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Tecnica di preparazione dei vetrini
Tecnica di preparazione di vetrini istologici By A. Pirola Preparazione del materiale istologico • Problema 1 • I tessuti vanno incontro a fenomeni di degradazione • Problema 2 • La luce può attraversare solo sezioni molto sottili • Problema 3 • La maggior parte dei tessuti sono molli • Problema 4 • Prima dell’osservazione il tessuto deve essere colorato Schema di preparazione di un vetrino Fasi della preparazione • • • • • • • • • • Prelievo del materiale Fissazione 1°Taglio (bisturi) 1a Disidratazione Inclusione in paraffina 2°Taglio (microtomo) Deparaffinatura e Idratazione Colorazione 2a Disidratazione Montaggio Prelievo del materiale • Strumenti per il prelievo • • • • • • Bisturi Punch per biopsia Pinze per biopsia Aghi per biopsia Raschietti Tamponi Prelievo del materiale Prelievo del materiale Prelievo del materiale Fissazione • Scopo della fissazione • fissativi coagulanti (denaturano le proteine) – etanolo – acido picrico al 2% – cloruro mercurico al 7 % • fissativi non coagulanti (gelificano le proteine) – – – – formaldeide in soluzione al 10% (formalina) acido acetico tetrossido d’osmio 7% (usato in microscopia elettronica) congelamento rapido in azoto liquido ed essiccazione 1°Taglio e 1a Disidratazione • Scopo del 1° taglio • Scopo della 1a disidratazione • • • • • Etanolo Etanolo Etanolo Etanolo Xilolo 80% 90% 95% 100% 1a Disidratazione Inclusione in paraffina • Scopo dell’inclusione • Paraffina • Resine epossidiche (microscopia elettronica) Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina 2°Taglio • Scopo del 2° taglio • • • • Microtomo Microtomo Microtomo Microtomo a slitta a rotazione elettronico congelatore • Spessore sezioni sottili – 2–10 µm (microscopia ottica) – 200–400 Å (microscopia elettronica) 2°Taglio 2°Taglio 2°Taglio 2°Taglio • Recupero delle sezioni sottili Deparaffinatura e Idratazione • Scopo deparaffinatura • Scopo idratazione • • • • Xilolo Etanolo 100% Etanolo 95% Acqua distillata Colorazione • Scopo della colorazione • • • • • • • • • • Caratteristiche delle colorazioni istologiche Semplici Differenziali Simultanee Successive Progressive Regressive Dirette Indirette Metacromatiche Colorazione REAGENTE RISULTATO Ematossilina Blu: nucleo, regioni acide del citoplasma, matrice cartilaginea Eosina Rosa: regioni basiche del citoplasma, fibre collagene Colorazione tricromica di Masson Blu scuro: nucleo Rosso: muscoli, cheratine, citoplasma Blu chiaro: chiaro: mucinogeno, mucinogeno, collagene Orceina per le fibre elastiche Marrone: Marrone: fibre elastiche Weigert per le fibre elastiche Blu: Blu: fibre elastiche Argento Nero: fibre reticolari Ematossilina ferrica Nero: striature muscolari, nucleo, eritrociti Acido periodicoperiodico-Schiff Magenta: glicogeno e molecole ricche di carboidrati Colorazione Amiloide di Thompson Blu: nucleo Rosa o rosso: amiloide Colorazione di Pearls Rosso: nucleo Blu: ferro Colorazione Colorazione • Colorazione Ematossilina-Eosina – Ematossilina (basica) colora in viola le strutture acide – Eosina (acida) colora in rosa le strutture basiche Colorazione • Colorazione Azan-Mallory – Azocarminio colora in rosso i nuclei e in rosa il citoplasma – Miscela di Mallory colora in blu le fibre collagene Colorazione • Nella microscopia elettronica i campioni si “colorano” mediante impregnazione con Sali di metalli pesanti (oro, palladio, osmio, ecc.) 2a Disidratazione • Scopo della 2a disidratazione • Etanolo 95% • Etanolo 100% • Xilolo Montaggio • Scopo del montaggio Cenni di Istochimica Istochimica • L'istochimica è lo studio della composizione chimica delle strutture dei tessuti biologici attraverso metodi microscopici • Le colorazioni istochimiche consentono l’identificazione delle sostanze chimiche contenute nei tessuti, queste reazioni non devono danneggiare le cellule e devono provocare la formazione di sostanze colorate insolubili Caratteristiche delle Reazioni Istochimiche • Dirette • Indirette • Specifiche – Assoluta – Non assoluta • Sensibili • Sicure Il problema dei fissativi • Tutti i fissativi usati nelle metodiche istologiche comportano modificazioni chimiche delle strutture in esame • In questo caso si ricorrere al congelamento dei campioni • Microtomo congelatore • Criostato • Congelamento rapido in azoto liquido ed essiccazione Tipi di colorazione • Proteine – Reazione Ninidrina-Schiff Tipi di colorazione • Acidi nucleici – Reazione di Feulgen Tipi di colorazione • Carboidrati – Reazione PAS – Reazione con Alcian Blu Tipi di colorazione • Lipidi – Lisocromi Istoenzimologia • L’istoenzimologia si prefigge di localizzare attività enzimatiche nei tessuti ed all’interno di cellule • A questo scopo si utilizzano reazioni chimiche catalizzate dagli enzimi tissulari, che forniscono un prodotto insolubile e visibile in microscopia • L'identificazione di un enzima è in realtà un artefatto, in quanto è il prodotto della reazione che si osserva al microscopio, non l'enzima Istoenzimologia • Metodo per la Fosfatasi alcalina (ALP)
