factor v leiden kit

FACTOR V LEIDEN KIT
Da utilizzarsi con lo strumento LightCycler® 2.0
REF 03 610 179 001 Kit sufficiente per 32 reazioni per un massimo di 30 campioni
Per uso diagnostico in vitro.
NOTA IMPORTANTE:
LE INFORMAZIONI RIGUARDANTI IL LOTTO SPECIFICO DEL KIT FACTOR V LEIDEN SONO RIPORTATE SUL RETRO DI QUESTO
FOGLIO ILLUSTRATIVO, IN FORMA ALFANUMERICA O COME CODICE A BARRE. È OBBLIGATORIO IMMETTERE QUESTE
INFORMAZIONI NEL SOFTWARE DELLO STRUMENTO LIGHTCYCLER® 2.0. A QUESTO SCOPO, INSERIRE I DATI MANUALMENTE O
UTILIZZARE IL LETTORE DI CODICI A BARRE NEL CORSO DEL FLUSSO DI LAVORO. PRIMA DI INSERIRE QUESTE INFORMAZIONI, È
TUTTAVIA OPPORTUNO VERIFICARE CHE IL NUMERO DI LOTTO RIPORTATO SUL RETRO DEL FOGLIO ILLUSTRATIVO E IL NUMERO
DI LOTTO PRESENTE SULLA SCATOLA DEL KIT SIANO IDENTICI.
USO PREVISTO
Il kit Factor V Leiden è indicato per la rivelazione e la genotipizzazione di una mutazione puntiforme (da G ad A nella posizione 1691) del gene del
fattore V umano, noto come mutazione Factor V Leiden, proveniente da DNA isolato da sangue periferico intero umano. Per l'esecuzione del test sullo
strumento LightCycler® 2.0 si utilizzano due tecniche: la prima, una reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR), amplifica il
DNA del fattore V proveniente da campioni clinici; la seconda, l'ibridazione target-specifica con sonde fluorogeniche, consente di rivelare e
genotipizzare il DNA del fattore V precedentemente amplificato.
Il test Factor V Leiden è un esame diagnostico in vitro finalizzato alla rivelazione e alla genotipizzazione della mutazione Factor V Leiden e utilizzato come
strumento ausiliario per la diagnosi e la valutazione dei pazienti con sospetta trombofilia. Il test è stato concepito per essere utilizzato sullo strumento
LightCycler® 2.0 con il software LightCycler® 4.05 o 4.1. I campioni devono essere preparati in base alle procedure di lavoro descritte di seguito.
SPIEGAZIONE DEL TEST
La trombofilia ereditaria predispone un soggetto ad eventi trombolici come la trombosi venosa, attualmente la terza patologia cardiovascolare più
diffusa (1). La resistenza alla proteina C attivata (APC) è ritenuta l'anomalia della coagulazione che più comunemente appare associata alla trombosi
venosa (1,2). Una mutazione puntiforme nella posizione 1691 del gene del fattore V, nota come mutazione Factor V Leiden, provoca una sostituzione
dell'arginina con glutamina nella posizione 506 nella proteina del fattore V, che sviluppa una parziale resistenza all'inattivazione mediante APC.
L'analisi genetica ha dimostrato che questa mutazione, che ha una prevalenza relativamente alta nella popolazione generale (ovvero del 5% circa negli
individui caucasici), è responsabile dell'85%-95% dei casi di resistenza all'APC (2).
PRINCIPIO DEL TEST E DESCRIZIONE
Preparazione dei campioni
LLa preparazione dei campioni può avvenire manualmente o in modo automatizzato utilizzando High Pure PCR Template Preparation Kit o lo
strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, sul quale viene eseguito MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Sono questi i soli metodi di purificazione
approvati per l’uso con il test Factor V Leiden.
Rivelazione
1. Un frammento di 222 bp (paia di basi) del gene del fattore V viene amplificato dal DNA genomico umano utilizzando primer specifici.
2. L'amplicone viene rivelato mediante fluorescenza utilizzando una coppia specifica di sonde H. Le sonde H sono
costituite da due distinti oligonucleotidi che, durante la fase di "annealing" (appaiamento, riassociazione) del ciclo PCR, ibridano su una
sequenza interna del frammento amplificato. Una sonda è marcata all'estremità 5' con LightCycler® Red 640-NHS (rosso, estere
dell'N-idrossisuccinimide 640) e, per evitare l'estensione, viene modificata all'estremità 3' mediante fosforilazione. L'altra sonda è marcata
all'estremità 3' con fluoresceina.
3. Le due sonde vengono a trovarsi in stretta prossimità solo dopo l'ibridazione sul DNA templato, provocando un trasferimento di energia a
risonanza di fluorescenza (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) tra i due fluorofori. Durante la fase FRET il fluoroforo donatore
(donor), ovvero la fluoresceina, viene eccitato dalla sorgente di luce dello strumento LightCycler® 2.0 e una parte dell'energia di eccitazione
viene trasferita al fluoroforo ricevente (acceptor), ovvero l'estere LightCycler® Red 640-NHS.
4. La fluorescenza emessa dall'estere LightCycler® Red 640-NHS viene quindi misurata dallo strumento LightCycler® 2.0.
Genotipizzazione
Le sonde H servono inoltre per determinare il genotipo. A questo scopo viene eseguita un'analisi della curva di melting al termine dei cicli
di amplificazione, quando l'amplicone è presente in concentrazioni maggiori.
• Si assiste così all'ibridazione della sonda H marcata con Red 640 su una parte della sequenza target che non è mutata e funge da
sonda di ancoraggio.
• La sonda H marcata con fluoresceina copre il sito di mutazione (sonda di mutazione).
Durante l'analisi della curva di melting, l'aumento della temperatura provoca una diminuzione della fluorescenza in quanto la sonda più corta tra le due
(la sonda di mutazione) si dissocia per prima e i due marcatori fluorescenti non si trovano più in stretta prossimità. Se la mutazione Factor V Leiden è
presente, l'assenza di complementarietà tra sonda di mutazione e target destabilizza l'ibrido, causando una diminuzione della fluorescenza a una
temperatura più bassa. Con il genotipo wild type non si verifica questa assenza di complementarietà, pertanto il DNA eteroduplice avrà una
temperatura di melting (Tm) più alta. Il genotipo eterozigote mostra un particolare insieme di proprietà.
