni. Il fattore tissutale si lega al fattore VIIa inducendo l'attivazione dei fattori IX e
X. Il fattore Xa trasforma la protrombina in trombina che innesca la formazione del coagulo per clivaggio del
fibrinogeno in fibrina. L'attivazione della via del fattore tissutale permette di evitare la via di contatto (intrinseca)
ed esclude qualsiasi interferenza dovuta a carenza del fattore XII.
Nel protocollo di screening, il plasma del paziente viene miscelato con ACTICLOT LA Buffer ™ e ACTICLOT
dPT Activator™. Il tempo di coagulazione è determinato in base a metodi semi- o completamente automatizzati.
Il risultato positivo è indicato da un tempo di coagulazione prolungato rispetto al range normale stabilito. Nel
protocollo di conferma, il plasma del paziente viene miscelato con ACTICLOT LA Phospholipids™ e ACTICLOT
dPT Activator. Il risultato positivo è indicato da una riduzione significativa del tempo di coagulazione rispetto al
tempo di coagulazione del protocollo di screening.
1
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L'identificazione della presenza di LA nei campioni di plasma è subordinata all'esecuzione di entrambi i
protocolli di screening e di conferma e all'ottenimento di un risultato positivo con entrambi i test (cfr. Algoritmo
decisionale per la diagnosi di LA a pagina 10). I protocolli di screening e di conferma possono essere eseguiti
in simultanea, permettendo di ottenere il più rapidamente possibile un risultato analitico per ciascun campione
di plasma. In alternativa, i campioni di plasma possono essere dapprima sottoposti a screening per determinare
l'eventuale presenza di LA e poi alla ripetizione del test per confermare la fosfolipide-dipendenza degli
autoanticorpi rilevati.
PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
Tutti i reagenti vengono forniti liofilizzati. Se conservati correttamente ad una temperatura compresa tra 2 e
8°C, i reagenti sigillati si mantengono stabili fino alla data di scadenza stampa sull'etichetta dei rispettivi flaconi.
Ricostituire ciascun reagente seguendo le istruzioni riportate di seguito.
1. LA Buffer™ (R1):
Ricostituire un flacone con 3,0 ml di acqua distillata o
deionizzata filtrata. Miscelare accuratamente i reagenti e
lasciarli riposare a temperatura ambiente per almeno 15
minuti per garantire una completa dissoluzione.
2. LA Phospholipids™ (R2):
Ricostituire un flacone con 2,0 ml di acqua distillata o
deionizzata filtrata. Miscelare accuratamente i reagenti e
lasciarli riposare a temperatura ambiente per almeno 15
minuti per garantire una completa dissoluzione.
3. dPT™ Activator™ (R3):
Ricostituire un flacone con 2,0 ml di acqua distillata o
deionizzata filtrata. Miscelare accuratamente i reagenti e
lasciarli riposare a temperatura ambiente per almeno 15
minuti per garantire una completa dissoluzione. NON
AGITARE AL VORTEX! MANTENERE A TEMPERATURA
AMBIENTE! NON REFRIGERARE! NON CONGELARE!
REAGENTI
R1
LA Buffer™: 3 flaconi, 40 test per flacone, contiene una formulazione unica di tampone, sali e
ingredienti inerti.
R2
LA Phospholipids™: 3 flaconi, 40 test per flacone, contiene una miscela brevettata di fosfolipidi,
conservanti e additivi inerti.
R3
dPT Activator™: 6 flaconi, 40 test per flacone, contiene una miscela brevettata di fattore tissutale
umano ricombinante, calcio, fosfolipidi, conservanti e additivi inerti.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI D'IMPIEGO
I reagenti contengono piccole quantità di sodio azoturo che, a contatto con le tubazioni di scarico in rame e
piombo, può dare luogo alla formazione di sostanze esplosive. Dopo aver provveduto allo smaltimento del
sodio azoturo, sciacquare con abbondante acqua.
