G. Orrù

Germano Orrù Ph.D
Uso dei Probiotici nelle Patologie del Cavo Orale
Cavita’ Orale
La bocca (anche detta cavità orale), è localizzata
nella testa.
Il limite anteriore, tramite il quale comunica
con l’esterno, sono le labbra,
il limite posteriore è formato dal palato molle e
dall’istmo delle fauci (comunicazione con la
faringe).
Il tetto , è formato dal palato (duro
anteriormente e molle posteriormente),
Pareti laterali sono formate dalle guance.
Arcate dentarie e Lingua.
Le arcate dentarie sono 2, una superiore
alloggiata sulle ossa mascellari e una inferiore
alloggiata sulla mandibola. Tra le labbra e le
arcate dentarie si trova uno spazio a forma di
ferro di cavallo, detto vestibolo della bocca.
2000 d.C
Oral microbiology is the study of the microorganisms of the oral
cavity and the interactions between the oral microorganisms
with each other and with the host
HIPPOCRATES
400 a.C
Alfred Civilion Fones 1900 d.C
Sigmund Socransky 1990 d.C
Discovery of oral microbe
Antonie van Leeuwenhoek
1632 –1723
http://www.rightdiagnosis.com/sym/mouth_infections.htm#intro
WILLOUGHBY D. MILLER
1853-1907
•J.D. Rudney et al.
•Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis, and Tannerella forsythensis are components of
a polymicrobial intracellular flora within human buccal
cells
•J. Dent. Res., 84 (2005), pp. 59–63
Tannerella forsythia
Medical diagnosis
In oral infections
Diagnostician
Radiological Tests
Laboratory diagnosis
of infections
Oral infection chain
Pathogen
Virulence
Host
Source
Means
Trasmission
Of entry
Oral infections
Abscesses
Dental caries
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Candidiasis
Endodontic infections
Herpangina
Herpes
Gingivitis
Gingivostomatitis
Candida spp.
Coxsackievirus
Herpex simplex
Gram -anaerobic pathogens.
Papilloma virus
Periodontitis
Actinomyces spp
Oral Halitosis
Osteomyelitis
Oral Papillomas
Eikenella spp
Microbes and humans
Very few microbes are
always pathogenic
Many microbes are
potentially pathogenic
Most microbes are
never pathogenic
Mark Pallen et al.,2011
Most Oral
bacterial
Oral Microbiota
Bacteria
yeast
Virus
protozoa
• The microbiota is the vast array of bacteria,
viruses, and fungi that live in and on our
bodies. These organisms outnumber our own
cells by 10 to 1, though they are much smaller
in size.
• The microbiome is the genetic information
which provides the blueprints and instructions
for these organisms. The terms microbiome
and microbiota are generally interchangeable.
Microrganisms are organized in sessile structure , biofilm
Human Microbiota
shotgun sequencing
Craig Venter
NEXT Generation Sequencing
2nd Generation or High-Throughput DNA Sequencing
A differenza del
sequenziamento tradizionale
( metodo Sanger) , consente
di sequenziare moltissimi
frammenti di DNA in
parallelo, con rese
notevolmente piu’ elevate
Procedura
1. Preparazione della “library”
2. Amplificazione
3. Sequenziamento
Applicazioni NGS
• 1. Whole-Genome Sequencing - WGS,
2. Whole-Exome Sequencing – WES:
3. Targeted Sequencing: .
4. Transcriptome Analysis: analisi di tutti gli
RNA).
