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GENEdia
Dispositivi per la rivelazione di OGM
OGM. Gli OGM contengono di solito tre elementi essen-
ziali: un trasgene, il nuovo gene introdotto per dare alla
pianta le caratteristiche desiderate, un promotore che
controlla quando il trasgene viene espresso nella pianta
e un terminatore che garantisce la corretta terminazione del trasgene evitando così che quest’ultimo crei
proteine chimeriche.
Benché molti potenziali promotori e terminatori sono
stati individuati, la maggior parte delle piante trasgeniche contengono sia il promotore Ca MV 35 (dal 35S
RNA del Caulimovirus) ed il terminatore NOS ( derivato
dal gene della Nopalina Sintetasi dell’ Agrobacterium Tumefacene).
Mais. Le rese produttive delle coltivazioni intensive di
mais sono compromesse da: presenza delle erbe infestanti e le infestazioni di insetti. Al fine di rendere la
pianta resistente all’azione di erbicidi si è operato nel
trasferire le caratteristiche genetiche che rendono le
piante di mais insensibili all’azione di questi erbicidi. La
tolleranza al glifosate è stata ottenuta, introducendo
nel genoma del mais, il tratto genico codificante per
l’enzima CP4-EPSPS proveniente dal ceppo CP4 di
Agrobacterium tumefaciens . Nella coltivazione di mais
OGM è oggi possibile utilizzare gli erbicidi totali a
basso impatto ambientale come il glifosate e il glufosinate d’ ammonio. Per contrastare le infestazioni del
lepidottero piralide (Ostrinia nubilaris) sono state
prodotte varietà di mais trasgenico resistenti alla piralide, inserendo geni codificanti la proteina Cry 1Ab,
tossica per l’insetto, contenuti in un batterio del suolo,
Bacillus thuringiensis.
Soia. La soia Round-Up Ready®, commercializzata
dalla Monsanto, contiene un trasgene, di tipo batterico,
che conferisce alla pianta la tolleranza al glifosato. Il
glicofosfato è un erbicida a largo spettro, che ha un’alta
biodegradabilità ed è in grado di controllare molte
infestanti del periodo di post-emergenza della soia. La
linea di soia GTS 40-3-2 (nome commerciale della soia
Roundup Ready®) è l’unica varietà di soia geneticamente modificata attualmente autorizzata ad essere commercializzata in Europa. Questa linea permette
l’impiego del principio attivo erbicida glifosate, normalmente letale per le varietà di soia tradizionale, anche
durante la fase vegetativa di crescita. Con un unico
intervento, è pertanto possibile controllare efficacemente tutte le specie infestanti presenti in campo.
Riso. Le rese produttive delle coltivazioni intensive di
riso sono compromesse da infestazioni di insetti.
Per contrastare le infestazioni sono state prodotte varietà
di riso trasgenico resistenti agli insetti, inserendo geni
codificanti la proteina Cry 1Ac, tossica per l’insetto,
contenuti in un batterio del suolo, Bacillus thuringiensis .
Recenti studi relativi alla tossina evidenziano che si tratti
di un potenziale allergene per gli esseri umani, in quanto
è dimostrato che questa proteina Cry1Ac1 ha indotto
reazioni di tipo allergico nei topi “Moreno-Fierros, L., García,
N., Gutiérrez, R., López-Revilla, R. & Vázquez-Padrón, R.I.
Intranasal, rectal and intraperitoneal immunization with
protoxin Cry1Ac from Bacillus thuringiensis induces compartmentalized serum, intestinal, vaginal and pulmonary immune
responses in Balb/c mice. Microbes and Infectection 2:885-890.”
Legislazione. L’Unione europea, al fine di garantire la sicurezza
dei prodotti alimentari e il diritto all’informazione dei consumatori, ha deliberato un regolamento atto al controllo della
commercializzazione e dell’utilizzo dei prodotti geneticamente
modificati all’interno dei Paesi membri. La prima direttiva
comunitaria approvata in materia di OGM (Direttiva 90/220
del 1990) e recepita a livello locale dai singoli Stati Membri
regola l’immissione nell’ambiente di organismi geneticamente
modificati, i successivi regolamenti disciplinano la materia.
La Direttiva 90/220 e stata abrogata con l’introduzione della
nuova Direttiva 2001/18/CE.
Le recenti decisioni della comunità Europea “Decision 2006/754/EC emergency measures regarding the non-authorised
genetically modified organism LLRICE62 in rice products;
Decision 2008/289/EC on emergency measures regarding the
unauthorised genetically modified organism ‘Bt 63’ in rice
products” predispone controlli analitici per i prodotti contenenti riso potenzialmente contaminato da trasgeni.
