Diapositiva 1 - Università degli Studi della Basilicata
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Diapositiva 1 - Università degli Studi della Basilicata
METODI EMATOLOGICI EMATOLOGIA: studio del sangue e dei tessuti emopoietici SANGUE: insieme di cellule sospese in un liquido detto PLASMA, composto da sali minerali ed organici; in un uomo adulto costituisce circa 1/12 del peso corporeo e corrisponde a 5-6 litri. ERITROCITI (globuli rossi) CELLULE: LEUCOCITI (globuli bianchi) ~45 %, chiamate anche elementi figurati. TROMBOCITI (piastrine) SIERO: plasma privo di fibrinogeno ~55 % COAGULO: aggregazione del fibrinogeno La proporzione tra cellule e plasma è regolata affinché rimanga relativamente COSTANTE Globuli rossi: contenendo EMOGLOBINA, trasportano OSSIGENO a tutti i tessuti Globuli bianchi: responsabili delle difese dell’organismo Piastrine: impediscono perdite di sangue dovute ad emorragie Proteine del plasma: trasporto di nutrienti o di metaboliti destinati all’escrezione EMATOCRITO (HCT): misura dell’altezza del sedimento eritrocitario, rapportata a quella dell’intero campione di sangue (porzione % dei globuli rossi, “packed cell volume”,PCV) Il compito del laboratorio è quello di valutare la normalità o l’anormalità dei vari componenti del sangue e di caratterizzare la natura di eventuali alterazioni: a tale scopo si usano esami QUANTITATIVI (conteggio e dimensionamento) o QUALITATIVI (morfometria, citochimica, citofluorimetria ecc.) EMOPOIESI Formazione e maturazione di TUTTI I TIPI DI CELLULE del sangue a partire dai precursori ADULTO: le cellule si formano nell’interstizio extravascolare del midollo osseo, sede delle cellule staminali totipotenti L’emopoiesi è controllata da regolazioni di contatto CELLULA-CELLULA, da una regolazione UMORALE (fattori di crescita glicoproteici) e da particolari esigenze dell’organismo Indagini QUANTITATIVE sulle cellule del sangue periferico: L’EMOGRAMMA Più noto come ESAME EMOCROMOCITOMETRICO con FORMULA LEUCOCITARIA Serie di valutazioni degli elementi del sangue periferico: conta e dimensionamento dei globuli rossi e delle piastrine, valore dell’ematocrito, determinazione della concentrazione di emoglobina e conta differenziale dei leucociti del sangue periferico. Inoltre vengono presi in considerazione altri parametri, come le concentrazioni sieriche di ferro, ferritina, transferrina e del recettore solubile della transferrina. Conta dei globuli rossi ERITROPOIESI Conta globuli bianchi LEUCOCITOPOIESI Conta delle piastrine MEGACARIOCITOPOIESI ERITROPOIESI La produzione di eritrociti, che trasportano ossigeno ai tessuti, è regolata dal livello di ossigenazione dei tessuti Valutazione di laboratorio dell’eritropoiesi: • Citologia midollare • Conteggio dei Reticolociti • Determinazione dell’Eritropoietina Citologia midollare PROERITROBLASTO ERITROBLASTO BASOFILO (2A) ERITROBLASTO POLICROMATOFILO (2B, 3E) ERITROBLASTO ORTOCROMATICO (2C,3F) RETICOLOCITA ERITROCITA MATURO CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI Comunemente utilizzato come misura della produzione eritroide. Negli adulti e nei bambini, il normale valore dei reticolociti, globuli rossi giovani, ancora immaturi, in percentuale è da 0,5% a 2,5% dei globuli rossi circolanti totali, nei neonati è dal 2% al 6%. Il valore assoluto è tra 25.000 e 80.000 per mm3. Nelle malattie ematologiche il conteggio reticolocitario assoluto rappresenta un indicatore dell'eritropoiesi efficace, mentre la percentuale di reticolociti ad alta fluorescenza (> RNA ribosomiale) esprime in modo più diretto l'intensità della stimolazione eritropoietinica. Il numero dei reticolociti nel sangue periferico, valutato mediante esame al microscopio dopo colorazione cellulare, è stato considerato, per il passato, nell'epoca precedente all'automazione, come uno dei mezzi diagnostici più semplici ed economici per l'iniziale classificazione delle anemie (analisi semi-quantitativa). Il conteggio dei reticolociti, effettuato con gli attuali metodi automatizzati (citometria a flusso e deviazione della luce laser da parte dei filamenti di RNA) è più rapido e meno soggetto alle cause di imprecisione e di inaccuratezza legate ai fattori umani di soggettività e a quelli statistici riguardanti il numero di cellule analizzate. ERITROPOIETINA Ormone glicoproteico prodotto dalle cellule interstiziali peritubulari renali che STIMOLA la velocità di crescita e di maturazione dei precursori eritroidi. Dosata con RIA o ELISA Livelli Epo nel sangue: 10-30 mUI/ml La concentrazione di Epo plasmatica consente una valutazione del grado di eritropoiesi Aumentano i livelli di Epo in casi di IPOSSIA TISSUTALE (dovuta a diminuita concentrazione di Hb o alterato scambio di ossigeno a livello respiratorio o a diminuzione flusso sanguigno ecc), con funzionalità renale adeguata. La sua concentrazione, inoltre, cresce in maniera direttamente proporzionale all’ematocrito. In presenza di una eritropoiesi efficace e di un adeguato apporto al midollo di ferro, acido folico e vitamina B12, l’Epo accelera quasi tutti gli stadi di produzione di eritrociti, causando un aumento di velocità di divisione cellulare, di incorporazione di Fe nel precursore eritroide e favorendo l’entrata in circolo di globuli rossi giovani (Reticolociti). L’intervento dell’ormone si può evidenziare in laboratorio con il conteggio dei reticolociti, visto in precedenza. ERITRONE: insieme dei precursori della serie rossa e degli eritrociti maturi, regolato dai livelli di Epo e di pressione di O2 FUNZIONE: favorire lo scambio di gas respiratori, O2 e CO2, tra cuore, polmoni e tessuti METABOLISMO DEI GLOBULI ROSSI In assenza di mitocondri, è assai scarsa la capacità di metabolizzare acidi grassi e aminoacidi. L’energia è generata pressoché esclusivamente attraverso la degradazione del glucosio. La via non-ossidativa o anaerobica (ciclo di Embden-Meyerhof) è responsabile dell’utilizzo di circa il 90% del glucosio cellulare. Nella conversione del glucosio a lattato, il guadagno netto di molecole di ATP fornisce i fosfati ad alta energia, necessari per il mantenimento della forma e della flessibilità cellulare, per preservare i lipidi di membrana e per rifornire di energia le pompe metaboliche che controllano gli scambi di sodio, potassio e calcio. Quando l’ATP è deficitario a causa dei difetti acquisiti o ereditari della glicolisi, la sopravvivenza della cellula è drasticamente ridotta e ne consegue un’anemia emolitica. Il ciclo di Embden-Meyerhof ha un ruolo essenziale nel mantenere i piridin- nucleotidi in forma ridotta per provvedere alla riduzione della metaemoglobina (via della emoglobina-reduttasi), e nella sintesi del 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) (ciclo di Rapaport-Luebering). Il significato del 2,3-DPG sta nella sua capacità di modulare la liberazione dell’ossigeno a seconda delle esigenze dei tessuti. Questa risposta è attivata da una variazione della proporzione di ossigeno estratta dai tessuti; ogni volta che il sangue venoso contiene un’aumentata produzione di emoglobina deossigenata, la glicolisi viene stimolata ad una maggiore produzione di DPG. Ciò diminuisce l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno consentendo una maggiore liberazione di questo per una data tensione di ossigeno nei tessuti. Altra via metabolica è lo shunt degli esoso-monofosfati (via del fosfogluconato). Questo sistema energetico accoppia il metabolismo ossidativo con la riduzione del piridin-nucleotide e del glutatione, proteggendo il globulo rosso da ossidanti ambientali. Quando questa via metabolica è funzionalmente deficitaria o quando ossidanti ambientali ne eccedono la capacità riducente, si verifica una denaturazione della globina e l’emoglobina forma un precipitato noto come “Corpi di Heinz” lungo la superficie interna della