Patologie dei gamberi d`acqua dolce e loro

Patologie dei gamberi d’acqua
dolce e loro monitoraggio
Corsi di formazione per personale ETP
Pretto Tobia, Manfrin Amedeo
IZS delle Venezie – Adria (RO)
PATOLOGIE DEI GAMBERI D’ACQUA DOLCE
NEL CONTESTO DEL PROGETTO LIFE+ RARITY
Peste del gambero sostenuta da Aphanomyces astaci
White Spot Disease o Malattia dei Punti Bianchi sostenuta
da White Spot Syndrome Virus (WSSV)
PESTE DEL GAMBERO
Agente eziologico: Aphanomyces astaci
 Phylum Chromista
 Classe Oomiceti
 Ordine Saprolegniales
 Famiglia Saprolegniaceae
 Genere Aphanomyces
EPIDEMIOLOGIA E PATOGENESI
Sensibilità di specie
  Astacidi, specie europee (Austropotamobius
pallipes, A. torrentium, Astacus astacus e A.
leptodactylus) molto sensibili.
  Cambaridi, specie americane (Procambarus
clarkii, Pacifastacus leniusculus, Orconectes spp.)
più resistenti.
  Parastacidi, specie australiane (Euastacus sp.,
Cherax sp., Geocherax sp., Astacopsis sp.) molto
sensibili a prove di infezione in laboratorio
(Unestam,1975).
Aphanomyces astaci è un patogeno primario che attacca le aree meno
calcificate della cuticola e le membrane delle articolazioni dei crostacei.
Le zoospore, che determinano la diffusione dell’infezione attraverso
l’acqua, sono lo stadio infettante della malattia.
La zona di giunzione tra due segmenti addominali o le articolazioni
sono il sito più opportuno per l’incistamento
Foto D. Alderman
Foto D. Alderman
Si genera un tubo germinativo di penetrazione e le ife con attività
proteasica e chitinasica cominciano a svilupparsi, progredendo
parallelamente alle fibrille chitinose all’interno della cuticola, invadendo
l’ipoderma e talvolta la muscolatura sottostante.
Raramente si ha diffusione in modo massivo in tessuti ed organi più
profondi.
La riproduzione è asessuata ed avviene per formazione di
zoosporangi che a maturità liberano zoospore.
Le zoospore, libere in acqua, generalmente sono attive per un periodo
variabile da pochi minuti a tre giorni, ma secondo la temperatura
ambientale i tempi possono essere molto più lunghi
Quando la zoospora per chemiotassi raggiunge l’esoscheletro di
un gambero vi aderisce con i flagelli e si incista nella cuticola,
dando luogo a nuova germinazione.
Il tentativo d’incistamento può avvenire più volte, fino a tre, se il
substrato non risulta idoneo alla germinazione
DIFFUSIONE E TRASMISSIONE DELLA MALATTIA
La peste si trasmette per via orizzontale
Da gambero infetto ad esemplari sani
Da gamberi alloctoni portatori ad esemplari autoctoni sani
Tramite acqua contaminata
Le zoospore rimangono vitali nel muco della pelle e del tratto intestinale
dei pesci.
Mammiferi, come la lontra, il visone o topi muschiati e uccelli acquatici sono stati
accusati di diffondere la peste dei gamberi in Europa.
Poiché studi scientifici hanno dimostrato che le zoospore non sopravvivono alle
temperature del tratto gastrointestinale di mammiferi o uccelli (Oidtmann et al.,
2002), la trasmissione può avvenire tramite la sola veicolazione, sulla superficie
corporea, di acqua contaminata.
La trasmissione verticale è stata segnalata in Finlandia in uova di gamberi della
California incubate artificialmente (Makkonen et al,. 2010).
I cadaveri dei crostacei mantenuti all’aria, a temperatura ambiente (circa
21°C), risultano ancora infettanti dopo 48 ore, in acqua dopo 3-5 giorni.
A. astaci può essere veicolato da equipaggiamento contaminato
(barche, attrezzatura da pesca, stivali, vestiario, ecc.). In condizioni
ideali, anche piccole quantità di acqua sono in grado di trasferire
sufficienti zoospore per infettare un nuovo corpo idrico.
Quando si manifesta la malattia in una nuova area, la popolazione astacicola
presenta elevatissima e rapida mortalità. La morte di tutti i gamberi si verifica
entro 6-10 giorni.