5. Microbiomi (analisi infezione parodontale)
Analisi Bioinformatica
ALIGNMENT
VARIANT CALLING
FILTERING & ANNOTATION
Strutture healthy human microbiome
Huttenhower et al., Nature 2012
• A total of 4,788 specimens from 242 screened and
phenotyped adults (129 males, 113 females)
Goals
•To develop a reference set of microbial genome sequences and to perform preliminary
characterization of the human microbiome
•To explore the relationship between disease and changes in the human microbiome
•To develop new technologies and tools for computational analysis
•To establish a resource repository
•To study the ethical, legal, and social implications of human microbiome research
http://www.homd.org/
Next Generation sequencing NGS
Dr. Germano Orrù
Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity
Jørn A. Aas, Bruce J. Paster ,Lauren N. Stokes
Ingar Olsen and Floyd E. Dewhirst 2005
Faculty of Dentistry, University of Oslo, Oslo, Norway
*1
I Biofilm
Diapositiva 25
*1
Lezuine N.1 ( 2 ore )
*****; 09/03/2007
Biofilm
Strato gelatinoso/duro aderente a :
Tessuti
Superficie dentale
Materiale vario ( es. tubature)
Costituzione :
Cellule batteriche
• Polisaccaridi complessi
Matrice amorfa
• proteine
• Sali ( es. carbonati)
Inglobati ( virus)
•Il Biofilm è una struttura tridimensionale vantaggiosa
per i batteri.
•Si possono riscontrare fluid channels per il trasporto
del substrato, di rifiuti e di molecole di segnale.
•La matrice che costituisce il biofilm è costituita da un
mix di polisaccaridi e proteine.
•Quando si organizzano in biofilm i microrganismi sono
meno suscettibili agli antimicrobici e più resistenti al
sistema immunitario.
Un agente antimicrobico per aver effetto sul biofilm
deve avere una concentrazione 10-1000 volte
superiore rispetto a quella inibitoria per i
microrganismi planctonici.
Biofilm nel cavo orale
• Area sottogengivale
• Dorso della lingua
Biofilm:
comunità microbica immersa in una matrice
composta da polimeri di origine batterica e
prodotti di essudazione gengivali e salivari
Anaerobiosi
Funzioni
Rappresenta l’ organo più importante per
la produzione del linguaggio .
Durante il discorso , la lingua può fare una
vasta gamma di movimenti
La funzione primaria della lingua è di
fornire un meccanismo per il gusto . Le
papille gustative si trovano su diverse aree
della lingua , ma si trovano generalmente
intorno ai bordi . Sono sensibili a quattro
sapori principali : amaro, acido , salato e
dolce
Induito
Coating linguale e alimentazione
Film sottile , lingua bianca lucente = stato di salute
Anaerobe Bacteria in tongue biofilm
Gram Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella melaninogenica
Prevotella nigrescens
Prevotella pallens
Prevotella veroralis
Peptostreptococcus spp.
Tannerella forsythensis
Veillonella dispar
Disposizione del Microbiota Orale
Tongue biofilm
mother
Newborn 1
Newborn 2
1 week
The oral-systemic connection
Physiologic function
Role in the local and systemic diseases
Olfactory Perception of Cysteine-S-Conjugates from
Fruits and Vegetables
CHRISTIAN STARKENMANN,* BENEDICTE LE CALV ´ E, YVAN NICLASS,
ISABELLE CAYEUX, SABINE BECCUCCI, AND MYRIAM TROCCAZ
Corporate R&D Division, Firmenich SA, P.O. Box 239, CH-1211 Geneva 8, Switzerland
odorless
J Agric Food Chem. 2008 Oct 22;56(20):9575-80. Epub 2008 Sep 24
F. nucleatum
The mouth acts as a reactor, adding another
dimension to odor perception, and saliva
modulates flavors by trapping free thiols.
Saliva solublization
Flavors
Human microbiome
Buffalo School of Dental Medicine in Buffalo, New York.
The bacterial profile of the placental
microbiome is similar to the microbiome of the
tongue, tonsils, saliva, and subgingival plaque.
