Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense

“Biologia e genetica di popolazioni in ambito
forense, dalla traccia biologica alle ultime
metodiche per lo studio dei polimorfismi STR's”
STR's”
Dott. Giorgio Portera
Dip. di Biotecnologie Mediche e
Medicina Traslazionale
Università degli Studi di Milano
www.biologiaforense.it
Laboratorio di Biologia Forense
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Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capelli…
sperma,capelli….)
Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)
Quantificazione (rt(rt-pcr)
Amplificazione (multiplex)
Tipizzazione (310(310-3130XL)
PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA
DINAMICA DELITTUOSA
Tipologia di reperti
Vestiti con evidenti
tracce ematiche
Vestiti con minime
tracce ematiche
Ricerca di tracce ematiche da reperti
ripuliti dopo il crimine
Indumenti usati per
travisare il viso,investigati
per la ricerca di saliva e
residui epiteliali
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Ricostruzioni parentali da
resti cadaverici o ossei
TEST GENERICI E DI SPECIE
Utili nell’
nell’identificazione del tipo di fluido biologico
TEST GENERICI
• combur test sangue (test colorimetrico)
• amilasi saliva (test colorimetrico)
• psa sperma (immunocromatografico)
TEST DI SPECIE
• obti test: specifico per sangue di primate (immunocromatografico)
• semelogenina: specifico per sperma umano (proteina secreta in
vescicole seminali, immunocromatografico)
COMBUR TEST - Combur3 Test
Test®
®E (ROCHE)
Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine,
saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine
e eritrociti
sostanza: tetrametilbenzidina
il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza
di attività
attività perossidasica dell’
dell’emoglobina
FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,
ruggine, ossidanti vari, ecc.
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COMBUR TEST - Combur3
Combur3 Test®
Test®E (ROCHE)
AMILASI TEST
test per diagnosi clinica della pancreatite acuta
• sostanza:
22-clorocloro-4-nitrofenolo
legato
a
maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce
con l’
l’α--amilasi della saliva,in presenza di saliva si
colora di giallo
• FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei
AMILASI TEST
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PSA TEST
• test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, dell’
dell’iperplasia
prostatica benigna (bph) e delle infezioni alla prostata; saggio
dell’’antigene
immunologico semiquantitativo per la determinazione dell
specifico prostatico nel sangue, siero e plasma
•sostanza:
sostanza: anticorpi anti antigene psa coniugati a oro colloidale
utilizzato per identificare tracce di sperma
•falsi
anticoncezionali
li
falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticonceziona
TEST SPECIFICI
OBTI TEST:
TEST anticorpi anti hb umani coniugati a particelle
cromogene (blu)
utilizzato per la diagnosi specie - specifico per il sangue dei primati
superiori.
TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (α(
semelogenina ,proteina
proteina secreta in vescicole seminali)
LAMPADA CRIMESCOPE
lampada con luce monocromatica a lunghezza
d’onda variabile (415(415-650 nm)
Principio: differente assorbimento/emissione tra
fluidi biologici e substrati
SLIP con tracce di
sperma
FODERA di una giacca
con tracce di sudore
Esempio di un reperto con numerose aree
luminescenti
22R
22 O
22Q
22N
22P
22I
22L
22M
Luminol
reazione di chemioluminescenza: l’
l’energia
proviene dall’
dall’ossidazione dell’
dell’emoglobina
Reazione
Le reazioni di chemioluminescenza del luminolo che
avvengono in una soluzione basica generano un
intermedio energeticamente ricco con conseguente
emissione di luce da parte dell’
dell’acido 33-aminoftalico .
Per ottenere chemioluminescenza dal luminolo in una
soluzione acquosa serve un reagente ossidante come il
perossido di idrogeno
La CATALISI avviene con la presenza di ioni
metallici del tipo: Fe (III) o Cu (II), …o da enzimi
come la perossidasi
Ferro emoglobina
08 Agosto 1997
Omicidio di Sergio CAFASSO
19
Impronte di piedi rilevate con il luminol
Comparazione di un’ impronta di piede insanguinato
con quella di uno dei due indagati
Internal part of car
Car trunk
Spare tire
NEGATIVE
Internal part of car trunk
NEGATIVE
Metal area of car trunk with luminol
C.S. reconstruction
( car trunk cover was changed
by coachworker!!!)
ESTRAZIONE DEL DNA
• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA – DNA affine alla
resina, rimane legato nella membrana della colonna,
successivamente viene eluito
• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE – stessa
chimica del precedente metodo, ma la resina è libera in soluzione.
Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito
• RESINE
SINTETICHE
AFFINI
AL
DNA
PER
CARICA
ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del pH della
della
soluzione
ESTRAZIONE CON
RESINA MAGNETICA
resina +
• metodo di estrazione del DNA che
ne sfrutta la carica negativa
• metodica veloce e modulabile a
seconda del tipo di traccia
(possibilità
possibilità di aumentare il numero
dei lavaggi, estrazione da diversi
volumi)
volumi)
DNA -
• estrazione automatizzabile
DNA -
resina -
QUANTIFICAZIONE
• fase fondamentale per la traccia forense (spesso priva di storia)
COSA SI È ESTRATTO e QUANTO DNA USARE per amplificare;
• anche test per la DIAGNOSI DI SPECIE, viene amplificata una sonda
specifica umana, come alfa-satellite del chr. 17 per metodo QUANTIBLOT o
h-tert transcrittasi inversa per QUANTIFILER Human in real-time. DNA
batterico non determina errori di valutazione perché non viene rilevato
QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME
• valutazione di una eventuale inibizione attraverso l’amplificazione
contemporanea di 2 DNA: templato (FAM) dell’estratto e IPC (internal pcr
control, VIC);
• possibilità di quantificare usando una sonda genomica umana (h-TERT,
human telomerase reverse transcriptase su chr. 5) ed una sonda umana
maschile (SRY, sex reversal, utile per violenze sessuali)
I campioni vengono quantificati
con STANDARD con DNA noto e
privo di inibizione
importanza dell’IPC nella lettura
della quantificazione dei campioni
per valutare la qualità del DNA
estratto (eventuale
PURIFICAZIONE)
INIBIZIONE: non è
possibile valutare la
presenza o assenza di
DNA. PURIFICAZIONE
Real -Time
IPC dei campioni e standard,
curva molto simile
IPC inibito
AMPLIFICAZIONE
caratteristiche di un marcatore forense
• Amplificare e tipizzare l’
l’intero genoma sarebbe improponibile
per costi e tempo
• Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori
con le seguenti caratteristiche:
1. POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso
marcatore
deve
presentare
diverse varianti nella
popolazione)
2. STABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primers)
3. EQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg
4. INDIPENDENTI
Microsatelliti STR (Short Tandem Repeat)
STRUTTURA DI UN STR
...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT..
•GATA è la sequenza del core-repeat
•Il microsatellite in questione è un tetranucleotidico
•Le varianti (alleli
alleli)
alleli hanno un numero diverso di repeat
8 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
9 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
10 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base
al numero di repeat
NOME DEL MARCATORE
POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL
NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT
SCELTA DEGLI STR
Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13
specifici marcatori STR, denominati Loci Codis
TPOX
D3S1358
D8S1179
D5S818
FGA
CSF1PO
TH01
VWA
D7S820
AMEL
D13S317
D16S539
D18S51
D21S11
AMEL
Studi di popolazione 13 Loci Codis
MULTIPLEX
• I 13 loci Codis vengono amplificati in un’unica reazione di PCR,
spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere
discriminante
• gli attuali kit di amplificazione caratterizzano
contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex)
• le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di
estratto inferiori ai 50 pg/µl
• DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/µl
20 cellule x reazione!!!
TIPIZZAZIONE
I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite
elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico
(310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che
discriminano i frammenti overlappanti
RAW DATA – DATO GREZZO
PROFILO GENETICO ELABORATO
DIMOSTRAZIONE D’IDENTITA’’
•un profilo secondo gli standard FBI (codis) e’ formato da 13 marcatori
•poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e’ pari a 0,1
nella popolazione di riferimento
•poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i
cromosomi (omozigosi)
•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e’ pari a
0,1*0,1=0,01
•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e’
0,01*0,01*…0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su miliardi di miliardi di
individui……..
IL PROFILO PUO’ ESSERE RITENUTO UNICO
indiziato
tampone vaginale
vittima
sperma
vestaglia
indiziato
tampone vaginale
vittima
vestaglia
indiziato
tampone vaginale
vittima
vestaglia
indiziato
tampone vaginale
vittima
vestaglia
INTERPRETAZIONE DI UN PROFILO MISTO CON CONTRIBUTO DI
TRE SOGGETTI
VITTIMA
PRIMO INDIVIDUO
SECONDO INDIVIDUO
Test di Paternità
Paternità
L.R.= 99,9999%
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Test di paternità= storie di vita!
- richieste test paternità da padri, che a seguito di
tradimento scoperto o crisi famigliare mettono in dubbio
propria paternità
- richieste test paternità da madri con dubbio partner
- richieste test paternità da figli.
Compatibilità parziale tra profilo tracce
e proprietario appartamento
Compatibilità parziale tra profilo tracce
e proprietario appartamento
Compatibilità parziale tra profilo tracce
e proprietario appartamento
LABORATORIO DI DATTILOSCOPIA FORENSE
IDENTITA’ CON 18 PUNTI
CONFRONTO IN B/N
BPA : Bloodstain Pattern Analysis
STUDIO DELLE TRACCE EMATICHE
-morfologia
-quantità
-posizione
ricostruzione della
scena del crimine
-direzione
-distribuzione
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Studio delle quantita’ e delle direzioni d’impatto
ANALISI DI LABORATORIO DEI DATI RACCOLTI
Punto di convergenza
Punto d’origine
Dott. Giorgio Portera
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