La malattia, nei corsi d’acqua, si diffonde rapidamente lungo la direzione del
flusso mentre è più lenta la propagazione controcorrente.
Raramente individui sensibili vengono rinvenuti vivi dopo un episodio di peste, se
ciò si verifica si deve probabilmente ad una mancata esposizione al patogeno
(animali presenti in corsi d’acqua tributari).
Dopo molti decenni di infezione, non ci sono osservazioni di sviluppo di
resistenza ed immunità alla malattia in specie europee di gambero.
Foto Ashley Cooper
SEGNI CLINICI
Il comportamento degli animali colpiti, andatura o attività insolita,
fornisce un indizio per una diagnosi di peste ma i segni clinici non sono
sufficienti.
I primi segni di malattia sono di tipo comportamentale, in presenza di
un elevato numero di soggetti morti. (Alderman & Polglase, 1986).
Si osserva inizialmente un aumento dell’attività motoria, seguito da
apatia.
L’animale affetto da peste si mostra, in pieno giorno, con gli arti in estensione,
esce dall’acqua e tenta di arrampicarsi sull’argine, si muove in modo
incoordinato, è instabile con perdita dell’equilibrio, non tenta di fuggire alla
cattura e si manifesta inerte se trattenuto
Al culmine dell’infezione i soggetti si rovesciano sul dorso, muovono convulsamente
le appendici e non riescono a raddrizzarsi. Talvolta la morte si manifesta per
paralisi, in questa posizione. Frequentemente si può manifestare il distacco degli
arti o porzioni di essi.
La morte dell’ospite è la conseguenza di una neurotossina.
Aree ulcerate brunastre sono più frequenti in gamberi alloctoni resistenti e
portatori o in gamberi indigeni con infezione subacuta.
A temperature inferiori a 10°C, i
gamberi infetti richiedono tempi più
lunghi per morire, e i segni clinici
sono più evidenti, come la perdita
di un arto e la presenza di ulcere
melanotiche (Alderman et al.,
1987).
Lesioni istologiche
All’osservazione istologica l’esoscheletro, l’ipoderma, più
raramente il muscolo scheletrico sottostante e le branchie si
presentano invasi da ife asettate e ramificate
Nelle specie di gamberi Nord Americani l’infezione è localizzata alla
cuticola, che presenta reazioni melanotiche
DIFFUSIONE DELLA PESTE IN ITALIA E IN EUROPA
La malattia è stata descritta per la prima
volta in Italia nel 1859 (Cornalia 1860).
Non fu mai isolato l’agente eziologico.
Ben presto la peste, ritenuta al tempo
essere provocata da parassiti o batteri, si
propagò in tutta l’Europa centrale e
successivamente a tutto il continente.
In Italia, dopo le segnalazioni della metà del 1800, episodi di afanomicosi
sono riportati:
•  1999, A. repetans in Procambarus clarkii,
valle di Marmorta (BO) (Galuppi et al., 2002;
Royo et al., 2004).
•  2008 A. astaci in P. clarkii, Lombardia e
Toscana (Gherardi comunicazione
personale).
•  2009 A. astaci in Austropotamobius
pallipes, in Molise (IS) (Cammà et al., 2010)
•  2010 A. astaci in A. pallipes, Valdobbiadene
(TV)
• 2011 A. astaci in A. pallipes, Trentino, fiume
Chiese, Ponte S. Lucia
Nuovi focolai in Italia
•  2011 A. astaci in A. pallipes,
Lombardia, Montevecchia (LC)
•  2011 A. astaci in A. pallipes,
Abruzzo, Crognaleto (TE)
•  2011 A. astaci in Cherax destructor,
in Veneto, Mogliano Veneto (TV)
DIAGNOSI in CAMPO
SEGNI CLINICI E COMPORTAMENTALI:
•  elevata mortalità esclusiva di gamberi in presenza di normale fauna ittica
•  letargia, paralisi o incoordinazione degli arti
•  esemplari rovesciati sul dorso
•  se catturati perdita del riflesso della coda e scarsa tonicità muscolare
•  presenza di aree brunastre, giallastre o grigiastre sulla cuticola addominale o
alla base degli arti
•  animali che abbandonano i rifugi o escono dall’acqua durante il giorno
DIAGNOSI di LABORATORIO
Tessuti target per identificazione o isolamento di A. astaci:
•  Nelle specie sensibili (Astacus astacus, Austropotamobius pallipes, A. torrentium)
prelievo da cuticola addominale.