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Non per uso interno negli esseri umani o negli animali. Non
utilizzare i componenti del kit oltre la data di scadenza stampata. Non miscelare reagenti appartenenti a lotti di
kit differenti. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti. Non fumare, mangiare o bere nei luoghi in cui
vengono manipolati i campioni o i reagenti del kit. Non pipettare i reagenti con la bocca. Indossare camice da
laboratorio e guanti monouso per tutta la durata del test e, al termine, lavarsi accuratamente le mani.
LA Buffer
-
-
H412, P273
LA
Phospholipids
-
-
H412, P273
CONT
dPT Activator
Dichiarazioni
Pericoli:
Prudenza:
Pericolo
La stabilità dei reagenti ricostituiti è riportata di seguito:
H
l
R1
R2
R3
10 giorni
10 giorni
8 ore
2-8°C
18-25°C
2-8°C
18-25°C
18-25°C
I reagenti ricostituiti R1 e R2 possono essere recuperati dallo strumento entro 10 giorni. Il reagente ricostituito
R3 può essere recuperato dallo strumento entro 8 ore. (Per i requisiti di temperatura validi per ciascun
reagente, fare riferimento alla tabella sopra riportata.)
CdCl2
H315, H319, H335, H340, H350, H360, H373,
P202, P260, P264, P280, P305+P351+P338,
P332+P313, P308+P313
H315 Provoca irritazione cutanea.
H319 Provoca grave irritazione oculare.
H335 Può irritare le vie respiratorie. H340 Può provocare alterazioni genetiche.
H350 Può provocare il cancro.
H360 Può nuocere alla fertilità o al feto.
H373 Può provocare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta
H412 Nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata.
P202 Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze.
P260 Non respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol.
P264 Lavare accuratamente dopo l’uso.
P273 Non disperdere nell’ambiente.
P280 Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso.
P305+P351+P338 In caso di contatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per
parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo.
Continuare a sciacquare.
P332 + P313 In caso di irritazione della pelle: Consultare un medico.
P308 + P313 IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Consultare un
medico.
2
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Per questo dosaggio si deve utilizzare plasma povero di piastrine raccolto in provette con citrato. Consultare
"Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-based Coagulation Assays and
Molecular Hemostasis Assays; Approved Guidelines-Fifth Edition", CLSI Document H21-A5, 2008".14 Il plasma
va prelevato nel modo seguente:
1. Utilizzando una siringa o provette sotto vuoto siliconate, prelevare 9 parti di sangue in 1 parte di soluzione
anticoagulante di citrato trisodico (diidrato) al 3,2% (0,109 M).
2. Centrifugare il campione di plasma ad una velocità minima di 5.000 x g per 10 minuti per ottenere plasma
povero di piastrine. Il plasma deve contenere meno di 10 4 piastrine/µl. È possibile eliminare le piastrine
anche facendo passare il plasma attraverso un filtro da 0,22 micron.
3. Il plasma deve essere conservato ad una temperatura compresa 2 e 8°C ed analizzato entro 4 ore. In
alternativa, il plasma può essere conservato a –70°C fino a 6 mesi.
H
l
4 ore
6 mesi
2-8°C
-70°C
4. Scongelare rapidamente il plasma congelato a 37°C. Il plasma scongelato deve essere conservato a 28°C ed analizzato entro 4 ore.
3
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Note:
1. Se l'ematocrito del campione di sangue originale è superiore al 55%, il risultato del test ACTICLOT dPT
può essere inesatto e potrebbe essere opportuna una correzione del rapporto sangue-anticoagulante.
2. Non analizzare campioni visibilmente itterici o lipemici con strumenti foto-ottici in quanto i tempi di
coagulazione ottenuti con tali strumenti potrebbero essere errati. Si consiglia di utilizzare un metodo
analitico alternativo, manuale o semi-automatico.
4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dPT Activator preriscaldato nella cuvetta contenente il plasma da
analizzare. Avviare subito il cronometro e registrare il tempo di coagulazione.
