Struttura genetica del gambero di fiume

Dottorato di ricerca in Scienze Ambientali
“Ambiente e uomo in Appennino”
Università degli Studi de L’Aquila
Tesi realizzata con il cofinanziamento della Comunità Europea
Curriculum: Ecologico – Ecologia delle acque interne –
Struttura genetica del gambero di fiume Austropotamobius
italicus e strategie di conservazione della specie in Italia
centrale con particolare riguardo all’Abruzzo.
Tutor
Prof. Bruno Cicolani
Dottorando
Marcello Iaconelli
Coordinatore
Prof. Valter Rossi
XIV Ciclo: 1999 - 2001
Struttura genetica del gambero di fiume Austropotamobius
italicus e strategie di conservazione della specie in Italia
centrale con particolare riguardo all’Abruzzo.
INDICE
INTRODUZIONE
i-iii
CAPITOLO 1: SISTEMATICA ED ECOLOGIA
1.1 Sistematica
1
1.2 Distribuzione geografica
5
1.3 Ecologia
8
1.4 Patologie
11
CAPITOLO 2: MATERIALI E METODI
2.1 Materiali
14
2.2 Analisi elettroforetica di sistemi gene-enzima
19
2.3 Analisi del DNA Mitocondriale
24
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
Estrazione del DNA
Amplificazione mediante PCR
Sequenziamento
Analisi del polimorfismo della lunghezza dei
frammenti di restrizione
2.4 Analisi Statistiche
2.4.1 Dati allozimici
2.4.2 Analisi delle sequenze
24
25
25
26
27
27
29
CAPITOLO 3: RISULTATI
3.1 Status attuale delle popolazioni italiane
31
3.2 Analisi genetica a livello nucleare: loci enzimatici
36
3.3 Analisi genetica a livello mitocondriale
67
3.3.1 Citocromo-Ossidasi I
3.3.2 Subunità 16S del RNA ribosomiale
67
78
3.4 Allevamenti sperimentali e ripopolamenti
85
CAPITOLO 4: DISCUSSIONI E CONCLUSIONI
88
BIBLIOGRAFIA
97
i
INTRODUZIONE
Dalla fine dell’800 la distribuzione e l’abbondanza dei gamberi di fiume
italiani (genere Austropotamobius) sono andate drasticamente riducendosi
per cause molteplici: alterazione degli habitat favorevoli, per inquinamento
chimico e organico delle acque, prelievi idrici, cementificazione degli argini
fluviali; sovrasfruttamento delle popolazioni; esclusione competitiva da parte
di specie alloctone, introdotte a scopo commerciale, quali il gambero turco
(Astacus leptodactylus) e quelli americani (Procambarus clarkii, Pacifastacus
leniusculus); epidemie da patogeni e parassiti, come la “peste del gambero”,
micosi causata da Aphanomyces astaci, introdotto da gamberi alloctoni. Oggi
i gamberi di fiume sono estinti in molte parti del loro areale e sono presenti in
Europa con popolazioni medio-piccole, frammentate e isolate, generalmente
in piccoli corsi d’acqua . Cio’ ha portato quasi tutti i paesi europei, compresa
l’Italia, a istituire norme di protezione per i gamberi di fiume autoctoni,
vietandone la pesca o limitandola a periodi molto brevi. Sono in
considerazione programmi per la reintroduzione e il ripopolamento di aree
naturali. Tali misure, se oculate, potrebbero favorire il reinstaurarsi di corridoi
biotici che consentano flusso genico tra popolazioni e contrastino l’erosione
genetica. E’ ormai ben dimostrato che un importante rischio di estinzione di
popolazioni piccole e frammentate e’ determinato dalla perdita di variabilita’
genetica, causata da deriva genetica e inbreeding, che ne riduce le capacita’
di rispondere adattativamente a fluttuazioni ecologiche nel tempo e nello
spazio. (Van Valen, 1973: Frankel & Soule’, 1981: Avise, 1994; Avise &
Hamrick, 1995).
Premessa fondamentale a qualsiasi programma di reintroduzione e di
restocking e’ una conoscenza della struttura genetica delle popolazioni. Le
popolazioni che si intende introdurre devono essere infatti sufficientemente
differenziate da permettere un aumento della variabilita’ genetica delle
popolazioni autoctone, ma non troppo da determinare una minore fitness
ii
degli ibridi (outbreeding depression) e/o fenomeni di esclusione competitiva,
come puo’ avvenire nel caso di entita’ parzialmente o completamente isolate
riproduttivamente. Andrebbero quindi preliminarmente identificate le ‘unita’
evolutivamente significative (ESU, Moritz, 1994: Avise & Hamrick, 1996) che
si intendono salvaguardare e i livelli di variabilita’ genetica intra- e
interpopolazionale. Ove possibile, andrebbe inoltre verificato in condizioni di
laboratorio o seminaturali controllate il successo degli incroci tra le
popolazioni che si intende rimescolare.
Nel caso dei gamberi di fiume italiani i dati sono ancora preliminari e
spesso controversi. Ricerche genetiche basate su allozimi hanno mostrato il
differenziamento genetico e il sostanziale isolamento riproduttivo tra A.
pallipes (Gran Bretagna, Francia, Italia nord-occidentale) e A. italicus (Italia,
Penisola Iberica), precedentemente considerate come conspecifiche, cf Bott,
1950); in una zona di parapatria tra le due entita’ in Liguria e Piemonte
occidentale e’ stata dimostrata assenza di sintopia e di ibridi di F1 (Santucci
et al., 1997; Iaconelli, 1997; Bondanelli et al., in prep.); e’ stata inoltre
evidenziata una eterogeneita’ genetica nell’ambito di A.italicus (Santucci et
al., 1997). Tale eterogeneita’ e stata confermata da altri autori (Grandjean et
al., 1997, Lörtscher et al., 1997, 1998) e ha portato al riconoscimento di una
terza specie, A. berndhauseri, in Svizzera e in Italia settentrionale, pur in
assenza di un chiaro differenziamento genetico da A. italicus (Largiader et
al., 2000). I vari studi generalmente concordano nell’indicare valori
generalmente molto bassi di variabilita’ genetica dei gamberi di fiume europei
sia a livello nucleare che mitocondriale (Santucci et al., 1997; Grandjean et
al., 1997, Lörtscher et al., 1997, 1998; Souty Grosset et al., 1997; Largiader
et al., 2000).
E’ da notare che nonostante i gamberi del genere Austropotamobius
siano considerati “rari e vulnerabili” dall’Unione Internazionale per la
Conservazione della Natura (IUCN: Baillie & Groombridge, 1996) e inseriti
nell’Invertebrate Red Data Book, in queste liste vengono tuttora riconosciute
solo A. pallipes (che include A. italicus) e A. torrentium.
iii
La presente tesi si inserisce in questa problematica con i seguenti
obiettivi:
•
verificare la presenza e l’abbondanza in Italia dei gamberi di fiume, con
particolare riguardo alle aree appenniniche, confrontando la situazione
attuale con quella osservata all’inizio del novecento (Vinciguerra, 1899);
•
analizzare la struttura genetica di Austropotamobius italicus, allo scopo di
definire le Unita’ Evolutivamente Significative (ESU) in questa specie. A
questo scopo verra’ confrontata la diversita’ genetica a livello intra- e
interpopolazionale sia nucleare (29 loci enzimatici) che mitocondriale
(sequenziamento di regioni codificanti per la citocromo I ossidasi e l’RNA
16S) tra popolazioni dell’Italia, Spagna, Slovenia, e Svizzera;
•
verificare la presunta presenza di una specie distinta, A. berndhauseri, in
Italia settentrionale;
•
caratterizzare i livelli di variabilita’ genetica delle popolazioni di A. italicus
e identificare i possibili ‘reservoirs’ di variabilita’;
•
fornire linee guida per la conservazione della specie, con particolare
riguardo alla scelta dei riproduttori, alle metodiche di allevamento e
all'individuazione delle aree idonee per le introduzioni e/o i ripopolamenti.
1
CAPITOLO 1
SISTEMATICA ED ECOLOGIA
1.1 Sistematica
Fino a pochi anni fa la sistematica dei gamberi d'acqua dolce europei era
basata quasi esclusivamente su sottili criteri morfometrici quali la forma
della punta del rostro, la forma dei gonopodi del maschio o il numero delle
spine postorbitali, poco decisivi per la definizione tassonomica, tanto che
numerose variazioni di nomenclatura si sono succedute nel tempo
(Tab.1). Bott (1972) riconosceva due generi distinti, Astacus e
Austropotamobius, con quattro specie: As. astacus, As. leptodactylus, A.
pallipes (comprendente anche le popolazioni italiane, con la sottospecie
A. p. italicus) ed A. torrentium.
Karaman (1962, 1963) e Brodsky (1981) considerano invece le
popolazioni iberiche, italiane e dalmate come appartenenti alla stessa
specie, A. italicus, suddivisa a sua volta in tre sottospecie (carsicus,
italicus e lusitanicus) di cui la nominale, ssp. italicus, presente in Italia. A.
italicus veniva considerata ancestrale rispetto a A. pallipes e le due forme
si sarebbero diffuse in Europa occidentale in epoche differenti.
Albrecht (1981, 1982) ha riunito i gamberi europei riunendoli nell'unico
genere Astacus. Astacus pallipes veniva suddivisa in varieta’: pallipes
(Francia, Gran Bretagna), rhodanicus, della Francia meridionale, italicus
dell’Italia centro-meridionale, lombardicus, del Ticino e Lombardia,
trentinicus del Trentino Alto Adige, dalmatinicus della Dalmazia,
carinthiacus della Carinzia (Austria).
Tab. 1: Classificazione degli astacidi europei secondo Bott, Karaman, Albrecht e Brodsky.
Bott (1950, 1972)
Karaman (1962, 1963)
Genere
Sottogenere
Specie
Sottospecie
Genere
Astacus
Astacus
astacus
-
Astacus
colchius
-
Sottogenere
-
Specie
Sottospecie
astacus
astacus
balcanicus
colchius
Pontastacus
pachypus
-
pylzowi
-
kessleri
-
leptodactylus
Pontastacus
-
leptodactylus
-
leptodactylus
salinus
leptodactylus
boreorientalis
cubanicus
intermedius
eichwaldi
salinus
eichwaldi
danubialis
bessarabicus
Austropotamobius
Austropotamobius
Atlantoastacus
torrentium
pallipes
torrentium
macedonicus
kessleri
pallipes
pylzowi
italicus
pachypus
lusitanicus
berndhauseri
pachypus
notabilis
Austropotamobius
Austropotamobius torrentium
Atlantastacus
pallipes
pallipes
bispinosus
italicus
italicus
carsicus
lusitanicus
Tab. 1 (continua)
Albrecht (1982)
Brodsky (1983)
Genere
Sottogenere
Specie
Sottospecie Varietà
Genere
Astacus
-
astacus
astacus
Astacus
Sottogenere
-
Specie
Sottospecie
astacus
astacus
balcanicus
pachypus
-
leptodactylus
-
torrentium
-
pallipes
-
balcanicus
Pontastacus
-
leptodactylus
leptodactylus
salinus
pallipes
boreorientalis
italicus
intermedius
lombardicus
trentinicus
eichwaldi
eichwaldi
rhodanicus
danubialis
dalmatinicus
bessarabicus
carinthiacus
kessleri
pylzowi
pachypus
pachypus
notabilis
Austropotamobius Austropotamobius torrentium
Atlantastacus
pallipes
pallipes
bispinosus
italicus
italicus
carsicus
lusitanicus
4
A differenza di Karaman egli considerava A. pallipes come specie
filogeneticamente più antica; essa si sarebbe evoluta dando origine alle
forme attuali nella Tedide occidentale (odierna regione del basso Rodano)
durante il medio Miocene. Cio’ sarebbe testimoniato dalla presenza nella
regione (Vaucluse) di popolazioni morfologicamente molto simili alla
forma italicus (Laurent & Suscillon, 1962).
Piu’ recentemente sono stati condotti studi genetici, sulla base di
marcatori sia nucleari che mitocondriali, con risultati in parte controversi.
Tre gruppi distinti, corrispondenti alle sottospecie di Bott (1950) A. p.
pallipes (con campioni della Francia, dell’Inghilterra e del Galles, risultati
geneticamente geneticamente omogenei), A. p. italicus (un campione
della Slovenia) e A. p. lusitanicus (un campione della Spagna), sono stati
identificati sulla base di enzimi di restrizione del DNA mitocondriale totale
(Souty-Grosset et al., 1997; Grandjean et al., 1998). D’altra parte Santucci
et al. (1997), sulla base di sistemi gene-enzima hanno dimostrato il
differenziamento genetico e l’isolamento riproduttivo in natura delle entita’
A. pallipes, A. italicus e A. torrentium , che vanno quindi considerate come
specie distinte, confermando l’ipotesi di Karaman (1962, 1963); tali studi
hanno inoltre confermato la sostanziale identita’ genetica in A. pallipes
della Francia meridionale, Inghilterra e Italia nord-occidentale, mentre
nell’ambito di A. italicus, geneticamente più eterogeneo, sono stati
evidenziati quattro gruppi, distribuiti rispettivamente in: i) Appennini
centro-settentrionali
e
penisola
Iberica;
ii)
Lazio,
Abruzzi,
Italia
meridionale: iii) Lombardia, Friuli, Croazia nord-occidentale e Slovenia; iv)
confine italo-sloveno (un campione del bacino dell’Isonzo). Non viene
quindi confermata la sottospecie iberica (“lusitanicus”). L’affinita’ genetica
delle popolazioni spagnole con A. italicus e’ stata successivamente
confermata a livello di DNA mitocondriale (Grandjean et al., 2001). Anche
la distinzione a livello specifico tra A. pallipes e A. italicus e’ stata
successivamente confermata da Grandjean et al. (2000) sulla base del
sequenziamento di una regione mitocondriale codificante per l’RNA 16S.
5
Questi autori hanno inoltre suddiviso A. italicus nelle sottospecie A. i.
italicus (aplotipi dell’Italia centrosettentrionale, Francia meridionale e
Spagna), A. i. carinthiacus (Plansee, Austria), e A. i. carsicus (aplotipi
della Slovenia e della Francia meridionale), evidenziando inoltre recenti
trasporti passivi in Francia. Tali risultati, tuttavia, sono basati su un
numero limitatissimo di campioni e di esemplari.
Anche nell’arco alpino e’ stata evidenziata una notevole eterogeneita’
genetica (Lörtscher et al., 1997, 1998). Largiader et al. (2000) sulla base
di allozimi e DNA mitocondriale (una regione di circa 1500bp compresa
tra i geni per l’RNA 12S e 16S), distingue un gruppo settentrionale,
corrispondente a A. pallipes, e uno meridionale, attribuito alla specie A.
berndhauseri, presente in Svizzera e Italia settentrionale. Non emerge,
tuttavia, un chiaro differenziamento genetico tra quest’ultimo taxon e A.
italicus.
1.2 Distribuzione geografica
Il genere Austropotamobius e’ distribuito in tutta l’Europa
occidentale e centro-meridionale. A. pallipes e’ la specie presente nelle
Isole Britanniche (a sud della Scozia), Francia, Italia nord-occientale,
Svizzera
settentrionale,
di recente sono state osservate alcune
popolazioni in alcuni tributari in Germania sud-occidentale (Trochel e
Dehus,
1993).
A.
italicus
(in
cui
provvisoriamente
includiamo
A.berndhauseri, non ancora chiaramente distinto a livello genetico) e’
distribuito nella Penisola Iberica, in Italia peninsulare, dalle Prealpi alla
Calabria settentrionale, Svizzera, Austria (Carinzia), Slovenia occidentale,
Istria e Dalmazia. A. torrentium si trova in Austria, Germania centromeridionale e paesi Danubiani fino all’Albania, Macedonia e Grecia
settentrionale (Fig. 1).
Fig. 1. Distribuzione geografica del genere Austropotamobius.
7
La distribuzione naturale di queste specie e’ stata notevolmente
modificata, soprattutto ad opera delle attivita’ antropiche, che hanno da
una parte alterato e distrutto gli habitat favorevoli, portando all’estinzione
da parti piu’ o meno estese dell’areale; dall’altra ad introdurle in nuove
aree, spesso per scopi commerciali.
Il trasporto passivo ad opera dell’uomo e’ considerato un fenomeno
molto diffuso (Albrecht, 1983; Holdich, 1988; Grandjean et al., 1997,
2000; Largiadièr et al., 2000). Per varie aree e’ stata ipotizzata una
introduzione recente, come per esempio l’Austria, dove sono note solo
poche popolazioni in Carinzia (Albrecht, 1981; Machino, 1997), o la
Corsica, dove si trova un’unica popolazione introdotta dalla Francia
meridionale
(Laurent,
1988).
Le
popolazioni
irlandesi
sono
apparentemente il risultato di introduzioni effettuate nel corso del XIX
secolo (Gerdstfeldt, 1859). La dimostrazione di introduzioni da parte
dell’uomo in un’area non permette tuttavia di escludere che la specie vi
fosse originariamente presente. Ad esempio per la penisola iberica una
colonizzazione recente ad opera dell’uomo e’ stata ipotizzata da Albrecht
(1983) e Laurent (1988) sulla base dell’assenza di segnalazioni antiche
della specie (cf per es. Aldrovandi 1642; Huxley, 1879). Secondo altri
autori, tuttavia, popolazioni autoctone e introdotte coesisterebbero in
quest’area (Balss, 1925; Matheus, 1937). In Portogallo, la presenza del
gambero in pochi affluenti del Duero nella parte nordorientale del
Portogallo sarebbe una conseguenza dell'introduzione negli anni ‘30
(Matheus, 1937). Una di tali popolazioni, relativamente abbondante nel
1996 (Machino, comunicazione personale), e’ risultata estinta nel 1999
(un solo esemplare morto rinvenuto, osservazione personale). La
presenza attuale di A. italicus in Portogallo resta pertanto molto incerta.
8
1.3 Ecologia
Il gambero di fiume puo’ essere definito un animale relativamente
solitario, a volte caratterizzato da un certo territorialismo. Manifesta
un’attivita’ prevalentemente crepuscolare e notturna, tuttavia esistono
notevoli differenze per quanto riguarda le singole specie. A. pallipes, A.
torrentium e As. astacus risultano essere esclusivamente crepuscolari
mentre altre specie come ad esempio As. astacus leptodactylus e
Procambarus clarkii (introdotto in Europa) sono attive anche di giorno.
I gamberi mostrano la tendenza a concentrarsi in gran numero in siti
favorevoli; anche laddove sono abbondanti, si possono osservare zone a
forte popolamento alternate a zone a popolamento scarso o nullo
(Arrignon, 1991).
La preferenza per un particolare sito rispetto ad un altro avviene in
funzione di fattori fisici quali la temperatura, l’illuminazione e la velocita’
della corrente, ma dipende anche dalla disponibilita’ di cibo e di rifugi.
Durante il periodo dell’accoppiamento questa tendenza si modifica
sensibilmente a causa dell'aumentare dell'aggressivita’ dei maschi.
Durante questo periodo gli individui (soprattutto i maschi) si disperdono in
misura notevole dai normali siti di stazionamento.
A. pallipes preferisce acque limpide e fresche, a corrente moderata,
con fondali rocciosi, ciottolosi o sabbiosi, ricoperti da lettiere di foglie morte
e rami e con sponde ricche di anfratti formati da rocce e grovigli di radici,
che possono offrire un’ottima rete di ripari. Si puo’ trovare da 0 ai 1200
metri sul livello del mare.
La’ dove i rispettivi areali si sovrappongono, e’ possibile che gamberi
appartenenti a specie diverse si incontrino. In particolare Laurent (1988)
fornisce una descrizione sulle relazioni interspecifiche tra A. pallipes e altre
specie. A. pallipes e A. torrentium sono sempre stati osservati in
parapatria. In Dalmazia essi coesistono nello stesso fiume, ma occupano
biotopi differenti: A. pallipes si trova nei fondali ciottoloso-sabbiosi e sugli
9
argini argillosi, mentre A. torrentium occupa i fondali rocciosi.
A. pallipes e As. astacus sono stati osservati nello stesso corso
d'acqua in Francia; anche in questo caso le due specie occupavano settori
differenti. A. pallipes si trovava nel tratto a monte, dove la pendenza era
maggiore, mentre As. astacus si trovava più a valle. Un tratto di 10 metri
separava le due popolazioni che sembravano evitarsi. Non sono mai stati
osservati fenomeni di ibridazione fra le due specie.
La superiorita’ competitiva dei gamberi esotici (Orconectes limosus,
Procambarus clarkii e Pacifastacus leniusculus) ha quasi sempre
provocato, dove sono stati introdotti, la scomparsa delle specie autoctone
(Mancini, 1986; Carral et al, 1993). Sono stati comunque osservati
fenomeni di ibridazione a livello sperimentale tra maschio di P. leniusculus
e femmina di A. pallipes; tuttavia non sono mai state ottenute progenie
vitali (Hogger, 1988). Ibridazione interspecifica e’ stata anche osservata fra
P. leniusculus e As. astacus. Anche in questo caso non si e’ mai osservata
progenie vitale (Hogger, 1988).
Cukerzis (1968), in un lavoro di ecologia comparativa fra As. astacus
e As. leptodactylus, ha descritto su base morfologica l’esistenza di forme
intermedie tra le due specie, ipotizzando che in natura avvengano incroci
interspecifici. Tentativi di incrocio sono stati effettuati a livello sperimentale
senza tuttavia ottenere progenie vitale (Guet & Roqueplo, 1995).