RIVELAZIONE OGM
MAIS. Il dispositivo GD 801 Real QUAL MAIS è stato studiato per
consentire la rilevazione di quantità potenzialmente piccole di
OGM(< 1%) presenti random in miscele di farine e alimenti, secondo
quanto descritto dalla U.E., mediante l’individuazione simultanea
del promotore 35 S e del gene specifico per il Mais (Zeina)
RISO Il dispositivo GD 803 Real QUAL Riso è stato studiato per
consentire la rilevazione di quantità potenzialmente piccole di
OGM(< 1%) presenti random in miscele di farine ed alimenti, secondo quanto descritto dalla U.E., mediante l’individuazione simultanea
del promotore 35S e del gene specifico per il Riso (Phospholipase
D gene).
Il dispositivo GD 805 Real QUAL Riso 35S-BAR è stato studiato
per consentire la rilevazione di quantità potenzialmente piccole di
OGM(< 1%) presenti random in miscele di farine ed alimenti, secondo quanto descritto dalla U.E., mediante l’individuazione simultanea
del promotore 35S-BAR e del gene specifico per il Riso
(Phospholipase D gene)
AMPLIFICAZIONE La reazione d’amplificazione, mediante Real
Time PCR, viene allestita in due pozzetti separati, predisponendo
due specifiche master mix relative alla ricerca del promotore 35S o
del terminatore e del gene di riferimento.
Il tampone d’amplificazione contiene i quattro deoxynucleosidi trifosfati, dei quali la deoxitimidina è sostituita con il deoxyuracile
consentendo utilizzo della Uracil DNA glicosilasi per il controllo
del carry over. La reazione d’amplificazione genica avviene ad opera
di una DNA polimerasi termostabile, contenuta nel dispositivo GD
214, a lento rilascio che garantisce un’elevata emivita ed omogenea
efficienza per l’intero processo analitico.
RIVELAZIONE. La tecnica della Real Time PCR permette la rivelazione del templato durante la sua formazione ad ogni ciclo di temperatura del protocollo programmato. Ciò avviene in quanto un intercalante fluorescente del dsDNA (Sybr Green I) è un componente della
mix di reazione.
Eccitando la mix di reazione a 490 nm, l’intercalante emette un
segnale fluorescente a 530 nm che una CCD camera inizia ad acquisire dopo la fase d’estensione ad una determinata temperatura, in
funzione del protocollo d’amplificazione.
Al termine del protocollo termico (40 cicli) il software di acquisizione del sistema di Real Time PCR, calcola un valore di Threshold
Cycle (TC) per ogni templato.
MELT CURVE. All’ultimo step del programma del termociclatore
viene eseguita la curva di dissociazione applicando un gradiente di
temperatura da 60°C a 95°C in 13 minuti e registrando la fluorescenza dei campioni in analisi. Il software visualizza la curva di fluorescenza e la sua derivata prima.
Ai fini della validazione dei risultati si rende necessario verificare la
presenza dei picchi di dissociazione relativi al promotore e al gene di
riferimento, in tabella sono elencate le temperature di dissociazione.
Melt temperature
Promotore 35S
82,0°C ±1.0 °C
Promotore 35S BAR
SOIA. Il dispositivo GD 802 Real QUAL SOIA è stato studiato per
consentire la rilevazione di quantità potenzialmente piccole di
OGM(< 1%) presenti random in miscele di farine/alimenti, secondo
quanto descritto dalla U.E., mediante l’individuazione simultanea
del promotore 35S e del gene specifico per la Soia (Lecitina)
Il GD 804 AMPLISET NOS è un test per la rivelazione di quantità
potenzialmente piccole del terminatore NOS, derivato dal gene
della Nopalina Sintetasi dell’ Agrobacterium Tumefacene, presente
in alcuni trasgeni.
DNA fragment
NOS
73,0°C ±1.0 °C
Zeina
80,5°C ±1.0 °C
Lecitina
80,0°C ±1.0 °C
Phospholipase D gene
80,0°C ±1.0 °C
FIG.1 Plot d’amplificazione e melt curve di campioni contenenti Mais OGM.
Linea Blu gene di riferimento Zeina,
Linea Rossa promotore 35S, Linea Verde controllo negativo
FIG.2 Plot d’amplificazione e melt curve di campioni contenenti Soia OGM.