The thicker lines demonstrate this similarity
http://www.dimensionsofdentalhygiene.com/2015/01_january/Features/The_Human_Microbiome.aspx
Superficie Dorsale
Costituita dalla mucosa linguale
due parti, diverse sia per aspetto che per
origine embriologica: corpo e radice della
lingua (orale e faringea)
Fondo cieco
Solco terminale
Collegata : ant. Frenulo
e post. Osso ioide
Corpo 2/3 volume
Meccano
recettori
mother
Newborn 1
Newborn 2
Hypothesis
on oral microbiota connection
Saliva
Periodontal pathogens
weaning
Hypothesis on Innate functions of the periodontal pathogens
Preferably, the reductase is an F420 dependent reductase. More preferably, the
F420 dependent reductase is a member of the pyridoxamine 5 '-phosphate oxidases
Hypothesis on Innate functions of the periodontal pathogens
Ferula communis L.
Alitosi
ALITOSI
Odore sgradevole dell’aria emessa dal cavo orale
rappresenta una grande limitazione nei rapporti interpersonali
interessa circa il 50% della popolazione mondiale
può essere il segnale di diverse patologie
Classificazione:
Transitoria
Persistente
Alitofobia
PubMed
120
halitosis
100
Periodontal
Pathogens Realtime PCR
n. lavori
80
60
40
Anaerobic Bacteria
20
0
1965
1970
(H2S) gas
detection
1975
1980
1985
BANA test
Tongue
1990 Anno 1995
VSC
2000
2005
2010
2015
probiotic
sulfite- Biofilms
reductor
tongue Cells
2020
Cause di Alitosi
fumo e consumo di alimenti alitogeni
Alitosi
transitoria
periodi di digiuno prolungato
periodi di alterazioni ormonali (periodo mestruale, pubertà)
periodi di particolare stress psico-fisico
assunzione di farmaci che causano xerostomia
Alitosi
persistente
patologie sistemiche:
gastriti, reflusso gastroesofageo
malattie epatiche
insufficienza renale cronica
diabete mellito
sinusiti, tonsilliti e infezioni orofaringee
neoplasie gastroesofagee e laringo-tracheo-polmonari
Origine:
Cavo orale (85-90%)
Extra orale (15-10%)
ALITOSI ORALE
ALITOSI NON ORALE
TERAPIA
INVIO AD ALTRI MEDICI
SPECIALISTI
Patologie o condizioni che interessano
il cavo orale:
patina linguale
patologie delle ghiandole salivari (xerostomia)
lesioni cariose molto estese
protesi o restauri incongrui
scarsa o inappropriata igiene orale
malattia parodontale
lingua fissurata o a carta geografica
neoplasie orali e faringee
altre lesioni orali (ascessi, infezioni da Candida spp.)
PRESENZA DI BATTERI ANAEROBI IN GRADO DI
PRODURRE “COMPOSTI SOLFORATI VOLATILI”
(VSC), RESPONSABILI DEL DISTURBO
Batteri responsabili dell’ alitosi
Porphyromonas gingivalis
Tannerella forsytensis
Treponema denticola
Prevotella intermedia
Helicobacter pylori a livello gastrico
Tongue microbial biofilm
Flavors Modulation
Oral Protection
Halitosis
Patient
homeostasis
Therapy
Periodontal
diseases
Pathogens reservoir
Transitory
septicemias
Endocarditis after Use of Tongue Scraper
Volume 13, Number 9–September 2007
Emerging Infectious Diseases
Letter
Andrew M. Redmond et al.
•
•
•
A 59-year-old woman reported infective
endocarditis after a known history of mitral
valve prolapse.
Two months previously she had begun
cleaning her tongue with a plastic tongue
scraper purchased at her local pharmacy.
We propose that our patient's infective
endocarditis was most likely a consequence of
bacteremia from her use of a tongue scraper.
Batteri responsabili dell’alitosi
Gram negativi,
anaerobi,
proteolitici
Principali localizzazioni:
Zone povere o prive di ossigeno
in cui tali batteri trovano le
condizioni ottimali per la loro
proliferazione
Cripte linguali
OBL
Tasche parodontali
Bacteria in tongue biofilm
Gram Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella melaninogenica
Prevotella nigrescens
Prevotella pallens
Prevotella veroralis
Peptostreptococcus spp.