I gamberi di fiume sono onnivori. Il loro modo di nutrirsi, sebbene
opportunistico, evidenzia delle preferenze per alcuni tipi di cibo. Esse
possono variare con l’eta’, la stagione e lo stato fisiologico dell’animale.
Una certa differenza nelle preferenze alimentari esiste a livello
interspecifico, sebbene siano stati condotti a proposito pochi studi
comparativi. Essi si nutrono principalmente di molluschi ma anche di piccoli
roditori, tricotteri, larve, vermi, girini e piccoli pesci. Le alghe come Chara
ed Elodea costituiscono una parte importante della loro dieta, ma anche la
vegetazione terrestre e’ ben apprezzata; A. pallipes mostra di preferire
foglie cadute della vegetazione arborea.
10
Contrariamente all'opinione comune, i gamberi non mostrano una
particolare predilezione per la materia animale in decomposizione. Si
possono inoltre verificare fenomeni di cannibalismo in caso di scarsita’ di
risorse alimentari o di densita’ eccessiva di una popolazione (Arrignon,
1991; Laurent, 1988).
Una serie di prove effettuate sia sul campo che in laboratorio hanno
rivelato che mentre i giovani si nutrono principalmente di invertebrati
acquatici, gli adulti si cibano prevalentemente di alghe e di detriti vegetali.
Si pensa che questo cambiamento nel regime alimentare sia legato alla
crescita: le aumentate dimensioni rendono gli adulti meno agili con
conseguente aumento delle difficolta’ nella cattura delle prede (Mason,
1974).
Come precedentemente accennato, la temperatura ed il pH
costituiscono due importanti fattori limitanti che condizionano notevolmente
il ciclo vitale dei gamberi. I limiti massimo e minimo dei suddetti parametri
variano sensibilmente secondo le specie. A. pallipes sopravvive entro un
range di temperatura dell’acqua compreso tra 4°C e 23°C con un optimum
compreso tra 15°C e 18°C; necessita in ogni caso di temperature estive
dell’acqua superiori a 10°C in quanto sotto questa soglia diventa inattivo.
A. torrentium sopporta un range di temperatura più ristretto; tuttavia non si
conoscono i limiti esatti. As. astacus sopravvive a temperature comprese
tra 4°C e 24°C mentre As. leptodactylus presenta un range compreso tra
4°C e 26°C (Cukerzis, 1968).
Le crescenti emissioni di solfati e di ossidi di azoto derivati dalla
combustione di combustibili fossili sono responsabili dell’incremento delle
precipitazioni acide (pH 3-4) sull’Europa negli ultimi anni. Cio’ ha avuto un
considerevole effetto sull’acidita’ dei corsi d’acqua e dei bacini lacustri
(soprattutto scandinavi) con la conseguente progressiva scomparsa della
fauna acquatica. Tali effetti sono stati meno evidenti in quelle regioni dove
il potere tamponante delle rocce calcaree e’ riuscito a mantenere il pH dei
corsi d’acqua entro limiti accettabili (Arrignon, 1991). In funzione di questa
11
problematica, sono stati condotti esperimenti di tolleranza a condizioni
estreme di pH. La tollerabilita’ di A. pallipes si colloca entro limiti
relativamente ristretti di acidita’ (6,5-8,5), sebbene riesca a sopportare
condizioni estreme per brevi periodi. Le altre specie europee, As. astacus
e As. leptodactylus, manifestano una tolleranza maggiore rispetto a A.
pallipes: 4<pH<11 per As. astacus e 3<pH<12 per As. leptodactylus
(Cukerzis, 1968). Il valore ottimale per entrambe le specie e’ pH = 7.
Gli agenti inquinanti costituiscono un importante fattore di disequilibrio
per le popolazioni astacicole. L’impatto di questi inquinanti sui gamberi si
manifesta in diversi modi: morte improvvisa di un consistente numero di
individui, diminuzione della resistenza alle malattie, basso tasso di
riproduzione, bassa velocita’ di crescita.
L’inquinamento meccanico, rappresentato dal deposito di sedimenti
che occludono le tane e rimodellano il fondo, risulta tanto più importante
quanto maggiore e’ il suo impatto. In casi estremi tale impatto puo’ essere
tanto violento da eliminare completamente una intera popolazione, come
ad esempio in seguito allo sbarramento di un corso d’acqua o alla
cementificazione degli argini.
I gamberi sono generalmente più resistenti all’inquinamento organico
rispetto ai pesci; spesso la presenza di sostanze organiche in
decomposizione risulta addirittura compatibile con la vita normale
dell’animale. Tuttavia quando i valori superano una determinata soglia, i
gamberi rispondono spostandosi a monte della fonte inquinante.
L’inquinamento chimico risulta molto più dannoso. Sostanze come
nitrati, fosfati, insetticidi, erbicidi e pesticidi risultano tossici per il gambero
a concentrazioni appena superiori a quelle naturali (Arrignon, 1991).
1.4 Patologie
Gli studi sulla patologia dei gamberi si sono notevolmente intensificati
12
in parallelo ai tentativi di allevamento a scopo commerciale (Smith &
Söderhäll, 1986; Cerenius et al., 1987; Rantamäki et al., 1992). La
concentrazione in spazi ristretti favorisce generalmente l’insorgenza di
malattie. Gli agenti eziologici responsabili sono i più svariati; funghi, batteri,
protozoi e parassiti metazoi.
L’afanomicosi o “peste del gambero” rappresenta la più pericolosa
malattia per i gamberi europei. La mortalita’ in caso di infezione, e’
elevatissima. Come gia’ accennato, essa comparve in Europa nel 1860 e
precisamente in Italia probabilmente con l’introduzione di specie esotiche
dagli Stati Uniti. In pochissimi anni essa si diffuse nel resto del continente.
Essa colpì indiscriminatamente tutte le specie autoctone europee
causandone la scomparsa in estese aree in poco tempo (Ninni, 1866;
Mancini, 1986; Carral et al., 1993). L’agente patogeno (Aphanomyces
astaci) é un micete della famiglia Saprolegniacee. L’infezione si propaga in
acqua con le zoospore prodotte in gran numero in un intervallo di
temperatura abbastanza ampio (da 2 a 25 °C) e ad un pH compreso tra 6 e
7,5. Cio’ significa che l’infestazione puo’ durare tutto l’anno (Arrignon,
1991; Cerenius et al., 1987). A. astaci e’ un parassita obbligatorio e le
spore non resistono per più di due mesi nell’ambiente privo di gamberi
(Arrignon, 1993). Attualmente non esiste alcun metodo efficace per
combattere la malattia se non metodi di prevenzione, in quanto gli
antimicotici risultano generalmente tossici anche per i gamberi .In caso di
infezione l'unico rimedio resta l'isolamento e la distruzione degli individui
malati.
Altre micosi degne di nota sono quelle delle uova e la fusariosi
causata da Fusarium solani, che colpisce i muscoli del gambero. La
ruggine o “burn spot” si manifesta con delle delle ulcerazioni rosso-brune
sulla parte superiore dell’esoscheletro; questa forma di micosi e’ causata
da diversi miceti quali Ramularia astaci, Cephalosporium leptodactyli e
Oidium astaci (Arrignon, 1991).
13
La Theolaniosi, comunemente nota come “malattia della porcellana” a
causa della colorazione lattiginosa della muscolatura addominale, e’
causata dal microsporidio Thelohania contejeani. L’evoluzione della
malattia puo’ perdurare per diversi mesi e i soggetti affetti mostrano
riflessi rallentati a causa della rigidita’ della muscolatura infiltrata dai
microsporidi.
Le batteriosi setticemiche sono generalmente conseguenti alle micosi
o
a
condizioni
di
stress
ambientali.
Gli
agenti
eziologici
sono
microorganismi del genere Proteus (P. vulgaris, P. morganii e P.
aeruginosa); sono stati isolati anche Pseudomonas fluorescens e P.
putrida. In gran parte delle infezioni i batteri sono stati trovati solo
nell’emolinfa.
Spesso si possono osservarere sulla superficie dei gamberi piccoli
vermi simili a sanguisughe; si tratta di piccoli oligocheti appartenenti al
genere Branchiobdella. Essi presentano un apparato boccale a ventosa col
quale si attaccano all’ospite. Non si sa ancora bene se si tratta di parassiti
o di commensali. Tuttavia, quando l’infestazione delle branchie diventa
pesante, sembrano essere responsabili della morte dell’ospite (Arrignon,
1991; Gelder et al, 1994).
14
CAPITOLO 2.
MATERIALI E METODI
2.1 MATERIALI
Il campionamento di A. italicus ha interessato 80 località italiane più
o meno uniformemente distribuite dal massiccio del Pollino all’arco alpino,
cinque località iberiche, sei località elvetiche, una località austriaca, cinque
slovene e sei croate Sono state inoltre campionate numerose popolazioni di
A. pallipes dell’Italia nord-occidentale, due popolazioni francesi e una
britannica. Al fine di stabilire le relazioni filogenetiche tra le varie specie
appartenenti al genere Austropotamobius sono state incluse nella ricerca
sei popolazioni di A. torrentium provenienti da località italiane, austriache,
slovene e croate (Tab. 2 e Fig. 2). I campionamenti sono stati eseguiti in
gran parte con la tecnica della pesca a mano di giorno oppure nelle ore
notturne e con l'ausilio di luce artificiale; in alcune occasioni mediante l’uso
di nasse. Ciascun esemplare prelevato subisce di norma l'asportazione sul
posto dell'ultimo paio di pereiopodi, viene identificato per il sesso, misurato
in lunghezza con l'ausilio di un calibro e quindi viene rilasciato. Le appendici
sono immediatamente inserite in provette con tappo a vite di tipo Falcon,
numerate e poi immerse in azoto liquido; con questa metodologia si è
potuto evitare il sacrificio degli individui, appartenenti ad una specie
minacciata. Il materiale raccolto viene infine trasferito in congelatori regolati
a -80°C.
15
Tabella 2. Elenco delle popolazioni studiate
Cod. Località di campionamento
Corpo Idrico
Lat
Long
msl
N°
A. italicus
1 Redipollos, Castilla y Leon (E)
affuente del fiume Duero
43° 0’ N
5° 1’ W 1500
16
2 Orozco, Pais Vasco (E)
Rio Altube
43° 2’ N
2° 5’ W
800
20
3 Roncesvalles, Navarra (E)
Rio Tres Regatas
43° 1’ N
1° 2’ E
850
16
4 Santa Pau, Catalunya (E)
Riera del Can Font
42° 8’ N
2° 38’ E
400
12
5 Beceite, Aragón (E)
Rio Matarrana
40,5 N
0° 11’ E
800
52
6 Arroyo, Andalucia (E)
Rio Genil
37° 12’ N 3° 58’ W 1000
23
7 Las Illas, Pyrénées Orientales (F) Las Illas
42° 31’ N
2° 47’ E
700
50
8 Claro, Canton Ticino (CH)
affluente del Ticino
46°16' N
9°10' E
270
35
9 Cugnasco, Canton Ticino (CH)
affluente del Ticino
46°10' N
8°53' E
350
11
10 Contone, Canton Ticino (CH)
Canale Magadino
46°9' N
8°57' E
200
60
11 Meride, Canton Ticino (CH)
Torrente Gaggiolo
45°54' N
8°57' E
500
40
12 Montecrestese,Alta Val d’Ossola affluente del Toce
46°10' N
8°20' E
300
38
46°5' N
8°18' E
300
31
13 Siberia,Alta Val d’Ossola
affluente del Toce
14 Bracchio,Bassa Val d’Ossola
affluente Lago di Mergozzo
45°58' N
8°28' E
250
32
15 Bieno, Fondo Toce
Torrente Valle di Bieno
45°58' N
8°30' E
350
21
16 Casalzuigno,Prealpi Lombarde
Torrente Le Marianne
45°54' N
8°43'
300
38
17 Borgo Ticino, Pianura Padana
Rio affluente del Ticino
45°43' N
8°38' E
140
20
18 Trecate, Pianura Padana
Rio affluente del Ticino
45°26' N
8°44' E
140
9
19 Valle Imagna, Prealpi Orobie
Rio Santuario
45°50' N
9°31' E
450
70
20 S. Gregorio, Prealpi Bellunesi
affluente del Piave
46°7' N
12°3' E
500
10
21 Avasinis, Carnia
Torrente Leale
46°18' N
13°1' E
250
29
22 Vedronza, Prealpi Giulie
Torrente Vedronsazza
46°15' N 13°12' E
500
45
23 Clodig, Prealpi Giulie
Torrente Cosizza
46°10' N 13°35' E
200
16
24 Sterpo, Piana del Tagliamento
affluente dello Stella
45°54' N
13°4' E
17
20
25 Bottazzo, Carso Triestino
Torrente Rosandra
45°37' N
13°53' E
26 Rocchetta Tanaro, Monferrato
Rio Ronsinaggio
44°54' N
8°27' E
190
14
27 Sagliano, Oltrepo’ Pavese
affluente torrente Staffora
44°51' N
9°10' E
550
20
28 Casali, App. Ligure-Emiliano
affluente del Torrente Arda
44°42' N
9°44' E
550
34
29 Iggio, Appennino Emiliano
Torrente Rivarolo
44°46' N
9°51' E
450
27
30 Grognardo, Appennino Ligure
Torrente Visone
44°37’ N
8°31’ N
460
15
31 Ottone, Appennino ligure
Affluente Trebbia
44°38' N
9°20' E
510
20
32 Nirano, Appennino Emiliano
Torrente Fossa
44°30' N 10°44' E
200
17
33 Palazzolo S., App. Romagnolo
Torrente Senio
44°7’ N 11°33’ E
440
10
34 Badia di M., App. Romagnolo
Affluente Santerno
44°5’ N 11°26’ E
569
30
300
45
(continua)
16
Tabella 2 (continua)
Cod.Località di campionamento
Corpo Idrico
Lat
35 Ronta, Mugello
Fosso Farfereta
36 Ferrano, Valdarno
Long
msl
N°
44°0' N 11°35' E
350
30
Torrente Vicano
43°47' N 11°32' E
500
34
37 Papiano di Stia, Casentino
Torrente Staggia
43°39' N 11°43' E
460
40
38 Gubbio, Appennino Umbro
Torrente Chiascio
43°22' N 12°38' E
600
10
39 Bisignano, App. Marchigiano
Torrente Fluvione
42°51' N 13°21' E
800
11
40 Acquapendente, Alta Tuscia
Torrente Subbissone
42°44' N 11°52' E
425
12
41 Farnese, Alta Tuscia
Fosso Faggeta
42°35' N 11°42' E
300
30
42 V. Castellana, Monti della Laga
Torrente Castellano
42°45' N 13°30' E
630
30
43 Borbona, Monti Reatini
affluente del Velino
42°31' N
13°9' E
950
11
44 Borgo Velino, Monti Reatini
affluente del Velino
42°24' N
13°2' E
450
32
45 Campotosto, Monti della Laga
Rio Fucino
42°34' N 13°21' E 1200
40
46 Torricella in S., Monti Sabini
Fosso dei Molini
42°15' N 12°53' E
400
20
47 Oriolo Romano, Monti Sabatini
Fosso Mignone
42°10' N
12°6' E
300
22
48 Val di Varri, Monti Carseolani
Rio Val di Varri
42°11' N
13°8' E
750
3
49 Licenza, Monti Sabini
Rio Corto
42°4' N 12°54' E
400
20
50 Tagliacozzo, Monti Carseolani
Fosso Pratolungo
42°4' N 13°17' E
730
32
51 Rocca di Mezzo, Sirente-Velino
Rio Gamberale
42°13' N 13°30' E 1100
14
52 Caramanico Terme, Majella
affluente dell’Orfento
42°9' N
53 Roccaraso, App. Marsicano
affluente del Sangro
41°50' N
14°0' E
650
30
14°5' E 1200
6
54 S. Antonio di Polla, Valli di Diano affluente del Tanagro
40°31' N 15°29' E
450
13
55 Paterno, Monti della Maddalena
Torrente Cavolo
40°23' N 15°44' E
650
8
56 Pantano, Massiccio del Pollino
Torrente Battintiero
39°58' N
16°0' E
800
8
57 Foce, Massiccio del Pollino
Torrente Coscile
39°52' N
16°9' E
650
20
58 Gitchtal, Alpi della Gail (A)
affluenti della Gail
46°4' N 13°16' E
750
30
59 Breginj, Prealpi Giulie (SLO)
affluente del Natisone
46°16' N 13°25' E
500
40
60 Idrija, Carso (SLO)
Torrente Idrija
46°8' N 13°38' E
150
110
61 Cehovini, Carso (SLO)
affluente del Vipava
45°45' N 13°56' E
350
30
62 Odolina, Carso (SLO)
Torrente Obrov
45°41' N 13°56' E
700
10
63 Buzet, Istria (HR)
Torrente Rusnjak
45°25' N 13°55' E
250
47
64 Rijeka, Monti Fiumani (HR)
Torrente Recina
45°23' N 14°27' E
480
20
65 Donje Postinje, Dalmazia (HR)
Torrente Vrba
43°44' N 16°28' E
410
16
(continua)
17
Tabella 2 (continua)
Cod. Località di campionamento
Corpo Idrico
Lat
Long
msl
N°
52°50’ N
1°8’ E
20
10
44°5' N
3°40' E
600
21
45°37' N
8°3' E
550
8
44°7' N
8°2' E
343
24
A. pallipes
66 Norfolk, East Anglia (UK)
Wenson River
67 M.gne de l’Esperou, (F)
affluente del Coudoulous
68 Miagliano, Prealpi Biellesi
affluente del Cervo
69 Castelbianco, Appennino Ligure
Rio Pennavaira
A. torrentium
70 Tarvisio, Alpi Carniche
Rio dei Gamberi
46°32' N 13°36' E
900
10
71 Arnoldstein, Alpi Carniche (A)
Steinbach
46°33' N 13°43' E
850
30
72 Smarse-Sap, Alpi Giulie (SLO)
Torrente Zacurek
46°2' N 14°24' E
320
20
73 Lokve, Gorski Kotar (HR)
Torrente Mrzlica
45°24' N 14°38' E
600
34
74 Cabar, Alpi Giulie (HR)
Torrente Cabarna
45°36' N 14°38' E
500
4
75 Zagreb, Medvenica (HR)
Torrente Mrzlak
45°51' N 15°51' E
250
29
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Fig. 2. Localizzazione geografica delle popolazioni del genere Austropotamobius studiate.
#%
19
2.2 ANALISI ELETTROFORETICA DI SISTEMI GENE-ENZIMA
É stata studiata la variabilità di 22 enzimi codificati presumibilmente da
29 loci (Tab. 3) mediante elettroforesi orizzontale su gel di amido.Per la
preparazione dei gel si e’ impiegato amido della Connaught Laboratories
(Starch-hydrolyzed) disciolto in proporzione del 12% in un sistematampone
specifico per ogni enzima. La soluzione veniva riscaldata fino all'ebollizione,
quindi degassata tramite l'uso di una pompa a vuoto, versata in piastre di
plexiglass di 16 cm x 21,5 cm x 0,7 cm. Il gel veniva poi fatto raffreddare
per almeno 20 minuti.
Sono state utilizzate per l'analisi elettroforetica le porzioni muscolari
scheletriche presenti nelle appendici amputate e porzioni muscolari di altre
parti corporee come l'addome o il torace degli animali sacrificati. Queste
venivano omogeneizzate meccanicamente in due o tre gocce di un tampone
di estrazione: tris 0,2 M, pH 7, mercaptoetanolo 14 mM, ditioeritritolo (DTT)
10-3 M, EDTA 2 mM (modificato da Soltis et al., 1983). L'omogenato così
ottenuto veniva poi fatto assorbire da rettangolini (4x5 mm) di carta
Whatman n°3 che venivano successivamente inseriti in pozzetti praticati nel
gel mediante un pettine ad un'altezza variabile da 3 a 5 cm sul lato più
lungo della piastra.
Le piastre venivano quindi portate in una cella termostatata a 4°C
dove veniva eseguita l'elettroforesi. Tempi e voltaggi applicati e sistema
tampone utilizzato per i diversi enzimi utilizzati sono elencati in Tab. 4.
Terminata l'elettroforesi, il gel veniva tagliato orizzontalmente mediante un
filo di nylon; ciascuna fetta veniva quindi colorata per uno specifico enzima.
Le tecniche di colorazione utilizzate sono riportate in Tab. 5.
20
Tab. 3. Enzimi analizzati con i relativi loci codificanti, la migrazione elettroforetica (+
= anodica; - = catodica), i sistemi tampone utilizzati e durata della corsa
elettroforetica.
Enzymes
EEC
Glicerolo-3-fosfato deidrogenasi 1.1.1.8
Lattato deidrogenasi
1.1.1.28
Malato deidrogenasi
1.1.1.37
Migrazione Sistema
Loci
V/cm
Tampone
codificanti
+
+
+
+
+
+
+
Corsa
(ore)
Ref.