1
REAGENTI – SOLUZIONI DI LAVORO
1. FVL MD Mix
(miscela di rivelazione della mutazione Factor V Leiden)
1 × 78 µl
2. FVL R Mix
(miscela di reazione per fattore V Leiden)
1 × 78 µl
3. FVL CT
(modello di controllo per fattore V Leiden)
1 × 50 µl
4. FVL DIL
(diluente per fattore V Leiden)
1 × 1 ml
• <0,01% primer FVL forward e reverse
• <0,01% sonda H FVL marcata con Red 640
• <0,01% sonda H FVL marcata con fluoresceina
• Tampone Tris-HCl
• <0,01% Taq DNA polimerasi, grado GMP
• <0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
<0,01% DNA templato di controllo
contiene plasmide: pCRF5 WT e pCRF5MUT
• Brij 35
• MgCl2
• Brij 35
• MgCl2
H2O, grado PCR (utilizzata anche come controllo negativo per l'amplificazione)
PRECAUZIONI E AVVERTENZE
Polimorfismo
Nell'ambito del gene del fattore V, oltre alla mutazione FVL nella posizione 1691 esistono altre mutazioni che sono coperte dalla sonda di mutazione. Tre
mutazioni rare produrranno un risultato falso positivo (ovvero il genotipo het o mut) dopo l'esecuzione dell'analisi della curva di melting (ovvero le
mutazioni A1692C, G1689A e A1696G).
Nota: il test Factor V Leiden può essere eseguito oltre a/successivamente a un dosaggio funzionale per determinare il fenotipo di resistenza alla
proteina C attivata (APC). Soltanto la mutazione FVL è collegata alla resistenza all'APC, non le altre tre mutazioni rare citate sopra.
Istruzioni per la manipolazione
• PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. Questo prodotto può essere manipolato esclusivamente da personale con adeguata conoscenza
della tecnica PCR.
• Adottare le normali precauzioni previste per la manipolazione di tutti i reagenti di laboratorio.
• Questo test è idoneo all'uso con sangue intero umano raccolto solo con gli anticoagulanti EDTA o citrato. L'uso dell'eparina in questa procedura
è sconsigliato, in quanto questo tipo di anticoagulante può interferire con la PCR.
• È necessario adottare un flusso di lavoro conforme alla Buona Prassi di Laboratorio (Good Laboratory Practices, GLP) che sia inoltre di tipo
unidirezionale e preveda, ad esempio, una separazione fisica tra le varie fasi: preparazione dei campioni, configurazione della PCR, seduta PCR con
LightCycler® 2.0.
• Non utilizzare pool di reagenti provenienti da lotti diversi o da flaconi diversi dello stesso lotto. Richiudere tutti i flaconi subito dopo l'uso, in modo da
prevenire eventuali fuoriuscite di liquidi, alterazioni della concentrazione del tampone o variazioni delle condizioni del tampone. Dopo l'apertura,
conservare i flaconi e le fiale in posizione verticale.
• Non mescolare reagenti di lotti diversi.
• Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.
• Evitare il contatto diretto tra la cute, gli occhi o le membrane mucose e il tampone legante/di lisi e il tampone di lavaggio I (MagNA Pure LC DNA
Isolation Kit I) o il tampone di rimozione degli inibitori (High Pure PCR Template Preparation Kit). In caso di contatto accidentale, lavare
immediatamente con abbondante acqua. Se non si interviene, vi è il rischio di ustioni. In caso di fuoriuscita del reagente, diluire il liquido con acqua
prima di asciugare.
• Evitare il contatto diretto tra soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) o soluzioni fortemente acide e il tampone legante/di lisi (MagNA Pure LC
DNA Isolation Kit I), che contiene tiocianato di guanidina. L'eventuale miscela di queste soluzioni può produrre gas altamente tossici.
Procedure di laboratorio
• Considerare come potenzialmente infettivi tutti i materiali di origine umana e i materiali di scarto prodotti. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le
superfici di lavoro con i disinfettanti consigliati dalle autorità locali.
• Evitare di mangiare, bere o fumare nell'area di lavoro del laboratorio.
• Non pipettare per bocca.
• Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso.
• Durante il prelievo delle aliquote dai flaconi, evitare la contaminazione microbica o da nucleasi dei reagenti. Si consigliano pipette sterili di tipo
monouso.
• Dopo la manipolazione dei campioni e dei reagenti del test, lavarsi accuratamente le mani.
Materiale di scarto
• Smaltire i reagenti inutilizzati e i rifiuti nel rispetto delle normative locali, regionali, nazionali e comunitarie vigenti.
• È possibile richiedere le schede di sicurezza dei prodotti (MSDS, Material Safety Data Sheets) alla sede Roche locale.
Preparazione dei campioni
• Per informazioni sulla manipolazione e lo smaltimento dei campioni, fare riferimento alle istruzioni per la sicurezza fornite nel foglio illustrativo dei
prodotti MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I e High Pure PCR Template Preparation Kit.
• Le confezioni di MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I e High Pure PCR Template Preparation Kit devono essere conservate a temperatura ambiente (tra
+15°C e +25°C). Prima di utilizzare il tampone legante/di lisi appartenente al MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, agitare il flacone per sciogliere i
precipitati. Non conservare a una temperatura inferiore a quella ambiente.
• Per lo svolgimento di questa procedura, utilizzare esclusivamente la tanica di reagente media MagNA Pure LC da 20 (nr. di catalogo 03 004 058 001)
o la tanica di reagente grande MagNA Pure LC (nr. di catalogo 03 004 040 001) nelle posizioni loro assegnate dallo strumento MagNA Pure LC/
MagNA Pure LC 2.0.
Amplificazione e rivelazione
• Prima di utilizzare questo kit, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler® 2.0 per uso IVD.
• Prendere nota della correlazione con l'ID del rotore porta campioni LightCycler®, registrando il nome associato a ciascun campione, la posizione sul
rotore porta campioni LightCycler® e il numero del capillare, in modo da assicurare una corretta identificazione dei campioni.
• Non toccare la superficie dei capillari. Per manipolare i capillari, indossare sempre i guanti.
2
MANIPOLAZIONE DEI REAGENTI
1. FVL MD Mix (tappo giallo, fiala 1), pronto per l'uso
2. FVL R Mix (tappo rosso, fiala 2), pronto per l'uso
3. FVL CT (tappo viola, fiala 3), pronto per l'uso
4. FVL DIL (tappo incolore, fiala 4), pronto per l'uso
•
•
•
•
•
Conservare tra -15°C e -25°C.
Tenere al riparo dalla luce.
Conservare tra -15°C e -25°C.