Tannerella forsythensis
Veillonella dispar
Tongue Biofilm
Cellula epiteliale
Gram +
Biofilm
Gram -
Fattori di patogenicità
•Endotossine: LPS di membrana
•Proteasi: aspecifiche
•Enzimi: tipo-tripsina, sialidasi
(neuroaminidasi).
•Proteine leganti Fc (di membrana): inibiscono
l’attivazione del complemento
•Enzimi anti-Ig: Litici per Ig
Composti responsabili dell’alitosi
Acidi grassi (acido butirrico, isovalerico, propionico)
Composti amminici (cadaverina e putrescina)
Composti solforati volatili (solfuro di idrogeno e metilmercaptano)
Derivanti dalla degradazione, da parte dei batteri
alitogeni, dello zolfo contenuto negli aminoacidi
presenti:
nella saliva e nel fluido crevicolare
nei residui di cibo dopo i pasti
nel sangue presente in caso di lesioni gengivali
COMPOSTI VOLATILI SOLFORATI (VSC)
Principali responsabili dell’alitosi
R-SH
• Solfuro di idrogeno;
• Metilmercaptano;
• Acidi grassi a catena alifatica (ac. butirrico, ac. valerico,
ac. isovalerico, ac. propionico)
Batteri
Enzimi
Putrefazione sostanze organiche VSC
COMPOSTI POLIAMINICI (PC),
DIAMINICI E INDOLICI
•
•
•
•
Metilamina;
Diamina;
Putrescina;
Cadaverina.
Diagnosi di alitosi
Diagnosi clinica
Diagnosi strumentale
• Anamnesi
• Esame clinico del cavo orale
strumentale
Misura la concentrazione di VSC presente nell’alito del paziente
Non permette di stabilire se la causa è orale o extraorale
Diagnosi di laboratorio
PCR real time
Identificazione e quantificazione dei patogeni
Iter diagnostico
Percorso diagnostico
• Anamnesi;
• Esame clinico del cavo
orale;
• Prova organolettica;
• Esame strumentale con
Halimeter;
• Esame microbiologico
(BANA test);
• Esame molecolare (PCR
classica e PCR real-time).
OralChroma
(1) Hydrogen sulfide
(2) Methyl mercaptan
(3) Dimethyl sulfide
Colonna
cromatografica
•Aria prelevata con siringa, no contaminazioni
•No tarature tra un paziente e l’altro
•Durata colonna 2 anni.
Sonda
ANAMNESI
ESAME CLINICO
istruzioni:
NO fumo, alcool, caffè,
cibi speziati, aglio, cipolle
nelle 24 ore precedenti;
NO collutori contenenti
clorexidina o olii
essenziali nei 7 giorni
precedenti il test;
nessuna cura antibiotica
nei 7 giorni precedenti il
test.
•Aspirare l’aria
all’interno del cavo
orale con una siringa.
•Inserire l’ago per poi
iniettare un campione
di 0.5 ml all’interno del
gascromatografo
Esempio
H2S = - 41,04%
CH3SH = - 48,12%
H2S = Ø
CH3SH = - 96,51%
Negativi 55%
45%
Moderata 21%
Grave 24%
77 pazienti
24
13%
78
44%
34
19%
43
24%
177 pazienti
Alitosi Assente
Alitosi Preclinica
Alitosi Orale
Alitosi Non Orale
90
39
39
22
21
20
14
15
9
Alitosi Assente
Alitosi Preclinica
Alitosi Orale
Alitosi Non Orale
TOT
Uomini
39
22
14
15
90
Donne
39
21
20
9
89
89
Alitosi in rapporto all’ età
50
TOT
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
TOT
6-14 anni
18
15-20 anni 21-30 anni 31-40 anni 41-50 anni 51-60 anni
11
10
28
38
43
>60 anni
31
Trattamento classico
a medio termine
Terapia meccanica
Non risolve per il 80% dei casi!
