LINEE di RICERCA - Istituto Gaslini

LINEE di RICERCA
Il laboratorio di Biologia Molecolare opera nel campo della ricerca traslazionale e si prefigge di:
 sviluppare e sperimentare protocolli di terapie innovative e nuove metodiche di diagnostica
avanzata;
 definire la genomica del tessuto patologico a fini diagnostici e prognostici.
Le patologie di primario interesse sono le neoplasie, le lesioni infiammatorie e le malattie genetiche
rare. Il laboratorio collabora sia con strutture dell’Istituto sia con diversi laboratori ed ospedali italiani
e stranieri.
Presentiamo di seguito i principali progetti attualmente in atto:
Genomica Funzionale
Il gruppo di genomica funzionale si dedica all’analisi dei profili di espressione genica,
dell’espressione dei micro-RNA e di SNP e CGH arrays, . La tecnologia del microarray permette di
definire i livelli di espressione genica, di micro-RNA regolatori o le anomalie cromosomiche.
L’area di ricerca riguarda la relazione tra infiammazione e tumorigenesi ed in particolare lo studio dei
diversi aspetti della risposta all'ipossia o ad altri stimoli che si generano durante la progressione di un
particolare tipo di tumore ad insorgenza pediatrica, il neuroblastoma, o nel corso di una patologia
infiammatoria. Si propone inoltre di identificare nuovi biomarcatori e studiarne la regolazione.
L’analisi integrata dei dati derivanti da esprimenti di espressione genica e miRNA rappresenta un punto
fondamentale per la comprensione dei meccanismi di regolazione genica. A tale scopo, è stato
costituito un gruppo di bioinformatici che si dedica allo sviluppo e alla trattazione bioinformatica dei
problemi di genomica, proteomica, gestione di database e sviluppo di applicazioni per l’analisi
integrata dei dati.
Il gruppo di Genomica Funzionale si occupa della caratterizzazione molecolare (espressione genica,
miRNA e CGH) dei campioni che giungono alla Biobanca Integrata Tessuto-genomica (BIT)
dell’Istituto Gaslini. I dati risultanti dalle singole analisi vengono integrati e correlati con i dati clinici
dei pazienti presenti in Biobanca. Il gruppo bioinformatico sviluppa le piattaforme per la condivisione
dei dati. Questo approccio è diretto alla diagnostica molecolare e a nuove strategie di ricerca.
Meccanismi di trasformazione cellulare
L’oncogene Dbl è un fattore di scambio (GEF) per le GTPasi della famiglia Rho le quali regolano
numerose funzioni cellulari normali ed una molteplicità di processi tumorali importanti tra cui la
trasformazione cellulare, la sopravvivenza, l’invasività, la metastatizzazione e l’angiogenesi. Il
nostro gruppo di ricerca è interessato da tempo alla caratterizzazione delle proprietà della proteina
codificata dall’oncogene Dbl. Questa proteina, come molte altre GEF finora identificate e
caratterizzate, in seguito ad alterazioni strutturali è in grado di trasformare cellule normali in coltura in
cellule tumorali. Aree di ricerca importanti di cui ci siamo occupati sono: l’identificazione di proteine
regolatrici del Dbl, lo studio dei meccanismi molecolari specifici che accoppiano la regolazione
dell’attività di scambio di Dbl con gli eventi di trasduzione del segnale all’interno della cellula, in
particolare con i meccanismi che controllano processi biologici dipendenti dalla polarità, dalla
progressione del ciclo cellulare e dall’architettura citoscheletrica. Abbiamo creato un modello di topo
transgenico in cui l’espressione del Dbl nelle cellule epiteliali del cristallino induce transizione
epitelio-mesenchimale (EMT) e angiogenesi. Recentemente abbiamo creato dei modelli animali di topi
knock-in sia per la parte regolatrice che per quella catalitica dell’oncogene Dbl. Le analisi condotte
hanno dimostrato lo sviluppo di linfomi B a grandi cellule in un’alta percentuale dei topi
geneticamente modificati. Attualmente la nostra ricerca è finalizzata al raggiungimento dei seguenti
obiettivi:
 l’identificazione delle alterazioni del profilo di espressione genica sia in fibroblasti murini
trasformati in modo stabile da Dbl sia nei topi transgenici per Dbl che abbiamo generato;
 l’identificazione del ruolo di Dbl nell’induzione della transizione epitelio-mesenchimale e
dell’angiogenesi, utilizzando sia sistemi in vitro che in vivo;
 il ruolo di Dbl nella differenziazione e funzione delle cellule B e la presenza di specifici
riarrangiamenti di Dbl in linfomi B umani come markers di valore diagnostico/prognostico
per questo tipo di linfoma.