Procedura automatica
Il test di conferma ACTICLOT dPT può essere eseguito sulla maggior parte dei coagulometri automatici. Le
applicazioni per analizzatori automatici speciali sono disponibili su richiesta.
3. Non eseguire il test ACTICLOT dPT con campioni emolizzati.
1. Trasferire ACTICLOT LA Phospholipids e ACTICLOT dPT Activator nei pozzetti dei reagenti del
coagulometro automatico.
PROCEDURA
Materiali in dotazione – si veda Reagenti
2. Dispensare 100 µl di plasma in esame (per es. plasma del paziente, PNP, controllo positivo LA o controllo
negativo LA) in una cuvetta per coagulazione.
Materiali necessari ma non in dotazione
3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Phospholipids nella cuvetta contenente il plasma da analizzare.
Incubare per 2 minuti a 37°C.
Plasma di controllo normale LAtrol™ (Sekisui Diagnostics REF 816N)
Plasma di controllo anormale LAtrol™ (Sekisui Diagnostics REF 816A)
Plasma da pool normali (PNP)
Pipette monocanali per la dispensazione di volumi rispettivamente da 0-200 µl, 200-1000 µl e 1000-5000 µl
Acqua distillata o deionizzata filtrata (0,22 µm)
Coagulometro completamente o semi-automatico
Protocollo di screening ACTICLOT dPT
Procedura semi-automatizzata per l'ST4
1. Trasferire un volume sufficiente di ACTICLOT dPT Activator e ACTICLOT LA Buffer nei pozzetti dei
reagenti a 37°C di un ST4.
2. Dispensare 100 µl di plasma in esame (per es. plasma del paziente, PNP, controllo positivo LA o controllo
negativo LA) in una cuvetta per coagulazione. Incubare per 2 minuti a 37°C.
3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Buffer preriscaldato nella cuvetta contenente il plasma da analizzare.
4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dPT Activator preriscaldato nella cuvetta contenente il plasma da
analizzare. Avviare subito il cronometro e registrare il tempo di coagulazione.
Procedura automatica
Il test di screening ACTICLOT dPT può essere eseguito sulla maggior parte dei coagulometri automatici. Le
applicazioni per analizzatori automatici speciali sono disponibili su richiesta.
1. Trasferire ACTICLOT LA Buffer e ACTICLOT dPT Activator nei pozzetti dei reagenti del coagulometro
automatico.
2. Dispensare 100 µl di plasma in esame (per es. plasma del paziente, PNP, controllo positivo LA o controllo
negativo LA) in una cuvetta per coagulazione.
3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Buffer nella cuvetta contenente il plasma da analizzare. Incubare per 2
minuti a 37°C.
4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dPT Activator preriscaldato a 37°C nella cuvetta contenente il plasma da
analizzare. Annotare il tempo di coagulazione.
Protocollo di conferma ACTICLOT dPT
Procedura semi-automatizzata per l'ST4
1. Trasferire un volume sufficiente di ACTICLOT dPT Activator e ACTICLOT LA Phospholipids nei pozzetti
dei reagenti a 37°C di un ST4.
2. Dispensare 100 µl di plasma in esame (per es. plasma del paziente, PNP, controllo positivo LA o controllo
negativo LA) in una cuvetta per coagulazione. Incubare per 2 minuti a 37°C.
3. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT LA Phospholipids preriscaldati nella cuvetta contenente il plasma da
analizzare.
4
4. Aggiungere 50 µl di ACTICLOT dPT Activator preriscaldato a 37°C nella cuvetta contenente il plasma da
analizzare. Annotare il tempo di coagulazione.
