Presentazione di PowerPoint

Biofisica: la
complessità della
vita e la
semplicità della
fisica
Velia Minicozzi
Dal genoma:
… ACU UUC CGU AAC…
Alla sequenza proteica:
… THR PHE ARG ASN…
DNA
amino
acidi
amino
acidi
ASN
ARG
PHE
THR
Studio di biosistemi
con metodologie…
stato
unfolded
folding
intermedio
...s
pe
ri
me
n ta
li
Anello di
sincrotrone
Risonanza Magnetica
Nucleare
stato
nativo
Struttura e funzione della proteina
Risonanza
Paramagnetica
Elettronica
Spettroscopia
LASER
Dal genoma:
… ACU UUC CGU AAC…
Alla sequenza proteica:
… THR PHE ARG ASN…
DNA
amino
acidi
...n
um
amino
acidi
ASN
ARG
PHE
THR
Studio di biosistemi
con metodologie…
stato
unfolded
folding
intermedio
stato
nativo
Struttura e funzione della proteina
eri
c
o/t
eo
r ic
he
Dal genoma:
… ACU UUC CGU AAC…
Alla sequenza proteica:
… THR PHE ARG ASN…
DNA
amino
acidi
amino
acidi
ASN
ARG
PHE
THR
stato
unfolded
Applicazione di
tecniche biofisiche a
problemi…
…di fisica
medica
folding
intermedio
stato
nativo
Struttura e funzione della proteina
TERA – Fondazione per Adroterapia Oncologica
La Fondazione TERA ha come scopo lo sviluppo,
in Italia e all'estero, delle tecniche di
radioterapia
basate sull'uso
di
particelle
adroniche e, più in generale, delle applicazioni
della fisica e dell'informatica alla medicina e alla
biologia.
Corso di Laurea in Fisica
Laurea Triennale (180 cfu)
Laurea Magistrale (120 cfu)
Laurea Magistrale in Fisica
indirizzo
Fisica dei Biosistemi
tre sotto-indirizzi
Teorico-Numerico, Sperimentale, Medico
Per informazioni riguardanti i curricula in Fisica dei Sistemi
Biologici e le modalità di accesso alla Laurea Magistrale provenendo
da altri curricola di Scienze, potete telefonare o spedire una email
alla Prof.ssa Silvia Morante: Tel. 06 72594554, email:
[email protected]
Problema
medico
Problema
biologico
“Strumento”
fisico
“Strumento”
matematico
Modello di funzionamento
Conoscenza
Azione
terapeutica
Proteine
• Proteina = polimero lineare composto di aminoacidi legati tramite
un legame peptidico
1. Sequenza aminoacidica
2. struttura locale della catena
aminoacidica
3. Struttura 3D della molecola
4. Distribuzione spaziale di subunità
differenti non legate da legami
covalenti
Folding & Misfolding
•Il folding delle proteine dipende
dalla loro struttura primaria ma
anche da altre caratteristiche
(pH, membranes, metal ions)
• Errori nel folding delle
proteine sono alla base di
malattie
dette
Protein
Conformational
Disorders
(PCD)
• In molte PCD le proteine
misfolded sono ricche in
struttura β e formano aggregati
β-sheet ⊥ fibril
axis
PCDs
Clinical Syndrome
Fibril Subunit
Alzheimer’s Disease
Aβ -peptide
Spongiform encephalopathies
Prion protein
α -synuclein
Parkinson’s disease
Sono state osservate circa
20 PCD
•Molte di loro colpiscono
il
Sistema
Nervoso
Centrale
Type II diabetes
Amylin
Thyroid carcinoma
Procalcitonin
Atrial amyloidosis
Atrial natriuretic factor
Amyotrophic lateral sclerosis
Superoxide dismutase
Huntington disease
Glutamine
Primary systemic amyloidosis
Ig light chains
Secondary systemic amyloidosis
Serum amyloid A
Senile systemic amyloidosis
Transthyretin (wild tipe)
Familial amyloidotic polyneuropathy I
Transthyretin (mutant)
Familial amyloidotic polyneuropathy II
Apolipoprotein A1
Familial Mediterranean fever
Serum amyloid A
β2-microglobulin
Hemodialysis-related amyloidosis
Finnish hereditary systemic amyloidosis
Gelsolin (mutant)
Lysozyme systemic amyloidosis
Lisozime
Insulin-related amyloidosis
Insulin
Malattie da Prioni:
Encefalopatia spongiforme trasmissibile (TSE)
(TSE
Un gruppo di malattie trasmesse (?) da una proteina (il
prione)
BSE (mucca pazza)
Scrapie
Prove
istologiche
(post
Malattia di Creutzfeldt-Jacob (CJD)
mortem)
nel
cervello:
vacuoli
circondati
da depositi di placche
Alzheimer
Malattia neurologica progressiva
debilitante che porta a perdita
irreversibile di memoria ed altre
capacità, fino alla completa
dipendenza da assistenza. Tempo
di sviluppo: circa 8 anni dopo la
diagnosi.