Isocitrato deidrogenasi
1.1.1.42
6-Fosfogluconato
deidrogenasi
Ottanolo deidrogenasi
Glyceraldeide-3-fosfato
deidrogenasi
1.1.1.44
G3pdh
Ldh
Mdh-1
Mdh-2
Idh-1
Idh-2
6Pgdh
1.1.1.73
Odh
+
5
8
5
c
1.2.1.12
Gapdh
+
8
4
d
Xantina deidrogenasi
NADH deidrogenasi
Superossido dismutasi
1.2.1.37
1.6.99.3
1.15.1.1
+
+
+
8
8
8
4
4
4
c
a
c
Aspartato aminotransferasi
2.6.1.1
5
8
6
b
Alanina aminotransferasi
Phosfoglicerato chinasi
Esterasi
2.6.1.2
2.7.2.3
3.1.1.1
5
3
2
8
8
8
6
4
3
b
f
d
Peptidasi (Leu-Ala)
Peptidasi (Leu-Gly-Gly)
3.4.11
3.4.11
3
6
8
8
5
5
f
f
Aldolasi
Anidrasi carbonica
Mannoso fosfato isomerasi
Glucosio fosfato isomerasi
Fosfoglucomutasi
4.1.2.13
4.2.1.1
5.3.1.8
5.3.1.9
5.4.2.2
Xdh
NADH-dh
Sod-1
Sod-2
Aat-1
Aat-2
Aat-1
Pgk
Est-1
Est-2
Pep-C
Pep-B1
Pep-B2
Pep-B3
Ald
Ca
Mpi
Gpi
Pgm-1
Pgm-2
3
3
1
1,2,3
3
3
2
2
1
8
8
8
8
8
4
4
3
3
4
d
e
e
c
a
+
+,–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1,6
1
4
8
8
8
4
4
4
d
a
b
3,7
8
4
b
4
8
4
b
*I sistemi tampone sono I seguenti: 1) Discontinous Ttris/Citrate (POULIK, 1957); 2) Continous
Tris/Citrate (SELANDER et al., 1971); 3) Tris/Versene/Borate (BREWER and SING, 1970); 4)
Tris/Versene/Maleate (BREWER and SING, 1970); 5) Discontinous Litium-Borate; SOLTIS et al.
(1983); 6) Phosfate-Cytrate; Harris (1966). **Riferimenti per le colorazioni: a) BREWER & SING (1970);
b) SHAW & PRASAD (1970); c) SELANDER & al. (1971); d) AYALA et al. (1972); e) HARRIS &
HOPKINSON (1976); f) RICHARDSON et al. (1986).
21
Tab. 4. Sistemi tampone (quantita’ di reagenti per litro di soluzione)
1. Tris/citrato discontinuo
(Poulik, 1957)
Tris 0,076 M, acido citrico
0,005 M, pH 8.2 (18,55 g di
ac. borico, 2,40 g di NaOH)
Tris 0,076 M , ac. citrico
0,005 M, pH 8.7 ( 9,21 g di
Tris, 1,05 g di ac. citrico)
2. Tris/citrato continuo
(Selander et al., 1971)
Tris 0,678 M, acido citrico
0,157 M, pH 8 (83,2 g di
Tris, 30 g di ac.citrico
monoidrato)
Tris 0,023M , ac. citrico
0,005 M, pH 8 ( 2,77 g di
Tris, 1,1 g di ac. citrico)
3. Tris/versene/borato I
(Brewer e Sing, 1970)
Tris 0,21 M, acido borico
0,15 M, EDTA 0,006 M, pH 8
(25,4 g di Tris, 9,27 g di ac.
borico, 2,20 g di EDTA)
Tris 0,021 M, ac. borico
0,02 M, EDTA 0,007 pH 8,6
(2,5 g di Tris, 1,24 g di ac.
borico, 0,25 g di EDTA )
4. Tris/maleato (Brewer e
Sing, 1970, modificato)
Tris 0,1 M, acido maleico 0,1
M, EDTA 0,01 M, MgCl2 0,015
Tampone elettrodi diluito
1:10, pH 7,2
M, NaOH 0,125 M, pH 7,2
(12,11 g di Tris, 11,61 g di
ac. maleico,3,72 g di EDTA,
3,05 g di MgCl2, 5 g di NaOH
5. Litio/borato discontinuo
(Soltis et al., 1985)
LiOH 0,038 M, acido borico
0,188 M pH 8.1 (1,6 g di LiOH,
11,6 g di ac. borico)
Tris 0,045 M, ac citrico 0,007
M, LiOH 0,004 M, ac. borico
0,019 M pH 8.3 (5,45 g di
Tris,1,28 g di ac. citrico in 900
ml, portare a volume con 100 ml
di tampone elettrodi 9:1).
6. Fosfato/Citrato
Citrato di sodio tribasico 0,15 M,
fosfato di sodio monobasico
0,24M pH 6,3 (44,11 g di citrato
di sodio, 32,12 g NaH2PO4)
Tampone elettrodi diluito
1:40, portare a pH 6,3 con
acido citrico 1M).
(Harris, 1966)
Tab. 5. Tecniche di colorazione
Enzima
EC 1.1.1.8 G3PDH
EC 1.1.1.28 LDH
EC 1.1.1.37 MDH
EC 1.1.1.42 IDH
EC 1.1.1.44 6PGDH
EC 1.1.1.73 ODH
EC 1.2.1.12 GAPDH
EC 1.2.1.37 XDH
EC 1.6.99.2 NADHdh
EC 1.15.1.1 SOD
EC 2.6.1.1 AAT
EC 2.6.1.2 ALAT
Tamp. di colorazione
coenzimi
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 50 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 50 ml
NAD 15 mg
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 50 ml
substrati
attivatori e/o inibitori
metodi di
visualizzazione
NAD 15 mg
α-glicerofosfato 300 mg
EDTA 50 mg
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
NAD 15 mg
idrossibutirrato 300 mg
NaCl 200 mg
NAD 15 mg
malato di sodio 1M pH 7
NADP 7
mg
NADP 7
mg
NAD 15 mg
DL-isocitrato 60 mg
NAD 15 mg
enzimi
EC 4.1.2.13 ALD 0,4 ml
gluconato-6- fosfato 20
mg
ottanolo 4 ml
etanolo 2 ml
fruttosio-1,6-difosfato 125
mg incubato con ALD
per 30'
ipoxantina 50 mg
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MgCl2 10 mg
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MgCl2 10 mg
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MTT 10 mg,
PMS 2 mg
Na arseniato 50 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MTT 1 mg
Menadione 25 mg
NADH 25 mg
EC 1.1.1.28 LDH 0,1 ml
ac. α-chetoglutarico 100
mg, ac. aspartico 200 mg,
pH 7,5 con Tris 1M
L-Alanina 200 mg, ac. αchetoglutarico 50 mg,
NADH 10 mg
piridossal-5'-P
10 mg
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
Fast Blu BB 100 mg
UV
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
Tab. 5 (continua)
Enzima
Tamp. di colorazione
EC 2.7.2.3 PGK
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
EC 3.1.1.1 EST
0,1 M NaHPO4; 0,1
EC 3.4.11 PEP
EC 3.4.11 P
EP
EC 4.1.2.13 ALD
EC 4.2.11 CA
EC 5.3.1.8 MPI
EC 5.3.1.9 PGI
EC 2.7.5.1 PGM
coenzimi
M KH2PO4 pH 5
150 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,1 M NaHPO4; 0,1
M KH2PO4 pH 5
150 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
0,05 M Tris/HCl
pH 8, 30 ml
enzimi
substrati
attivatori e/o inibitori metodi di
visualizzazione
EC 1.2.1.12 G3PDH 0,1 ml
EC 1.3.1.1 TPI 0,02 ml
EC 2.7.1.1 HK 0,02 ml
ac. 3-fosfoglicerico 30 mg
ATP 30 mg
NADH 10 mg
α+β-naftilacetato 50 mg
sciolto in 3 ml di acetone
MgCl2 40 mg
UV
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
Fast Garnet GBC
100 mg
EC 1.11.1.7 PER 0,03 ml EC
1.2.3.1 L-AO 0,05 ml
EC 1.11.1.7 PER 0,03 ml
EC 1.2.3.1 L-AO 0,05 ml
EC 1.2.1.12 G3PDH 0,1 ml
L-Leu-Ala 20 mg
O-dianisidina 10 mg
L-Leu-Gly-Gly 20 mg
O-dianisidina 10 mg
fruttosio-1,6-difosfato 125
mg incubato con ALD per
30'
4-metil-umbelliferil-acetato
10 mg in 1 ml di acetone
MnCl2 20mg
agar 8%
MnCl2 20mg
agar 8%
EC 1.11.1.7 PER 0,03 ml
EC 1.2.3.1 L-AO 0,05 ml
Na arseniato 50 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
UV
MgCl2 10 mg
NADP 7 mg
EC 1.1.1.43 6PGDH 0,02 ml mannosio-6-fosfato 25 mg
EC 5.3.1.9 PGI 0,02 ml
EC 1.1.1.43 6PGDH 0,02 ml fruttosio-6-fosfato 10 mg
NADP 7 mg
EC 1.1.1.43 6PGDH 0,02 ml glucosio-1-fosfato 160 mg
MgCl2 10 mg,
NADP 7 mg
MgCl2 10 mg
glucosio-1,6difosfato, tracce
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
MTT 10 mg,PMS 2 mg
agar 8%
24
Come in un precedente lavoro, gli enzimi con la stessa funzione
enzimatica, codificati da loci diversi (isozimi), sono stati numerati in ordine
decrescente a partire da quello più anodico, ad esempio Aat-1, Aat-2, e
così via. Per gli allozimi, cioè quegli enzimi che sono codificati da alleli
diversi dello stesso locus, è stata adottata una nomenclatura che esprime
la loro mobilità relativa in mm rispetto all’allele 100, ad esempio Odh85, ha
una mobilita’ di 15mm inferiore a quella di Odh100.in una corsa standard).
2.3 ANALISI DEL DNA MITOCONDRIALE
2.3.1 Estrazione del DNA
Il DNA totale è stato estratto da tessuto muscolare conservato a -80°C
secondo il metodo CTAB/fenolo-cloroformio modificato. Circa 200 mg di
tessuto per ogni individuo sono stati omogeneizzati in 500 µl di tampone di
estrazione CTAB [Tris HCl 0,1 M, pH 8; NaCl 1,4 M; EDTA 0,02 M; CTAB
(bromuro di hexadecyltrimetilammonio) 2%; 2-mercaptoetanolo 0,1%] e
digeriti con 5 µl di proteinasi K (20 mg/µl) a 45°C per 12 ore.
Successivamente si aggiungono 500µl di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico
(25: 24:1), si mantengono in agitazione per 5’ e poi si centrifugano per 15’, al
fine di separare la fase più pesante contenente i prodotti proteici della
digestione dalla fase acquosa che viene prelevata e messa in tubi puliti. Per
assicurare una separazione accurata tale passaggio si ripete due volte,
prima con fenolo: cloroformio: alcol isoamilico e poi in cloroformio assoluto.
Gli acidi nucleici contenuti nella fase acquosa vengono fatti precipitare a –
20°C con 1000 µl di etanolo assoluto in presenza di NaCl (7mM) e
successivamente sottoposti a centrifugazione (15’ per 13000 giri/minuto); un
ulteriore passaggio in etanolo al 70% permette di allontanare i sali residui.
Il pellet così ottenuto viene fatto asciugare e risospeso in 100 µl di TE (Tris
10 mM e EDTA 1 mM, pH 8).
25
Nelle metodiche applicate in seguito non ha interferito l’eventuale presenza
di RNA, pertanto non è stato necessario sottoporre la soluzione ottenuta a
trattamento con RNAasi.
2.3.2 Amplificazione mediante PCR
Il DNA estratto è stato sottoposto ad una reazione a catena della DNA
polimerasi (PCR, Saiki et al., 1988). Tale reazione permette di ottenere, a
partire da una soluzione molto eterogenea di acidi nucleici, un elevato
numero di copie di una specifica porzione di DNA. In questo studio sono
state amplificate due regioni mitocondriali codificanti rispettivamente per un
frammento di 490 bp per la citocromo I ossidasi individuata dai primers
specifici COX1768 (5’ GGC TTT CCC CCG AAT AAA TA 3’) e COX2220 (5’
AAC CTC TGG GTG ACC AAA AA 3’), e un frammento di 510 bp per la
subunità ribosomiale 16S, individuato dai primers degenerati modificati da
Palumbi (1996): D16SAR (5' CGC CTG TTT AHY AAA AAC AT 3’) e
D16SBR (5' CCG GTC TGA ACT CAG MTC AYG T 3’).
La reazione della PCR è avvenuta utilizzando un "termal cycler"
GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer), in 50 µl di soluzione con: 5-20
ng di DNA totale, 2,5 u di Taq DNA polymerase (Promega) con il tampone di
reazione fornito dal produttore, i due primers 0,2 µM, MgCl2 2,5 mM, dNTP
0,2 mM. Il programma di reazione, preceduto da una fase iniziale di 2’ a
94°C, è il seguente: 30’’ a 94°C, 45’’ a 49°C, 1’ a 72°C per 35 cicli, 10’ a
72°C.
Il prodotto di reazione è stato controllato sottoponendone 5 µl a
migrazione elettroforetica su gel d’agarosio al 2% in TBE (0,045 M Trisborato;0,001 M EDTA, pH 8) contenente 0,01% di bromuro di etidio e
visualizzato sotto luce ultravioletta.
2.3.3 Sequenziamento
Per ciascun esemplare, i frammenti di PCR di alcuni individui sono
stati purificati (PCR Purification kit, Qiagen), e sottoposti a sequenziamento
26
mediante sequenziatore automatico (modello A.B.I. Prisma 310, Perkin
Elmer). La soluzione per la reazione di sequenza avviene in un volume finale
di 10 µl e contiene 2 µl di ABI-mix per sequenziamento (Perkin Elmer), 1,2 µl
di primer (10 µM) e circa 50 ng di prodotto di PCR purificato; sono utilizzati
gli stessi primers della reazione di PCR.
Per ogni esemplare entrambi i filamenti sono stati sequenziati, in
modo da effettuare un accurato controllo della lettura della sequenza
mediante la procedura dell’allineamento e del controllo reciproco.
2.3.4 Analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione
Per estendere l’indagine a un maggior numero di individui rispetto a
quelli sequenziati si è cercato un set di enzimi di restrizione che presentasse
un pattern di digestioni polimorfico all’interno del frammento analizzato in
modo da poter caratterizzare, all’interno dei campioni a disposizione, i
principali aplotipi mitocondriali evidenziati sulla base delle sequenze. Tale
analisi e’ stata limitata al frammento per la citocromo I ossidasi. Gli enzimi di
restrizione utilizzati sono: Dde-I, Xsp-I e Acc-I (Tab. 6). La reazione di
digestione è stata condotta in un volume finale di 10 µl del tampone di
reazione fornito dal produttore, contenente 7,5 µl di prodotto di PCR, 1 µg di
BSA (acetato di siero albumina bovina) e 5 u di enzima. Alla miscela di
reazione sono state aggiunte alcune gocce di olio minerale per impedire
eventuali fenomeni di evaporazione e conseguenti variazione nelle
concentrazioni dei reagenti. Le digestioni sono avvenute in ambiente
termostatato, alla temperatura consigliata dal fornitore dell’enzima, per circa
12 ore , in modo tale da garantire il completamento della digestione.
Al termine della reazione sono stati aggiunti 2 µl di soluzione colorante
avente anche il ruolo di bloccare ulteriori processi digestivi; i frammenti
ottenuti sono stati separati ed individuati su gel d’agarosio al 3% e le
rispettive dimensioni sono state inferite attraverso il confronto con le bande
prodotte da un appropriato marcatore di peso.
27
Tabella 6. Enzimi di restrizione considerati e relativi siti di taglio.
ENZIMA DI RESTRIZIONE
SITO DI TAGLIO
Dde I
C’TNAG
Xsp I
C’TAG
Acc I
GT’(A/C)
2.4 ANALISI STATISTICHE
2.4.1 Dati allozimici
I dati ottenuti dalle analisi elettroforetiche sono stati utilizzati per
calcolare la variabilità genetica all’interno e tra le popolazioni e il
differenziamento genetico. L’elaborazione è stata eseguita mediante i
programmi Biosys (Swofford & Selander, 1981) e Genepop 2 (Raymond &
Rousset, 1995).
Equilibrio di Hardy-Weinberg
Per ogni campione (o gruppo di campioni), l’equilibrio di Hardy-Weinberg e’
stato verificato con il metodo del χ2e con il test esatto di Fisher (1970)- Stime
di linkage disequilibrium tra genotipi sono state ottenute tramite test esatti di
Fisher (1970) calcolati su tavole di contingenza costruite per coppie di loci.
L’ipotesi nulla che è stata verificata è che non ci fosse associazione tra
genotipi a loci diversi. Mediante il programma GENEPOP sono state
elaborate le tavole di contingenza su cui è stato applicato il test esatto di
Fisher per la stima
della probabilità dell’associazione di ogni coppia di loci attraverso tutti i
campioni.
28
Parametri di variabilità genetica
I parametri utilizzati sono i seguenti:
1)
Numero medio di alleli per locus (A):
A=
Nall
N loc
P=
X
N
con Nall numero totale di alleli e Nloc numero totale di loci.
2)
Percentuale di loci polimorfici (P):
dove X è il numero di loci polimorfici e N è il totale di loci esaminati. Un locus
è considerato polimorfico se presenta più di un allele e se la frequenza
dell’allele più comune non supera il 99% (criterio del 99%). Può anche
essere adottato il criterio di polimorfismo al 95%, in questo caso la frequenza
dell’allele più comune non supera il 95%.
Eterozigosi media per locus, osservata (Ho) e attesa . Quest’ultima viene
calcolata come:
He = −
3)
∑h
e
N loc
in cui, con xi uguale alla frequenza dell’allele i-esimo, he rappresenta la
percentuale di eterozigoti attesi ad ogni singolo locus in base all’equilibrio di
Hardy-Weinberg;
he = ∑ x i
2
Differenziamento genetico fra popolazioni
I livelli di divergenza o di identità genetica tra le popolazioni è stato stimato
mediante gli indici di distanza genetica standard di Nei (1972) e di distanza
della corda di Cavalli Sforza ed Edwards (1967).
Per valori relativamente bassi di distanza genetica (D<1), ed
assumendo un tasso costante di sostituzioni aminoacidiche per le varie
29
proteine, la distanza genetica secondo Nei risulta correlabile al tempo di
divergenza tramite una relazione lineare.
Nei (1975, 1987), ha proposto la seguente formula:
t=
D
2cnλ
dove t rappresenta il tempo relativo all’inizio dell’isolamento fra le due
popolazioni ancestrali, in seguito al quale si sarebbe verificata la loro
evoluzione indipendente; c è la proporzione di sostituzioni aminoacidiche
riconoscibili elettroforeticamente; n è il numero medio di aminoacidi per
proteina; λ corrisponde al tasso di sostituzione aminoacidica per sito per
anno. Una stima approssimativa di tali parametri porta alla formula t =
5·106D (Nei, 1975).
Cluster analysis
Per rappresentare le relazioni di affinità genetica tra le popolazioni
sono stati elaborati dei dendrogrammi (cluster analysis). In particolare è stato
usato il metodo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis, Sokal &
Sneath, 1963) sulla base della matrice di valori di distanza genetica di Nei
(1972) e con il metodo Neighbor Joining (NJ, Saitou and Nei, 1987).a partire
dalle distanze della corda di Cavalli Sforza e Edwards, 1967. Per queste
elaborazioni e’ stato usato il programma Phylip 3.572 (Felsenstein, 1995).
2.4.2 Analisi delle sequenze
Le sequenze sono state corrette e analizzate con il programma
Chromas e allineate con il programma ClustalX 1.81 (Jeanmougin et al.,
1998). Il numero di transizioni (ts) e transversioni (tv) e’ stato calcolato a
mano, mentre il numero di siti polimorfici, la composizione nucleotidica cosi’
come gli alberi di Neighbor Joining (NJ) (Saitou e Nei, 1987), e Massima
Parsimonia (MP) (Cavalli-Sforza & Edwards 1967) sono stati calcolati usando
il programma MEGA version 2.1 (Kumar et al. 2001). Gli alberi di NJ sono
stati ottenuti a partire da una matrice di distanze calcolata con il metodo di
30
Jukes-Cantor (1969) che da’ lo stesso peso a ts e tv. E’ stato osservato che,
nel caso in cui si abbia un set di sequenze con una distanza media totale
simile o inferiore a 0.05 (nel nostro caso 0.066 per COI e 0.026 per 16S), e’
consigliabile usare Jukes–Cantor in quanto garantisce un livello accurato di
stima delle distanze con una minore varianza rispetto a altre formule piu’
complesse per la distanza genetica (Nei & Kumer, 2000). Il metodo della
Massima Parsimonia (MP) opera direttamente dalle sequenze dei nucleotidi
per la ricostruzione di un albero che contenga il minor numero possibile di
cambiamenti evolutivi
Prima di operare l’analisi filogenetica con i due metodi sopra descritti, i
dati delle sequenze sono stati trattati con la procedura del bootstrap. Tale
metodo risponde all’esigenza di ridurre l’errore di campionamento presente
nel data set di sequenze, in modo da svincolare il più possibile la stima dal
caso particolare dei dati a disposizione. Il metodo del bootstrap crea delle
“pseudorepliche” del campione di sequenze iniziale, in modo da ottenere un
set di dati multipli e quindi comparare le stime ottenute dai diversi campioni.
Partendo da un data set multiplo, ciascuna procedura per l’analisi
filogenetica (NJ, MP) ha dato come risultato una serie di alberi; attraverso il
metodo del consenso è stato poi ottenuto un solo albero, in cui è stata
riportata la frequenza di ogni nodo che fosse presente in almeno metà degli
alberi del bootstrap.
Sono stati inoltre costruiti dei minimum spanning trees con il metodo
della ‘probabilità statistica’ (Templeton et al., 1992), con il Programma TCS
(Posada et al., 2000).