•  Nelle specie resistenti Nord Americane prelievo di cuticola addominale,
telson e aree melanizzate di arti e cuticola.
Immagine
DIAGNOSI di LABORATORIO
ESAME A FRESCO:
•  porzione di cuticola osservata a piccolo ingrandimento
•  identificazione di ife asettate ed eventuali sporangi
•  la presenza di infiltrato emocitario e melanizzazione associata alle
ife tende ad escludere che si tratti di micosi secondarie
ESAME COLTURALE IN TERRENO AGARIZZATO (ALDERMAN,1986):
•  RGY agar (River water Glucose Yeast extract Agar)
•  richiede esemplari vivi o morti entro le 12-24 ore (refrigerati)
•  efficace solo in specie sensibili, richiede tempi lunghi (15 gg)
•  isolamento ed identificazione morfologica di ife e sporangi
•  necessario per analisi molecolare RAPD-PCR (Random
Amplification of Polymorphic DNA)
ESAME ISTOLOGICO:
•  eseguito su esemplari vivi o fissati in campo (fissativo di
Davidson o formalina)
•  evidenzia la presenza di ife fungine (colorazione di Grocott)
•  non discrimina tra A. astaci e infezioni micotiche secondarie
ANALISI MOLECOLARE (PCR):
•  eseguibile su vivo, morto, congelato o fissato in etanolo
•  efficace anche nelle specie resistenti (Procambarus clarkii)
•  metodica più sensibile e specifica
METODICHE MOLECOLARI
L’analisi PCR, riportata nel Manual of Diagnostic Tests for Aquatic
Animals 2009 OIE (Oidtmann et al.,2006), amplifica una sequenza
di 569 bp nella regione ITS (Internal Transcribed Spacer) del
genoma di A. astaci.
Primer 42 Forward
5’-GCTTGTGCTGAGGATGTTCF-3’
Primer 640 Reverse 5'-CTATCCGACTCCGCATTCTG-3’
Garantisce una sensibilità pari al 100% in campioni vivi o morti
entro le 24 ore; può essere effettuato anche su campioni congelati
o fissati in etanolo.
SEQUENZIAMENTO:
I prodotti di amplificazione vengono sequenziati e confrontati con le
sequenze riportate in letteratura tramite BLAST (GenBank).
Omologia di sequenza conferma la presenza di A. astaci nel
campione analizzato.
PREVENZIONE
Quando A. astaci viene a contatto con una popolazione di gamberi sensibili la
sua diffusione non è controllabile perciò prevenirne l’introduzione risulta
essenziale.
Misure preventive secondo:
AUSTRALIAN AQUATIC VETERINARY EMERGENCY PLAN Disease Strategy Crayfish
plague, 2005
OIE: Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2009
o  evitare la movimentazione di gamberi vivi o morti, potenzialmente infetti,
di acqua o attrezzatura contaminata, verso aree indenni ospitanti
popolazioni suscettibili.
o  evitare la movimentazione ed il rilascio di specie ittiche provenienti da
aree soggette ad episodi di afanomicosi.
o  evitare la cattura accidentale di gamberi alieni, possibili carrier di A. astaci,
durante le movimentazioni di fauna ittica tra bacini diversi.
o  evitare il rilascio in natura di gamberi alieni Nord-Americani (acquariofili!)
o  applicare una corretta disinfezione di attrezzatura (guadini, nasse), stivali,
natanti e veicoli tra campionamenti effettuati in bacini diversi.
METODI di DECONTAMINAZIONE
ESSICCAMENTO: il micelio e le spore risultano inattivate dopo disidratazione per
48-72 ore
TRATTAMENTO TERMICO: risulta efficace il riscaldamento a 60°C per pochi
minuti, e il raffreddamento a -20°C per 72 ore (Oidtmann et al 2002).
DISINFEZIONE CHIMICA:
•  ipoclorito di sodio: 100 ppm per 30’’ utile per strumentario e acqua contaminata
•  iodofori: 500 ppm fino a 5’, dopo pulizia dai residui organici
•  acido peracetico: 100 ppm per 5’ (soluzione al 5% in H2O2)
SMALTIMENTO DEI GAMBERI DALLA SEDE DEL FOCOLAIO
Raccolta delle carcasse e termodistruzione tramite ditta specializzata secondo
disposizioni del Regolamento UE 1069/2009 e s.m.i..