Diagnosi per mezzo di test
neuropsicologici
Prove
istologiche
(post
mortem)
nel
cervello: depositi di
placche amiloidi (in
vivo con PET)
em
ort
raf
og
icr
om
fot
• Malattia di Alzheimer
• Encefalopatie spongiforme Trasmissibile (TSEs):
a
un
di
ia
a
gic
olo
i st
• Sclerosi amiotrofica laterale
e
on
• Malattia di Parkinson; Demenza con corpi Lewy
zi
se
nell’uomo: malattia di Creutzfeldt-Jakob
sporadica
familiare
iatrogenica
variante
nella pecora: Scrapie
nei bovini: Encefalopatia Bovina Spongiforme
l
de
to
l
de
iagnosi in vivo con Tomografia da emissione di positroni (PET)
su
tes
• Malattia di Huntington
ce
Cosa hanno in comune?
Formazione di fibrille amiloidi che costituiscono il centro
del deposito
100 nm
Le fibrille si formano per aggregazione di peptidi o
proteine che vivono spesso un’esistenza da Dr. Jekyll - Mr.
Hyde (PrP, APP, α-sinucleina) nel processo folding misfolding.
Un ruolo importante, come “pozione magica” o
come “antidoto”, è forse giocato da metalli come
proteine diverse che formano fibrille
non hanno omologie né strutturali né chimiche
ma
tutte le fibrille da amiloidi presentano notevoli somiglianze
proprietà istologiche
morfologia
Scale bar: 100 nm
fibrille che legano congo-dye
strutture cross-beta
β-foglietti: ⊥ asse
della fibrilla
Human body: ~7 x 1027 atoms
99% : C, H, O and N;
87%: are either H or O;
but 41 different elements
Estimated Atomic Composition of a lean 70-kg Male Human Body
Element
Hydrogen
Oxygen
Carbon
Nitrogen
Calcium
Phosphorus
Sulfur
Sodium
Potassium
Chlorine
Magnesium
Silicium
Fluorine
Iron
Zinc
Sym
H 1
O
8
C
6
N
7
Ca 20
P
15
S
16
Na 11
K
19
Cl 17
Mg 12
Si
14
F
9
Fe 26
Zn 30
# Atoms
Element
4.22 x 1027
1.61 x 1027
8.03 x 1026
3.9 x 1025
1.6 x 1025
9.6 x 1024
2.6 x 1024
2.5 x 1024
2.2 x 1024
1.6 x 1024
4.7 x 1023
3.9 x 1023
8.3 x 1022
4.5 x 1022
2.1 x 1022
Rubidium
Strontium
Bromine
Aluminum
Copper
Lead
Cadmium
Boron
Manganese
Nickel
Lithium
Barium
Iodine
Tin
Gold
Sym
# Atoms
Element
Rb 37 2.2 x 1021
Sr 38 2.2 x 1021
Br 35 2 x 1021
Al 13 1 x 1021
Cu 29 7 x 1020
Pb 82 3 x 1020
Cd 48 3 x 1020
B
5 2 x 1020
Mn 25 1 x 1020
Ni 28 1 x 1020
Li 3 1 x 1020
Ba 56 8 x 1019
I
53 5 x 1019
Sn 50 4 x 1019
Au 79 2 x 1019
Sym
Zirconium
Cobalt
Cesium
Mercury
Arsenic
Chromium
Molybdenum
Selenium
Beryllium
Vanadium
Uranium
Radium
# Atoms
Zr 40 2 x 1019
Co 27 2 x 1019
Cs 55 7 x 1018
Hg 80 6 x 1018
As 33 6 x 1018
Cr 24 6 x 1018
Mo 42 3 x 1018
Se 34 3 x 1018
Be 4 3 x 1018
V 23 8 x 1017
U
92 2 x 1017
Ra 88 8 x 1010
TOTAL
1
1
2
3
6.71x1027
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14 15 16 17 18
H
He
1
2
2
Li
3
4
5
6
7
8
9
10
3
Na
Mg
Al
Si
P
S
Cl
Ar
Be
B
C
N
O
F
Ne
11
12
4
K
Ca
Sc
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
5
Rb
Sr
Y
Zr
Nb
Mo
Tc
Ru
Rh
Pd
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
6
Cs
Ba
*
Hf
Ta
W
Re
Os
Ir
Pt
72
73
74
75
76
77
78
**
Rf
Db
Sg
Bh
Hs
Mt
Uun
104
105
106
107
108
109
110
111
112
*
La
Ce
Pr
Nd
Pm Sm
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
**
Ac
Th
Pa
U
Np
Pu
Am
Cm
Bk
Cf
Es
Fm
Md
No
Lr