31
CAPITOLO 3
RISULTATI
3.1
STATUS ATTUALE DELLE POPOLAZIONI ITALIANE
Il primo censimento nazionale delle popolazioni italiane risale alla fine
del XIX secolo ad opera dell’allora Ministero dell’Agricoltura (Vinciguerra,
1899). Anche in quel rapporto veniva rimarcato il notevole decremento
rispetto a pochi decenni prima a causa di “straordinarie mortalità per cause
non bene identificate e probabilmente di natura molteplice, tra cui però
principale qualche infezione epidemica”. In Fig.3. i campioni riportati da
Vinciguerra vengono confrontati con quelli censiti dal presente studio e con
uno studio precedente di Albrecht, 1983. Le popolazioni censite da noi sono
evidenziate in rosso, quelle osservate da Vinciguerra sono indicate in nero: i
punti interrogativi indicano aree da noi non investigate e pertanto a presenza
incerta, mentre le X rappresentano aree censite dove non abbiamo ritrovato
gamberi. Nella figura sono inoltre mostrati campioni riportati da Albrecht
(1982).
Il confronto tra l’analisi distributiva fatta da Vinciguerra (1899) e quella
da noi effettuata negli ultimi cinque anni ha evidenziato una notevole identità
distributiva delle popolazioni italiane di A. italicus.In entrambe le distribuzioni
si osserva una presenza più marcata nei corsi d’acqua pralpini e una bassa
presenza in Pianura Padana. Lungo la penisola la sua presenza si mantiene
mediamente più elevata nei corsi d’acqua del versante adriatico rispetto a
quello tirrenico. Il limite meridionale della distribuzione e’ rappresentato dal
confine Calabro-Lucano. In particolare le popolazioni piu’ meridionali di A.
italicus da noi osservate sono localizzate nel massiccio del Pollino.
33
Gran parte delle popolazioni sono distribuite lungo i crinali alpini ed
appenninici; meno cospicua la presenza in pianura, dove sono state censite
pochissime popolazioni. Molte popolazioni della fine dell’800 venivano
descritte nei corsi d’acqua principali, oggi virtualmente privi di gamberi
residenti. Le popolazioni da noi censite sono state tutte individuate nei piccoli
tributari delle principali aste fluviali.
In Italia nord-occidentale sono state censite numerose popolazioni
nelle provincie di Genova ed Alessandria nell’ambito di studi di una zona di
parapatria tra A. pallipes e A. italicus escluse dal presente lavoro; in
quest’area il Vinciguerra descriveva una singola popolazione dell’alto Scrivia.
Diverse popolazioni da noi investigate lungo la fascia alpina sono di
modeste dimensioni e presumibilmente prossime all’estinzione mentre
alcune di dimensioni rilevanti sopravvivono ancora in Val d’Ossola e in
Canton Ticino. Popolazioni abbondanti sono state osservate nelle stazioni
dell’Italia nordorientale, particolarmente in Friuli, lungo il bacino dell’Isonzo,
nel Carso Sloveno e Triestino, mentre il campione dalmata era molto ridotto.
Un numero discreto di popolazioni è stato rilevato nei corsi d'acqua dell’alto
Lazio alcune delle quali relativamente abbondanti. In alcuni di essi, localizzati
in aree protette, sono state effettuati dei ripopolamenti nell’ambito di progetti
life natura.
In Sabina, nel passato ricca di gamberi, la rarefazione del gambero di
fiume è stata particolarmente significativa; il bacino del Velino del Turano e
del Tronto sono ormai virtualmente privi di popolazioni autoctone, mentre la
diffusione delle specie esotiche è in espansione. Nell'Agro reatino è stata
rilevata la presenza del gambero della Louisiana (Procambarus clarkii),
mentre nei laghi artificiali del Salto e del Turano convivono il gambero turco
(Astacus leptodactylus) e il gambero americano Orconectes limosus.
Due piccole popolazioni di A. italicus individuate nel 1995 in due affluenti
dell'alto Velino si sono estinte nell'arco di due anni. Altre tre popolazioni
34
attualmente oggetto di studio sono state localizzate in aree isolate e
scarsamente antropizzate del bacino Tevere-Farfa.
Anche in Abruzzo la rarefazione del gambero di fiume è stata
particolarmente significativa: fino a pochi decenni fa esso era ampiamente
distribuito lungo i principali bacini idrici, in particolare quelli dell'Imele-Salto,
dell'Aterno, del Pescara e del Sangro.
Scomparse ormai dai corsi principali, le popolazioni superstiti sono limitate a
quelli secondari e terziari.
Tra le numerose cause di rarefazione la più importante è certamente
l'inquinamento dei corpi idrici. Le analisi delle comunità macrobentoniche di
numerosi corsi d'acqua abruzzesi hanno rivelato livelli di inquinamento
incompatibili con le esigenze ecologiche del gambero di fiume. In numerose
occasioni sono state rilevate situazioni di inosservanza delle norme di tutela
ambientale quali scarichi abusivi o sistemi di depurazione inadeguati.
Un secondo fattore di rilevo è rappresentato dalla gestione delle acque
interne. Ad esempio nel corso superiore dell'Imele, dove sopravviveva una
discreta popolazione di gambero di fiume sono stati di recente interventi di
arginatura consistenti nell’escavazione degli argini e del letto del corso
d’acqua e nella totale eliminazione della copertura vegetazionale. Tale
intervento ha causato la totale eliminazione della popolazione residente nel
tratto interessato e la distruzione dell’habitat del gambero di fiume.
L’eliminazione della copertura vegetale e l’allargamento del letto fluviale
hanno inoltre provocato un sensibile innalzamento della temperatura
dell’acqua passata dalla media estiva di 16°C ai quasi 25°C nel mese di
luglio. L’esplorazione di un tratto ancora integro situato più a valle ha rivelato
una presenza modesta di gamberi adulti ma una modesta presenza di forme
giovanili.
Le osservazioni di numerose popolazioni italiane hanno confermato
che Austropotamobius italicus predilige corsi d’acqua di piccole e medie
dimensioni localizzati in aree integre, poco disturbate e ricche di calcare e
argille. Sono state messe in evidenza due principali tipologie di habitat
35
preferenziale: torrenti moderatamente ripidi con fondali rocciosi e ghiaiosi a
corso rapido più o meno ricchi di vegetazione acquatica; fossati a corso lento
caratterizzati da fondali sabbiosi e limacciosi, piuttosto ricchi di macrofite
acquatiche (Acorus calamus, Phragmites communis). Nella prima tipologia i
gamberi tendono a stabilirsi nelle pozze, ben riparate dalla vegetazione
riparia, dove la corrente è meno intensa nascondendosi tra i sassi o
scavando rifugi lungo le sponde argillose. Nella seconda tipologia di habitat
acquatico essi prediligono le ampie pozze che si formano lungo le anse ben
coperte dalla vegetazione arborea. Qui essi scavano i propri rifugi sulle
sponde più ripide.
36
3.2 ANALISI GENETICA A LIVELLO NUCLEARE: LOCI ENZIMATICI
Dei 29 loci enzimatici analizzati, 4: Mdh-2, Idh-1, Sod-1, Mpi sono
risultati monomorfici per uno stesso allele in tutti i campioni analizzati di
Austropotamobius italicus, A. pallipes e A. torrentium. Le frequenze alleliche
ai loci variabili sono mostrate in Tab. 7. Solo in tre casi e’ stato osservato uno
scarto significativo dall’equilibrio di Hardy-Weinberg a singoli loci, con un
deficit di eterozigoti nel campione #36 (Ferrano, Valdarno) per l’Aat-2
(D=0,352) e con un eccesso di eterozigoti nei campioni #19 (Valle Imagna,
Prealpi Orobie) per l’Idh-1 (D=0,310) e #25 (Bottazzo, Carso Triestino) per
l’Odh (D=0,429).
Undici loci mostrano alleli distinti in A. torrentium sia rispetto a A.
pallipes che a A. italicus (G3pdh104, Mdh-1127, Odh106, NADHdh104, Aat-298,
Pgk99, Pgm-292, Pgm-296, Est-195, PepC86, PepC96, Ca98, Ca108) mentre 6
discriminano A. pallipes dagli altri taxa (con gli alleli caratteristici G3pdh106,
Odh85, Aat-2104 Pgm-1105, PepC88, PepB-198).
I campioni di A. pallipes sono risultate notevolmente omogenee,
mentre nell’ambito di A. torrentium sono stati osservati due gruppi di
popolazioni, differenziati per l’Aat-1, Est-2, Ald e Ca. In Tab 7 sono mostrate
le frequenze alleliche di due campioni rappresentativi di ciascun gruppo,
Tarvisio (Friuli) e Lokve (Croazia). Nell’ambito di A. italicus, 9 loci: Mdh-2,
Idh-2, Sod-1, Aat-1, Est-1, PepB-2, Ald, Ca, Mpi, sono risultati monomorfici in
tutti i campioni analizzati, mentre 10: G3pdh, Ldh, Idh-1, 6Pgdh, Gapdh, Xdh,
NADHdh, Pgm-1, Pgm-2, Est-2, Gpi, hanno mostrato bassi livelli di
polimorfismo, con uno stesso allele piu’ frequente in tutte le popolazioni e
spesso l’unico presente. Il polimorfismo a questi loci riguardava infatti di volta
in volta solo alcuni (o uno solo) dei campioni analizzati, con frequenze
generalmente basse; solo nel caso di Idh-1, 6Pgdh, Pgm-2, e Alat la
frequenza del secondo allele osservato superava il 30% (Tab.7). I rimanenti
loci risultano differenziati tra popolazioni (o gruppi di popolazioni) di
37
A.italicus, spesso mostrando un andamento geografico, come mostrato nelle
cartine in Figg. 4-10.
Al locus Mdh-1 (Fig.4) l’allele 125 e’ stato osservato solo in Spagna,
con frequenze che raggiungono 0,58 in Aragona (#5), mentre tutte le altre
popolazioni sono caratterizzate dall’allele 100.
All’Odh (Fig.5) si caratterizzano per la presenza dell’allele 108
campioni orientali: del Carso triestino (#25), dei dintorni di Rijeka (#64) e
della Dalmazia (#65).
Alla Sod-2 (Fig.6), un gruppo di popolazioni del bacino dell’Isonzo
(#23, 59-61) si differenzia per avere l’allele 106, invece di 100, come piu’
comune o unico presente.
Per il locus Aat-2 (Fig.7) la situazione e’ piu’ complessa; in Spagna
prevale l’allele 95 nelle popolazioni del versante mediterraneo e il 102 in
quelle atlantiche; quest’ultimo caratterizza una vasta area, con i campioni del
Canton Ticino (#8-11), dell’Italia nord-occidentale (#12-31) e centrosettentrionale fino alle Marche (#32-38) e ha frequenze elevate nei campioni
del bacino dell’Isonzo (#23, 59-61) e delle Prealpi Giulie (#22); mentre l’allele
92 caratterizza campioni delle Prealpi Orobie (#19) e Bellunesi (#20), Carnia
(#21) e Rijeka (#64), prevale lungo le coste adriatiche rispettivamente fino
alla Dalmazia (#24, 25, 65), e fino a Gubbio lugo la costa, nonche’ in vari
campioni dell’Appennino Abruzzese; infine l’allele 100 prevale nei campioni
dell’Italia centro-meridionale (#39-57), e si ritrova anche in campioni dei
Pirenei orientali (]#7), della piana del Tagliamento (#24) e del Carso Triestino
(#25);
Alla Pgk (Fig.8) le popolazioni spagnole sono caratterizzate da una
frequenza elevata dell’ allele 94 (>0,44, tranne che in Andalucia, #6) e bassa
dell’allele 100 (0-0,22), mentre l’allele 98 supera il 50% nei campioni #1 e #5.
Quest’ultimo allele e’ fissato in campioni del Carso Triestino (#25) e Sloveno
(#62), a Rijeka (#64), in Istria (#63) e un singolo campione dell’Appennino
Emiliano (#32), mentre in genere non supera lo 0,30 nei campioni dell’Italia
nord occidentale e del Canton Ticino ed e’ assente nella maggior parte dei
38
campioni dell’Italia centro-meridionale, tranne che in quelli adriatici
marchigiani (#39, 42).
Al locus PepC (Fig.9) le popolazioni spagnole (#1-6), svizzere (#8-11)
e
dell’Italia
centro-settentrionale-occidentale
(#13-18,
26-37)
sono
caratterizzate dall’allele 90, quelli dell’Italia centro-meridionale e nordorientale, della Slovenia e della Croazia dall’allele 100, mentre alleli privati
112 e 104 sono stati osservati rispettivamente nei campioni del Carso
Sloveno (#62) e Rijeka (#64).
Al locus PepB-1 (Fig.10) l’allele 100 e’ l’unico presente nelle
popolazioni dell’Italia centromeridionale (#39-57) nei campioni del Carso
Sloveno (#62) e Rijeka (#64) e in due campioni rispettivamente
dell’Appennino Ligure (#30) e dei Pirenei Oientali francesi (#7). In tutti gli altri
e’ fissato o prevale l’allele 105.
Infine al locus PepB-3 (Fig.11) l’allele 100 e’ l’unico presente tranne
che in un gruppo dell’Italia centro-settentrionale (#32-37) dove e’ fissato
l’allele 92, e in un gruppo del bacino dell’Isonzo (#23, 59-61), dove e’ fissato
l’allele 96.
I valori di distanza genetica, calcolati con gli indici di distanza genetica
standard di Nei (1972) e di distanza della corda di Cavalli Sforza Edwards
(1967) sono riportati in Tab. 8. La distanza genetica media tra A.italicus e A.
pallipes (escludendo le popolazioni introgresse identificate in Liguria e
Piemonte, Santucci et al., 1997; Bondanelli et al., in prep.) e’ risultata
DNei=0,32 (range 0,25-0,41), mentre tra A. italicus e A. torrentium DNei=0,70
(range 0,63-0,81); tra A. pallipes e A. torrentium la media e’ DNei=0,83 (range
0,80-0,87). All’interno di A.italicus i valori di distanza genetica variano da 0 a
0,189, con una media di 0,082. La maggiore omogeneita’ genetica e’ stata
osservata per: il gruppo di popolazioni dell’Italia centrale e meridionale e tra
questo e due campioni disgiunti, rispettivamente dei Pirenei orientali e
dell’Appennino Ligure (DNei=0,003, range 0-0,01); un gruppo dell’Italia nordoccidentale e canton Ticino (DNei=0,008, range 0-0,03); un gruppo del bacino
dell’Isonzo (DNei=0,001, range 0-0,002). Valori lievemente superiori sono stati
39
osservati all’interno dei seguenti gruppi: (i) Spagna (DNei=0,02, range 0,0010,03), (ii) Italia nord-orientale, con campioni delle Prealpi Orobie, Bellunesi, e
della piana del Tagliamento (DNei=0,01, range 0,01-0,02), (iii) Appennino
Tosco-Emiliano (DNei=0,03); (iv) Carso sloveno e Rijeka (DNei=0,02).
Le relazioni di affinita’ genetica tra le popolazioni di A.italicus sono
mostrate dai dendrogrammi nelle Figg. 12 e 13, ottenuti rispettivamente con il
metodo UPGMA dalle distanze di Nei e con il metodo Neighbor Joining dai
valori di distanza della corda di Cavalli Sforza ed Edwards. Campioni
rappresentativi di A. pallipes e A. torrentium sono stati inclusi come outgroup.
Per quanto riguarda A. italicus, I due metodi coincidono nell’indicare tre
gruppi principali, rispettivamente comprendente: 1) campioni della Spagna,
Canton Ticino, Italia nord-occidentale e Appennino Tosco-Emiliano, con la
Spagna piu’ affine a campioni delle prime due regioni; 2), campioni dell’Italia
centro-meridionale, che si legano a campioni dalle Prealpi Orobie all’Italia
nord-orientale, Carso italiano e Sloveno, Istria, Dalmazia; 3) un gruppo del
bacino dell’Isonzo. All’interno di questi tre clusters vi sono alcune differenze
di topologia con i due metodi: ad esempio le popolazioni spagnole si legano
prima tra loro con l’UPGMA, mentre con il NJ due campioni spagnoli del
versante Atlantico si legano prima a un campione emiliano che agli altri
spagnoli; nell’ambito del gruppo 2, relativamente eterogeneo, i campioni del
Carso sloveno (62) e Rijeka (64) formano un cluster distinto con l’UPGMA
mentre si legano a due campioni del Carso Triestino (#25) e dell’Istria (#63)
con l’NJ; il campione di Gubbio (#38) si lega a queste ultime con il NJ, e a
campioni della piana del Tagliamento con l’UPGMA. I valori di bootstrap sono
comunque generalmente piuttosto bassi all’interno dei cluster principali,
mentre risultano piu’ elevati tra cluster. I tre cluster non vengono risolti con il
NJ, mentre il gruppo del bacino dell’Isonzo risulta il piu’ differenziato con
l’UPGMA.
I parametri di variabilita’ genetica osservati nelle popolazioni studiate
sono riportate in Tab. 9. I valori osservati sono notevolmente bassi. In
40
particolare per A. italicus i valori medi sono A=1,1; P99=8,1; P95=5,9;
Ho=0,021; He=0,022). Alcune popolazioni di questa specie sono risultate
monomorfe a tutti i 29 loci studiati, soprattutto nell’Italia peninsulare,
dall’Emilia alla Calabria (#31, 40, 48, 54, 55); altre, sempre in questa regione,
sono polimorfiche solo con il criterio del 99% (#28, 41, 44, 45). Valori di
polimorfismo superiori al 20% (con il criterio del 99%) sono stati osservati
solo nel campione delle Prealpi Orobie (#19, P99=24,1), e in uno dei Monti
Sabini (#P99=20,7) di eterozigosi sempre nel #19 (He=0,049), in alcuni
campioni del Carso (#25,43,62, con He tra 0,04 e 0,05) e della Spagna (#3,
4, 6, con He=0,04). In A. pallipes la variabilita’ genetica a livello dei marcatori
nucleari analizzati e’ prossima a zero, mentre in A. torrentium i valori sono
nel range di quelli osservati in A. italicus (A=1,1, P99=10,3, P95=5,1,
Ho=0,014, He=0,017)
I valori di FST, che misurano la diversita’ tra popolazioni, sono invece
generalmente elevati in A. italicus. Il valore complessivo e’ 0,78. Anche
all’interno di gruppi risultati omogenei a livello di distanze genetiche, i valori
di FST rimangono piuttosto elevati: per es. FST=0,16 tra il gruppo di
popolazioni dell’Italia centro-meridionale, piu’ quelle dei Pirenei orientali e del
Piemonte risultate ad esso affini; FST=0,25 per i campioni della Spagna, e
0,16 per quelli dell’Italia nord-occidentale e Canton Ticino (esclusa l’Emilia),
mentre FST =0,56 per tutto il cluster comprendente le popolazioni dall’Italia
centro-settentrionale alla Spagna evidenziato dai dendrogrammi. Anche per
le popolazioni dell’Italia nord-orientale i valori di FST sono in genere elevati:
mantenendosi superiori a 0,2. Per il cluster formato da Italia centromeridionale e orientale, Carso, Slovenia e Dalmazia il valore di FST e’ 0,63.
Solo per il cluster comprendente i campioni del bacino dell’Isonzo si ottiene
un valore basso di FST: 0,036.
A questi valori corrispondono livelli molto bassi di flusso genico,
generalmente inferiori a 1 (considerata come soglia al di sotto del quale si
puo’ avere differenziamento per deriva genetica, in assenza di selezione).
Superano tale soglia i gruppi dell’Italia nord-occidentale e del Canton Ticino
41
(Nm=1,32), dell’Italia centro-meridionale(Nm=1,29) e del bacino dell’Isonzo
(Nm=6,69).
Tab. 7- frequenze alleliche osservate nelle 59 popolazioni studiate di Austropotamobius italicus ai 25 loci variabili.