Conservare tra -15°C e -25°C.
Conservare tra -15°C e -25°C.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ DEI REAGENTI
• Prima dell'apertura, il kit può essere conservato a una temperatura compresa tra -15°C e -25°C fino alla data di scadenza stampata
sull'etichetta.
• Tenere il reagente FVL MD Mix (fiala 1, tappo giallo) al riparo dalla luce.
• Scongelare i componenti del kit Factor V Leiden, miscelare con cura e conservare in ghiaccio.
• Congelare subito dopo l'uso.
• I reagenti del kit possono essere congelati e scongelati al massimo cinque volte.
RACCOLTA, PREPARAZIONE E STABILITÀ DEI CAMPIONI
Per la preparazione del DNA genomico da sangue umano, eseguire la purificazione dell'acido nucleico con il prodotto High Pure PCR Template
Preparation Kit (nr. di catalogo 11 796 828 001) oppure con il prodotto MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di catalogo 03 003 990 001) sullo
strumento MagNA Pure LC (nr. di catalogo 12 236 931 001) o sullo strumento MagNA Pure LC 2.0 (nr. di catalogo 05 197 686 001), come descritto
di seguito.
• Il sangue periferico umano raccolto con gli anticoagulanti EDTA o citrato è stabile per almeno 7 giorni a una temperatura compresa tra +2°C
e +8°C. Può essere conservato a -20°C per un massimo di 12 mesi e scongelato una sola volta.
• Il DNA eluito può essere conservato in una cartuccia per campioni sigillata oppure in provette Sarstedt con tappo avvitabile a una temperatura
compresa tra +2°C e +8°C per un massimo di 7 giorni. È stabile a lungo (3 settimane circa) se conservato a una temperatura compresa tra 15°C e -25°C. Il DNA eluito può essere congelato e scongelato al massimo tre volte.
MATERIALI FORNITI
Vedere "Reagenti – soluzioni di lavoro" a pagina 2.
MATERIALI E DISPOSITIVI NECESSARI MA NON FORNITI
• Strumento LightCycler® 2.0 (nr. di cat. 03 531 414 201)
Nota: negli USA sono utilizzati numeri di catalogo diversi. Rivolgersi
all'ufficio vendite negli USA per i dettagli.
(Il numero di serie 1415001 e i successivi sono approvati per l’uso IVD
e per l’uso con questo kit. Gli strumenti con numeri di serie anteriori a
1415001 sono anch’essi approvati per l’uso con questo kit, ma soltanto
in subordine all’approvazione per l’uso IVD dopo una speciale
procedura di aggiornamento. Rivolgersi al servizio clienti locale per
ulteriori informazioni sulla procedura di aggiornamento.)
• Software LightCycler® 4.05 (nr. di cat. 04 717 392 001)
o 4.1 (nr. di cat. 04 898 915 001)
• Capillari LightCycler® (20 µl) (nr. di cat. 04 929 292 001)
• High Pure PCR Template Preparation Kit (nr. di cat. 11 796 828 001)
• Provette per microcentrifuga da 1,5 ml, sterili, senza nucleasi
• Adattatori per centrifuga LightCycler® (nr. di cat. 11 909 312 001)
• Lettore di codici a barre (nr. di cat. 04 557 174 001)
• Factor V Leiden Kit Macro (nr. di cat. 04 586 913 001)
• Etanolo p.a.
MATERIALI OPZIONALI
• CD contenente i protocolli di post-eluizione per trombofilia
(nr. di cat. 04 378 784 001)
• Stampante per codici a barre MagNA Pure LC, modello TLP 2844
(nr. di cat. 03 576 094 001)
• Attrezzatura generale da laboratorio
• Isopropanolo p.a.
• H2O, bidistillata, sterile e senza nucleasi
• Strumento MagNA Pure LC (nr. di catalogo 12 236 931 001) con il
software MagNA Pure LC 3.011 o versione successiva oppure
Strumento MagNA Pure LC 2.0 (nr. di catalogo 05 197 686 001) con
qualsiasi configurazione software
• MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di cat. 03 003 990 001)
• Cestelli per Centrifuga per rotore porta campioni LC 2.0 plus [nr. di cat.
03 709 582 001 (230 V) o 03 709 507 001 (115 V)]. Se è già stata
acquistata una Centrifuga per rotore porta campioni LC [nr. di cat.
12 189 682 001 (230 V) o 03 030 512 001 (115 V)], occorre procurarsi
anche un Set rotori LightCycler® 2.0 (nr. di cat. 03 724 697 001)*.
• Provette Sarstedt con tappo avvitabile, da 1,5 ml, sterili
* Nel caso in cui non sia disponibile una Centrifuga per rotore porta
campioni LC, consultare il Manuale Operativo dello strumento
LightCycler® 2.0, versione software 4.05 o 4.1 per uso diagnostico in vitro,
oppure rivolgersi all'assistenza tecnica. In questo caso sono necessari
anche gli adattatori per centrifuga LightCycler® (nr. di cat.11 909 312 001).
• Nastro per stampante di codici a barre MagNA Pure LC
(nr. di cat. 03 531 538 001)
• Blocco di raffreddamento MagNA Pure LC per rotore porta campioni LC
(nr. di cat. 12 189 704 001)
• Penna per applicazione tappini LightCycler® (Capping Tool)
(nr. di cat. 03 357 317 001)
PROCEDURA DELL'ANALISI
NOTA IMPORTANTE:
LE INFORMAZIONI RIGUARDANTI IL LOTTO SPECIFICO DEL KIT FACTOR V LEIDEN SONO RIPORTATE SUL RETRO DI QUESTO
FOGLIO ILLUSTRATIVO, IN FORMA ALFANUMERICA O COME CODICE A BARRE. È OBBLIGATORIO IMMETTERE QUESTE
INFORMAZIONI NEL SOFTWARE DELLO STRUMENTO LIGHTCYCLER® 2.0. A QUESTO SCOPO, INSERIRE I DATI MANUALMENTE O
UTILIZZARE IL LETTORE DI CODICI A BARRE NEL CORSO DEL FLUSSO DI LAVORO. PRIMA DI INSERIRE QUESTE INFORMAZIONI, È
TUTTAVIA OPPORTUNO VERIFICARE CHE IL NUMERO DI LOTTO RIPORTATO SUL RETRO DEL FOGLIO ILLUSTRATIVO E IL NUMERO
DI LOTTO PRESENTE SULLA SCATOLA DEL KIT SIANO IDENTICI.