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
7
55
56
Fr
Ra
87
88
Ti
V
Cr
Mn
Fe
Co
Ni
Eu
13
14
15
16
17
18
Zn
Ga
Ge
As
Se
Br
Kr
29
30
31
32
33
34
35
36
Ag
Cd
In
Sn
Sb
Te
I
Xe
47
48
49
50
51
52
53
54
Au
Hg
Tl
Pb
Bi
Po
At
Rn
79
80
81
82
83
84
85
86
Uuu
Uub
Dy
Ho
Er
Tm
Yb
Lu
Cu
Gd
Tb
Element Groups (Families)
Alkali Earth Alkaline Earth Transition Metals
Rare Earth Other Metals
Metalloids
Non-Metals Halogens
Noble Gases
Dove vanno i metalli
Fe: livello medio accumulato nel corpo: 3÷4 gr
Zn: livello medio accumulato nel corpo: 1.5 ÷2.5 gr
Cu: livello medio accumulato nel corpo : 50÷120 mg
(la maggior parte nel fegato)
I reni
0.5% del totale del peso ricevono il 25% del flusso di sang
⇓
Concentrano le sostanze di scarto inclusi i metalli
Fegato
Funzione primaria: rimuovere gli agenti tossici
⇓
è carico di enzimi che distruggono composti
chimici estranei
⇓
è il primo organo ad essere esposto a metalli
tossici
Polmoni
I metalli entrano per inalazione
⇓
Tutto il sangue passa per i polmoni molte volte al giorn
⇓
Le sostanze tossiche hanno molte opportunità di
entrare nel flusso sanguigno
Sistema Nervoso Centrale
Molti metalli tossici possono attraversare
la barriera emato-encefalica
⇓
Le cellule nervose non possono rigenerarsi
una volta danneggiate
Gli ioni metallici possono danneggiare le cellule cerebrali
 direttamente
 disturbando l’equilibrio elettrochimico
 promuovendo il mis-folding
Come può essere d’aiuto la
Fisica nella soluzione di tali
problemi?
Fisica Sperimentale
Spettroscopia
spectrum (apparenza, immagine) + σκοπεω (osservo)
Radiazione ElettroMagnetica (EM)
(luce visibile, radiazione UltraVioletta e Infrarossa, MicroOnde,
RadioFrequenza, raggi X, ...)
Composizione, struttura e proprietà della
materia
⇔
materia
⇓
scambio di energia
EM
 assorbimento ⇒ atomi e molecole “eccitati” ⇒
l’energia EM è trasferita al moto (rotazionale,
vibrazionale, elettronico, …) di atomi e molecole
 atomi e molecole “eccitate” tornano nello stato
fondamentale
⇒
emissione energia EM
TIPI di SPETTROSCOPIA
Tipo di
Processo
I raggi X
8 Novembre 1895 - Scoperta dei
raggi X
1901 - Premio Nobel per la Fisica
“in riconoscimento dello straordinario
servizio reso per la scoperta delle
importanti radiazioni che in seguito
presero il suo nome”
Conrad Wilhelm Röntgen 1845
-1923
Fisico
La prima radiografia medica eseguita da
Röntgen il 22 dicembre 1895 alla mano
sinistra della moglie Anna Berthe. È visibile
anche l'anello (Hand mit Ringen)
Sorgenti di luce
Le sorgenti di luce (www.lightsources.org) sono
sorgenti di radiazione eccezionalmente intensa,
fortemente focalizzata di raggi X e radiazione
ultravioletta,
e
infrarossa,
basate
sugli
acceleratori di particelle che rendono possibile
sia la ricerca di base in campi quali la fisica e la
biologia sia la ricerca applicata.
Guardare l’invisibile
(Credit: Argonne National Laboratory)
Il successo dei tentativi di rendere visibile l’invisibile dipende,
tra le altre cose, da come la luce di determinata lunghezza
d’onda e di sufficiente intensità possa essere concentrata su un
campione.