RANGE DI RIFERIMENTO NORMALI
Per garantire il funzionamento corretto del test ACTICLOT dPT, è necessario che ciascun laboratorio stabilisca
i propri range di riferimento normali per i test di screening e di conferma. Per stabilire il range di riferimento
normale (si veda la sezione VALORI PREVISTI) vanno analizzati un minimo di 20 donatori di sangue sani, sia
uomini che donne in età adulta. Nello stabilire i range di riferimento normali, occorre prestare attenzione ad
effettuare il prelievo e la preparazione dei campioni di plasma normali allo stesso modo dei campioni di plasma
da analizzare. Se vengono analizzati esclusivamente campioni congelati, anche i range di riferimento normali
vanno stabiliti utilizzando campioni normali congelati. Per stabilire i range di riferimento normali o per i test di
routine non si raccomanda di analizzare popolazioni di plasma miste, costituite sia da campioni freschi che
congelati. È necessario stabilire nuovamente il range di riferimento normale ogni volta che viene utilizzato un
nuovo lotto di reagenti, un nuovo coagulometro o almeno una volta all'anno. I dati del range di riferimento
normale vanno rilevati nell'arco di alcuni giorni, in modo da tenere conto della variabilità inter-giornaliera.
Determinazione del tempo di screening medio e del range di riferimento normale per il test di screening
dPT
Analizzare i 20 campioni di plasma normale con il test di screening e determinarne il tempo di screening medio
(in secondi). Il tempo di screening medio + 2 DS rappresenta il limite superiore del range di riferimento normale
e viene utilizzato come valore limite (cut-off) per stabilire se un campione del paziente è positivo per LA nel test
di screening.
Determinazione del tempo di conferma medio per il test di conferma
Analizzare i 20 campioni di plasma normale con il test di conferma e determinarne il tempo di conferma medio.
Determinare il tempo di conferma medio (in secondi) per gli stessi 20 campioni di plasma normale sottoposti al
test di screening.
NOTA: per stabilire la presenza di LA in un campione di plasma, quest'ultimo deve essere sottoposto al test di
screening e a quello di conferma. Il tempo di screening e di conferma medio dei campioni di plasma normale
viene utilizzato per i calcoli alla base della diagnosi di LA nei campioni dei pazienti. Di seguito vengono descritti
due metodi di calcolo per i campioni dei pazienti: tempo di screening/tempo di conferma (S/C) e il rapporto
normalizzato. Sono stati descritti metodi alternativi per il calcolo dei risultati dei test LA.15
Determinazione del range di riferimento normale in base al metodo del rapporto S/C
Il rapporto S/C viene calcolato per ciascuno dei venti campioni di plasma normale dividendo il tempo di
screening per il tempo di conferma:
rapporto S/C = tempo di screening dPT (sec.) ÷ tempo di conferma dPT (sec.)
5
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Determinare il rapporto medio S/C (± 2 D.S.) per i venti campioni di plasma normale. Il rapporto S/C normale
medio + 2 DS viene utilizzato per stabilire il limite superiore del range di riferimento normale per diagnosticare
la presenza di LA nei campioni in esame.
Determinazione del range di riferimento normale in base al metodo del rapporto normalizzato
Dividere il tempo di screening di ciascun campione di plasma normale per il tempo di screening medio del
range di riferimento normale (si veda sopra). Dividere quindi il tempo di conferma di ciascun campione di
plasma normale per il tempo di conferma medio del range di riferimento normale (si veda sopra). Il rapporto
normalizzato viene determinato dividendo il rapporto di screening normalizzato per il rapporto di conferma
normalizzato:
rapporto
normalizzato =
tempo di screening dPT plasma normale (sec.) ÷ tempo di screening dPT normale medio (sec.)
1. Se il tempo di screening dPT della miscela 1:1 è superiore al range di riferimento normale stabilito dal
laboratorio (media + 2 DS), si sospetta che il campione di plasma sia positivo per LA. Se il tempo di
screening dPT della miscela 1:1 rientra nel range normale (media ± 2 DS), si sospetta la presenza di
carenza di un fattore del sangue. Se lo si desidera, si possono eseguire test del fattore appropriati (si veda
Algoritmo decisionale).
2. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato della miscela 1:1 è superiore al range di riferimento normale
stabilito dal laboratorio (media + 2 DS), il campione di plasma è confermato positivo per LA. Se il rapporto
S/C o il rapporto normalizzato della miscela rientra nel range di riferimento normale stabilito dal laboratorio
(rapporto medio ± 2 DS), si sospettano altre anormalità (per es. Coumadin, inibitore del fattore).
VALORI PREVISTI
Determinare il rapporto normalizzato medio (± 2 DS) dei venti campioni normali. Il rapporto normalizzato medio
+ 2 DS viene utilizzato per stabilire il limite superiore del range di riferimento normale per diagnosticare la
presenza di LA nei campioni in esame.
Nella Tabella 1 sono riportati i range di riferimento normali tipici per i test ACTICLOT dPT di screening e di
conferma, i tempi di coagulazione e il rapporto S/C, ottenuti utilizzando coagulometri in commercio. Questi
risultati sono soltanto indicativi. I campioni di plasma congelati prelevati da singoli donatori sono stati
acquistati da fornitori commerciali o prelevati e preparati dal personale di laboratorio in cui viene eseguito il
test conformemente al documento H21-A4 dell'NCCLS.14 I donatori comprendevano sia uomini che donne,
di età adulta e con valori PT e aPTT normali. Non erano disponibili altri dati demografici.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
TABELLA 1: Range di riferimento normali per il test ACTICLOT dPT con coagulometri in
commercioa
tempo di conferma dPT plasma normale (sec.) ÷ tempo di conferma dPT normale medio (sec.)
Un algoritmo decisionale per l'analisi dei campioni di plasma dei pazienti è riportato alla fine del presente
foglietto illustrativo per facilitare l'interpretazione dei risultati.
Coagulometro
A. I campioni di plasma dei pazienti vengono sottoposti al test di screening. Determinare se il tempo di
coagulazione del campione di plasma è superiore o inferiore al limite superiore del range di riferimento
normale stabilito.
ACL® 300+
(n=25)
BCT®
(n=32)
CA7000
(n=20)
MLA® 900C
(n=93)
ST4
(n=25)
STA
Compact®
(n=25)
Tempo di screening, sec.
(media ± 2 DS)
34,4 + 4,5
51,2 + 7,8
38,8 + 8,8
26,7 + 4,8
38,4 + 4,2
36,6 + 5,9
1. Se il tempo di coagulazione (sec.) del campione di plasma sottoposto a test di screening rientra nel range
di riferimento normale stabilito (media + 2 DS), il risultato del test è negativo per LA.
Tempo di conferma, sec.
(media ± 2 DS)
29,2 + 4,8
50,5 + 11,0
35,8 + 4,0
26,2 + 5,2
34,9 + 8,5
35,7 + 3,1
2. Se il tempo di coagulazione (sec.) del campione di plasma sottoposto a test di screening è superiore al
limite superiore del range di riferimento normale stabilito (media + 2 DS), si sospetta che il campione sia
positivo per LA.
Rapporto S/C
(media ± 2 DS)
1,18 + 0,12
1,02 + 0,12
1,08 + 0,26
1,02 + 0,16
1,11 + 0,19
1,03 + 0,09
Un plasma con un risultato positivo al test di screening ACTICLOT dPT deve essere sottoposto al test di
conferma ACTICLOT dPT per identificare la presenza di LA nel campione di plasma. Un risultato positivo per
LA al test di screening ACTICLOT dPT può essere confermato soltanto con il test di conferma ACTICLOT dPT.
a
dati dell'Sekisui Diagnostics16
CONTROLLO DI QUALITÀ
2. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato del campione di plasma in esame rientra nel range di
riferimento normale (media ± 2 DS), il campione di plasma non è confermato positivo per LA. Questo
campione deve essere fatto oggetto di studi di mixing.