3
➀
A.
Procedura automatizzata per la preparazione di 15 o 30 campioni con il prodotto MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I
(nr. di catalogo 03 003 990 001) e lo strumento MagNA Pure LC (nr. di catalogo 12 236 931 001) o lo strumento MagNA Pure
LC 2.0 (nr. di catalogo 05 197 686 001).
PURIFICAZIONE
Operazioni preliminari
Iniziare a preraffreddare il blocco MagNA Pure LC per rotore porta campioni LC (nr. di catalogo 12 189 704 001) in frigorifero, a una temperatura
compresa tra +2°C e +8°C per almeno 2 ore.
Accensione dello strumento e avvio del software MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0
1. Accendere lo strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 e avviare il computer.
2. Per il software MagNA Pure LC: avviare il software MagNA Pure LC e, nella schermata Main Menu, fare clic sul pulsante Sample
Ordering.
Per il software MagNA Pure LC 2.0: aprire la scheda Workplace e selezionare la scheda secondaria Ordering.
3. Per MagNA Pure LC: Nella schermata Sample Ordering, selezionare il protocollo intitolato DNA I Blood Cells Fast e immettere
i numeri dei lotti per MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di catalogo 03 003 990 001) e per il kit Factor V Leiden, quindi immettere
l'ID del rotore porta campioni LightCycler® (non modificare le altre impostazioni).
Per MagNA Pure LC 2.0: nella scheda secondaria Ordering selezionare il protocollo intitolato DNA I Blood Cells Fast e immettere
i numeri dei lotti per MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (nr. di catalogo 03 003 990 001) e per il kit Factor V Leiden, quindi immettere
l'ID del rotore porta campioni LightCycler® (senza modificare le altre impostazioni).
4. Immettere il controllo negativo (FVL DIL, fiala 4, tappo incolore) nella riga 1 della tabella relativa all'ordine dei campioni (posizione A1)
digitando "Controllo Negativo". Specificare 50 µl per il volume del campione e 0 µl per il volume di diluizione (preimpostato). Il volume di
eluizione è preimpostato su 100 µl.
5. Partendo dalla riga 1 (posizione B1), digitare i nomi dei campioni oppure utilizzare il lettore di codici a barre MagNA Pure LC
(facoltativo). Specificare 50 µl per il volume del campione e 0 µl per il volume di diluizione (preimpostato). Il volume di eluizione è
preimpostato su 100 µl.
6. Salvare e stampare le informazioni del file con l'ordine dei campioni.
7. Utilizzare la funzione Print Sample Names per stampare un elenco dei nomi dei campioni con le rispettive posizioni all'interno della
cartuccia per campioni (facoltativo).
8. Stampare tre copie delle etichette Cartridge Barcode (facoltativo).
9. Apporre le etichette alla cartuccia per campioni (per l'eluizione) e alle stampe (facoltativo).
10. Fare clic su Stage Setup.
Preparazione della soluzione di lavoro Proteinasi K
(sufficiente per 32 campioni)
1. Aggiungere 3 ml di tampone di eluizione (flacone 6, tappo giallo) in una fiala di Proteinasi K liofilizzata (fiala 4, tappo rosa). Non appena
la Proteinasi K sarà completamente sciolta, aggiungere altri 2 ml di tampone di eluizione per ottenere un volume finale di 5 ml.
2. Chiudere la fiala e miscelare con cura.
Nota: se non viene utilizzata in giornata, la soluzione ricostituita deve essere conservata a una temperatura compresa tra +2°C e +8°C
nella fiala 4 (massimo 4 settimane).
Tutti gli altri reagenti sono pronti per l'uso.
Caricamento dei reagenti e dei dispositivi in plastica monouso
Nota: • Non utilizzare la tanica di reagente MagNA Pure LC da 30: con questa procedura è possibile utilizzare solo la tanica media MagNA Pure
LC da 20 (nr. di catalogo 03 004 058 001) oppure la tanica grande MagNA Pure LC (nr. di catalogo 03 004 040 001) nelle posizioni loro
assegnate dallo strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
• Prima di riempire le taniche di reagente con la sospensione di particelle di vetro magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP), verificare
che lo stato della Heat Unit e delle Cool Units 1 & 2 sia PASS.
1. Riempire manualmente le taniche di reagente (all'esterno dello strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0) con i volumi indicati
nella schermata Start Information (strumento MagNA Pure LC) o nella scheda secondaria Stage Setup (strumento MagNA Pure
LC 2.0) (accanto al grafico Stage Layout), quindi richiuderle con gli appositi tappi e coperchi. Collocare le taniche piene di reagente
nel rack del serbatoio per reagenti, rispettando le posizioni loro assegnate nella schermata Start Information (strumento MagNA
Pure LC) o nella scheda secondaria Stage Setup (strumento MagNA Pure LC 2.0) (ad eccezione della sospensione MGP, vedere il
passaggio 4).
2. Collocare gli altri dispositivi in plastica monouso nelle posizioni indicate e caricare il rack del serbatoio per reagenti sul piatto porta
campioni/porta reagenti seguendo le indicazioni visualizzate nella schermata Start Information (strumento MagNA Pure LC) o nella
scheda secondaria Stage Setup (strumento MagNA Pure LC 2.0).
3. Trasferire manualmente 50 µl di campioni di sangue periferico intero umano risospeso con gli anticoagulanti EDTA o citrato
direttamente nella cartuccia per campioni (all'esterno dello strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0) seguendo l'ordine dei
campioni indicato nell'elenco.
4. Un attimo prima di avviare la seduta, agitare accuratamente in vortex la fiala di vetro MGP, riempire una tanica di reagente con la
sospensione MGP, richiuderla con l'apposito tappo e collocarla sul piatto porta campioni/porta reagenti dello strumento, nella
posizione indicata nella schermata Start Information (strumento MagNA Pure LC) o nella scheda secondaria Stage Setup (strumento
MagNA Pure LC 2.0).
5. Collocare la cartuccia per campioni nello strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
4
Seduta di purificazione
1. Confermare tutte le posizioni caricate sullo strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 facendo clic su ognuna di esse con il
pulsante del mouse nella schermata Start Information (strumento MagNA Pure LC) o nella scheda secondaria Stage Setup
(strumento MagNA Pure LC 2.0). Quando tutte le posizioni saranno state confermate, comparirà il pulsante OK (strumento MagNA
Pure LC) o il pulsante Start (strumento MagNA Pure LC 2.0).
