Prodotti da geni clonati nativi e manipolati

Prodotti da geni clonati nativi e
manipolati
Stefano Forte
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•  Fattori che influiscono sull’espressione dei
geni clonati
•  Espressione dei geni clonati nei batteri
•  Espressione in cellule eucariotiche
I batteri vengono spesso utilizzati
come sistemi per l’espressione di
geni clonati.
•  TRASCRIZIONE
•  Il fattore più importante è il promotore
•  I batteri controllano quali regioni esprimere e
quali quantità produrre
•  Le sequenze regolative si sono evolute
insieme alle seuenze codificati dei batteri
•  I segnali di trascrizione eucariotici sono
sostanzialmente diversi
•  Utilizzo di VETTORI DI ESPRESSIONE
•  Utilizzo di cDNA invece che di DNA
•  Per la produzione del prodotto proteico è
determinante la quantità di RNA disponibile
per la traduzione:
–  Velocità di sintesi
–  Stabilità del messaggero
•  Ma nei batteri la stabilità del messaggero è
meno importante che negli eucarioti perché
la vita media dei messaggeri è molto ridotta.
•  Più facile manipolare il transcription rate che
la stabilità
•  La trascrizione può anche essere influenzata
dal contenuto di CG
•  INIZIO DELLA TRADUZIONE
•  INIZIO DELLA TRADUZIONE
•  Il ribosoma si lega in prossimità del codone
di inizio attraverso il riconoscimento della
sequenza shine-dalgarno (complementare a
parte dell’rRNA 16s)
•  Distanza tra shine-dalgarno codone di start
variabile
•  CODON USAGE
•  Il codice genetico prevede l’utilizzo di codoni
sinonimi
•  Non tutti i codoni però funzionano allo stesso
modo
•  Diversa disponibilità dei tRNA
•  L’utilizzo dei codoni precede un uso
preferenziale che si chiama codon bias
•  CODON BIAS
•  Il fenomeno è più accentuato per i geni molto
espressi
–  Pressione evolutiva per la selezione di codoni più
abbondanti (selezione dei codoni e selezione dei
tRNA)
•  Questo fenomeno si riflette nell’efficienza di
espressione di un gene clonato in un
organismo diverso da quello di partenza
•  Se non si riscontra alcun prodotto proteico?
•  Utilizzo alternativo dei codoni
•  In alcune specie batteriche UGA->triptofano
•  In E. coli UGA -> STOP
-> per esprimere questi geni in E. coli bisogna
ingegnerizzare il gene (complesso) o fornire
all’ospite i tRNA specifici.
•  GC content
•  Effetti sulla trascrizione (melting alterato)
•  Effetti sul codon usage:
Il codon usage può essere “pressato” a
selezionare soltanto codoni che rispettino il
GC content previsto
•  Esistono variazioni tra il 30 ed il 70%
•  Caratteristiche del prodotto proteico
•  Stabilità della proteina
•  Localizzazione della proteina
–  Utilizzo di sequenze segnale per la secrezione
–  La proteina viene secreta nel mezzo di coltura
–  Volume del mezzo di coltura superiore alla somma dei
volumi dei citoplasmi (possibilità di produrre più proteina
senza incorrere in concentrazioni eccessive)
–  Anche con la sequenza segnale la proteine potrebbe non
passare attraverso la membrana
•  Modificazioni post traduzionali (glicosilazione, taglio)
–  Questo rappresenta il principale stimolo all’utilizzo di ospiti
non batterici
Necessità di avere un
promotore funzionante
nell’ospite.
Utilizzo di un vettore di
clonazione che presenta
tale promotore:
l’inserimento del gene a
valle del promotore genera
un una unità trascrizionale
per fusione trascrizionale.