Un plasma di controllo LA normale e uno di controllo LA anormale devono essere analizzati con ciascun gruppo
di una serie analitica, nel caso di cambio del personale o all'inizio di ogni turno di lavoro, o in base alle linee
guida previste dal rispettivo laboratorio. I controlli devono essere poveri di piastrine, con meno di 10 4
piastrine/µl. I plasmi di controllo LA normale ed anormale sono disponibili presso la Sekisui Diagnostics
(rispettivamente REF 816N e REF 816A). I valori per entrambi i plasmi di controllo LA normale e anormale
devono rientrare nei range dei controlli stabiliti dal laboratorio. Se i valori dei controlli non rientrano nei limiti dei
controlli precedentemente stabiliti dal rispettivo laboratorio ed è stato appurato che la strumentazione funziona
correttamente, i risultati devono essere eliminati e i campioni sottoposti alla ripetizione del test con reagenti
freschi. Prima di analizzare i campioni dei pazienti, è necessario aver ottenuto valori corretti per i controlli
normale e anormale.
Studi di mixing
TRACCIABILITÀ DEI CONTROLLI
Se il campione di plasma presenta un tempo di screening ACTICLOT dPT prolungato e il rapporto S/CO o il
rapporto normalizzato rientra invece nel range di riferimento normale, si può sospettare la presenza di
anormalità biologiche, quali ad esempio la carenza di un fattore della coagulazione del sangue (per es. fattore
II, V o X), un inibitore del fattore (per es. l'inibitore del fattore VIII), o che il paziente sia in trattamento con
anticoagulanti orali (ad es. Coumadin™). In tal caso si raccomanda di eseguire uno studio di mixing. Uno studio
di mixing si effettua aggiungendo pari volumi di plasma in esame e plasma da pool normali. I test ACTICLOT
dPT di screening e di conferma devono essere eseguiti con il plasma miscelato in rapporto 1:1.
Informazioni relative alla tracciabilità dei controlli possono essere richieste all'Sekisui Diagnostics.16
B. Ciascun campione di plasma risultato positivo al test di screening viene sottoposto al test di conferma.
Determinare il rapporto S/C o il rapporto normalizzato del plasma in esame.
1. Se il rapporto S/C o il rapporto normalizzato del campione di plasma in esame è superiore al limite
superiore stabilito per il range di riferimento normale (media + 2 DS), il campione di plasma è confermato
positivo per LA.
6
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LIMITI DEL METODO
Specificità e sensibilità
Il tempo di screening del test ACTICLOT dPT può risultare prolungato nei pazienti con carenze di fattore
congenite o acquisite. Le carenze di fattore congenite possono essere determinate sulla base di studi di mixing,
descritti in precedenza. I campioni di plasma contenenti inibitori del fattore (carenze acquisite) possono essere
identificati o meno negli studi di mixing poiché l'inibitore può non essere completamente neutralizzato dal PNP
utilizzato in tali studi.
Nello studio clinico I, la specificità e sensibilità del test ACTICLOT dPT sono state determinate utilizzando 20
campioni di plasma normali e 23 campioni di plasma noti essere debolmente positivi per LA. I risultati sono
indicati nella Tabella 3. Si riportano anche i risultati del test ACTICLOT dPT in combinazione con quelli ottenuti
dai test LA disponibili in commercio DVVtest/DVVconfirm (dell'Sekisui Diagnostics).
L'ACTICLOT dPT Activator contiene degli agenti che neutralizzano l'eparina non frazionata fino a 1,0 U/ml
compreso. I campioni di plasma che contengono livelli di eparina non frazionata superiori a 1,0 U/ml possono
dare risultati non corretti e non devono essere pertanto utilizzati con il presente test.
TABELLA 3: Studio clinico I – specificità e sensibilitàa
I campioni di plasma prelevati da pazienti trattati con Coumadin e altri anticoagulanti orali possono presentare
tempi di coagulazione prolungati con i test ACTICLOT dPT di screening e di conferma. Negli studi di mixing,
questi tempi di coagulazione possono essere abbreviati fino a rientrare nel range normale, a condizione che LA
non sia presente.