2. Rimuovere i tappi dei coperchi, quindi chiudere la barra della serratura e lo sportello dello strumento MagNA Pure LC/MagNA Pure
LC 2.0.
3. Fare clic sul pulsante OK (strumento MagNA Pure LC) o sul pulsante Start (strumento MagNA Pure LC 2.0) per avviare la seduta. Verrà
visualizzata la schermata Batch Status (strumento MagNA Pure LC) o la schermata Run Status (strumento MagNA Pure LC 2.0),
mentre una linea viola si sposterà da sinistra a destra per indicare l'andamento della procedura di isolamento.
4. Per lo strumento MagNA Pure LC: al termine della seduta verrà visualizzata la schermata Result.
Per lo strumento MagNA Pure LC 2.0: verranno visualizzati i risultati della seduta di purificazione nella scheda secondaria Batch
Results.
5. Salvare e stampare la schermata Result o la scheda secondaria Batch Results (facoltativo).
6. Facoltativamente, è possibile selezionare la funzione Open Post-Elution nel menu Action (strumento MagNA Pure LC) o nella scheda
secondaria Post-Elution Edit (strumento MagNA Pure LC 2.0). oppure procedere con il passaggio B del Capitolo 2 ("Preparazione
manuale dei campioni") del presente foglio illustrativo.
7. Se la procedura di estrazione MagNA Pure non può essere portata a termine per un campione (segnalato nella schermata Result o
nella scheda secondaria Batch Results), occorrerà ripetere l'estrazione del campione in questione.
Se non viene eseguita la funzione di post-eluizione, procedere con il passaggio B del Capitolo 2 ("Preparazione manuale dei campioni") del
presente foglio illustrativo e utilizzare i campioni estratti o ri-estratti inizialmente.
B.
POST-ELUIZIONE (facoltativa)
Procedura di post-eluizione (facoltativa)
1. Assicurarsi che il blocco di raffreddamento MagNA Pure LC per rotore porta campioni LC sia in posizione e sia stato preraffreddato
(cioè lasciato in frigorifero a una temperatura compresa tra +2°C e +8°C per almeno 2 ore).
2. Caricare il protocollo di post-eluizione intitolato Thrombophilia 15 or 30 samples dal CD contenente i protocolli di post-eluizione per
trombofilia (nr. di catalogo 04 378 784 001) (facoltativo).
3. Preparazione del Master Mix (solo per la procedura di post-eluizione)
• Preparare solo la quantità necessaria immediatamente prima dell'uso.
• Scongelare i componenti del kit Factor V Leiden, miscelare con cura e conservare in ghiaccio.
• Collocare nel rotore porta campioni LightCycler® un capillare LightCycler® per ogni campione di DNA e uno per ogni controllo (in tutto
17 capillari per 15 campioni oppure 32 capillari per 30 campioni).
• Preparare il Master Mix:
Passaggio
Operazione
1
In una provetta Sarstedt con tappo avvitabile da 1,5 ml, su ghiaccio, aggiungere i seguenti componenti nell'ordine indicato
(esempi per 15 o 30 campioni):
Reagenti - soluzioni di lavoro
Volume* / 15 campioni
Volume* / 30 campioni
FVL DIL, fiala 4
209 µl
396 µl
FVL MD Mix, fiala 1
38 µl
72 µl
FVL R Mix, fiala 2
38 µl
72 µl
Volume totale
285 µl
540 µl
* i volumi indicati comprendono controlli e margini di pipettamento
2
• Miscelare con delicatezza.
• Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nella punta della provetta.
3
Collocare la provetta contenente il Master Mix sul blocco di raffreddamento MagNA Pure LC, nella posizione 1. Rimuovere il tappo del
coperchio.
4. Collocare il rotore porta campioni LightCycler®, con i capillari indicati dal protocollo di post-eluizione, sul blocco di raffreddamento e
caricare sul piatto dello strumento MagNA Pure LC il numero necessario di puntali per pipette indicato nella schermata.
5. Aprire il reagente FVL CT (fiala 3, tappo viola), pipettarne 25 µl in una nuova provetta Sarstedt con tappo avvitabile da 1,5 ml, quindi
collocare quest'ultima sul blocco di raffreddamento MagNA Pure LC nella posizione 16, come indicato dal protocollo di post-eluizione.
Nota:
• Centrifugare la fiala contenente il reagente FVL CT in modo da spingerne il contenuto in basso prima di aprirla.
• Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nella punta della provetta.
• Sostituire i guanti dopo avere manipolato il controllo.
6. Chiudere lo strumento e fare clic su Start (strumento MagNA Pure LC) o su Run (strumento MagNA Pure LC 2.0) e quindi su OK per
avviare il pipettamento automatico. Al termine della post-eluizione verrà visualizzata la schermata Post-Elution Result (strumento
MagNA Pure LC) o si aprirà la scheda secondaria Post-Elution results nella scheda Workplace (strumento MagNA Pure LC 2.0).
7. Stampare tre copie del codice a barre del blocco di raffreddamento (facoltativo).
8. Salvare e stampare la tabella dei risultati di Post-Elution utilizzando i comandi Save e Print (strumento MagNA Pure LC) oppure
utilizzare il pulsante di stampa globale nella scheda secondaria Post-Elution Results (strumento MagNA Pure LC 2.0), infine apporre alla
stampa un'etichetta con il codice a barre del blocco di raffreddamento (facoltativo).
9. Etichettare un dischetto vuoto con il nome della seduta di purificazione o con un codice a barre del blocco di raffreddamento. Generare
sul dischetto un file SAM (Sample Pattern File, file del modello del campione) LightCycler®.
10. Sigillare ogni capillare con un tappo utilizzando l'apposito arnese LC (nr. di catalogo 03 357 317 001).
11. Apporre al rotore porta campioni LightCycler® un'etichetta con il codice a barre del blocco di raffreddamento (facoltativo).
12. Collocare il rotore porta campioni LightCycler® nel cestello per rotore della Centrifuga per rotore porta campioni LC.
13. Trasferire il cestello con il rotore porta campioni LightCycler® nella Centrifuga per rotore porta campioni LC.
Nota: se non è disponibile una Centrifuga per rotore porta campioni LC, utilizzare una centrifuga da tavolo (ad esempio la Biofuge® 13 di
Heraeus Instruments o Kendro Laboratory Products) con gli adattatori LightCycler® e far funzionare ad una velocità massima di 735 × g
per 30 secondi.