WSD o MALATTIA DEI PUNTI BIANCHI
Sostenuta da: White Spot Syndrome Virus, dsDNA, dotato di envelope
Famiglia: Nimaviridae
Genere: Whispovirus
Diffusione:
Asia (primo focolaio in Giappone, 1992), Americhe (Texas,1995), Medio Oriente
Sporadicamente segnalato nel bacino del Mediterraneo (1995-2001)
Specie sensibili: tutti i crostacei decapodi, durante tutte le fasi di sviluppo.
WSSV causa mortalità elevatissime nei gamberi della famiglia Penaeidae.
Granchi, gamberi d’acqua dolce, astici e aragoste sono suscettibili all’infezione
tuttavia sintomatologia e mortalità sono estremamente variabili.
Elevate mortalità di Procambarus clarkii riportate in allevamenti della Louisiana
nel 2007
TRASMISSIONE DELLA MALATTIA:
Per via orizzontale: principalmente per ingestione di tessuti infetti
(cannibalismo, predazione), per contatto diretto, tramite vettori quali
rotiferi, vermi policheti, isopodi e crostacei non decapodi (Artemia salina),
meno frequentemente tramite acqua contaminata.
Per via verticale trans-ovum.
METODI DI DECONTAMINAZIONE:
Calore: 50°C per 20’, 70°C per 5’
pH: esposizione a pH 1 per 10’, pH 3 per 1 ora o pH 12 per 25’ a 25°C
AGENTI CHIMICI
Ipoclorito di sodio: 100 ppm per 10 minuti, 10 ppm per 30 minuti
Iodofori: 100 ppm per 10’ and 10 ppm per 30’
Sali quaternari d’ammonio:75 ppm per 10 minuti
SEGNI CLINICI
D.V. Lightner, P. Saibaba
D.V. Lightner
Letargia, marcata riduzione nel consumo di alimento.
Lesioni tipiche nei Peneidi : distacco della cuticola e presenza di macchie
sottocuticolari biancastre nell’esoscheletro, 0,5-2 mm di diametro, conseguenti
a deposito di calcio da parte dell’epidermide. Le macchie possono essere
coalescenti, formando placche più estese.
Nei gamberi d’acqua dolce tali lesioni possono essere assenti.
Occasionalmente si ha una colorazione rossastra dovuta ad espansione dei
cromatofori della cuticola.
DIAGNOSI
Esame istologico:
I tessuti target di origine ectodermica
(l’epitelio cuticolare, l’epitelio dello
stomaco) e mesodermica (il tessuto
connettivo, gli organi linfoidi, gli
emociti, il tessuto ematopoietico)
presentano nuclei ipertrofici, con più
o meno marcata basofilia, ed
inclusioni intranucleari debolmente
eosinofile.
Analisi molecolare:
D.V. Lightner
Nested-PCR secondo OIE (Manual of Diagnostic Tests for Aquatic
Animals, 2009) e successivo SEQUENZIAMENTO, metodo di conferma.
CAMPIONAMENTO
Prelievo di esemplari di Austropotamobius pallipes da destinare a
riproduzione
Prelievo di esemplari di Procambarus clarkii per contenimento delle
popolazioni e monitoraggio sanitario.
In entrambi i casi osservare le idonee misure di disinfezione delle attrezzature:
Aspersione di nasse e guadini con iodofori (500 ppm) e pulizia e disinfezione
degli stivali prima di lasciare il sito di pesca.
Tra campionamenti eseguiti in siti diversi è necessario disinfettare le vasche o i
contenitori con cui vengono trasportati i gamberi con iodofori o ipoclorito di
sodio e adeguato risciacquo.
CAMPIONAMENTO
In caso di sospetto focolaio di peste in una popolazione suscettibile il
campione di gamberi sottoposto ad analisi dovrebbe essere costituito
da:
A.  Gamberi moribondi sintomatici
B.  Gamberi vivi e apparentemente sani
C.  Gamberi morti in buono stato di conservazione
Gli esemplari prelevati vivi dovrebbero essere inviati al laboratorio entro
le 24 ore, in contenitori di polistirolo forati, mantenuti umidi (giornali o
erba bagnata) e nel periodo estivo refrigerati (<16°C).
Gli esemplari prelevati morti possono essere inviati congelati oppure
fissati in etanolo 70° o superiore (non metilato) con rapporto campione:
fissativo MINIMO 1:3.