LOCUS
G3pdh
94
100
104
106
Ldh
92
95
100
Mdh-1
100
125
127
Idh-1
93
100
6Pgdh
96
100
103
Odh
85
100
106
108
Gapdh
100
110
Xdh
100
110
Nadh-dh
100
102
104
107
Sod-2
92
100
106
110
1
2
3
4
5
6
7
8,9,10
11
12,13 14,15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,95
0,00
0,05
0,00
1,00
0,00
0,00
0,16
0,84
0,00
0,00
0,00
0,96
0,00
0,04
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,72
0,28
0,00
0,70
0,30
0,00
0,69
0,31
0,00
0,78
0,22
0,00
0,42
0,58
0,00
0,82
0,18
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,32
0,68
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,98
0,02
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,02
0,98
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,70
0,00
0,30
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
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0,00
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Tab. 7 (continua)
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Pgk
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103
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88
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104
112
1
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3
4
5
6
7
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11
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17
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19
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Tab. 7 (continua)
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100
104
PepB3
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100
102
Ald
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17
18
19
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Tab. 7 (continua)
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1,00
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1,00
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1,00
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1,00
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1,00
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0,00
0,00
1,00
0,00
Tab. 7 (continua)
LOCUS
Aat-1
100
104
Aat-2
88
92
95
98
100
102
104
110
Pgk
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98
99
100
105
107
Pgm-1
97
100
105
Pgm-2
92
96
100
Est-1
95
100
Est-2
92
93
100
103
PepC
86
88
90
96
100
104
112
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
47
48
49
50
51
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1,00
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1,00
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1,00
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1,00
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1,00
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Tab. 7.(continua)
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102
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Tab. 7.(continua)
LOCUS
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Sod-2
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Tab. 7 (continua)
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104
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104
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Pgk
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Pgm-2
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Est-1
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Est-2
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103
PepC
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88
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1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,18
0,82
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,06
0,00
0,00
0,94
0,03
0,00
0,97
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,58
0,00
0,42
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,69
0,31
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,75
0,00
0,00
0,25
0,00
0,00
0,00
Tab. 7(continua)
LOCUS
PepB1
98
100
105
PepB2
100
104
PepB3
92
95
100
102
Ald
94
100
Ca
98
100
108
Gpi
100
103
Alat
90
100
108
110
61
62
63
64
65
66
67
69
70
73
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,03
0,97
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,94
0,00
0,06
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,96
0,05
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
Mdh-1
100
125
Fig. 4. Variazione geografica al locus Mdh-1 in A. italicus
Odh
100
108
Fig. 5. Variazione geografica al locus Odh in A. italicus
Sod-2
100
106
Fig. 6. Variazione geografica al locus Sod-2 in A. italicus
Aat-2
88
92
95
100
102
110
Fig.7. Variazione geografica al locus Aat-2 in A. italicus
Pgk
94
98
100
105
Fig. 8. Variazione geografica al locus Pgk in A. italicus
Pep-C
90
100
104
112
Fig. 9. Variazione geografica al locus PepC in A. italicus
PepB-1
100
105
Fig. 10. Variazione geografica al locus PepB-1 in A. italicus
PepB3
92
96
100
Fig.11. Variazione geografica al locus PepB3 in A. italicus
59
A. pallipes
100
51
A. italicus
91
A. torrentium
0.1
66-69
6
28
1
2
26
27
8-16
17
18
29
31
63
3
4
5
32
54
33
34
35, 36
47
7
30
43
66 50
53
49
57
45
44
40
41
39
42
62
64
65
22
20
52
19
38
21
24
55 25
63
23
100 60
59
61
70, 71, 72, 74
73, 75
Fig. 12. Dendrogramma UPGMA sulla base dei valori di distanza genetica di
Nei (1972) che mostra le relazioni di affinit genetica in campioni di
Austropotamobius italicus (1-65), di A. pallipes (66-69) e di A. torrentium (7075). I numeri sui nodi indicano i valori di bootstrap superiori a 50% (su 100
repliche). Per i codici dei campioni, vedi Tab. 3.
60
A. torrentium
70, 71, 72, 74
73, 75
A. pallipes
66-69
65
19
20
21
22
24
38
25
63
62
64
100
75
A. italicus
53
50
30
43
7
49
45
47
40
57
44
41, 48, 51, 54, 56
39
42
8-16
27
26
28
6
1
2
3
4
5
17
69 18
29
31
32
36
33
34-35
61
23
59
60
Fig. 13. Dendrogramma costruito col metodo Neighbor Joining sulla base dei valori
di distanza della corda (Cavalli-Sforza e Edwards, 1967) che mostra le relazioni di
affinit genetica in campioni di Austropotamobius italicus (1-65), A. pallipes (6669) e A. torrentium(70-75). I numeri sui nodi indicano i valoridi bootstrap superiori
a 50% (su 100 repliche). Per i codici dei campioni, vedi Tab. 3.
Tab. 8. Matrice dei valori di distanza genetica tra le popolazioni: la distanza genetica di Cavalli-Sforza (1967) è riportata sopra la diagonale; la distanza di Nei (1972) è
riportata sotto la diagonale.
Popolazioni
1
1 REDIPOLLOS (E)
2 OROZCO (E)
3 RONCESVALLES (E)
4 STA PAU (E)
5 BECEITE (E)
6 ARROYO (E)
7 LAS ILLAS (F)
8-16 C. TICINO (CH)
17 B. TICINO
18 TRECATE
19 V. IMAGNA
20 BELLUNO
21 AVASINIS
22 VEDRONZA
23 CLODIG
24 STERPO
25 ROSANDRA
26 R. TANARO
27 SAGLIANO
28 CASALI
29 PIANDOLO
30 VISONE
31 OTTONE
32 NIRANO
36 FERRANO
38 GUBBIO
41 FARNESE
40 ACQUAPEND.
47 ORIOLO
43 BORBONA
44 B. VELINO
49 LICENZA
42 CASTELLANO
39 BISIGNANO
48 VALDEVARRI
50 T TAGLIACOZZO
53 ROCCARASO
54 POLLA
55 PATERNO
57 FOCE
62 ODOLINA (SLO)
63 BUZET (HR)
64 RECINA (HR)
65 DONJE P. (HR)
-0.001
0.010
0.025
0.034
0.017
0.116
0.018
0.017
0.018
0.088
0.114
0.103
0.103
0.151
0.096
0.082
0.010
0.017
0.010
0.029
0.138
0.029
0.049
0.067
0.113
0.141
0.144
0.150
0.135
0.137
0.138
0.126
0.130
0.144
0.137
0.136
0.144
0.144
0.145
0.121
0.078
0.102
0.131
0.033
-0.007
0.022
0.030
0.020
0.114
0.018
0.017
0.018
0.085
0.111
0.101
0.100
0.149
0.094
0.078
0.009
0.016
0.015
0.027
0.136
0.027
0.045
0.064
0.110
0.138
0.141
0.147
0.133
0.135
0.135
0.123
0.127
0.141
0.135
0.134
0.141
0.141
0.143
0.116
0.074
0.098
0.129
0.096
0.083
-0.005
0.010
0.017
0.111
0.027
0.027
0.027
0.077
0.105
0.095
0.093
0.151
0.087
0.065
0.015
0.024
0.031
0.034
0.129
0.035
0.045
0.071
0.104
0.133
0.135
0.141
0.127
0.129
0.130
0.114
0.122
0.135
0.129
0.127
0.135
0.135
0.136
0.102
0.060
0.087
0.122
0.133
0.123
0.048
-0.005
0.013
0.112
0.038
0.039
0.039
0.075
0.102
0.092
0.090
0.156
0.085
0.065
0.028
0.036
0.043
0.045
0.127
0.046
0.059
0.082
0.101
0.131
0.132
0.139
0.124
0.127
0.127
0.112
0.122
0.132
0.126
0.125
0.132
0.132
0.134
0.103
0.061
0.091
0.120
0.142
0.139
0.073
0.061
-0.024
0.133
0.059
0.060
0.060
0.093
0.123
0.112
0.110
0.179
0.105
0.077
0.046
0.057
0.061
0.067
0.148
0.068
0.073
0.105
0.122
0.152
0.154
0.160
0.145
0.148
0.148
0.131
0.142
0.154
0.147
0.146
0.154
0.154
0.155
0.114
0.072
0.103
0.141
0.127
0.123
0.097
0.088
0.121
-0.103
0.022
0.023
0.023
0.077
0.095
0.085
0.088
0.145
0.078
0.084
0.023
0.025
0.016
0.034
0.119
0.034
0.074
0.070
0.094
0.123
0.125
0.131
0.117
0.120
0.119
0.115
0.117
0.125
0.119
0.117
0.125
0.125
0.126
0.125
0.083
0.112
0.113
0.299
0.290
0.296
0.297
0.324
0.283
-0.085
0.087
0.087
0.057
0.065
0.055
0.048
0.121
0.034
0.069
0.096
0.087
0.117
0.085
0.002
0.085
0.157
0.119
0.029
0.003
0.004
0.008
0.001
0.003
0.003
0.006
0.003
0.004
0.002
0.002
0.004
0.004
0.004
0.063
0.076
0.041
0.075
0.149
0.137
0.164
0.178
0.221
0.137
0.244
-0.000
0.000
0.070
0.082
0.072
0.076
0.118
0.065
0.091
0.006
0.000
0.020
0.003
0.104
0.002
0.063
0.038
0.080
0.106
0.109
0.114
0.101
0.103
0.105
0.107
0.101
0.109
0.103
0.102
0.109
0.109
0.110
0.135
0.092
0.116
0.098
60 IDRIJA (SLO)
61 CEHOVINI (SLO)
59 BREGINJ (SLO)
0.155
0.143
0.148
0.153
0.141
0.145
0.154
0.145
0.150
0.158
0.153
0.158
0.181
0.176
0.182
0.148
0.141
0.147
0.123
0.119
0.125
67 HERAULT (F)
0.299
0.294
0.279
0.279
0.292
0.306
70 TARVISIO
73 LOKVE (HR)
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0.632
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0.634
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0.695
0.634
2
3
4
5
6
7
8
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
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0.136
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-0.005
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0.110
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0.114
0.122
0.122
0.123
0.119
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0.100
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0.083
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0.001
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0.117
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0.123
0.111
0.116
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0.315
0.316
0.316
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0.322
0.321
0.410
0.308
0.260
0.296
0.306
0.775
0.709
0.708
0.647
0.710
0.648
0.710
0.648
0.720
0.657
0.708
0.646
0.718
0.656
0.698
0.636
0.703
0.642
0.708
0.645
0.700
0.638
0.704
0.642
0.707
0.646
Tab. 8 (continua)
Popolazioni
28
29
30
31
32
36
38
41
40
47
43
44
49
42
39
48
50
53
54
1 REDIPOLLOS (E)
2 OROZCO (E)
3 RONCESVALLES (E)
4 STA PAU (E)
5 BECEITE (E)
6 ARROYO (E)
7 LAS ILLAS (F)
8-16 C. TICINO (CH)
17 B. TICINO
18 TRECATE
19 V. IMAGNA
20 BELLUNO
21 AVASINIS
22 VEDRONZA
23 CLODIG
24 STERPO
25 ROSANDRA
26 R. TANARO
27 SAGLIANO
28 CASALI
29 PIANDO
30 VISONE
31 OTTONE
32 NIRANO
36 FERRANO
38 GUBBIO
41 FARNESE
40 ACQUAPEND.
47 ORIOLO
43 BORBONA
44 B. VELINO
49 LICENZA
42 CASTELLANO
39 BISIGNANO
48 VALDEVARRI
50 TAGLIACOZZO
53 ROCCARASO
54 POLLA
55 PATERNO
57 FOCE
62 ODOLINA (SLO)
63 BUZET (HR)
64 RECINA (HR)
65 DONJE P. (HR)
60 IDRIJA (SLO)
61 CEHOVINI (SLO)
59 BREGINJ (SLO)
0.109
0.125
0.167
0.185
0.208
0.136
0.282
0.118
0.119
0.121
0.289
0.302
0.292
0.295
0.339
0.291
0.294
0.140
0.135
-0.035
0.140
0.035
0.071
0.072
0.116
0.142
0.145
0.151
0.137
0.139
0.138
0.134
0.134
0.145
0.139
0.138
0.145
0.145
0.147
0.142
0.098
0.123
0.134
0.159
0.147
0.148
0.179
0.160
0.172
0.187
0.229
0.173
0.250
0.080
0.083
0.082
0.246
0.257
0.244
0.251
0.300
0.244
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0.079
0.174
-0.103
0.001
0.069
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0.106
0.109
0.114
0.100
0.102
0.105
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0.101
0.109
0.102
0.101
0.109
0.109
0.109
0.142
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0.124
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0.109
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0.332
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0.326
0.349
0.320
0.079
0.288
0.297
0.297
0.220
0.224
0.201
0.198
0.315
0.155
0.216
0.309
0.296
0.328
0.288
-0.103
0.177
0.136
0.028
0.002
0.002
0.006
0.000
0.002
0.002
0.005
0.003
0.002
0.000
0.001
0.002
0.002
0.002
0.067
0.076
0.046
0.074
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0.179
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0.063
0.061
0.246
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0.101
0.109
0.103
0.101
0.109
0.109
0.110
0.143
0.101
0.125
0.096
0.119
0.108
0.133
0.206
0.199
0.204
0.220
0.239
0.244
0.329
0.227
0.229
0.229
0.304
0.338
0.329
0.301
0.332
0.321
0.293
0.197
0.210
0.236
0.222
0.359
0.227
-0.033
0.153
0.179
0.182
0.189
0.174
0.176
0.177
0.151
0.159
0.182
0.177
0.175
0.182
0.182
0.184
0.142
0.098
0.123
0.171
0.156
0.145
0.113
0.248
0.235
0.245
0.254
0.287
0.239
0.286
0.179
0.182
0.182
0.296
0.302
0.291
0.282
0.296
0.288
0.322
0.202
0.184
0.237
0.176
0.319
0.171
0.152
-0.114
0.139
0.142
0.147
0.134
0.135
0.138
0.136
0.128
0.142
0.136
0.135
0.142
0.142
0.143
0.181
0.136
0.161
0.132
0.118
0.108
0.150
0.313
0.303
0.301
0.296
0.322
0.289
0.158
0.260
0.264
0.264
0.142
0.136
0.102
0.174
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0.141
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-0.040
0.041
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0.040
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0.032
0.039
0.041
0.026
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0.041
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0.060
0.050
0.063
0.039
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0.093
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0.332
0.322
0.323
0.321
0.345
0.313
0.078
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0.286
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0.231
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0.182
0.235
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0.287
0.317
0.276
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0.350
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0.178
-0.000
0.004
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0.000
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0.000
0.003
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0.000
0.000
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0.082
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0.102
0.341
0.331
0.330
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0.296
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0.252
0.231
0.203
0.327
0.181
0.234
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0.000
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0.000
0.003
0.003
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0.000
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0.113
-0.003
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0.005
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0.007
0.008
0.047
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0.308
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0.309
0.096
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0.284
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-0.002
0.004
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0.002
0.003
0.070
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0.132
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0.331
0.330
0.325
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0.319
0.091
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0.296
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0.000
0.083
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-0.003
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0.000
0.000
0.000
0.081
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0.138
0.135
0.128
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0.332
0.327
0.350
0.321
0.084
0.290
0.298
0.298
0.218
0.222
0.199
0.201
0.315
0.154
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0.311
0.300
0.329
0.289
0.042
0.292
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-0.000
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0.123
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0.296
0.296
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0.138
0.135
0.130
67 HERAULT (F)
0.321
0.315
0.314
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0.321
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0.314
0.321
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0.316
0.315
0.320
0.320
0.297
0.313
0.323
0.317
0.315
0.323
70 TARVISIO
73 LOKVE (HR)
0.715
0.653
0.710
0.648
0.783
0.717
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0.655
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0.652
0.715
0.653
0.733
0.670
0.789
0.722
0.790
0.724
0.813
0.744
0.781
0.715
0.787
0.721
0.781
0.722
0.769
0.703
0.777
0.711
0.790
0.724
0.787
0.720
0.782
0.716
0.790
0.724
Tabella 8 (continua)
Popolazioni
55
57
62
63
64
65
60
61
59
48
49
50
1 REDIPOLLOS (E)
2 OROZCO (E)
3 RONCESVALLES (E)
4 STA PAU (E)
5 BECEITE (E)
6 ARROYO (E)
7 LAS ILLAS (F)
8-16 C. TICINO (CH)
17 B. TICINO
18 TRECATE
19 V. IMAGNA
20 BELLUNO
21 AVASINIS
22 VEDRONZA
23 CLODIG
24 STERPO
25 ROSANDRA
26 R. TANARO
27 SAGLIANO
28 CASALI
29 IGGIO
30 GROGNARDO
31 OTTONE
32 NIRANO
36 FERRANO
38 GUBBIO
41 FARNESE
40 ACQUAPEND.
47 ORIOLO
43 BORBONA
44 B. VELINO
49 LICENZA
42 V. CASTELLANA
39 BISIGNANO
48 VALDEVARRI
50 TAGLIACOZZO
53 ROCCARASO
54 POLLA
55 PATERNO
57 FOCE
62 ODOLINA (SLO)
63 BUZET (HR)
64 RIJEKA (HR)
65 DONJE P. (HR)
60 IDRIJA (SLO)
61 CEHOVINI (SLO)
59 BREGINJ (SLO)
67 HERAULT (F)
70 TARVISIO
73 LOKVE (HR)
0.341
0.331
0.330
0.325
0.349
0.319
0.091
0.286
0.296
0.296
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0.252
0.231
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0.181
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0.298
0.326
0.286
0.063
0.290
0.358
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0.177
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0.000
0.083
0.071
0.036
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0.000
0.075
0.074
0.000
-0.000
0.081
0.083
0.051
0.084
0.138
0.135
0.148
0.323
0.790
0.724
0.344
0.335
0.333
0.328
0.352
0.322
0.102
0.290
0.300
0.300
0.250
0.256
0.235
0.208
0.330
0.187
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0.312
0.301
0.329
0.289
0.078
0.293
0.361
0.320
0.183
0.053
0.046
0.095
0.073
0.058
0.070
0.120
0.093
0.046
0.088
0.087
0.046
0.046
-0.082
0.084
0.052
0.085
0.138
0.135
0.141
0.321
0.784
0.718
0.322
0.319
0.313
0.312
0.320
0.336
0.244
0.344
0.344
0.344
0.230
0.278
0.257
0.290
0.363
0.240
0.204
0.321
0.331
0.344
0.341
0.238
0.344
0.344
0.377
0.234
0.262
0.262
0.275
0.236
0.263
0.255
0.206
0.249
0.262
0.236
0.230
0.262
0.262
0.265
-0.054
0.021
0.114
0.177
0.177
0.141
0.270
0.793
0.725
0.263
0.260
0.253
0.252
0.261
0.280
0.250
0.283
0.290
0.290
0.169
0.207
0.193
0.168
0.307
0.174
0.087
0.262
0.275
0.283
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0.240
0.290
0.282
0.327
0.202
0.255
0.254
0.268
0.241
0.257
0.252
0.211
0.244
0.254
0.241
0.237
0.254
0.254
0.259
0.222
-0.044
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0.121
0.120
0.187
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0.708
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0.296
0.294
0.299
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0.321
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0.322
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0.290
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0.261
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0.238
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0.297
0.309
0.317
0.314
0.205
0.322
0.316
0.351
0.229
0.212
0.217
0.229
0.201
0.213
0.212
0.169
0.192
0.217
0.205
0.202
0.217
0.217
0.222
0.172
0.202
-0.097
0.167
0.163
0.128
0.251
0.762
0.696
0.329
0.320
0.318
0.313
0.338
0.307
0.230
0.277
0.283
0.283
0.192
0.178
0.160
0.189
0.291
0.156
0.162
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0.284
0.318
0.276
0.218
0.276
0.351
0.316
0.167
0.238
0.238
0.252
0.218
0.240
0.234
0.233
0.249
0.238
0.217
0.213
0.238
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-0.114
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0.329
0.325
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0.314
0.322
0.328
0.033
0.315
0.317
0.318
0.310
0.322
0.311
0.307
0.322
0.322
0.325
0.360
0.304
0.348
0.288
0.060
-0.002
0.408
0.700
0.639
0.347
0.338
0.344
0.349
0.374
0.339
0.313
0.304
0.304
0.303
0.289
0.280
0.269
0.282
0.032
0.278
0.314
0.316
0.305
0.341
0.302
0.326
0.297
0.334
0.299
0.285
0.327
0.334
0.340
0.320
0.328
0.330
0.333
0.323
0.334
0.326
0.323
0.334
0.334
0.337
0.375
0.320
0.361
0.305
0.030
0.048
-0.415
0.709
0.647
0.457
0.455
0.451
0.451
0.456
0.467
0.473
0.473
0.473
0.473
0.458
0.452
0.474
0.470
0.524
0.470
0.444
0.456
0.456
0.473
0.468
0.467
0.473
0.473
0.502
0.475
0.473
0.473
0.474
0.473
0.473
0.475
0.460
0.466
0.473
0.474
0.473
0.473
0.473
0.474
0.448
0.442
0.443
0.473
0.529
0.521
0.529
-0.870
0.798
0.643
0.643
0.643
0.643
0.643
0.643
0.664
0.643
0.643
0.643
0.648
0.643
0.644
0.643
0.639
0.640
0.644
0.643
0.643
0.643
0.643
0.664
0.643
0.643
0.643
0.649
0.664
0.664
0.669
0.661
0.664
0.662
0.664
0.664
0.664
0.665
0.664
0.664
0.664
0.659
0.666
0.643
0.664
0.643
0.643
0.637
0.643
0.685
-0.148
0.626
0.626
0.626
0.626
0.626
0.626
0.648
0.626
0.626
0.626
0.631
0.626
0.627
0.626
0.622
0.623
0.627
0.626
0.626
0.626
0.626
0.648
0.626
0.626
0.626
0.632
0.648
0.648
0.653
0.645
0.648
0.647
0.648
0.648
0.648
0.649
0.648
0.648
0.648
0.643
0.650
0.626
0.648
0.627
0.626
0.620
0.626
0.669
0.334
--
64
Tab. 9. Variabilità genetica delle 87 popolazioni studiate. A = numero medio di
alleli per locus; P = percentuale di loci polimorfici con i criteri del P99 e del P95;
Ho = eterozigosi media osservata; He = eterozigosi media attesa. Per i codici dei
campioni, vedi Tab 2. Tra parentesi sono indicati i valori di deviazione standard.