5
14. Premere Start per avviare la seduta della Centrifuga per rotore porta campioni LC.
15. Al termine della centrifugazione, trasferire il rotore porta campioni LightCycler® nello strumento LightCycler® 2.0.
Nota: conservare il DNA eluito a una temperatura compresa tra +2°C e +8°C per un massimo di sette giorni o a una temperatura compresa
tra -15°C e -25°C per periodi più lunghi (3 settimane circa). Se il protocollo di post-eluizione con lo strumento MagNA Pure LC/MagNA
Pure LC 2.0 non viene eseguito, procedere con il passaggio B del Capitolo 2 per la preparazione del Master Mix per PCR.
16. Se non si devono eseguire altre sedute MagNA Pure, spegnere il computer MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 e lo strumento MagNA
Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
C.
AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE
Strumento LightCycler® 2.0
Nota: prima di avviare la macro, eseguire la connessione ad un database Exor DB con tracciato di controllo. Se si è connessi ad un
database Exor DB con tracciato di controllo, compare la parola "Traceable" nella barra di stato del software. Per ulteriori informazioni
sull'accesso al software, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler® 2.0, versione software 4.05 o 4.1 per uso diagnostico
in vitro.
1. Se in precedenza (passaggio B.11) è stata apposta l'etichetta del codice a barre, rimuoverla dal rotore porta campioni LightCycler®
(facoltativo).
2. Collocare il rotore porta campioni nello strumento LightCycler® 2.0.
3. Assicurarsi che sia installata la macro Factor V Leiden Kit Macro (nr. di cat. 04 586 913 001). È sufficiente installare questa macro una
volta, in occasione della prima esecuzione del test.
4. Per avviare la macro, premere il pulsante Roche e immettere il numero di catalogo del kit manualmente o con il lettore di codici a barre.
Per conoscere il codice a barre esatto, vedere il retro di questo foglio illustrativo.
Nota: è possibile che la casella "Perform self test" non sia attiva.
5. Con la procedura guidata del kit verranno visualizzate istruzioni dettagliate per completare l'intera operazione.
6. Immettere i nomi dei campioni nella schermata Capillary View manualmente oppure, se in precedenza è stato creato un file SAM,
scegliendo "Import SAM". Immettere il numero di lotto del kit nel campo corrispondente della schermata Capillary View.
7. Fare clic sul pulsante "Start Run" nella procedura guidata del kit.
8. Al termine della seduta, lo strumento LightCycler® 2.0 determina automaticamente il genotipo e visualizza le informazioni corrispondenti
eseguendo un'analisi della curva di melting.
Nota: il segnale di fluorescenza è misurato nel canale a 640 nm.
➁
A.
Procedura manuale per la preparazione di un campione con High Pure PCR Template Preparation Kit (nr. di catalogo 11 796 828 001)
PURIFICAZIONE
Operazioni preliminari
Iniziare a preraffreddare gli adattatori per centrifuga LightCycler® in frigorifero a una temperatura compresa tra +2°C e +8°C per almeno 2 ore.
Preparazione delle soluzioni di lavoro
Reagente
Proteinasi K
(fiala 3, tappo rosa)
Tampone di rimozione
(fiala 4a, tappo nero)
Tampone di lavaggio
(fiala 4, tappo blu)
Ricostituzione e preparazione della soluzione di lavoro
Dissolvere la proteinasi K in 4,5 ml di acqua bidistillata,
aliquotare la soluzione.
Aggiungere 20 ml di etanolo nel tampone di rimozione degli
inibitori.
Nota: contrassegnare e datare il contenitore dopo l'aggiunta
dell'etanolo.
Aggiungere 80 ml di etanolo nel tampone di lavaggio.
Nota: contrassegnare e datare il contenitore dopo l'aggiunta
dell'etanolo.
Conservazione e stabilità della soluzione di lavoro
Conservare tra -15°C e -25°C. Stabile per 12 mesi.
Conservare tra +15°C e +25°C. Stabile fino alla data di
scadenza stampata sull'etichetta del kit.
Conservare tra +15°C e +25°C. Stabile fino alla data di
scadenza stampata sull'etichetta del kit.
Procedura di purificazione
Nota: attenersi scrupolosamente alla procedura descritta di seguito e non alla procedura contenuta nel foglio illustrativo del prodotto High Pure
PCR Template Preparation Kit.
1. Con il tampone di eluizione preparare un'aliquota di 200 µl per ogni campione, utilizzando provette di reazione sterili da 1,5 ml.
Chiudere le provette e preriscaldarle a +70°C.
2. In 200 µl di sangue periferico intero umano risospeso con gli anticoagulanti EDTA o citrato aggiungere:
• 200 µl di tampone legante (tappo verde)
• 40 µl di proteinasi K (ricostituita)
• Miscelare immediatamente in vortex e incubare a +70°C per 10 minuti.
3. Aggiungere 100 µl di isopropanolo e miscelare accuratamente in vortex.
4. Pipettare la miscela campione nel serbatoio superiore di una unità filtro High Pure-provetta di raccolta.
5. Centrifugare per 1 minuto a 6000 × g in una centrifuga standard da tavolo.
6. Gettare il materiale residuo e la provetta di raccolta.
7. Abbinare la provetta filtro a una nuova provetta di raccolta.
8. Aggiungere 500 µl di tampone di rimozione degli inibitori (tappo nero) nel serbatoio superiore.
9. Centrifugare per 1 minuto a 6000 × g.
10. Gettare il materiale residuo e la provetta di raccolta.
11. Abbinare la provetta filtro a una nuova provetta di raccolta.
12. Aggiungere 500 µl di tampone di lavaggio (tappo blu) nel serbatoio superiore.
13. Centrifugare per 1 minuto a 6000 × g.
14. Gettare il materiale residuo e la provetta di raccolta.
15. Abbinare la provetta filtro a una nuova provetta di raccolta.
16. Aggiungere 500 µl di tampone di lavaggio (tappo blu) nel serbatoio superiore.
17. Centrifugare per 1 minuto a 6000 × g.
6
18. Gettare il materiale residuo.
19. Abbinare la provetta filtro alla stessa provetta di raccolta.
20. Centrifugare per 10 secondi alla velocità massima (13.000 × g o più) per rimuovere il tampone di lavaggio residuo.
21. Gettare la provetta di raccolta.
22. Inserire la provetta filtro in una provetta di reazione pulita da 1,5 ml.
23. Aggiungere nella provetta filtro 200 µl di tampone di eluizione preriscaldato (+70°C).
24. Centrifugare per 1 minuto a 6000 × g.
La provetta microfuge contiene il DNA eluito.