membrana eritrocitaria. Questa forma di distruzione ossidativa del globulo rosso si verifica solitamente nei pazienti con deficienza della glucosio-6-fosfato-deidrogenasi legata al cromosoma X, l’enzima principale della via metabolica del fosfogluconato. Riassunto….. VIA DEL FOSFOGLUCONATO Eritrociti devono contenere il pigmento che lega l’ossigeno... EME Molecola di porfirina che coordina uno ione ferroso Fe(II), posto leggermente al di fuori del piano della molecola: L'eme costituisce il gruppo prostetico, cioè la parte non proteica, di una serie di proteine tra cui l’emoglobina, la mioglobina e i citocromi 4 gruppi EME sono contenuti all’interno di 4 globuli proteici, detti GLOBINA. Quindi, l'EMOGLOBINA è una proteina globulare di struttura quaternaria, solubile, di colore rosso, presente nei globuli rossi del sangue dei vertebrati, responsabile del trasporto dell‘ossigeno molecolare da un compartimento ad alta concentrazione di O2 ai tessuti che ne hanno bisogno. L'emoglobina (che si indica con il simbolo Hb o Hgb), viene sintetizzata inizialmente a livello dei proeritroblasti policromatofili (precursori dei globuli rossi), rimanendo poi in alte concentrazioni all'interno dell‘eritrocita maturo. Quando si lega all'ossigeno viene chiamata ossiemoglobina, nella forma non legata deossiemoglobina. Le alterazioni di origine genetica della struttura primaria della molecola, che ne alterano la funzione, o della sua espressione che alterano la quantità in circolo, vanno sotto il nome di emoglobinopatie Conta e dimensionamento dei globuli rossi Per svolgere la loro funzione, devono mantenere: Forma a disco biconcavo Ambiente interno costante, per mantenere l’emoglobina in forma “ridotta” Elasticità necessario mantenere un complesso equilibrio tra i meccanismi preposti alla sintesi dell’emoglobina e quelli preposti alla maturazione dell’eritrocita difetti in qualsiasi punto di tali processi compromettono l’apporto di ossigeno ai tessuti Determinazioni QUANTITATIVE: capacità di trasportare ossigeno Determinazioni QUALITATIVE: la valutazione dell’aspetto morfologico può evidenziare difetti di membrana Parametri valutabili (esame emocromocitometrico): 1. Quantità di emoglobina (Hb) 2. Ematocrito (rapporto tra volume complessivo GR e volume totale di sangue) 3. Numero assoluto di eritrociti nel sangue (RBC) 4. Indici corpuscolari o eritrocitari 1. Quantità di emoglobina Il metodo principale per la determinazione dell’emoglobina (Hb) è basato, anche nei contatori elettronici, su misure spettrofotometriche (picco di assorbimento a 540 nm) effettuate sull’emolisato. Nei counters elettronici si sfruttano anche fenomeni di riflessione, trasmissione, rifrazione e scattering (luce dispersa): l’indice di rifrazione dipende essenzialmente dalla concentrazione corpuscolare di emoglobina. Il valore centrale della distribuzione degli indici di rifrazione rappresenta la CONCENTRAZIONE CORPUSCOLARE MEDIA DI EMOGLOBINA (MCHC). L’ampiezza della distribuzione (σ)delle concentrazioni di Hb rapportata al valore della media (MCHC) dà luogo ad un indice eritrocitario noto come ANISOCROMIA (hemoglobin distribution width, HDW). Se aumenta il numero di eritrociti con valore basso di emoglobina corpuscolare (ipocromici), la base dell’istogramma si sposta a sx; sono, invece, rare le situazioni di aumento di Hb corpuscolare (sferocitosi ereditaria o acquisita) ed in tali casi l’istogramma si sposta verso dx. • Valori normali Hb: UOMINI: 13,5 - 18 g/dl DONNE: 12 - 16 g/dl 2. Ematocrito L’altezza del sedimento eritrocitario, ottenuto dopo centrifugazione, rapportata a quella dell’intero campione di sangue, fornisce la percentuale di GR nel sangue (metodo diretto); Tuttavia, di norma viene calcolato nei moderni contaglobuli automatizzati, indirettamente come: MCV (fl)x RBC (x1012 /l) Ht (%) 1000 RBC (red blood cells): numero di GR MCV (mean corpuscolar volume): volume corpuscolare