•  In E. coli vengono spesso utilizzati promotori derivati
da lac e trp
•  Possono essere creati promotori ingegnerizzati
derivati dai promotori naturali per aumentarne la
forza
Il promotore tac -> lac+trp
•  Il numero di copie del plasmide ha un effetto sulla
concentrazione finale del prodotto:
–  Poiché i plasmidi originali possiedono elementi di controllo del numero di
copie è possibile indurre un aumento del numero di copie rimuovendo
alcuni elementi di controllo
Maggiore efficienza nella produzione del
prodotto proteico
Alta resa della produzione
totale della proteina in termini
di prodotto per litro di coltura
Percentuale minore di proteine
(ed altro materiale)
contaminanti
•  STABILITA’: ESPRESSIONE CONDIZIONALE
•  Troppa proteina -> inibizione della crescita
–  (proteina dannosa o proteina non dannosa)
•  In queste condizione i mutanti non produttivi
vengono selezionati per un vantaggio
selettivo (effetto non voluto)
•  Per evitarlo è possibile la selezione con
antibiotico -> Problemi per lo smaltimento
•  Soluzione: promotori controllabili (lac o trp)
La regolazione dell’espressione genica è di grandissima importanza
anche nei procarioti. Non tutti gli enzimi della cellula devono essere
sintetizzati contemporaneamente e non tutti devono essere
sintetizzati nella stessa quantità.
La regolazione è fortemente influenzata dall’ambiente proprio per
permettere al batterio di rispondere in maniera efficace alle
variazioni nel mezzo in cui il batterio si trova.
L’induzione e la Repressione rappresentano due efficaci
meccanismi di regolazione dell’espressione genica operati dal
batterio. Essi permettono al batterio di sintetizzare gli enzimi
necessari soltanto quando servono.
Gli enzimi che catalizzano la sintesi di un prodotto non vengono
sintetizzati se questo prodotto è già presente nel mezzo.
La repressione dei sistemi enzimatici deputati alla sintesi di un
dato composto è effettuata dal composto stesso che, se presente
nel mezzo, assume il ruolo di repressore.
La repressione è un fenomeno estremamente diffuso, ed è
altamente specifico.
Il vantaggio della repressione è ovvio: l’organismo non spreca la
propria energia per la sintesi degli enzimi non necessari.
L’induzione enzimatica, o semplicemente induzione, rappresenta il
fenomeno attraverso il quale la sintesi di un enzima è attivata
soltanto quando il suo substrato è disponibile.
Un esempio è dato dagli enzimi per la degradazione di sostanze
energetiche. Questi vengono prodotti esclusivamente se le
sostanze da degradare sono presenti nel mezzo, e possono quindi
essere utilizzate.
• La sostanza che inizia l’induzione enzimatica è chiamata
induttore
• La sostanza che reprime la produzione di enzimi è chiamata
corepressore (perché richiede l’intervento di una proteina
addizionale chiamata repressore)
• Queste sostanze, che di solito sono piccole molecole, vengono
collettivamente definite effettori
Come fanno gli effettori ad influenzare i geni bersaglio in maniera
così specifica?
• Legando combinandosi con proteine di regolazione specifiche
Quando un corepressore lega una proteina di regolazione
(repressore) la rende capace di legarsi in una specifica regione di
DNA a valle del promotore detta operatore.
Il legame di questo complesso impedisce alla polimerasi di
proseguire e di sintetizzare l’mRNA dei geni a valle.
I geni bersaglio sono tutti posizionati a valle della regione
operatore, vengono quindi controllati simultaneamente.
Questo tipo di organizzazione viene chiamata operone.
Promotore
Operatore
Gene 1
Gene 2
Trascrizione
RNA polimerasi
repressore
Promotore
RNA polimerasi
Operatore
repressore
corepressore
Gene 1
Gene 2
Trascrizione Bloccata
Promotore
RNA polimerasi
Promotore
Operatore
repressore
Operatore
Gene 1
Trascrizione Bloccata
Gene 1
Trascrizione
RNA polimerasi
repressore
Gene 2
induttore
Gene 2
La repressione e l’induzione sono meccanismi di controllo
negativo dell’espressione in quanto in entrambi i casi è coinvolta
una proteina regolatrice specifica, chiamata repressore, che
impedisce la sintesi dei geni di un operone.