B.
PREPARAZIONE DEL MASTER MIX
1. Scongelare i componenti del kit Factor V Leiden, miscelare con cura e conservare in ghiaccio.
2. Negli adattatori per centrifuga LightCycler® preraffreddati, collocare un capillare LightCycler® per ogni campione di DNA e uno per ogni
controllo.
3. Preparare il Master Mix moltiplicando la cifra riportata nella colonna "Volume/reazione" per il numero di reazioni da eseguire (ovvero
campioni di DNA, controllo negativo e controllo positivo), più una reazione extra.
Per ottenere una reazione standard da 20 µl procedere nel modo descritto di seguito.
Passaggio
Operazione
1
In una provetta da reazione da 1,5 ml, su ghiaccio, aggiungere i seguenti componenti nell'ordine indicato:
Reagenti – soluzioni di lavoro
FVL DIL, fiala 4
FVL MD Mix, fiala 1
FVL R Mix, fiala 2
Volume totale
2
3
4
5
6
7
8
9
Volume/reazione
11 µl
2 µl
2 µl
15 µl
• Miscelare con delicatezza.
• Pipettare 15 µl di Master Mix in ciascun capillare LightCycler® preraffreddato.
• Verificare l'elenco dei campioni (Capitolo 1, A7, stampa) confrontando i codici a barre della cartuccia per campioni corrispondente
(facoltativo).
• Aggiungere 5 µl di campione di DNA isolato o 5 µl di FVL CT (fiala 3, tappo viola) come controllo positivo oppure aggiungere 5 µl di
FVL DIL (fiala 4, tappo incolore) come controllo negativo.
Sigillare ogni capillare con un tappo utilizzando l'apposito arnese LC (nr. di catalogo 03 357 317 001).
Se si utilizza la Centrifuga per rotore porta campioni LC, procedere con il passaggio 5.
Se si utilizza una centrifuga da tavolo equivalente, (ad esempio la Biofuge 13 di Heraeus Instruments o Kendro Laboratory Products),
collocare ciascun capillare nel corrispondente adattatore per centrifuga LightCycler® preraffreddato, quindi eseguire i seguenti
passaggi:
• Collocare gli adattatori nella centrifuga da tavolo.
• Centrifugare alla velocità massima di 735 × g per 30 secondi.
• Procedere con il passaggio 5.
Collocare il capillare contenente il controllo negativo nella posizione 1 e il capillare contenente il controllo positivo nella posizione 2
del rotore porta campioni LightCycler®.
Partendo dalla posizione 3, collocare i capillari contenenti i campioni di DNA nel rotore porta campioni LightCycler®.
Trasferire il cestello con il rotore porta campioni LightCycler® LC nella Centrifuga per rotore porta campioni 2.0 oppure nella
Centrifuga porta campioni LC equipaggiata con il Set rotori LC 2.0.
Premere Start per avviare la seduta della Centrifuga per rotore porta campioni LC.
Al termine della centrifugazione, trasferire il rotore porta campioni LightCycler® nello strumento LightCycler® 2.0.
7
C.
AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE
Strumento LightCycler® 2.0
Nota: prima di avviare la macro, eseguire la connessione ad un database Exor DB con tracciato di controllo. Se si è connessi ad un
database Exor DB con tracciato di controllo, compare la parola "Traceable" nella barra di stato del software. Per ulteriori informazioni
sull'accesso al software, consultare il Manuale Operativo dello strumento LightCycler® 2.0, versione software 4.05 o 4.1 per uso diagnostico
in vitro.
1. Collocare il rotore porta campioni nello strumento LightCycler® 2.0.
2. Assicurarsi che sia installata la macro Factor V Leiden Kit Macro (nr. di cat. 04 586 913 001). È sufficiente installare questa macro una
volta, in occasione della prima esecuzione del test.
3. Per avviare la macro, premere il pulsante Roche e immettere il numero di catalogo del kit manualmente o con il lettore di codici a barre.
Per conoscere il codice a barre esatto, vedere il retro di questo foglio illustrativo.
Nota: è possibile che la casella "Perform self test" non sia attiva.
4. Con la procedura guidata del kit verranno visualizzate istruzioni dettagliate per completare l'intera operazione.
5. Immettere i numeri dei campioni nella sezione Sample Count e i relativi nomi nella schermata Capillary View, facendo riferimento allo
schema di caricamento dei campioni. Immettere il numero di lotto del kit nel campo corrispondente della schermata Capillary View.
6. Fare clic sul pulsante "Start Run" nella procedura guidata del kit.
7. Al termine della seduta, lo strumento LightCycler® 2.0 determina automaticamente il genotipo e visualizza le informazioni corrispondenti
eseguendo un'analisi della curva di melting.
Nota: il segnale di fluorescenza è misurato nel canale a 640 nm.
CALIBRAZIONE DELLO STRUMENTO
Non è prevista nessuna calibrazione.
CONTROLLO DI QUALITÀ
In ogni seduta PCR è necessario includere i controlli negativi e positivi.
Controllo negativo:
Il risultato del dosaggio del controllo negativo Factor V Leiden deve essere sempre "negative". In caso contrario viene annullata la validità dell'intera
seduta e la procedura deve essere ripetuta dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione). Se il controllo negativo produce
costantemente un risultato non negativo, rivolgersi al rappresentante Roche locale per ricevere assistenza tecnica.
Controllo positivo:
l risultato del dosaggio del controllo Factor V Leiden CT deve essere sempre del genotipo eterozigote ("het").
In caso contrario, la seduta non sarà valida e si dovrà ripetere la PCR.
Se il controllo positivo non produce mai un risultato del genotipo eterozigote, rivolgersi al rappresentante Roche locale per ricevere assistenza tecnica.
Risultato dei campioni:
Il dosaggio dei campioni di DNA deve produrre sempre un risultato caratterizzato da un profilo della curva di melting con genotipo omozigote wild
type, omozigote mutante oppure eterozigote. In caso contrario viene annullata la validità dei risultati dei campioni e la procedura deve essere ripetuta
dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione).
LIMITI E INTERFERENZE
Il reagente FVL MD Mix (fiala 1, tappo giallo) è specifico della sequenza del gene del fattore V umano. Concentrazioni elevate di eparina potrebbero
interferire con la reazione a catena della polimerasi. Non sono note altre possibili interferenze.