medio dei GR Valori anomali dell’ematocrito possono ritrovarsi in condizioni di policitemia, macrocitosi, sferocitosi, anemie ipocromiche, alterazioni morfologiche degli eritrociti. • Valori normali Ht: UOMINI: 40 - 54 % DONNE: 38 - 47 % 3. Numero assoluto di eritrociti nel sangue (RBC) Può essere valutato con metodi diretti (microscopia ottica, con camere di conta) o con metodi indiretti, tramite contatori elettronici (counters) 4. Indici corpuscolari o eritrocitari (ampiamente utilizzati nelle classificazioni dielle anemie) MCV (mean cellular volume): rappresenta il volume cellulare medio di un globulo rosso; si considera l’insieme di valori (insieme di volumi) di luce scatterata (dispersa) nei contaglobuli automatizzati e si calcola il valore medio (MCV). L’ intervallo di riferimento è: 80 - 100 fl (femtolitri). Rispetto al volume, il GR può essere definito NORMOCITA se ha MCV normale, MICROCITA con valore di MCV più basso del normale e MACROCITA con valore di MCV più alto del normale. Nella MICROCITOSI, la quota di microciti totali aumenta tanto da rappresentare la maggioranza degli eritrociti; nella MACROCITOSI accade il contrario. Il rapporto tra il grado di dispersione dei volumi (σ), che corrisponde all’ampiezza della base dell’istogramma, ed il valore medio (MCV) consente di calcolare l’INDICE DI ANISOCITOSI, RDW (red cell distribution width), il cui valore esprime il grado di eterogeneità dei volumi dei GR. L’ intervallo di riferimento è: 11,6 - 14,6 %. Un valore più alto, che indica elevata eterogeneità, è caratteristico di anemie, talassemie, emoglobinopatie. Ampiezza MCV RDW = Ampiezza/MCV MCH (mean corpuscolar hemoglobin): espresso in picogrammi, è il rapporto tra il valore della concentrazione di emoglobina ed il numero di globuli rossi per mm3. L’intervallo di riferimento è: 26 - 32 pg (emazie NORMOCROMICHE). Valori inferiori a 26 pg indicano IPOCROMIA delle emazie, valori superiori a 32 pg indicano IPERCROMIA delle emazie. MCHC (mean corpuscolar hemoglobin concentration): espresso in percentuale, è il rapporto tra il valore della concentrazione di emoglobina e l’ematocrito L’intervallo di riferimento è: 32 - 36 %. Volume corpuscolare medio (MCV) Interpretazione indici eritrocitari Macrocitica ipocromica Macrocitica normocromica Macrocitica ipercromica Normocitica ipocromica Normocitica normocromica Normocitica ipercromica Microcitica ipocromica Microcitica normocromica Microcitica ipercromica Concentrazione emoglobinica corpuscolare media (MCHC) STRISCIO DI SANGUE PERIFERICO Usato sangue capillare o sangue venoso appena prelevato (event. trattato con EDTA, che consente per alcune ore una buona conservazione degli elementi figurati). Si deposita sul vetrino una piccola goccia di sangue vicino all’estremità destra, vi si appoggia sopra il margine del vetrino molato (a formare un angolo di circa 30°); si fa scorrere il vetrino inclinato verso sinistra. Il movimento di scorrimento deve essere piuttosto rapido ed uniforme. Si fa asciugare lo striscio all’aria per circa 30’, ma senza farlo essiccare, e si effettua la colorazione di May Grunwald-Giemsa, che, oltre a colorare, serve per fissare lo striscio: è una soluzione metilica di blu di metilene (basico) ed eosina (acido); La colorazione avviene aggiungendo per 3’ il reattivo di May-Grunwald, facendo cadere sul vetrino tante gocce di colorante finché sarà coperto completamente. Si aggiunge acqua distillata direttamente sul liquido colorante e si lascia agire per 1’. Si lava abbondantemente con acqua distillata. Colorare con reattivo di Giemsa (diluito 1:3 con acqua tamponata) per 15’, lavare con acqua. I coloranti acidi, presenti in questa colorazione, colorano la parte basica della cellula, mentre i coloranti basici colorano la parte acida. 