Nessun test LA è in grado da solo di identificare tutti i campioni LA-positivi. Il sottocomitato scientifico dell'ISTH
raccomanda di sottoporre i campioni sospettati di contenere LA a due o più test di screening per la
determinazione di LA e ad almeno un test di conferma contenente un'elevata concentrazione di fosfolipidi.9
CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
Precisione
Gli studi di precisione per il test ACTICLOT dPT sono stati condotti dall'Sekisui Diagnostics e da due laboratori
indipendenti su diversi coagulometri: l'ACL™ 300R della Instrumentation Laboratory, il BCT® della Dade
Behring, il CA-7000 della Sysmex®, il coagulometro MLA® 900C della Instrumentation Laboratory e STart® 4 e
STA Compact® della Diagnostica Stago. Gli studi hanno incluso test multipli eseguiti per diversi giorni
utilizzando plasmi di controllo disponibili in commercio. I risultati sono riportati in sintesi nella Tabella 2.
TABELLA 2: Dati di precisione per il test ACTICLOT dPT con plasmi di controllo normale e anormale
(Lupus-positivi)
Coagulometro
ACL 300R
BCT
CA-7000
MLA 900C
STart 4
STA Compact
a
b
Protocollo di
screening
ACTICLOT
dPT
Protocollo di
conferma
ACTICLOT dPT
ACTICLOT dPT (S/C)
+ DVV (T/C)
N. di plasmi normali risultati negativi al test
N. di plasmi normali sottoposti a test
20/20
20/20
NRb
Specificità
100%
100%
NRb
N. di plasmi LA noti risultati positivi al test
N. di plasmi LA noti sottoposti a test
21/23
18/23
22/23
Sensibilità
91%
78%
95,6%
eseguito sul coagulometro CA-7000
Non Riportato
Nello studio clinico II, ventinove campioni di plasma noti essere LA-positivi sono stati analizzati con il test
ACTICLOT dPT, DVVtest/DVVconfirm e un reagente aPTT LA-sensibile disponibile in commercio. Se utilizzata
in un pannello con questi test, la sensibilità di ACTICLOT dPT è riportata nella TABELLA 4. La sensibilità è
aumentata combinando i risultati ottenuti con ogni singolo test.
Tempo
medio del
test di
screening
dPT (sec.)
CV (%)
intradosaggio
CV (%)
interdosaggi
Tempo
medio del
test di
conferma
dPT (sec.)
CV (%)
intradosaggio
CV (%)
interdosaggi
Normale
32,8
2,5
5,1
30,2
3,8
5,3
Anormale
63,8
1,9
7,1
36,9
3,2
3,8
Normale
47,5
0,5
3,2
51,6
1,7
4,5
Anormale
89,2
0,6
5,2
61,9
1,2
3,7
Normale
44,3
0,9
ND
37,9
2,0
ND
Anormale
84,1
5,4
ND
48,6
3,3
ND
Normale
27,9
2,5
3,7
27,2
2,8
4,1
b
Anormale
51,6
2,4
8,6
30,5
1,5
3,7
Confronto metodologico
Normale
38,1
0,7
ND
37,3
3,8
ND
Anormale
60,6
6,5
ND
44,0
6,7
ND
Normale
40,2
0,8
3,4
39,7
0,9
4,3
Anormale
77,9
1,1
7,2
46,0
1,0
4,8
Sono stati condotti due studi di confronto tra i metodi con i test ACTICLOT dPT e DVVtest/DVVconfirm. In
entrambi gli studi sono stati esaminati campioni di pazienti risultati precedentemente positivi per LA o con valori
entro il range normale. Nel primo studio, condotto sul sistema STA Compact, i risultati di 49 su 54 campioni di
pazienti analizzati (90,7%) erano concordanti. Nel secondo studio, condotto sul sistema BCT, i risultati di 82 su
93 campioni di pazienti analizzati (88,2%) erano concordanti.16
Controllo*
* Sekisui Diagnostics REF 816N, 816A
TABELLA 4: Studio clinico II – Sensibilità di un pannello del test LA di ACTICLOT dPT,
DVVtest/DVVconfirm e aPTT
N. di plasmi LA noti risultati positivi al test
N. di plasmi LA noti sottoposti a test
Sensibilità
a
ACTICLOT dPTa
ACTICLOT dPTa
+ DVVb
ACTICLOT dPTa
+ DVVb + aPTTb
23/29
25/29
28/29
78%
86%
97%
eseguito sul coagulometro ACL® 300R
eseguito sul coagulometro Sysmex CA-1500
ND = Non Determinato
8
9
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BIBLIOGRAFIA
Algoritmo decisionale per la diagnosi di LA con il test ACTICLOT dPT
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Confirms Heterogeneity among 'Lupus Anticoagulants.' Blood Coag Fibrinol 1990, 1: 259-266.