GESTIONE DEI CENTRI DI RIPRODUZIONE
•  Nella scelta di nuovi siti dovrebbe essere considerata la presenza,
nelle vicinanze, di specie di gamberi aliene.
•  Per le strutture che si approvvigionano direttamente da acque
superficiali va esclusa la presenza di popolazioni aliene a monte
del punto di prelievo, e impedita la loro risalita da valle.
•  Prevenire l’introduzione di gamberi potenzialmente infetti, acqua e
attrezzatura contaminata.
•  Sottoporre a adeguato trattamento termico il pesce utilizzato come
alimento per i gamberi se di origine incerta o proveniente da aree dove
sono presenti gamberi alieni.
•  Applicare le misure di biosicurezza: recinzione del sito, bagni podalici
all’ingresso della struttura, accurata disinfezione di tutte le attrezzature,
introduzione di riproduttori provenienti da aree indenni, accertamenti
diagnostici in caso di mortalità nel centro di riproduzione.
CENTRO DI RIPRODUZIONE: INDICAZIONI PER LA DISINFEZIONE
Disinfezione dei mezzi di trasporto:
All’ingresso della struttura disporre vasca contenente ipoclorito di sodio o
iodofori, oppure nebulizzare le ruote dell’automezzo
Disinfezione per personale e visitatori:
Vaschette podaliche all’ingresso dell’impianto e tra i vari settori, con
sostituzione settimanale delle soluzioni, in alternativa calzari monouso
Disinfezione pavimentazione:
Vapore > 100°C o ipoclorito 2 volte al mese, trattamento del circuito idraulico
a fine ciclo
Disinfezione delle vasche ad inizio ciclo:
Iodofori 500 ppm, ipoclorito > 100 ppm o cloramina
Per la pulizia di routine delle vasche in impianto è opportuno
dedicare a ciascuna guadini e spazzole propri.
Se la stessa attrezzatura viene usata su più vasche immergerla in
contenitori con soluzione disinfettante (iodofori) per alcuni secondi
e risciacquarla con acqua pulita.
Una volta utilizzata va riposta pulita in un luogo asciutto o immersa
in soluzione disinfettante
CONTROLLO DELLE MOVIMENTAZIONI
Prevenire la movimentazione di gamberi infetti e la diffusione del
patogeno rappresenta uno dei punti cruciali in caso di focolaio di peste
accertato o sospetto tale.
Il corso d’acqua coinvolto deve essere identificato ed applicate misure di
controllo delle movimentazioni.
Possono essere considerate tre zone:
•  ZONA INFETTA che comprende il bacino idrico dall’area soggetta a
mortalità lungo il suo decorso verso valle
•  ZONA DI PROTEZIONE
•  ZONA DI SORVEGLIANZA
L’estensione di queste zone deve essere valutata caso per caso, in base
alle caratteristiche idrogeografiche del sito interessato.
•  blocco della movimentazione di gamberi vivi da e verso la
zona di protezione
•  blocco della pesca sportiva nella zona di sorveglianza
SORVEGLIANZA
Necessaria per individuare nuovi focolai, definire l’estensione
della zona infetta e monitorare i siti di ripopolamento
Basata su tre metodi:
•  semplice osservazione del comportamento e dei fenomeni di
mortalità di gamberi nel territorio
•  monitoraggio periodico dello stato sanitario di popolazioni di
gamberi in differenti siti tramite analisi di laboratorio
•  impiego di animali sentinella in bacini precedentemente
infetti o sospetti.
RIPOPOLAMENTO A SEGUITO DI UN FOCOLAIO
Il ripopolamento di un corso d’acqua può avvenire solo dopo
l’eliminazione certa del patogeno:
•  dopo tre mesi dall’eliminazione di tutti i gamberi presenti
nell’area, sia di specie autoctone che aliene, verificata tramite
catture
•  dopo due anni di monitoraggio tramite gamberi sentinella,
mantenuti in gabbie disposte lungo il corso d’acqua, se non è
garantita l’estinzione della popolazione a seguito del focolaio di
peste (Alderman, 2002)
•  gli esemplari reinseriti devono essere disease free
•  a volte il ripopolamento avviene naturalmente per migrazione di
gamberi da aree indenni e isolate dello stesso bacino.
GRAZIE PER L’ATTENZIONE