Le informazioni che deriveranno da questi studi saranno importanti per l’identificazione di “targets”
molecolari di potenziale utilità per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
Patofisiologia e trattamento della glicogenosi di tipo 1a
La GSD-1a è una malattia congenita causata dalla non funzionalità di una proteina presente nel fegato,
la glucosio−6−fosfatasi (G6Pasi), che è importante per il controllo del metabolismo degli zuccheri. A
seguito di mutazioni di questa proteina il metabolismo del glucosio è molto alterato ed è compromessa
la funzionalità epatica e renale, spesso in modo particolarmente grave. Lo scopo generale del progetto è
quello di studiare un sistema di trasferimento genico per trattare la GSD-1a utilizzando un modello
sperimentale preclinico rappresentato da topi knock-out per la G6Pasi, che manifestano la stessa
patologia dei pazienti affetti da GSD-1a. Stiamo studiando un approccio di terapia genica costituito da
cellule ematopoietiche staminali isolate da midollo osseo di topi adulti in quanto queste cellule hanno
dimostrato di possedere la capacità di ripopolare il fegato fondendosi con gli epatociti malati e dando
origine a epatociti sani funzionanti. Il nostro obiettivo è quello di definire l’efficacia terapeutica di
queste cellule derivate dal midollo osseo, isolate sia da topi normali che da topi malati e poi modificate
geneticamente e trapiantate nei topi affetti da GSD-1a, con l’obiettivo finale di rigenerare l’organo
malato. In parallelo si valuta il contributo del processo infiammatorio nella patogenesi della malattia
valutando la produzione di citochine e il profilo di espressione genica dei tessuti epatici dei pazienti.
Microambiente del tessuto
La presenza di aree di ipossia, cioè una diminuzione della tensione di ossigeno che origina da
un’inappropriata vascolarizzazione e/o un eccessivo consumo di ossigeno, è una caratteristica
comune dei tumori maligni e di numerose altre situazioni patologiche, quali condizioni ischemiche (ad
esempio infarto del miocardio e ischemia cerebrale), infiammazione cronica (ad esempio artrite
reumatoide e aterosclerosi), infezioni batteriche e ferite. L'ipossia crea un microambiente unico capace
di influenzare l’espressione genica, il fenotipo e le risposte funzionali sia delle cellule del tessuto
d’origine che dell’infiltrato infiammatorio e rappresenta quindi un parametro determinante per
l’architettura tissutale, l’evoluzione di un tumore, le reazioni infiammatorie e immunitarie e la
risposta alle terapia. Studi sperimentali e clinici sottolineano il ruolo critico dello stimolo ipossico nella
patogenesi dei tumori solidi e delle patologie infiammatorie croniche.
Il nostro gruppo di ricerca è interessato da tempo alla caratterizzazione della relazione tra ipossia,
infiammazione e tumorigenesi e in particolare allo studio dei diversi aspetti della risposta di
monociti/macrofagi all'ipossia o ad altri stimoli che si generano durante la progressione di un tumore o
nel corso di una patologia infiammatoria, quali l’acido picolinico, un metabolita del triptofano
prodotto in condizioni di degenerazione del tessuto, dei meccanismi molecolari responsabili della loro
attivazione e dell’interazione dei monociti/macrofagi con le cellule tumorali e stromali. Nel suo
complesso, questa ricerca è finalizzata al raggiungimento dei seguenti obiettivi:
 la comprensione di come stimoli ambientali influenzino la biologia delle cellule che
compongono il tessuto patologico e modulino l’attività proinfiammatoria, chemiotattica e
immunoregolatoria delle cellule macrofagiche;
 l’identificazione delle alterazioni nel pattern d'espressione genica dei monociti/macrofagi
potenzialmente responsabili della loro inattivazione funzionale nel microambiente tumorale e
in particolare della modulazione di una serie di chemochine importanti per la regolazione
dell’infiltrato leucocitario nel tessuto patologico;
 lo sviluppo di un nuovo sistema di terapia genica, basato sull’utilizzo di un “vettore
macrofagico” selettivamente responsivo all’ipossia o all’acido picolinico per veicolare il
gene terapeutico all’interno del tessuto malato, che potrebbe avere una potenziale
applicazione nella terapia genica dei tumori e delle lesioni infiammatorie (ad esempio
nell’artrite reumatoide);
 la caratterizzazione biomolecolare dell’interazione tra cellula tumorale e microambiente
nello sviluppo di tumori solidi pediatrici e in particolare l’identificazione di gruppi di geni
coinvolti nella risposta proliferativa o differenziativa del Neuroblastoma all’ipossia,
utilizzabili come potenziali “markers” diagnostici o prognostici di progressione tumorale e per
la valutazione del potenziale terapeutico di nuove molecole farmacologiche nei confronti di
questo tumore.