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An Update. Thromb Haemost 1995, 74(4): 1185-1190.
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Comparison of the Tissue Thromboplastin Inhibition Procedure with a New Platelet Neutralization
Procedure. Am J Clin Path 1983, 79: 678-682.
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15. Lawrie, A. A., Mackie, I. J., Purdy, G. and Machin, S. J. The Sensitivity and Specificity of Commercial
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Photo-optical and Mechanical Coagulometers. Thromb Haemost 1999, 81: 758-762.
16. Dati disponibili su file presso la Sekisui Diagnostics, Stamford, Connecticut 06902
ACL è un marchio commerciale di Instrumentation Laboratory, SpA.
Plasma Di Un Paziente Con
Sintomi APS
Protocollo Di Screening dPT
LA NEGATIVO
NO
Analizzare Il Plasma Con Altri
Test (dRVVT, aPTT, KCT, ecc.) o
APA ELISAs
Test Del Tempo Di
Coagulazione
Prolungato?
SÌ(1)
Protocollo Di Conferma dPT
SÌ
Il Test Di Conferma è
Risultato Positivo?
LA POSITIVO
NO(2)
Preparare Il Campione Per Studi
Di Mixing Con Il Campione Di
Plasma Più PNP (1:1)
Protocollo Di Screening dPT
Caratterizzare Anticorpi
Antifosfolipidi Specifici(3)
NO
LA NEGATIVO
BCT è un marchio commerciale registrato di Dade Behring Inc.
Test Del Tempo
Di Coagulazione
Prolungato?
MLA è un marchio commerciale registrato di Instrumentation Laboratory, SpA.
SÌ(1)
STACLOT e STA Compact sono marchi commerciali registrati di Diagnostica Stago, sas.
Protocollo Di Conferma dPT
Sysmex è un marchio commerciale registrato di Sysmex Corporation.
Analizzare Per Determinare
L’eventuale Presenza Di Carenze Di
Fattori, Inibitori O Anticoagulanti Orali
NO(2)
SÌ
Il Test Di Conferma È
Risultato Positivo?
LA POSITIVO
(1) Si sospetta la presenza di LA
10
(2) Il prolungamento del tempo di coagulazione
con il protocollo di screening non è stato corretto
in modo significativo nel protocollo di conferma.
(3) Test ELISA per anti-ß2GP1, anti-protrombina, anti-cardiolipina,
anti-annessina V, etc.
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Chiave dei simboli

Consultare le istruzioni
per l’uso

Consultare la SDS

Dispositivo medico per
diagnosi in vitro

Prodotto da
8°C
2°C
 
Conservare tra 2°C e 8°C

Numero di lotto

Data di scadenza

Numero di catalogo

Marchio CE

Rappresentante
sutorizzato per l’Europa
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