POPOLAZIONE
A.italicus
1. Redipollos
2. Orozco
3. Roncesvalles
4. Sta Pau
5. Beceite
6. Arroyo
7. Las Illas
8-10. Canton Ticino
12-15. Val d’Ossola
16. Casalzuigno
17. B. Ticino
18. Trecate
19. Valle Imagna
20. S. Gregorio A.
21. Avasinis
22. Vedronza
23. Clodig
24. Sterpo
25. Bottazzo
26. R. Tanaro
27. Sagliano
28. Casali
29. Piandolo
A
1.1
(0.0)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.2
(0.1)
1.2
(0.1)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
1.2
(0.1)
1.0
(0.0)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.2
(0.1)
1.2
(0.1)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.0
(0.0)
1.1
(0.1)
P99
P95
Ho
He
6.9
6.9
6.9
6.9
10.3
10.3
10.3
10.3
10.3
10.3
13.8
10.3
13.8
10.3
6.9
3.4
6.9
3.4
6.9
3.4
3.4
3.4
3.4
3.4
24.1
17.2
3.4
3.4
10.3
6.9
10.3
10.3
6.9
3.4
13.8
10.3
13.8
13.8
3.4
3.4
6.9
6.9
3.4
0.0
10.3
3.4
0.034
(0.024)
0.034
(0.024)
0.030
(0.018)
0.035
(0.022)
0.038
(0.021)
0.052
(0.028)
0.025
(0.015)
0.016
(0.014)
0.016
(0.014)
0.016
(0.014)
0.015
(0.015)
0.017
(0.017)
0.048
(0.023)
0.020
(0.020)
0.010
(0.006)
0.027
(0.015)
0.018
(0.016)
0.034
(0.020)
0.048
(0.026)
0.021
(0.021)
0.020
(0.017)
0.003
(0.003)
0.012
(0.009)
0.033
(0.023)
0.034
(0.024)
0.046
(0.026)
0.042
(0.024)
0.037
(0.021)
0.045
(0.025)
0.031
(0.020)
0.016
(0.013)
0.016
(0.013)
0.016
(0.013)
0.014
(0.014)
0.014
(0.014)
0.049
(0.023)
0.018
(0.018)
0.010
(0.006)
0.039
(0.023)
0.022
(0.020)
0.034
(0.021)
0.044
(0.023)
0.026
(0.026)
0.018
(0.015)
0.003
(0.003)
0.013
(0.009)
(continua)
65
Tab. 9 (continua)
POPOLAZIONE
30. Grognardo
31. Ottone
32. Nirano
34. Badia di Moscheta
35. Ronta
36. Ferrano
37. Papiano di Stia
38. Gubbio
39. Bisignano
40. Acquapendente
41. Farnese
42. Valle Castellana
43. Borbona
44. Borgo Velino
45. Campotosto
46. Oriolo R.
48. Valdevarri
49. Licenza
50. Tagliacozzo
53. Roccaraso
54. Polla
55. Paterno
56. Pantano
57. Foce
A
P99
P95
Ho
He
1.1
(0.0)
1.0
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
1.1
(0.1)
1.2
(0.1)
1.1
(0.0)
1.1
(0.0)
1.1
(0.1)
1.0
(0.0)
1.2
(0.1)
1.1
(0.0)
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
1.1
(0.1)
6.9
3.4
0.0
0.0
6.9
3.4
6.9
3.4
6.9
3.4
6.9
3.4
6.9
3.4
10.3
10.3
10.3
10.3
0.0
0.0
3.4
0.0
13.8
10.3
13.8
3.4
6.9
0.0
6.9
0.0
10.3
6.9
0.0
0.0
20.7
6.9
6.9
6.9
3.4
3.4
0.0
0.0
0.0
0.0
3.4
3.4
10.3
3.4
0.016
(0.014)
0.000
(0.000)
0.006
(0.005)
0.004
(0.003)
0.004
(0.003)
0.004
(0.003)
0.004
(0.003)
0.037
(0.023)
0.027
(0.016)
0.000
(0.000)
0.003
(0.003)
0.041
(0.021)
0.017
(0.013)
0.006
(0.004)
0.034
(0.025)
0.022
(0.015)
0.000
(0.000)
0.019
(0.009)
0.020
(0.015)
0.014
(0.014)
0.000
(0.000)
0.000
(0.000)
0.005
(0.000)
0.010
(0.006)
0.015
(0.013)
0.000
(0.000)
0.006
(0.004)
0.006
(0.005)
0.006
(0.005)
0.006
(0.005)
0.006
(0.005)
0.034
(0.021)
0.027
(0.015)
0.000
(0.000)
0.003
(0.003)
0.038
(0.020)
0.018
(0.014)
0.006
(0.004)
0.030
(0.021)
0.023
(0.017)
0.000
(0.000)
0.018
(0.008)
0.020
(0.015)
0.016
(0.016)
0.000
(0.000)
0.000
(0.000)
0.005
(0.000)
0.010
(0.006)
(continua)
66
Tab. 9 (continua)
POPOLAZIONE
59. Breginj
60. Idrija
61. Cehovini
62. Odolina
42. Buzet
43. Recina
44. Donje Postinje
media
A
P99
P95
Ho
He
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
1.1
(0.0)
1.2
(0.1)
1.0
(0.0)
1.2
(0.1)
1.1
(0.1)
3.4
3.4
3.4
3.4
6.9
6.9
17.2
13.8
3.4
3.4
13.8
13.8
10.3
6.9
0.020
(0.020)
0.025
(0.025)
0.027
(0.022)
0.039
(0.021)
0.018
(0.018)
0.040
(0.020)
0.016
(0.012)
0.016
(0.016)
0.022
(0.022)
0.022
(0.017)
0.043
(0.023)
0.018
(0.018)
0.057
(0.030)
0.021
(0.015)
1,1
8,1
5,9
0,021
0,022
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
1.0
(0.0)
0.0
0.0
0.0
0.0
3.4
3.4
0.000
(0.000)
0.000
(0.000)
0.004
(0.004)
0.000
(0.000)
0.000
(0.000)
0.004
(0.004)
1,0
1,3
1,3
0,001
0,001
1.1
(0.1)
1.1
(0.1)
10.3
6.9
10.3
3.4
0.014
(0.008)
0.015
(0.011)
0.018
(0.012)
0.017
(0.013)
10,3
5,1
0,014
0,017
A.pallipes
69. Wenson
71. Herault
80. Castelbianco
media
A.torrentium
84. Tarvisio
87. Lokve
media
1,1
67
3.3 ANALISI GENETICA A LIVELLO MITOCONDRIALE
3.3.1 – Citocromo-ossidasi I
E’ stato sequenziato un frammento di 414 paia di basi per la subunita’ I
del gene mitocondriale della Citocromo Ossidasi (COI). Sono stati osservati
21 aplotipi diversi, di cui 18 in A. italicus (codificati come COI-A – COIQ), 1 in
A. pallipes (COI-R), e 3 in A. torrentium (COI-S – COI-U), per un totale di 83
siti variabili, di cui 70 filogeneticamente informativi e 23 presenti in un solo
aplotipo. Il frammento sequenziato comprendeva il 37,1% di T, il 17,2% di C,
il 23,3% di A e il 22,% di G. Le sequenze sono mostrate in Tab. 10.
Solo cinque delle 83 sostituzioni osservate determinavano un
cambiamento aminoacidico, di cui tre osservate solo in A. torrentium, una in
A. italicus e una in entrambe le specie. Delle sostituzioni osservate il numero
medio di transizioni (calcolato sulla base di tutte le possibili coppie di aplotipi)
e’ 12 (di cui solo una in prima posizione) e di transversioni e’ 1 (in terza
posizione). Il rapporto transizioni/transversioni osservato e’ di R=16,7 che è
un
valore
relativamente
alto.
Questa
osservazione
suggerisce
un
differenziamento recente delle varie linee evolutive.
All’interno della specie A. italicus sono stati trovati 17 aplotipi diversi con
45 posizioni variabili, di cui 37 presenti in almeno due genotipi. La loro
distribuzione geografica e’ riportata in Fig. 14. Il numero medio di transizioni
e’ 9. Le distanze genetiche calcolate secondo vari metodi con algoritmi di
diversa complessita’ danno valori medi molto simili (Jukes-Cantor 0.06 vs.
Tamura-Nei 0.058) come atteso nel caso di sequenze poco differenziate. Per
questo motivo nella costruzione dell’ albero Neighbor-Joining e’ stato
utilizzata la matrice di distanze di Jukes-Cantor i cui valori, data la maggior
semplicità dell’algoritmo, hanno una varianza minore. In Tab. 11 è riportata la
matrice delle distanze genetiche tra aplotipi calcolata con il metodo di
Tamura-Nei (sopra la diagonale) e quello di Jukes-Cantor (sotto la
diagonale).
68
Nelle Figg. 15 e 16 sono riportati i dendrogrammi costruiti con i metodi
Neighbor Joining (NP) e massima parsimonia (MP) rispettivamente. Da
un’analisi degli alberi e’ risultata chiara una separazione netta tra A.
torrentium, A. pallipes e A. italicus. Nell’ambito di A. italicus si evidenzia una
eterogeneita’, con almeno tre cluster principali evidenziati da entrambi i
metodi: il cluster (1) raggruppa gli aplotipi COI-A - COI-C e comprende i
campioni provenienti dalla Spagna (#1-3, 5-6, COI-A), dall’Appennino ToscoEmiliano (#32 e 37, COI-A), dall’Italia Nord Occidentale (#12, 16, 26, 31,
COI-B; #14, COI-C) e dal Canton Ticino (#8, 9, 11, COI-B); il cluster (2), con
gli aplotipi COI-D – COI-F, comprende i campioni del Carso Sloveno (#62,
COI-D), di Rijeka (#64, COI-D,COI-E), del Carso triestino (#25,COI-D) e il
campione delle Pealpi Orobie (#19, COI-F); il cluster (3), il piu’ eterogeneo
geograficamente, comprende almeno tre sottogruppi: (i) i campioni dell’Italia
centrale e meridionale (#42, 46, COI-G, #56 COI-H; #38, COI-I),
dell’Appennino Ligure (#30 COI-G), dei Pirenei orientali (#7, COI-G) e un
campione istriano (#63, COI-J), (ii) i campioni del confine italo-sloveno lungo
il bacino dell’Isonzo (#23, 59, 60, COI-K); (iii) i campioni friulani lungo la
piana del Tagliamento (#22, COI-N: #24, COI-N e COI-P; #21, COI-O) il
campione austriaco (#58, COI-Q) e, piu’ staccati, un campione della
Dalmazia (#65, COI-L) e del Carso Sloveno (#61, COI-M).
I valori di bootstrap dopo 500 repliche mostrano che i tre gruppi
principali hanno valori superiori a 80 (significa che quei nodi sono presenti
nell’80% delle repliche) con entrambi i metodi, le relazioni tra i gruppi, invece,
cambiano e in particolare il gruppo 2 si lega a 1 con il NJ (Bs 54) e a 3 con la
MP (Bs 65). Il risultato discordante tra i due metodi sembra indicare una
difficolta’ nel risolvere i rapporti filogenetici tra i tre gruppi. Per quanto
riguarda la topologia all’interno dei gruppi, vi e’ una discordanza all’interno
del cluster 3, con i campioni del Carso sloveno (#61, COI-M), quelli del
bacino dell’Isonzo (#23, 59, 60, COI-K) e quello della Dalmazia (#65, COI-L)
che non vengono risolti nell’albero MP.
69
I valori medi di distanza d all’interno dei gruppi, calcolati con la formula
di Jukes-Cantor per la COI, mostrano che il gruppo 3 (d 0,0213) e’ piu’
differenziato al suo interno dei gruppi 2 (d 0,0164 o d 0.0024 escludendo
VIM) e 1 (d 0,0032), come e’ da attendersi data la maggior eterogeneità
geografica dei campioni che lo compongono.
Le relazioni di affinita’ tra gli aplotipi osservati in A. italicus sono anche
state analizzate mediante un metodo di “parsimonia statistica” (Templeton et
al., 1992); i network ottenuti con un limite di confidenza del 95%
connettevano aplotipi che differivano per un massimo di 8 mutazioni; sono
stati così ottenuti tre cladogrammi distinti, corrispondenti ai tre cluster
principali evidenziati sopra, in quanto differivano tra loro per piu’ di 8 step. Il
singolo aplotipo delle Prealpi Orobie, che differiva per piu’ posizioni contigue,
non e’ stato inserito in nessuno dei network ottenuti. I minimum spanning
trees ottenuti per i tre gruppi principali sono mostrati in Fig. 17. Ogni linea
rappresenta una singola sostituzione; gli zeri rappresentano aplotipi
mancanti. Gli aplotipi terminali sono derivati da quelli piu’ interni.
Nell’ambito del gruppo 1, si evidenzia la posizione centrale (cioe’ piu’
ancestrale) dell’aplotipo COI-B (distribuito nei campioni dell’Italia nordoccidentale e del Canton Ticino) rispetto sia all’aplotipo COI-A (osservato in
Spagna e in Italia centro-settentrionale), sia l’aplotipo COI-C, osservato in un
campione dell’Italia centrosettentrionale (#14).
Il gruppo 2 comprende solo due aplotipi COI-D, il piu’ diffuso (Carso
Triestino #62, e Sloveno #25, Rijeka, #65), e COI-E (trovato a Rijeka insieme
a COI-D), separati da una singola sostituzione; si puo’ considerare derivato
l’aplotipo COI-E, trovato in un singolo campione.
Il gruppo 3 si conferma eterogeneo. Gli aplotipi piu’ vicini all’ipotetico
antenato comune (rappresentato da aplotipi centrali mancanti) sono quelli
della Dalmazia (COI-L), del Bacino dell’Isonzo (COI-K) e, relativamente piu’
staccato, un singolo campione del Carso Sloveno (#61 COI-K). Posizioni piu’
esterne (e quindi piu’ derivate) hanno da una parte l’aplotipo osservato nel
70
campione istriano (#63, COI-J) e quelli dell’Italia centro-meridionale, con COI
G (#42, 46) centrale rispetto sia a COI-H (#56) che a COI-I (#38); dall’altra il
gruppo di aplotipi osservati in campioni della piana del Tagliamento, COI-N –
COI-Q, con COI-N (osservato nel campione #22 delle Prealpi Giulie) centrale
rispetto a COI-O (#21, 22 ); da quest’ultimo derivano l’aplotipo COI-P (trovato
nel campione #22 insieme a COI-O) e l’aplotipo COI-Q, osservato nel
campione austriaco.
Dato l’elevato costo delle reazioni di sequenza, per poter analizzare
un maggior numero di campioni e’ stata condotta un’analisi su un set di 3
enzimi di restrizione, scelti in modo da discriminare i principali aplotipi. In
Tab. 12 sono riportate le posizioni di taglio e gli 11 aplotipi evidenziati
nell’ambito di A. italicus con questo approccio. La loro distribuzione
geografica e’ riportata in Fig. 14, insieme a quelli ottenuti mediante
sequenziamento. Alcuni aplotipi di enzimi di restrizione (indicati come RE
seguiti da una lettera minuscola) includono piu’ aplotipi di sequenza(indicati
come COI); in particolare, l’aplotipo REd non distingue tra COI-D e COI-E;
l’aplotipo REg non distingue tra COI-G, COI-H, COI-I, COI-J; l’aplotipo REk
include COI-K e COI-M. Tenendo conto di queste limitazioni, si puo’
comunque vedere che REa e’ presente in tutti i campioni analizzati della
Spagna e dell’Italia centro-settentrionale, e in alcuni individui del campione di
Las Illas, nei Pirenei orientali, dove la maggior parte degli esemplari
presentava aplotipo REg. L’aplotipo REb prevale nei campioni del Canton
Ticino e in quelli dell’Italia nord-occidentale; in questi ultimi e’ stato osservato
anche l’aplotipo REc, coesistente con REb in una stazione (#15). L’aplotipo
REd e’ stato osservato anche nel campione delle Prealpi Bellunesi (#20).
Tab. 10. Aplotipi osservati per una regione di 414 bp codificante per la citocromo ossidasi I in: Austrapotamobius italicus (A-Q), A. pallipes (R), e
A. torrentium (S, T).
COI-A
COI-B
COI-C
COI-D
COI-E
COI-F
COI-G
COI-H
COI-I
COI-J
COI-K
COI-L
COI-M
COI-N
COI-O
COI-P
COI-Q
COI-R
COI-S
COI-T
COI-U
ACATGAGATTTTGATTACTTCCGTTTTCTTTAACTCTATTATTAACTAGGGGGTTAGTGGAGAGGGGAGTTGGGACAGGGTGAACTGTCTACCCCCCTTTAGCATCAGCTATTGCTCACGCAGGGGCGTCTGTGGACCTGGGGA
.................................................................................................C..............................................
.................................................................................................C..............................................
.............G..G...............................................A..........................T..T.............................T........A.....A....
.............G..G...............................................A..........................T..T.............................T........A.....A....
................................................................A..........................T..T............................................A....
.............G........A...........C................................G.......................T..T................................A...........A....
.............G........A...........C......C.........................G.......................T..T................................A...........A....
.............G........A...........CT...............................G.......................T..T................................A...........A....
.............G........A............................................G........G..............T..T................................A...........A....
.............G........A............................................G........G.................T............................................A....
.............G........A............................................G.....A..G..............T..T.................................................
..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T............................................A....
..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T..C.........................................A....
..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T..C...................................T.....A....
..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T..C...................................T.....A....
..........C..G........A............................................G.....A.................T..T..C...................................T.....A....
.T.....G..............A............T.....C.......A..............A..G.....C.....A........T..T..G...C................C....................T.......
.......G........G.....A............T.................A....A...........G.....C...........T..T.....CC.G.....T...........T.....A..C.....A...T......
.......G........G.....A............T.................A....A...........G.....C...........T..T.....CC.G.....T...........T.....A..C.....A...T......
.T..A..G..............A............T.................A.G..A...........G..T..C..T...........T.....C........T.................A..C.....A..TT.A....
COI-A
COI-B
COI-C
COI-D
COI-E
COI-F
COI-G
COI-H
COI-I
COI-J
COI-K
COI-L
COI-M
COI-N
COI-O
COI-P
COI-Q
COI-R
COI-S
COI-T
COI-U
TTTTTTCACTTCATTTAGCGGGGGTATCTTCAATTTTAGGGGCGGTAAATTTTATAACTACAGCTATTAATATACGAAGGGTAGGGATAACCTTAGATCGAATACCTCTTTTTGTTTGATCCGTATTTATTACGGCAGTTCTTT
................................................................................................................................................
.............C..................................................................................................................................
...................A...........................................................A.........................................T......................
...................A...........................................................A.........................................T......................
...................A.....................................................G...G...CG......................................T......................
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C....
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C....
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C....
.............C........................................................C...........G..A..G.....G..........................T..............G..C....
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C....
.............C........................................................C........A..G.....G...C.G..........................T..............G..C....
......................................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C....
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C....
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C....
.............C...........G............................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C....
.............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C....
.........................T.....................................................A...........T.............................T...........A........C.
....C....................T.....................................G.........G..GG....G..A.....T.................C...........T...........A..G.......
....C..............A.....T...............................................G..GG....G..A.....T.................C...........T...........A..G.......
....C....................T..................................................GG.T..G..A.....T.............................T...........A..G.....C.
COI-A
COI-B
COI-C
COI-D
COI-E
COI-F
COI-G
COI-H
COI-I
COI-J
COI-K
COI-L
COI-M
COI-N
COI-O
COI-P
COI-Q
COI-R
COI-S
COI-T
COI-U
TACTTTTGTCTCTACCTGTATTAGCAGGTGCTATTACTATATTATTAACAGATCGTAATTTAAATACTTCATTTTTTGATCCTGCTGGGGGAGGAGACCCGGTTTTATATCAACACTTATTTTGGT
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
.......A.................................C..............................................A..G.......................T..........
.......A.................................C..............................................A..G.................C.....T..........
.......A.................................C..............................................A..G.................C.....T..........
.......A.....G.........................................C.............................G.......................C.....T..........
.......A.....G.........................................C.............................G.......................C.....T..........
.......A.....G.........................................C.............................G.......................C.....T..........
.......A...............................................C.............................G.......................C.....T..........
.......A.............................................................................G........G..............C.....T..........
.......A.............................................................................A........G..............C.....T..........
.......A................................................................................A....................C.....T..........
.......A...T.........................................................................A........G..............C.....T..........
.......A...T.........................................................................A........G..............C.....T..........
.......A...T.........................................................................A..T.....G..............C.....T..........
.......A...T.........................................................................A.......................C.....T..........
.......A........C...........G..........................G......................................G.....A..............T..........
.......A..AT....C........G...........C................................G..C..........................AA.......C..G..T..........
.......A..AT....C........G...........C................................G..C..........................AA.......C..G..T..........
.......A..GT.......G...............................................C....................A..G..G..T..TA..C....C.....T..........
CO I
DdeI+XspI+AccI
a
k
b
l
c
n
d
o
f
p
g
B
A
C
B
A A
Q
F
K
N
O
P
M
D
N
A D
D,E
I
G
J
G
G
A
L
G
A
H
A
Fig. 14. Distribuzione geografica degli aplotipi osservati mediante enzimi di restrizione (a-p) e mediante
sequenziamento (aplotipi COI A-Q).