E’ come guidare di notte  è necessaria un’illuminazione
intensa davanti all’auto
Luce di Sincrotrone
Nelle sorgenti di luce si sfrutta il fatto che
quando
particelle
cariche
vengono
accelerate, emettono luce (irradiano).
Se gli elettroni vengono accelerati avanti e
indietro in un antenna a frequenze di kHz o
MHz, essi irradiano nella parte dello spettro
elettromagnetico delle onde radio o TV.
Se gli elettroni sono costretti a muoversi su
percorsi circolari e vengono accelerati verso
l’interno della curva, essi irradiano e noi
chiamiamo quella radiazione: luce, o
radiazione, di sincrotrone.
La luce deve anche essere collimata con specchi parabolici, che
accrescono ciò che si chiama brillanza. Questo è precisamente ciò
che fa una sorgente di luce di sincrotrone: produce un alto flusso
e lo concentra in un raggio molto sottile, come richiesto dalla
maggior parte delle applicazioni di raggiX.
ELETTRA
DAFNE
ESRF - Grenoble
Una sorgente di luce di sincrotrone comprende (1)
pistola di elettroni, (2) un acceleratore lineare, (3) un
sincrotrone supplementare, (4) un anello, (5) le linee e
(6) le stazioni sperimentali. (Courtesy: Australian
Synchrotron, Illustrator: Michael Payne)
Cos’è il Free Electron Laser?
Il FEL è un nuovo tipo di sorgente di luce con brillanza che può
arrivare ad essere fino ad un miliardo di volte maggiore di
quella della luce di sincrotrone.
Cristallografia
Ricostruzione 3D del cervello di un topo transgenico,
studio dell’Alzheimer, Krucker et al. (SCRIPPS, UZh,
ETHZ, PSI). (Courtesy: Swiss Light Source/PSI)
Emoglobina
L'emoglobina è stata soggetto di innumerevoli lavori.
Il primo che riuscì a cristallizzarla ed a determinarne la
struttura con la cristallografia a raggi X fu Max Perutz
nel 1959.
Spettroscopia di Assorbimento
dei raggi X (XAS)
La radiazione di sincrotrone esce tangenzialmente
dall’anello e raggiunge le postazioni di misura
Nelle postazioni di misura:
• la radiazione è inviata da elementi ottici al monocromatore
• il monocromatore seleziona la lunghezza d’onda opportuna
• la radiazione è inviata sul campione
Spettro XAS da un atomo isolato (gas mono-atomico rarefatto)
funzione d’onda elettronica
E0
Il coefficiente di assorbimento, µ , decresce monotonamente con l’energia del fotone incidente, hν .
Quando hν = E0 = energia di foto-ionizzazione di un elettrone interno dell’atomo assorbitore
(energia di soglia*), µ cresce rapidamente. Quindi decresce monotonamente dopo soglia.
*soglia K: ionizzazione degli elettroni più interni.
Spettro XAS di una molecola diatomica
interferenza
In un sistema multi-atomico µ non decresce monotonamente dopo la soglia, ma ha
un andamento oscillante.
•L’assorbitore (punto rosso) emette un’onda sferica uscente (l’elettrone ionizzato, foto-elettrone).
•Il diffusore (punto verde) agisce come un centro di diffusione, e l’onda retro-diffusa
interferisce (in fase o fuori-fase) con quella uscente.