BIT (Biobanca Integrata Tessuto-genomica) 
Il laboratorio di Biologia molecolare è responsabile della componente genomica della Biobanca
Integrata Tessuto-genomica (BIT) dell’Istituto G. Gaslini che è stata recentemente accreditata a livello
della regione Liguria. La BIT rappresenta una nuova struttura in cui il materiale biologico viene
analizzato e caratterizzato in base a criteri morfologici ed istochimici associati ad informazioni di
espressione genica del tessuto attraverso tecnologie più innovative.
La BIT raccoglie materiale proveniente dalla struttura in cui ha sede, e da altre esterne. L’unità di
Anatomia Patologica è responsabile della collezione, del frazionamento e dello stoccaggio iniziale del
campione e della caratterizzazione istopatologica del tessuto.
Parte del campione biologico viene trasferito presso il laboratorio di Biologia Molecolare dove viene
trattato per l’estrazione di DNA, RNA e proteine. Viene valutata la qualità dei derivati genomici e
viene criopreservata in apposito ambiente controllato. Il DNA viene sottoposto ad analisi mediante
SNP e CGH array.
I prodotti della BIT rappresentano una risorsa indispensabile per lo studio delle patologie in quanto
possono fornire informazioni per l’identificazione di nuovi biomarcatori della malattia, e per la
scoperta di nuovi bersagli terapeutici. Il database associato alla BIT è una sorgente continua di
informazione che si aggiorna nel tempo e che serve da guida e supporto per il disegno di una terapia
sempre più mirata e personalizzata.
Microambiente e Neuroblastoma
Il neuroblastoma è il tumore solido più comune in età pediatrica, deriva dal sistema nervoso simpatico
ed è caratterizzato da un’elevata eterogeneità clinica e biologica. L’amplificazione del gene N-myc nel
neuroblastoma è uno dei fattori prognostici più importanti ed è associato a rapida progressione della
malattia ad esito infausto. L’ipossia, una condizione di bassa tensione di ossigeno, si ritrova
frequentemente nei tumori solidi come risultato di un’inappropriata vascolarizzazione. L’ipossia nei
tumori è associata con la progressione tumorale, con la metastasi, con la resistenza alla terapia e con
una prognosi negativa. L’induzione dell’espressione genica da ipossia è regolata principalmente dal
fattore di trascrizione inducibile da ipossia HIF-1, un eterodimero formato da due subunità, HIF-1α e
HIF-1β. HIF-2α, un partner alternativo di dimerizzazione di HIF, strutturalmente molto simile a HIF-1,
è anch’esso implicato nella regolazione della risposta trascrizionale all’ipossia, ma con un pattern di
geni modulati diverso da quelli di HIF-1. Poiché le proteine della famiglia Myc e HIF condividono,
nell’ambito dei promotori dei geni di cui modulano la trascrizione, sequenze target simili, è stata
recentemente suggerita una possibile interazione tra Myc e ipossia.
Lo scopo della nostra ricerca è quello di studiare la relazione tra N-myc e ipossia nella progressione del
neuroblastoma attraverso il raggiungimento dei seguenti obiettivi:
1) identificazione dei geni modulati dalla risposta ipossica in linee cellulari di neuroblastoma e
correlazione con espressione o amplificazione del gene N-myc tramite l’uso della tecnologia
del microarray. Al riguardo sono stati sviluppati e applicati algoritmi bioinformatici dedicati
alla selezione dei geni modulati;
2) uso di modelli tridimensionali in vitro (sferoidi), che mimano la situazione del tessuto in vivo,
per lo studio dell’influenza dell’espressione di N-myc nelle dimensioni e nella morfologia del
tumore e per l’identificazione di aree ipossiche e della componente staminale tramite
immunofluorescenza;
3) individuazione dei geni direttamente regolati da HIF e N-myc tramite l’analisi di
immunoprecipitazione della cromatina (ChIP on chip) e studio dell’interazione di N-myc e
dell’ipossia nella regolazione genica.
I risultati ottenuti forniranno nuove conoscenze sul ruolo dell’ipossia nella progressione del
neuroblastoma e porranno le basi per lo sviluppo di approcci terapeutici innovativi per il trattamento
del neuroblastoma.