Tabella 11 Matrice delle distanze genetiche tra aplotipi della COI calcolate con il metodo di Tamura-Nei (sopra la diagonale) e JukesCantor (sotto la diagonale) per A. italicus (COI-A – COI-Q), A. pallipes (COI-R) e A. torrentium (COI-S – COI-U)
Aplotipi COI-A
COI-B
COI-C
COI-D
COI-E
COI-F
COI-G
COI-H
COI-I
COI-J
COI-K
COI-L
COI-M
COI-N
COI-O
COI-P
COI-Q
COI-R
COI-S
COI-T
COI-U
COI-A
-
0.002
0.005
0.040
0.043
0.040
0.059
0.062
0.051
0.062
0.056
0.056
0.054
0.062
0.064
0.070
0.059
0.075
0.121
0.122
0.127
COI-B
0.002
-
0.002
0.043
0.046
0.043
0.062
0.064
0.054
0.064
0.059
0.059
0.057
0.059
0.062
0.067
0.056
0.078
0.118
0.119
0.124
COI-C
0.005
0.002
-
0.046
0.048
0.046
0.059
0.062
0.051
0.062
0.056
0.056
0.059
0.056
0.059
0.064
0.053
0.081
0.121
0.122
0.127
COI-D
0.040
0.042
0.045
-
0.002
0.025
0.059
0.062
0.057
0.062
0.062
0.062
0.049
0.062
0.062
0.064
0.056
0.083
0.131
0.125
0.120
COI-E
0.042
0.045
0.047
0.002
-
0.022
0.057
0.059
0.054
0.059
0.060
0.060
0.046
0.059
0.059
0.062
0.053
0.086
0.128
0.122
0.117
COI-F
0.040
0.042
0.045
0.025
0.022
-
0.060
0.062
0.057
0.062
0.057
0.063
0.049
0.062
0.065
0.067
0.059
0.089
0.121
0.116
0.114
COI-G
0.058
0.060
0.058
0.058
0.055
0.058
-
0.002
0.017
0.002
0.012
0.025
0.025
0.030
0.032
0.038
0.027
0.095
0.140
0.140
0.136
COI-H
0.060
0.063
0.060
0.060
0.058
0.060
0.002
-
0.020
0.005
0.015
0.027
0.027
0.033
0.035
0.040
0.030
0.092
0.143
0.143
0.139
COI-I
0.060
0.063
0.060
0.060
0.058
0.060
0.002
0.005
-
0.020
0.015
0.012
0.017
0.017
0.020
0.025
0.025
0.089
0.137
0.137
0.126
COI-J
0.055
0.058
0.055
0.060
0.058
0.055
0.012
0.015
0.015
-
0.015
0.027
0.027
0.033
0.035
0.040
0.030
0.092
0.137
0.137
0.133
COI-K
0.050
0.053
0.050
0.055
0.053
0.055
0.017
0.020
0.020
0.015
-
0.022
0.022
0.027
0.030
0.035
0.030
0.098
0.127
0.127
0.126
COI-L
0.055
0.058
0.055
0.060
0.058
0.060
0.025
0.027
0.027
0.022
0.012
-
0.017
0.015
0.017
0.022
0.022
0.086
0.137
0.137
0.129
COI-M
0.053
0.055
0.058
0.047
0.045
0.047
0.025
0.027
0.027
0.022
0.017
0.017
-
0.017
0.020
0.022
0.020
0.089
0.134
0.135
0.120
COI-N
0.060
0.058
0.055
0.060
0.058
0.060
0.030
0.032
0.032
0.027
0.017
0.015
0.017
-
0.002
0.007
0.007
0.092
0.137
0.138
0.123
COI-O
0.063
0.060
0.058
0.060
0.058
0.063
0.032
0.035
0.035
0.030
0.020
0.017
0.020
0.002
-
0.005
0.005
0.095
0.137
0.137
0.123
COI-P
0.068
0.066
0.063
0.063
0.060
0.066
0.037
0.040
0.040
0.035
0.025
0.022
0.022
0.007
0.005
-
0.010
0.097
0.140
0.140
0.123
COI-Q
0.058
0.055
0.053
0.055
0.053
0.058
0.027
0.030
0.030
0.030
0.025
0.022
0.020
0.007
0.005
0.010
-
0.095
0.134
0.134
0.126
COI-R
0.074
0.076
0.079
0.082
0.084
0.087
0.092
0.090
0.090
0.095
0.087
0.084
0.087
0.090
0.092
0.095
0.092
-
0.124
0.124
0.117
COI-S
0.117
0.115
0.117
0.126
0.123
0.117
0.135
0.137
0.132
0.123
0.132
0.132
0.129
0.132
0.132
0.135
0.129
0.120
-
0.005
0.083
COI-T
0.117
0.115
0.117
0.120
0.117
0.112
0.135
0.137
0.132
0.123
0.132
0.132
0.129
0.132
0.132
0.135
0.129
0.120
0.005
-
0.084
COI-U
0.123
0.120
0.123
0.117
0.115
0.112
0.132
0.135
0.129
0.123
0.123
0.126
0.117
0.120
0.120
0.120
0.123
0.115
0.082
0.082
-
74
COI-0 (21)
COI-NJ
COI-P (24)
COI-Q (58)
92
COI-N (22, 24)
COI-L (65)
!
COI-M (61)
99
COI-K (23, 50, 60)
COI-J (63)
55
COI-I (38)
90
A. italicus
98
95
70
COI-H (56)
COI-G (7, 30, 42, 46)
COI-A (1, 2, 3, 5, 6, 32, 37)
100
COI-B (8, 9, 11, 12, 16, 27, 31)
COI-C (14)
54
COI-F (19)
COI-D (62, 64, 25)
92
99
A. pallipes
COI-E (64)
COI-R (66, 67,68, 69)
COI-U 71, 72, 73, 75
A. torrentium
COI-T (74)
99
100
COI-S (70)
0.01
Fig. 15. Dendrogramma costruito con il metodo Neighbor-Joining sulla base delle
distanze di Jukes-Kantor per una regione di 414 bp di mtDNA codificante per la
subunita' I della Citocromo ossidasi (COI) che mostra le affinita' genetiche tra gli
aplotipi osservati in Austropotamobius italicus (COI-A -- COI-Q), A. pallipes (COI-R) e
A. torrentium (COI-S -- COI-U). Per le sigle vedi Tab. 2. Sopra i nodi sono indicati i
valori di bootstrap superiori al 50% dopo 500 repliche.
75
64
COI-MP
89
COI-0 (21)
COI-P (24)
COI-Q (58)
COI-N (22, 24)
COI-L (65)
!
COI-K (23, 50, 60)
98
COI-J (63)
COI-I (38)
74
92
56
COI-H (56)
COI-G (7, 30, 42, 46)
COI-M (61)
A. italicus
COI-F 19
82
83
97
COI-D (25, 62, 64)
COI-E (64)
COI-A (1,2,3,5,6,32,37)
COI-B (8,9,11,12,16,27,31)
98
72
A. pallipes
COI-C (14)
COI-R (66, 67, 68, 69)
99
A. torrentium
99
COI-S (70)
COI-T (74)
COI-U (71,72,73,75)
Fig. 16. Dendrogramma costruito con il metodo della Massima Parsimonia per una
regione di 414 bp di mtDNA codificante per la subunita' I della Citocromo ossidasi
(COI) che mostra le affinia' genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius
italicus (COI-A -- COI-Q), A. pallipes (COI-R) e A. torrentium (COI-S -- COI-U). Per le
sigle vedi Tab. 2. Sopra i nodi sono indicati i valori di bootstrap superiori al 50% dopo
500 repliche.
76
COI-B
COI-C
COI-D COI-E
COI-A
COI-M
!
COI-J
COI-P
COI-K
COI-I
COI-N
COI-G
COI-O
COI-H
COI-L
COI-Q
Fig. 17. Minimum spanning tree ottenuto con il metodo della "parsimonia statistica"
(Templeton et al., 1992) tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus una
regione di mtDNA codificante per la COI, . Le linee indicano una singola sostituzione; gli
zeri aplotipi mancanti. Per le sigle, vedi Tab.10.
Tab. 12. Aplotipi osservati sulla base dei siti di taglio di tre enzimi di restrizione Xsp I, Dde I, Acc I su una sequenza
di 414 bp del gene mitocondriale per la citocromo ossidasi uno (COI) in Austropotamotius italicus (REa-p). 0 =
assenza del sito di taglio; 1 = presenza del sito di taglio.
POSIZIONE DEI SITI DI TAGLIO (bp)
Xsp I
Aplotipi
Dde I
Acc I
47
100
139
99
159
237
89
134
REa
1
0
0
0
0
1
1
0
REb
1
0
0
1
0
1
1
0
REc
1
0
0
1
1
1
1
0
REd
1
0
1
0
0
1
0
1
REf
1
0
1
0
0
1
0
0
REg
1
0
1
0
1
0
0
0
REk
1
0
1
0
1
0
1
0
REl
1
0
0
0
1
0
0
0
REn
1
0
1
1
1
0
0
0
REo
1
0
1
1
1
0
1
0
REp
1
0
1
1
0
0
0
0
78
3.3.2 – Subunita’ 16S del RNA ribosomiale
Per il gene mitocondriale della subunita’ 16S del RNA risosomiale e’
stato sequenziato un frammento di 511 paia di basi, su un numero minore di
campioni rispetto alla COI. Sono stati osservati 15 aplotipi diversi, per un
totale di 62 siti variabili di cui 30 filogeneticamente informativi e 32 presenti in
un solo aplotipo. La loro sequenza e’ riportata in Tab.13. Di questi, 12 sono
stati osservati in A. italicus (16SA-16S-L), due in A. pallipes (16S-M, 16S-N)
e uno nell’unico esemplare di A. torrentium analizzato (COI-O). Il frammento
sequenziato comprendeva il 34,4 % di T, il 20,5% di C, il 34.1 % di A e l 11%
di G. Questi valori mostrano una netta preponderanza dei nucleotidi A e T,
gia’ osservata nel DNA mitocondriale di molti invertebrati. Sono state
osservate
50
transizioni
e
15
transversioni,
con
un
rapporto
transizioni/transversioni R di 4,4 che e’ di molto inferiore a quello osservato
per la citocromo ossidasi.
La matrice delle distanze genetiche calcolate con i metodi di JukesCantor e Tamura-Nei è riportata in Tab 14. Nelle Figg. 18 e 19 sono riportati i
dendrogrammi costruiti con il metodo Neighbor Joining (sulla base delle
distanze di Jukes-Cantor riportate in Tab.14) e massima parsimonia
rispettivamente. Le tre specie A. torrentium, A. pallipes e A. italicus formano
tre cluster ben differenziati, con una separazione piu’ antica di A. torrentium
rispetto alle altre due. Nell’ambito di A. italicus sono evidenti i tre gruppi gia’
osservati con la citocromo ossidasi. Anche in questo caso i campioni dei
gruppi 2 (Slovenia e Croazia occidentale, Carso triestino, Prealpi
Bergamasche) e 3 (con i sottogruppi: i Italia centrale e meridionale, un
campione istriano, uno dal Piemonte e uno della Francia sud-occidentale, ii
campioni del confine italo-sloveno lungo il bacino dell’Isonzo, iii campioni
friulani lungo il corso del Tagliamento hanno un progenitore in comune piu’
recente rispetto al gruppo 1 (Appennino Tosco-Emiliano, Italia Nord
Occidentale, Canton Ticino e Spagna).
79
Il metodo di massima parsimonia ha prodotto 117 alberi con lo stesso
numero di passaggi evolutivi o “step” e con diversi valori di bootstrap da cui
e’ stato ricavato un albero di consenso riportato in figura 19. L’albero di
consenso (in cui sono riportati solo i nodi con valori di bootstrap superiori al
50%) di massima parsimonia, ottenuto con il 16S, mostra un basso livello di
risoluzione per i nodi piu’ esterni, cioe’ per i fenomeni evolutivi avvenuti piu’
recentemente fenomeno che e’ stato osservato anche con la COI.
I valori medi di distanza d all’interno dei gruppi, calcolati con la formula
di Jukes-Cantor per il 16S, mostrano che il gruppo 1 (d 0,0058) e’ il piu’
differenziato seguito dal 3 (d 0,0035) e 2 (d 0,0020). Questo risultati
contrastano da quelli osservati per la COI soprattutto per il maggiore
differenziamento del gruppo 1 in cui sono stati saggiati sostanzialmente gli
stessi campioni con i due marcatori.
E’ stato inoltre costruito un minimum spanning tree con il metodo della
‘parsimonia statistica’ (Templeton et al., 1992), mostrata in Fig. 20. E’ stato
ottenuto un singolo network con un limite di confidenza del 95%, questo
connetteva tutti gli aplotipi, che differivano per un massimo di 9 mutazioni.
Dei tre clusters evidenziati nelle analisi precedenti, il cluster 3 risulta piu’
vicino all’ipotetico antenato comune, differendo per un solo step dall’aplotipo
mancante centrale; per i cluster 2 e 3 e’ necessario ipotizzare 5 step.
Essendo questa regione piu’ conservativa, le relazioni nell’ambito del cluster
3 non sono risolte chiaramente.
Tab. 13. Aplotipi osservati per una regione di 511 bp codificante per l’rRNA 16S mitocondriale in: Austrapotamobius italicus (A-L), A. pallipes
(M, N), e A. torrentium (O).
16S-A
16S-B
16S-C
16S-D
16S-E
16S-F
16S-G
16S-H
16S-I
16S-J
16S-K
16S-L
16S-M
16S-N
16S-O
AAAATTTTAAAGGTCGAACAGACCTTCTATTATAGTTTCTGCTCCATAAAGAACTTTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAACTCTCCTGTTGATAAGAACTCTTAAAGAAAATTACGCTGTTATCCCTAAAGTAACTTAACC
...........................................................T.................................................................................
.............................................................................................................................................
..................................................................................T......C...................................................
..................................................................................T......C...................................................
...................................................................................C.T.A.C...................................................
...................................................................................C.T...C...................................................
..................................................................................T..T...C...................................................
..................................................................................T..T...C...................................................
..................................................................................T..T...C...................................................
..................................................................................T..T...C...................................................
..................................................................................T..T...C...................................................
....A.......................G........................................................T...C...................................................
....A.......................G........................................................T...C...................................................
............................T...............T........T............................T..T...C................A................................T.
16S-A
16S-B
16S-C
16S-D
16S-E
16S-F
16S-G
16S-H
16S-I
16S-J
16S-K
16S-L
16S-M
16S-N
16S-O
TTCTTTCCCTAATTAGGATCTTTTACTCAAACACCTCTGTAAAAAAAAAGAAACAGTTATCTTTTATTATATTCCTATCACCCCAATAAAATATTTAAAAATAGCCTTCTCATACAAAATTAATTAATATTTTTAAAATAT
.............................................................................................................................................
.........................T..............................................................................T....................................
................................................-..............C........C....................................................................
................................................-.......................C....................................................................
..........T.........C...................................................C....................C.......C.A.....C....T..........................
..........T.........C...........................-.......................C....................C.......C.A.....C....T..........................
..........T.........C...................................................C....................C.........A..C..................................
..........T.........C...........................-.......................C....................C.........A..C..................................
..........T.........C...................................................C.T..................C.........A......T..............................
..........T.........C...................................................C.T..................C.........A.....................................
..........T.........C...........................-.......................C....................C.........A......T..............................
..........T.........A..........T.T.................G....................C....................C.C.....A.AA.C...T........C..G..................
..........T.........A..........T.T..............-..G....................C....................C.C.....A.AA.C...T........C..G..................
..........T.CC...T..A...G......T.TTAT.....T.....-A.G.......CT.A.....T...C.T..................C.........AA.C..C..C.............T.....C-.......
16S-A
16S-B
16S-C
16S-D
16S-E
16S-F
16S-G
16S-H
16S-I
16S-J
16S-K
16S-L
16S-M
16S-N
16S-O
AAAGTTTTATAGGGTCTTATCGTCCCCCTAGAAAATTTAAGCCTTTTCACTTAAAAGTTAAATTCAATATTTTTGCTCGAGACAGCTTATCTCTTGTCCAACCATTCATACCAGCCTTCAATTAAAAGACTAATGATTATG
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
...............................G.............................................................................................................
...............................G.............................................................................................................
............................C..G.............................................................................................................
............................C..G.............................................................................................................
............................C..G.............................................................................................................
............................C..G.............................................................................................................
............................C..G.............................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.................................G........................................A..TA....................G.........T.......C.......................
16S-A
16S-B
16S-C
16S-D
16S-E
16S-F
16S-G
16S-H
16S-I
16S-J
16S-K
16S-L
16S-M
16S-N
16S-O
CTACCTTAGCACGGTCATAATACCGCGGCCTTTTAAATCTCAATGGGCAGGTTAGACTTTATATACCTCTCATATAGACATGTTTTTG
........................................................................................
........................................................................................
........................................................................................
........................................................................................
.........................................................C..............................
.........................................................C..............................
........................................................................................
........................................................................................
........................................................................................
........................................................................................
........................................................................................
.................................................................T......................
.................................................................T......................
.................................C......................................................
Tab. 14. Matrice delle distanze genetiche tra gli aplotipi del gene 16S calcolate secondo il metodo di TamuraNei (sopra la diagonale) e Jukes-Cantor (sotto la diagonale) per A. italicus (16S-A - 16S-L), A. pallipes (16S-M
e 16S-N) e A. torrentium (16S-O).
Aplotipi 16S-A 16S-B 16S-C 16S-D 16S-E 16S-F 16S-G 16S-H 16S-I
16S-J
16S-K 16S-L
16S-M 16S-N 16S-O
16S-A
-
0,002
0,004
0,008
0,006
0,028
0,026
0,022
0,024
0,022
0,022
0,022
0,041
0,041
0,094
16S-B 0,002
-
0,006
0,010
0,008
0,030
0,028
0,024
0,026
0,024
0,024
0,024
0,043
0,043
0,097
16S-C 0,004
0,006
-
0,012
0,010
0,033
0,031
0,026
0,029
0,026
0,026
0,026
0,043
0,043
0,097
16S-D 0,008
0,010
0,012
-
0,002
0,028
0,026
0,018
0,020
0,018
0,018
0,018
0,041
0,041
0,090
16S-E 0,006
0,008
0,010
0,002
-
0,026
0,024
0,016
0,018
0,016
0,016
0,016
0,039
0,039
0,087
16S-F 0,028
0,030
0,032
0,028
0,026
-
0,002
0,018
0,020
0,018
0,018
0,018
0,041
0,041
0,092
16S-G 0,026
0,028
0,030
0,026
0,024
0,002
-
0,016
0,018
0,016
0,016
0,016
0,039
0,039
0,090
16S-H 0,022
0,024
0,026
0,018
0,016
0,018
0,016
-
0,006
0,000
0,004
0,004
0,032
0,032
0,080
16S-I
0,022
0,024
0,026
0,018
0,016
0,018
0,016
0,000
-
0,006
0,002
0,002
0,034
0,034
0,083
16S-J
0,024
0,026
0,028
0,020
0,018
0,020
0,018
0,006
0,006
-
0,004
0,004
0,032
0,032
0,080
16S-K 0,022
0,024
0,026
0,018
0,016
0,018
0,016
0,004
0,004
0,002
-
0,004
0,037
0,037
0,080
16S-L
0,022
0,024
0,026
0,018
0,016
0,018
0,016
0,004
0,004
0,002
0,004
-
0,032
0,032
0,085
16S-M 0,040
0,042
0,042
0,040
0,038
0,040
0,038
0,032
0,032
0,034
0,036
0,032
-
0,000
0,083
16S-N 0,040
0,042
0,042
0,040
0,038
0,040
0,038
0,032
0,032
0,034
0,036
0,032
0,000
-
0,083
16S-O 0,092
0,094
0,094
0,087
0,085
0,090
0,087
0,079
0,079
0,081
0,079
0,083
0,081
0,081
-
82
55
67
16S-NJ
50
16S-L (21, 22, 24)
16S-K (65)
71
!
16S-J (23, 59)
16S-I (30)
85
16S-H (39, 41, 42, 57)
16S-G (25)
A. italicus
99
95
16S-E (12)
77
98
A. pallipes
A. torrentium
16S-F (62)
16S-D (28)
16S-C (3)
95
16S-A (1, 5)
65
11S-B (6)
16S-M (68)
100
16S-N (69)
16S-O (72)
0,01
Fig.18. Dendrogramma costruito con il metodo Neighbor-Joining per un regione
di 511bp codificante per l'RNA 16S mitocondriale, che mostra le affinita'
genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus (16S-A -- 16S-L),
A.pallipes (16S-M, 16S-N) e A.torrentium (16S-O).
83
16S-J (23, 59)
16S-L (21, 22, 24)
54
16S-MP
!
16S-K (65)
16S-I (30)
51
58
16S-H (39, 41, 42, 57)
16S-G (25)
A. italicus
99
94
51
16S-F (62)
16S-E (12)
16S-D (28)
95
16S-A (1,5)
91
16S-C (3)
11S-B (6)
A. pallipes
16S-M (68)
99
A. torrentium
16S-N (69)
16S-O (72)
Fig. 19. Dendrogramma costruito con il metodo della Massima Parsimonia
per una regione di 511bp codificante per l'RNA 16S mitocondriale, che
mostra le affinita' genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius
italicus (16S-A -- 16S-L), A.pallipes (16S-M, 16S-N) e A.torrentium (16S-O).
84
16S-E
16S-D
16S-A
16S-B
16S-I
16S-L
16S-H
!
16S-J
16S-K
16S-G
16S-F
Fig. 20. Minimum spanning tree ottenuto con il metodo della "parsimonia
s t a t i s t i c a " (T e m p l e t o n e t a l. , 1 9 9 2 ) t r a g l i a p l o t i p i o s s e r v a t i i n
Austropotamobius italicus per l'RNA16S mitocondriale. Le linee indicano una
singola sostituzione; gli zeri aplotipi mancanti. Per le sigle, vedi Tab 13.