Spettroscopia di Assorbimento
dei raggi X (XAS)
µ(E)
E
Spettro XAS
Spettro
di unXAS
atomo
di una
isolato
molecola
(e.g. gas
biatomica
monoatomico)
Alzheimer, metalli e luce di
sincrotrone
APP
Grovigli
Neurofibrilla
ri
Neurone
αsecretase
P3
Placche
Amiloidi
17
40-
42
γ-secretase
APP
β-secretase
Aβ
1
40-42
Peptide Abeta
Peptide Aβ – Esperimenti XAS
- Peptidi Aβ sintetici comprati da AnaSpec
- Vari frammenti di peptidi Aβ sospesi nel buffer NEMO, pH=7
Aβ1-16
H3N+-DAEFRHDSGYEVHHQK-COO-
Aβ1-28
H3N+-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-COO-
Aβ5-23
H3N+-RHDSGYEVHHQKLVFFAED-COOH3N+
Aβ17-40
H3N+-LVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COO-
N -DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-COO
- Cu2+Aβe1-40
Zn2+Hda
CuSO4 e ZnCl2
3
+
- 2 campioni di controllo: Cu-buffer, Zn-buffer
-
EXAFS Analysis
Cu2+/Zn2+-Aβ17-40
Cu2+-(Aβ1-16, Aβ1-28)
Cu2+-Aβ5-23
Zn2+-(Aβ1-16, Aβ1-28, Aβ5-23)
Cu-Aβ
Cu-Aβ
Cu-Aβ
1−16
Cu-Aβ
1−28
Cu-Aβ
1−40
=
=
≠
=
Cu2+/ Zn2+ in solution
Cu2+-Aβ1-40
Cu2+-Aβ1-40
Zn2+-Aβ1-40
Zn-A β
17−40
Zn-A β
5−23
4
4
0
0
-4
-4
-8
-8
4
6
8
10
k(Å) -1
4
Zn-A β
1−16
Zn-A β
1−28
6
Zn-A β
1−40
17−40
5−23
8
10
k(Å) -1
(Cu-Aβ)1-16
Coordinated Residue
σ 2DW ± ∆σ 2DW (Å2)
r ± ∆ r (Å)
N
(Cu-Aβ)1-16
His
3
1.95 ± 0.01
0.002 ± 0.001
Tyr
1
2.06 ± 0.01
0.002 ± 0.001
O
1
1.95 ± 0.01
∆ Ef = -10.6 ± 0.7 eV; R= 28 %
Data
Fit
Cu-Aβ1-16
0.002 ± 0.001
|FT|
Data
Fit
4
0
-4
-8
4
6
8
10 k(Å-1)
0
1
2
3
4
r(Å) 5
(Cu-Aβ)5-23
Coordinated Residue
σ 2DW ± ∆σ 2DW (Å2)
r ± ∆ r (Å)
N
(Cu-Aβ)5-23
His
2
1.99 ± 0.01
0.003 ± 0.001
Tyr
1
2.06 ± 0.01
0.003 ± 0.001
N-terminus
1
1.99 ± 0.01
0.003 ± 0.001
O
1
2.27 ± 0.01
Data |FT|
∆ Ef = -13.8
Fit ± 0.4 eV; R= 40 %
0.003± 0.001
Data
Fit
4
0
-4
-8
4
6
8
10 k(Å-1)
0
1
2
3
4
r(Å) 5
(Zn-Aβ)1-16
Coordinated Residue
σ 2DW ± ∆σ 2DW (Å2)
r ± ∆ r (Å)
N
(Zn-Aβ)1-16
His
2
1.96 ± 0.01
0.003 ± 0.001
His
2
2.00 ± 0.01
0.003 ± 0.001
1
2.00 ± 0.01
∆ Ef = -6.5 ± 0.2 eV; R= 23 %
0.003± 0.001
O
Zn-Aβ
Data
Fit
1-16
|FT|
Data
Fit
4
0
-4
-8
4
6
8
10 k(Å-1)
0
1
2
3
4
r(Å) 5
Risultati
• Cu e Zn mostrano differenti siti di legame
• Il sito di legame per I metalli è in entrambi i casi entro i primi
16 residui aminoacidici
• Cu mostra una coordinazione intra-peptide
• Zn mostra una coordinazione inter-peptide
Quali altre tecniche fisicomatematiche possono essere
d’aiuto nella soluzione di tali
problemi?
Fisica Teorica e Computazionale
Biofisica Computazionale
Meccanica Classica
Meccanica Quantistica
F = ma
Supercomputer
JUGENE - Hardware Characteristics
72 racks (9x8) - 73728 nodes (294912 cores)
Overall peak performance: 1 Petaflops
Main memory: 144 TB
Compute Card/Processor:
Power PC 450, 32-bit, 850 MHz, 4-way SMP
Peak performance: 13.6 GFlops
Networks:
Three-dimensonal torus (compute nodes),
bandwidth per link: 425 MB/s (total: 5.1 GB/s), hardware
latency: 100ns - 800ns
Processori
Cell è il nome di una tipologia di processori sviluppati da IBM in
cooperazione con Sony e Toshiba.
La famiglia di processori Cell è sviluppata per permetterne un
utilizzo quasi universale.
Si tratta di CPU progettate per utilizzare la computazione
parallela e Sony li utilizza anche per la console PlayStation 3.
Modello per dinamica
molecolare
Filmino
Filmino
Simulazione del processo di legame di un inibitore ad
un enzima
Legame del repressore Lac al DNA
tp://biophys.roma2.infn.it/BiophysicsGroup.htm
tp://biophys.roma2.infn.it/BiophysicsGroup.ht
GRAZIE!
Francesc
o
Stellato
Stefania
Alessandr Alleva
o
Maiorana
Giancarlo
Rossi
Velia
Minicozz
i
Silvia
Morante