Nel controllo positivo una proteina regolatrice promuove il
legame della RNA polimerasi agendo così in modo da
incrementare la sintesi degli mRNA regolati.
Le proteine regolatrici che intervengono in questo processo sono
chiamate attivatori (o proteine di attivazione)
I siti di legame per gli attivatori possono talvolta essere
localizzate a distanza dai promotori. In questo caso la loro azione
è mediata dal ripiegamento del DNA (secondo un modello simile a
quello incontrato per gli enhancer eucariotici)
Promotore
Operatore
Gene 1
Gene 2
La trascrizione non ha inizio
RNA polimerasi
Promotore
Operatore
RNA polimerasi
attivatore
induttore
attivatore
Gene 1
Trascrizione
Gene 2
L’operone del lattosio, in E. coli ha un doppio tipo di controllo,
basato sia sulla induzione che sulla repressione.
Questo permette al batterio di utilizzare il lattosio solo quando
questo è disponibile e solo quando non sono presenti nel
mezzo delle fonti energetiche più appetibili
Un’altra modalità di controllo nota come attenuazione è
utilizzata in alcuni operoni che controllano la sintesi degli
aminoacidi.
Il caso più conosciuto è quello della via biosintetica
dell’aminoacido triptofano.
L’operone del triptofano possiede diverse modalità di
regolazione, una di queste è appunto l’attenuazione che
prevede la presenza di una particolare sequenza, chiamata
sequenza guida, all’interno della quale è presente una
regione codificante per un polipetide. Questo polipeptide ha
tre codoni per il triptofano consecutivi.
L’attenuazione, nell’operone triptofano, è possibile soltanto
perché nei procarioti trascrizione e traduzione sono
accoppiate: la traduzione inizia prima che la sintesi dell’mRNA
sia terminata. Lo spostamento del ribosoma sull’mRNA in
formazione può influenzare il ripiegamento dell’mRNA stesso
nascondendo delle regioni complementari.
La terminazione prematura della trascrizione è influenzata
proprio dalla formazione di strutture secondarie tipiche
• L’operone del triptofano è sempre
acceso.
•  La polimerasi comincia a produrre
mRNA messaggero.
• Il ribosoma si attacca e comincia a
produrre il polipeptide codificato dalla
sequenza dell’attenuatore
• Se vi è una elevata presenza di
triptofano la velocità del ribosoma è
elevata, il ribosoma raggiunge la
regione 2 e le impedisce di legarsi, per
complementarietà, alla regione 3. In
questo modo la regione 3 si appaia
con la regione 4 formando una
struttura che induce la terminazione
della trascrizione
• Se il triptofano è scarso, quando il
ribosoma arriverà in corrispondenza
dei tre codoni per il triptofano
effettuerà una pausa. La diffusione
degli aminoacil-tRNA per il triptofano è
infatti più lenta e il ribosoma deve
aspettare che questi arrivino.
• La sosta del ribosoma nella zona 1
non impedisce alla zona 2, che questa
volta è libera, di appaiarsi con la
regione 3. Non potendosi più formare
la struttura di terminazione (perché la
regione 3 è impegnata e non
disponibile per l’appaiamento con la
regione 4) la trascrizione continua a
valle producendo un mRNA con i geni
per la biosintesi del triptofano.
•  FUSIONI
TRADUZIONALI
•  Una parte della
proteina deriverà dal
nostro inserto ed
una parte dal vettore
•  ORIENTAMENTO
•  FRAME DI LETTURA
•  CONTROLLARE IL
PRODOTTO
RICOMBINANTE PER
SEQUENZIAMENTO