Terapia antimicrobica
Terapia dell’alitosi orale
evitare il consumo di alimenti alitogeni, alcolici e tabacco
bere spesso o utilizzare specifici sostituti salivari, in caso di xerostomia
trattamento di eventuali patologie o condizioni orali che favoriscono il disturbo
Scrupolosa igiene orale
Utilizzo di antimicrobici
(olii essenziali, clorexidina)
Probiotici
Composti
funzionali
Efficacia limitata nel tempo:
immediata ricolonizzazione
delle cripte linguali
Batteri “buoni” in grado di ricolonizzare le cripte
linguali dopo terapia, impedendone la
ricolonizzazione da parte dei batteri alitogeni
Estratti vegetali in grado di modulare il
microbiota.
oral microbioma as a double-edged sword
Patient
homeostasis
Flavors Modulation
Oral cavity/Body Protection
Halitosis
Therapy
Periodontal diseases
Pathogens reservoir
Systemic diseases
Transitory
septicemias
Probiotici
Lactobacillus reuteri
Streptococcus salivarius
Probiotici
• Competono con i patogeni per i siti di adesione
• Producono sostanze antibatteriche
Principali Probiotici in studio presso OBL Cagliari
L. reuteri DSM 17938
L. reuteri ATCC PTA 5289
S. salivarius ceppo K12
Meccanismo d’azione
Tolleranza orale
macrofago
A. actinomicetemcomitans
Richiamo di commensali
TLR4
Quorum sensing
Immunomodulanti
Probiotico
N
Porphyromonas gingivalis
batteriocine
s
S. intermedius
Cross talk
Walker et al., 2008, CID
adesione
TLR
Tongue cells
L. rhamnosus Supplementing 1-6 year old
children with L. rhamnosus for 7 months
significantly reduced the risk of dental caries.
L. salivarius & L. fermentum Both strains
showed antagonistic activity on the growth of
S. mutans and Streptococcus pneumonia. L.
salivarius was able to survive an environment
of low pH as that produced by a high number
of S. mutans
L. rhamnosus & Lactobacillus bulgaricus
Inhibitory effects against P. gingivalis,
Fusobacterium nucleatum & streptococcal spp
L. fermentum L. fermentum was found in the
saliva of healthy children. This strain
significantly inhibited the formation of the
insoluble glucan produced by S. mutans. It did
not affect the multiplication of this pathogenic
strain, but it completely inhibited the
adherence onto cuvette walls
Haukioja 2010 Eur. J. Dent
Probiotico
Reports di
effetti avversi
Bifidobacterium
setticemia, ascessi, peritonite
15
Lactobacillus rhamnosus
endocardite, ascessi, peritonite
13
Lactobacillus casei
endocardite, ascessi
8
Lactobacillus plantarum
endocardite
8
Lactobacillus johnsonii
0
Lactobacillus probiotici
Streptococcus K12*
0
Saccharomyces boulardii
fungimia
13
Anamnesi
pazienti: 6
5 affetti da alitosi
orale
1 affetto da
glossite
Età media: 11 anni
Esame cavità orale
Oral Chroma
Meccanica
Terapia
Colluttorio
Probiotico
L. reuteri 3 mesi
H2S = - 96,62%
CH3SH invariato
30
60
Valori risultano
azzerati dopo un
mese di terapia
120
giorni
I caso
Caso II
H2S = - 41,04%
CH3SH = - 48,12%
30
60
H2S = Ø
CH3SH = - 96,51%
120
giorni
Case report
Candidosi MDR
Basale
30 giorni
S. salivarius K12
Oral microbiome is very complex and when disturbed lead to
oral and systemic pathologies .
The “microbiome analysis approach” suggest a modulating
treatment ,. i.e for long term therapy.
Probiotics could be useful for reconstruct a physiological oral
microbiota .