Linea Blu gene di riferimento Lecitina,
Linea Rossa promotore 35S, Linea Verde controllo negativo
FIG.3 Plot d’amplificazione e melt curve di campioni contenenti Riso OGM.
Linea Blu gene di riferimento Phospholipase D gene
Linea Rossa promotore 35S, Linea Verde controllo negativo
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DISPOSITIVI PER LA RIVELAZIONE
DI OGM
GD 801 REAL QUAL MAIS
CONSERVARE A -20°C
Contenuto del dispositivo
Codice colore
1) Real T. Buffer (80 reazioni)
AZZURRO
2) Primer 35 S FWD (40 reazioni)
NERO
3) Primer 35 S REV (40 reazioni)
BIANCO
4) Primer Zein FWD (40 reazioni)
ROSSO
5) Primer Zein REV (40 reazioni)
VERDE
6) Uracil DNA glycosylase Heat Labile (43 Unità)
MARRONE
7) Magnesio Cloruro 25 mM
GIALLO
GD 802 REAL QUAL SOIA
CONSERVARE A -20°C
Contenuto del dispositivo
Codice colore
1) Real T. Buffer (80 reazioni)
AZZURRO
2) Primer 35 S FWD (40 reazioni)
NERO
3) Primer 35 S REV (40 reazioni)
BIANCO
4) Primer le1 FWD (40 reazioni)
VIOLA
5) Primer le1 REV (40 reazioni)
ARANCIONE
6) Uracil DNA glycosylase Heat Labile (43 Unità)
MARRONE
7) Magnesio Cloruro 25 mM
GIALLO
GD 803 REAL QUAL RISO
CONSERVARE A -20°C
Contenuto del dispositivo
Codice colore
1) Real T. Buffer (80 reazioni)
AZZURRO
2) Primer 35 S FWD (40 reazioni)
NERO
3) Primer 35 S REV (40 reazioni)
BIANCO
4) Primer PLD FWD (40 reazioni)
VERDE
5) Primer PLD REV (40 reazioni)
ARANCIONE
6) Uracil DNA glycosylase Heat Labile (43 Unità)
MARRONE
7) Magnesio Cloruro 25 mM
GIALLO
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Dispositivi correlati
GD 804 AMPLISET NOS
CONSERVARE A -20°C
Contenuto del dispositivo
Codice colore
1) Real T. Buffer (80 reazioni)
AZZURRO
2) Primer T NOS FWD (40 reazioni)
VIOLA
3) Primer T NOS REV (40 reazioni)
MARRONE
4) Magnesio Cloruro 25 mM
GIALLO
GD 805 REAL QUAL RICE 35 S BAR
CONSERVARE A -20°C
Contenuto del dispositivo
Codice colore
1) Real T. Buffer (80 reazioni)
AZZURRO
2) Primer 35 S BAR FWD (40 reazioni)
NERO
3) Primer 35 S BAR REV (40 reazioni)
BIANCO
4) Primer PLD FWD (40 reazioni)
VERDE
5) Primer PLD REV (40 reazioni)
ARANCIONE
6) Uracil DNA glycosylase Heat Labile (43 Unità)
MARRONE
7) Magnesio Cloruro 25 mM
GIALLO
Caratteristiche dei reagenti
•
High Purity,DNAsi-RNAsi Free
Materiali richiesti (non inclusi nel dispositivo):
•
GD 214 DNA TAQ PLUS 250 U
•
Dispositivo per purificazione DNA per alimenti
•
Tubi conici da 2 ml con tappo a vite; Portaprovette refrigerato; Puntali
sterili con barriera anti-aerosol; Tubi ottici da 0,2 ml per PCR (DNAsi
RNAsi Free)
•
MICROCENTRIFUGA con rotore ad angolo fisso per tubi da 2 ml (min
14000 x g.)
•
REAL TIME PCR SYSTEM (TERMOCICLATORE programmabile completo di unità ottica con filtro per SYBR GREEN I ; software dedicato ;
PC and stampante a colori).
•
Set di micro pipette pre PCR: 0.5-10 µl - 5-50 µl - 50-200 µl - 200-1000 µl
Strumenti richiesti: (non inclusi nel dispositivo)
QUALITY
ENDORSED
COMPANY
ISO 13485:2003
ISO 9001:2008
GeneDia
SVILLUPPATO E PRODOTTO IN ITALIA DA:
G ENE DIA S. R . L .: VIA LOMBARDA, 169/A – 55013 LAMMARI (LU)
TEL./FAX +39(0)583 962672 – Email [email protected] Web. genedia.it
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INFO REV 1 2010-09 ed. IT