8
VALORI PREVISTI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
1. Assicurarsi che i risultati dei controlli eseguiti nella seduta siano validi. In caso contrario è necessario ripetere la procedura dall'inizio
(preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione).
2. Quando la seduta è valida, i risultati vengono visualizzati dal modulo di analisi del genotipo presente nel software LightCycler® nel
seguente modo:
Risultato visualizzato
Interpretazione
wt
Genotipo omozigote wild type: il campione è negativo alla mutazione Factor V Leiden (ovvero non è presente nessun allele
mutante)
het
Genotipo eterozigote: nel campione sono presenti entrambi gli alleli, uno wild-type e uno mutante (Factor V Leiden)
mut
Genotipo omozigote mutante: il campione è positivo alla mutazione Factor V Leiden (in altre parole, sono presenti due alleli
mutanti)
unknown
• Non è stato possibile classificare il genotipo in base agli standard di melting predefiniti.
• Ripetere la procedura di analisi dall'inizio (preparazione dei campioni, amplificazione e rivelazione).
Se il risultato è ancora sconosciuto ("unknown"), rivolgersi al rappresentante Roche locale per ricevere assistenza
tecnica.
negative
il campione è conforme ai criteri software impostati per i controlli negativi
Analisi della
sequenza
–(d/dT) Fluorescenza (640)
DATI SPECIFICI SULLE PRESTAZIONI
Specificità analitica
0,9
Grazie all'impiego di oligonucleotidi sintetici come primer e di sonde H, è
0,8
stato possibile dimostrare che la genotipizzazione con il software LightCycler® 4.05 o 4.1
0,7
eterozigote
identifica in modo inequivocabile la mutazione Factor V Leiden, pur non consentendo
wild type (omozigote)
mutante (omozigote)
0,6
tuttavia la differenziazione delle mutazioni rare A1692C, G1689A e A1696G. La
FVL DIL
®
0,5
genotipizzazione con il software LightCycler 4.05 o 4.1 consente quindi di classificare
0,4
queste mutazioni come risultati falsi positivi del fattore V Leiden.
0,3
Applicando l'analisi della sequenza è stato possibile dimostrare che gli oligonucleotidi
0,2
sintetici selezionati che sono stati utilizzati come primer amplificano in modo specifico
0,1
un frammento di 222 bp relativo al gene del fattore V contenente la sequenza Factor V
Leiden.
0
Sensibilità analitica
50
60
45
55
65
70
Il DNA umano eterozigote purificato per la mutazione Factor V Leiden è stato sottoposto
Temperatura [°C]
a diluizione seriale in quattro passaggi. Ogni diluizione è stata analizzata in sei replicati
ed è stata oggetto di un'attenta interpretazione statistica. Il livello di sensibilità minimo
per il kit Factor V Leiden è stato fissato a 202 copie per reazione.
Sensibilità e specificità diagnostica
In uno studio prospettico riguardante campioni di DNA umano sia freschi che conservati, sono stati analizzati 530 casi di pazienti caucasici con
sospetta trombofilia utilizzando il kit Factor V Leiden e l'analisi della sequenza a filamento singolo o doppio con lo strumento MegaBACE 500
Sequencing System, dotato di software Cimarron Base Caller SW 3.12. In entrambi i gruppi, i campioni erano rappresentativi di una raccolta di dati su
pazienti con sospetta trombofilia, provenienti da un laboratorio di un ospedale universitario e accumulati in un arco di tempo definito. Il livello di
concordanza tra il kit Factor V Leiden e l'analisi della sequenza è stato del 99,4% (527 casi su 530). I dettagli sono illustrati nella tabella riportata di
seguito.
Tabella 1: confronto fra il kit Factor V Leiden e l'analisi della sequenza
Kit Factor V Leiden
wild type (wt)
eterozigote (het)
mutante (mut) sconosciuto
wt
440
–
–
2
het
1
82
–
–
mut
–
–
5
–
Nota: il 41,0% dei campioni di DNA umano proveniva da pazienti con sospetti eventi tromboembolici venosi, secondo una o entrambe le dichiarazioni
di consenso (2,4) dell'American College of Medical Genetics (ACMG) o del College of American Pathologists (CAP); il 37,0% proveniva da pazienti con
disturbi trombotici arteriosi (ad esempio ictus); il 18,0% da pazienti con sospetta trombofilia, identificati per altri motivi; infine il 4,0% è stato incluso per
ragioni non specificate. Il kit Factor V Leiden non ha prodotto il genotipo relativo a due di questi campioni.
AVVISO PER L'ACQUIRENTE
Acquistando il presente prodotto si acquisisce il diritto all'uso dello stesso per le finalità di amplificazione e rivelazione delle sequenze di acido
nucleico a scopo diagnostico in vitro su campioni di origine umana. Non si acquisisce tuttavia nessun'altra licenza di nessun tipo, ad eccezione
del suddetto diritto specifico all'uso, derivante dall'acquisto.
9
BIBLIOGRAFIA
1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening.
JAMA, 277, 1305-1307.
2 Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in
Medicine, 3, Vol.2,139-148.
3 Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN 1-56238-368-X). NCCLS
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa 19087-1898, USA (1999).
4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders.
CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia.
©2012 Roche Molecular Systems, Inc.
La tecnologia utilizzata per lo strumento LightCycler® è concessa in licenza da Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA.
ROCHE, LIGHTCYCLER, HYBPROBE, MAGNA PURE, LC e HIGH PURE sono marchi di Roche.
Biofuge è un marchio di Heraeus Instruments GmbH.
Brij è un marchio registrato di ICI Americas, Inc., PA, USA.
MegaBACE è un marchio registrato di GE Healthcare Bio-Sciences Corp.
Cimarron è un marchio di Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, USA.
I coloranti cianino di questo prodotto sono coperti da brevetto intestato a GE Healthcare Bio-Sciences Corp. e Carnegie Mellon University e sono
concessi in licenza a Roche esclusivamente per l'uso nei componenti dei kit di ricerca e diagnostica in vitro. Qualsiasi impiego di tali kit per scopi
diversi dalla ricerca e dalla diagnostica in vitro dovrà essere approvato tramite il rilascio di licenze secondarie da parte di GE Healthcare
Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA e Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA.
Prodotto in Germania
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Str. 116
68305 Mannheim
Germania
Per gli Stati Uniti:
Distribuzione negli Stati Uniti: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
Assistenza tecnica ai clienti negli Stati Uniti: 1-800-526-1247
09/2012
Doc Rev. 7.0
04536045001-07
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