85
3.4 ALLEVAMENTI SPERIMENTALI E RIPOPOLAMENTI
Sono stati effettuati dei test di allevamento sperimentale di campioni di
A.italicus
provenienti
da
aree
geografiche
diverse,
caratterizzati
geneticamente, presso le strutture dello Stabilimento Ittiogenico di Roma al
fine di verificarne l’allevabilità in condizioni artificiali e mettere a punto le
condizioni ottimali. Gli esemplari catturati in natura venivano stabulati in
vasche di vetroresina di 100x100x40 cm alimentate da un flusso continuo di
acqua di conduttura (ACEA) alla temperatura costante di 12°C. Gli animali
venivano alimentati con una dieta mista costituita principalmente da pesci
d’acqua dolce (coregone) e di estuario (eperlano), carote semibollite e ortica.
Un’importante integrazione dietetica era rappresentata dai detriti e fauna di
fondo quali foglie e macroinvertebrati prelevati dagli stessi torrenti.
I test effettuati nel corso di due anni successivi hanno confermato
l’estrema vulnerabilità del gambero di fiume a variazioni anche minime dei
parametri chimico-fisici e biologici dell’acqua. La mortalita’ si manifestava
improvvisamente dopo tre o quattro mesi nelle singole vasche con decorso
più o meno rapido. L’assenza di strutture zooprofilattiche competenti in
patologia dei crostacei non ha purtroppo consentito di individuare con
certezza le cause di tale mortalita’. Le cause scatenanti potevano essere
individuate nel malfunzionamento del sistema di declorazione e filtraggio
dell’acqua che, indebolendo progressivamente gli animali, potrebbe aver
favorito l’insorgenza di patologie legate ad organismi opportunisti. Una
seconda ipotesi potrebbe essere la presenza di alcuni esemplari di gamberi
alloctoni già infetti che avrebbero contagiato quelli autoctoni.
A favore della prima ipotesi e’ l’assenza di mortalita’ in un nuovo set di
allevamenti attualmente in corso, iniziato alcuni mesi fa dopo revisione
dell’impianto di depurazione dell’acqua.
Gli accoppiamenti avvenivano regolarmente in autunno con una
percentuale di femmine fecondate pari a circa il 90%. A fecondazione
avvenuta le femmine venivano spostate e stabulate in vasche separate e la
86
schiusa si aveva tra i 90 e i 120 giorni successivi. I gamberetti venivano
quindi separati dalle madri dopo circa dieci giorni dalla nascita. Nel corso del
primo mese la mortalità tra i gamberetti era molto elevata e la stima di
sopravvivenza a 60 giorni non superava il 30%. La mortalità era attribuibile
principalmente alla difficoltà a completare il processo di muta e al
cannibalismo; la disponibilità di spazio sufficiente e rifugi sono pertanto
importanti per l’ottenimento della massima efficienza produttiva di progenie.
Esperimenti di incubazione delle uova in dispositivi di incubazione
artificiale (bottiglie di Zoug) hanno evidenziato una discreta percentuale di
schiusa soltanto in quelle ad avanzato stadio di sviluppo (circa due mesi); il
principale fattore limite per l’incubazione artificiale è rappresentato
dall’insorgenza di infezioni micotiche (saprolegnosi) che possono essere
combattute con il costante monitoraggio delle uova eliminando quelle
infettate, e trattamenti periodici con cloruro di sodio.
Nell’ambito di un progetto pilota finanziato dalla Regione Abruzzo
finalizzato al ripopolamento di alcuni corsi d’acqua del Parco Regionale del
Sirente-Velino, sono stati avviati ad allevamento presso le strutture dell’ex
incubatoio provinciale del Vetoio de L’Aquila un centinaio di riproduttori
raccolti in diversi corsi d’acqua abruzzesi e laziali. L’impianto sorge in
corrispondenza di una risorgiva che alimenta una serie di vasche e piccoli
stagni. L’acqua presenta una temperatura quasi costante (9-12°C) nell’arco
dell’anno e un indice biotico di 1a Classe. Gli animali, in rapporto di un
maschio ogni tre femmine, sono stati in parte liberati negli stagni ed in parte
incubati
in
vasche
di
cemento
collocate
all’interno
e
all’esterno
dell’incubatoio.
Lo scopo è di procedere con forme di allevamento di tipo misto: da un
lato in un habitat molto simile a quello naturale, sebbene poco controllabile,
che potrebbe dare utili indicazioni sulla dinamica di accrescimento naturale
della popolazione introdotta; dall’altro l’allevamento controllato in maniera da
poter seguire il livello di acclimatazione degli adulti, le fasi di fecondazione e
87
sviluppo delle uova mirati alla produzione di progenie da destinare ai
ripopolamenti.
I risultati di questi esperimenti sono ancora preliminari, essendo trascorsi solo
pochi mesi dall’immissione degli esemplari. Tuttavia appaiono molto
promettenti, in quanto la mortalita’ e’ finora assente. In questa fase del
periodo riproduttivo (che durera’ fino a gennaio) e’ stata gia’ ottenuta una
buona percentuale (circa 50%) di femmine ovigere.
88
CAPITOLO 4
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Il censimento da noi condotto sulle popolazioni di Austropotamobius
italicus hanno mostrato che, almeno per l’Italia dove e’ possibile il confronto,
l’area complessiva di distribuzione e’ rimasta sostanzialmente sovrapponibile
rispetto a quella evidenziata alla fine dell’800 (Vinciguerra, 1899). Si
conferma infatti una presenza di A. italicus piu’ marcata nei corsi d’acqua
prealpini e alpini e in quelli dei versanti appenninici adriatici rispetto a quelli
tirrenici. Il limite meridionale della distribuzione e’ stato confermato nel
massiccio del Pollino.
Una differenza marcata rispetto alla fine dell’800 riguarda la virtuale
assenza di gamberi autoctoni dalla maggior parte dei corsi d’acqua principali:
le popolazioni da noi censite sono state tutte individuate nei piccoli tributari
delle principali aste fluviali. Ad esempio per l’Italia centrale il bacino del
Velino, del Turano e del Tronto sono ormai virtualmente privi di A. italicus,
mentre la diffusione delle specie esotiche è in espansione. Due piccole
popolazioni di A. italicus individuate nel 1995 in due affluenti dell'alto Velino si
sono estinte nell'arco di due anni. Anche in Abruzzo la rarefazione di A.
italicus è stata particolarmente significativa: fino a pochi decenni fa esso era
ampiamente distribuito lungo i principali bacini idrici, in particolare quelli
dell'Imele-Salto, dell'Aterno, del Pescara e del Sangro, mentre attualmente
sono completamente scomparse dai corsi principali, e sopravvivono solo in
alcuni corsi d’acqua secondari e terziari.
L’indagine condotta mediante marcatori molecolari ha confermato ed
esteso i risultati da noi precedentemente ottenuti sulla base di soli marcatori
allozimici (Santucci et al., 1997). La separazione di A. italicus da A. pallipes e
A.torrentium, il cui isolamento riproduttivo e’ stato verificato in natura
dall’assenza di ibridi di F1 (Santucci et al., 1997; Bondanelli et al., in prep) e’
stata confermata anche a livello dei marcatori mitocondriali esaminati. La
89
distinzione specifica del taxon berndhauseri proposta da Largiader et al.
(2000) non trova conferma dal presente studio. Infatti i campioni del Canton
Ticino, della Val d’Ossola e delle Prealpi Lombarde, che secondo Largiader
et al. (2000) sarebbero da attribuire a A. berndhauseri, risultano affini sia a
livello nucleare che mitocondriale a campioni di una’area piu’ vasta dell’Italia
nord-occidentale, nonche’ a campioni dell’Italia centrosettentrionale e della
Spagna, attribuiti a A. italicus. Tali dati concordano con Albrecht (1982) che
su base morfologica includeva le popolazioni del Canton Ticino e della
Lombardia nella varieta’ lombardicus.
Nell’ambito di A. italicus, viene confermata l’eterogeneita’ genetica
evidenziata sia a livello di marcatori allozimici (Santucci et al., 1997) che di
RFLP e sequenze mitocondriali (Grandjean et al., 2000). In Fig. 21 viene
messo a confronto il quadro schematico complessivo evidenziato per questa
specie a livello nucleare, sulla base di 29 loci enzimatici, e citosplasmatico,
sulla base di due regioni del DNA mitocondriale codificanti per la COI e per
l’RNA 16S (cf dendrogrammi NJ e MP delle Figg. 14, 15, 19, 20). I due
metodi concordano nell’identificare 5 gruppi di affinita’, che si raggruppano in
3 cluster principali; sono state tuttavia osservate alcune discordanze, che
verranno qui di seguito analizzate.
1) popolazioni
del
Canton
Ticino,
Italia
nord-occidentale,
centro-
settentrionale e della Spagna
Vengono poste in un cluster distinto, nettamente separato dagli altri,
sia dai marcatori nucleari che mitocondriali. Nell’ambito dell’Italia con
entrambi gli approcci si evidenziano due sottogruppi. I campioni
dell’Italia nord-occidentale e del Canton Ticino formano un sottogruppo
molto omogeneo (DNei media 0,008), che come distribuzione geografica
corriponde alla varieta’ lombardicus descritta da Albrecht (1982). A
questo gruppo appartengono le popolazioni del Piemonte e della
Liguria, non inserite in questo lavoro, che hanno mostrato fenomeni di
introgressione con A. pallipes (Santucci et al., 1997; Bondanelli et al.,
in
prep.).
Il
gruppo
dell’Italia
centro-settentrionale,
90
mtDNA
allozymes
Fig. 21 . Rappresentazione riassuntiva dei principali gruppi di affinita'
genetica evidenziati in Austropotamobius italicus a livello di marcaori
nucleari e mitocondriali.
91
presenta
popolazioni
piu’
eterogenee
e
frammentate
(DNei
media=0,03). Per quanto riguarda la Spagna, per la COI e il 16S i
campioni spagnoli sono risultati geneticamente molto omogenei e
affini ai campioni dell’Italia centro-settentrionale; a livello di allozimi e’
stata osservata una notevole variabilita’ genetica, soprattutto per la
Pgk e l’Aat-2, con alleli privati sia per Aat-2 che per l’Mdh-1 (DNei
media=0,02). I campioni piu’ differenziati sono quelli dell’Andalusia e
della Spagna mediterranea rispetto ai campioni atlantici, che risultano
molto affini a popolazioni dell’Italia nord-occidentale. Questi dati
confermano l’affinita’ dei campioni spagnoli con campioni italiani di
A. italicus precedentemente
osservata da Santucci et al. (1997) a
livello di allozimi e da Grandjean et al. (2000, 2001) su RFLP di
mtDNA totale e su sequenze del mtDNA 16S. A livello morfologico le
popolazioni spagnole vengono attribuite alla sottospecie “lusitanicus”
da Bott (1950, 1972) e Karaman (1962), mentre Albrecht (1982) li
include insieme all’Italia centrale e meridionale nella varieta’ italicus
per l’elevata variabilita’ morfologica osservata.
Tali dati sembrano escludere che i campioni spagnoli derivino
tutti da introduzioni recenti, come suggerito ad esempio da Albrecht
(1982) e Laurent (1988). Per spiegare la maggiore variabilita’
evidenziata a livello di allozimi e di mtDNA rispetto ai supposti
campioni di origine bisognerebbe infatti supporre che questa
variabilita’ sia stata completamente persa in Italia in un periodo
successivo alle introduzioni in Spagna. Si puo’ invece ipotizzare che in
Spagna vi fossero popolazioni autoctone (il cui segnale si ritrova negli
alleli privati che ancora si osservano in questa regione) il cui pool
genico si sia in gran parte rimescolato con quello di popolazioni
occidentali italiane di A. italicus. Tale entita’ poteva corrispondere a A.
i. lusitanicus.
L’attuale distribuzione disgiunta di A. italicus non permette di
distinguere tra introduzioni recenti in Spagna ad opera dell’uomo e
92
flusso
genico
meridionale
naturale
anche
se
tra
i
popolazioni
due
attraverso
fenomeni
non
si
la
Francia
escludono
reciprocamente. La Francia meridionale e’ attualmente occupata da A.
pallipes e l’unico campione di A. italicus del sud della Francia (Pirenei
orientali) e’ risultato composto circa al 5% da esemplari affini ai vicini
campioni spagnoli, e al 95% da esemplari affini a quelli dell’Italia
centro-meridionale. Anche in questo caso potrebbe trattarsi di
trasporto passivo. Una popolazione di tipo italicus citata da Laurent e
Suscillon (1962) nei dintorni di Avignone non e’ stata successivamente
ritrovata.
2) Popolazioni dell’Italia centro-meridionale
Sono risultate geneticamente omogenee a livello di marcatori
mitocondriali; a livello nucleare solo l’Aat-2 differenzia il campione di
Gubbio e in misura minore alcuni campioni del versante adriatico, per
la presenza di un allele tipico di campioni nordorientali. Del tutto
omogenee rispetto a questo gruppo, sia a livello di allozimi che di
mtDNA, sono risultate due popolazioni
rispettivamente dei Pirenei
orientali, sopra citata e dell’Appennino Ligure. Anche in questo caso la
distribuzione disgiunta non permette di distinguere tra una situazione
relitta di una passata distribuzione piu’ ampia (per es. strettamente
costiera) e introduzioni recenti.
3) Popolazioni del Bacino dell’Isonzo
Anche questo gruppo risulta geneticamente omogeneo e distinto dagli
altri a livello di DNA mitocondriale e, soprattutto, a livello di allozimi,
dove con l’UPGMA rappresentano il clade piu’ ancestrale (DNei
media=0,13 dagli altri). Queste popolazioni risultano ben caratterizzate
a livello genetico da campioni situati a pochi chilometri in linea d’aria,
che vanno a far parte del bacino della Piana del Tagliamento (DNei
media=0,17)
93
4) Popolazioni della Piana del Tagliamento
Formano un clade distinto per l’mtDNA insieme al campione disgiunto
austriaco, caratterizzato solo a questo livello, e risultano relativamente
affini al campione della Dalmazia, mentre a livello di allozimi formano
un gruppo piu’ ampio (con Dalmazia, Marche, Prealpi Orobie e
Bellunesi e
Carnia);
a livello morfologico gli esemplari austriaci
(stessa localita’) sono stati attribuiti alla varieta’ carinthiacus; (Albrecht,
1981, 1982) e elevati a sottospecie da Grandjean et al (2000) sulla
base del mtDNA.
5)
Popolazioni del Carso, Italiano, Sloveno e Fiumano (Rijeka)
Ben distinte, soprattutto a livello di mtDNA, dove formano un clade
insieme a campioni della Carnia e delle Prealpi Orobie e Bellunesi: a
livello di allozimi pur formando un sottogruppo distinto rientrano in un
cluster con le popolazioni della Piana del Tagliamento e dell’Italia
centromeridionale.
Popolazioni
del
Trentino
(geograficamente
prossime alle Prealpi Bellunesi) erano state attribuite da Albrecht
(1982) alla varieta’ trentinicus).
Le popolazioni orientali di A. italicus mostrano livelli maggiori di
variabilita’ e di eterogeneita’ genetica rispetto a quelle occidentali. Tale dato,
insieme alla posizione generalmente centrale di queste popolazioni con i
diversi metodi di clustering indica che esse costituiscono verosimilmente un
gruppo piu’ ancestrale rispetto alle altre e un possibile centro di diffusione, da
un rifugio Adriato-Mediterraneo (secondo la definizione di Keith, 1998). Da
questo sarebbe derivato dapprima il gruppo piu’ occidentale (rappresentato
dalle popolazioni dell’Italia nord-occidentale e centro-settentrionale, del
Canton Ticino e della Spagna), che puo’ essersi isolato in un rifugio del
bacino occidentale del mediterraneo durante una fase glaciale pleistocenica.
Uno dei periodi di piu’ drastici cambiamenti climatici negli ultimi 3 milioni di
anni si e’ verificato intorno a 700,000 anni fa e avrebbe portato al primo
importante isolamento dei principali sistemi fluviali che formano gli attuali
94
bacini idrografici (Webb & Bartlein, 1992; Andersen & Borns, 1994; Villinger,
1986). Pur nell’impossibilita’ di calibrare un orologio molecolare, in particolare
per l’mtDNA, la distanza genetica osservata a livello di allozimi per il gruppo
occidentale di A. italicus (DNei=0,12) corrisponde a tale datazione con
l’algoritmo di Nei (1987).
Il gruppo dell’Italia nord-occidentale si sarebbe separato solo
successivamente da quello nord-adriatico. E’ noto che i bacini del Po, della
Slovenia e della Croazia sono stati tutti interconnessi durante le fasi di
massimi interglaciali (Bianco, 1990). La relativa omogeneita’ genetica,
osservata
in
un’area
geografica
relativamente
ampia
suggerisce
un’espansione piuttosto rapida (Ibrahim et al., 1996).
Ripetuti eventi di isolamento geografico nei diversi sistemi fluviali
(accompagnati da riduzioni numeriche, con fenomeni di deriva genetica), e
di successiva espansione legate a cambiamenti climatici pleistocenici,
possono spiegare il marcato differenziamento delle popolazioni nordadriatiche e le discordanze osservate in quest’area. Ad esempio, la
distribuzione piu’ ampia del pool genico corrispondente al gruppo geografico
della piana del Tagliamento osservata a livello di allozimi rispetto all’mtDNA
farebbe pensare a una espansione di questo gruppo nelle aree circostanti
(sia ad ovest, verso le Prealpi , a sud verso le Marche e ad est verso l’Istria e
la Dalmazia). Una colonizzazione da parte prevalentemente dei maschi (di cui
sono note le
Arrignon,
maggiori capacita’ di dispersione rispetto alle femmine,
1991)
spiegherebbe
l’assenza
di
introgressione
a
livello
mitocondriale, che manterrebbe il segnale delle popolazioni preesistenti. Tale
asimmetria nei pattern di introgressione tra marcatori nucleari e mitocondriali
e’ stata recentemente messa in evidenza nello studio di una zona di
parapatria tra A. pallipes e A. italicus (Bondanelli et al., in prep.).
I gruppi di affinita’ genetica evidenziati nel presente lavoro nell’ambito
di A.italicus rappresentano “unita’ evolutivamente significative” (ESU) da
salvaguardare. Per la maggior parte tali gruppi corrispondono alle ‘varieta’
identificate da Albrecht, 1982 (che pur includeva Austropotamobius nel
95
genere Astacus). La varieta’ carsicus, descritta dell’Erzegovina e Dalmazia
meridionale (Albrecht, 1982) e la sua identita’ con popolazioni del Carso (il
nostro gruppo 5), ipotizzata da Grandjean et al (2000) senza confronti diretti,
rimane da verificare. La situazione evidenziata in Austropotamobius mostra
un notevole parallelismo con quella evidenziata in altri organismi europei
d’acqua dolce, come la trota (Salmo trutta, Bernatchez et al, 2000) e la
tartaruga Emys orbicularis (Lenk et al., 1999). e mostra un ruolo importante,
nel creare e strutturare la diversita’ genetica, dei fattori storici legati a rifugi
multipli mediterranei e adriatici durante le glaciazioni pleistoceniche e ad
alterni processi di isolamento ed espansione. Come in Austropotamobius,
anche in Salmo trutta e’ stato evidenziato un gradiente longitudinale da est a
ovest di riduzione della strutturazione delle popolazioni, con livelli molto piu’
elevati di frammentazione nelle popolazioni adriatiche rispetto a quelle piu’
occidentali, che suggerisce fenomeni di espansione dell’areale relativamente
recenti in queste ultime.
A questo quadro gia’ complesso si aggiungono le conseguenze
dell’attivita’ antropica, da una parte con introduzioni non controllate a scopi
commerciali, dall’altra con i drastici e recenti fenomeni di frammentazione e
relittazione delle popolazioni legati all’alterazione degli habitat e ai problemi di
sovrappesca, di epidemie da patogeni introdotti e di competizione con specie
alloctone. Il fenomeno e’ particolarmente evidente in alcune popolazioni
dell’Italia centrale e settentionale, in cui a valori molto bassi di variabilita’
genetica si accompagnano alleli privati ad elevata frequenza.
La ormai scarsa presenza del gambero di fiume in numerose aree
dove un tempo era relativamente abbondante, insieme alla bassa variabilita’
genetica messa in evidenza con i marcatori utilizzati in gran parte dell’areale
di distribuzione di A. italicus, indica la necessita’ di misure di reintroduzione e
restocking per questa specie. Il presente studio fornisce una mappa della
struttura genetica delle popolazioni, e suggerisce, nell’ambito di ciascun
gruppo evidenziato, le aree risultate piu’ a rischio di estinzione e quelle con
la maggiore diversita’ genetica. Le popolazioni piu’ abbondanti sono state
96
osservate in stazioni dell’Italia nordorientale, particolarmente in Friuli, lungo il
bacino dell’Isonzo, nel Carso Sloveno e Triestino; in alcune stazioni dell’Alto
Lazio, in parte situate in aree protette; in campioni della Spagna
mediterranea e dei Pirenei orientali. Spesso (ma non sempre, come ad
esempio per l’Italia centrale) tali popolazioni sono anche quelle con i
maggiori livelli di variabilita’ genetica.
Tali popolazioni possono rappresentare “reservoirs” di diversita’
genetica. Qualsiasi intervento in natura deve, tuttavia, tener conto della
struttura filogeografica evidenziata nel presente lavoro. Prima di interventi in
natura, appare indispensabile verificare in situazioni sperimentali controllate il
successo riproduttivo degli incroci che si intendono effettuare allo scopo di
evitare fenomeni di outbreeding depression. Tali allevamenti andrebbero
mantenuti per piu’ di una generazione. I risultati degli allevamenti
sperimentali effettuati indicano situazioni come quella seminaturale dell’ex
incubatoio provinciale dell’Aquila una struttura ottimale per realizzare tali
esperimenti.
97
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