1. Raccolta del campione 2. Preparazione del vetrino 3. Fissaggio con May-Grunwald 4. Colorazione con Giemsa (blu di metilene ed eosina) 5. Montaggio e osservazione A fine colorazione: gli eritrociti (GR) appariranno in rosa intenso; il nucleo dei leucociti (GB) dovrà apparire in violetto intenso; i granuli dei granulociti neutrofili in rosa pallido; quelli dei gran. eosinofili in rosa intenso; quelli dei gran. basofili in bleu. Esame morfologico dei GR In uno striscio ben eseguito, i globuli rossi si presentano disposti gli uni accanto agli altri e appaiono come dischi biconcavi (schiacciati al centro). Esaminando i GR in uno striscio di sangue si terranno presenti i seguenti caratteri : dimensioni, forma e colore. Dimensioni: il valore normale è 7,2 - 7,8 μm Se il valore > 7,8 μm : macrociti; se il valore < 7,2 μm : microciti Se in uno striscio prevalgono i microciti o i macrociti, si parla rispettivamente di microcitosi o macrocitosi L’insieme di GR con dimensioni diverse prende il nome di anisocitosi. Normali Macrocitosi Microcitosi Forma: i globuli rossi devono essere tondeggianti. In molte forme di anemia, accanto a GR a contorni tondeggianti, se ne trovano altri con forme irregolari (ovoidali, a pera, a falce, sferica, frammenti globulari, ecc.). Questi GR presentanti forme irregolari vengono indicati col termine di poichilociti e la loro presenza in uno striscio viene indicata col termine di poichilocitosi. Ovalociti GR a forma di falce Sferocitosi Colore: i globuli rossi appaiono di un colore roseo-grigiastro; normalmente presentano una colorazione più intensa alla periferia, mentre nella parte centrale appaiono meno colorati. Quelli colorati più intensamente del normale vengono indicati col termine di ipercromici: questi presentano spesso una colorazione uniforme e in essi non è visibile, o è molto meno evidente, l’area centrale meno colorata. I GR meno colorati dei normali sono indicati col termine di ipocromici: l’area centrale meno colorata è assai più estesa e il globulo rosso appare trasformato in un dischetto chiaro circondato da un sottile alone colorato in rosa. ipercromici ipocromici cellule a bersaglio Velocità di eritrosedimentazione (VES) La VES è un test di laboratorio che misura la velocità di sedimentazione (in mm/h) degli eritrociti nel plasma in cui sono sospesi, o meglio misura la distanza percorsa da un eritrocita in una provetta verticale in un determinato intervallo di tempo; La sedimentazione dei globuli rossi dipende dalla loro capacità di aggregarsi, formando i cosiddetti rouleaux, cioè pile di cellule, che si formano per semplice attrazione delle superfici; In condizioni normali, la capacità di aggregarsi è relativamente bassa perché tra i globuli rossi esistono delle forze di repulsione che li tengono sospesi nel plasma. Se nel sangue aumenta la presenza di globuline o di fibrinogeno (si riducono le forze di repulsione che allontanano i globuli rossi uno dall'altro ed aumenta la viscosità plasmatica), i rouleaux si formano più facilmente e, di conseguenza, la VES aumenta. La formazione degli aggregati dipende dalla forma degli eritrociti e dalla composizione del plasma Importanza diagnostica della misura della VES Il metodo di determinazione più usato è il Westergren: campione di sangue con sodio citrato (reso, così, incoagulabile) lasciato sedimentare per un’ora in una provetta di vetro lunga 20 cm e di piccolo calibro. La misura della VES ha principalmente tre scopi: segnalare la presenza di un processo infiammatorio controllare il decorso o lo stato di attività di una malattia individuare patologie occulte Pur mancando di specificità e di sensibilità, il test è ancora largamente usato perché economico e di facile esecuzione. È inoltre utile come test di primo livello perché infiammatori la acuti maggior e cronici parte e dei processi delle malattie neoplastiche si associano ad un aumento della VES. LEUCOCITOPOIESI Leucociti: Granulociti (Neutrofili, Eosinofili, Basofili) Linfociti Monociti/Macrofagi I globuli bianchi si differenziano dai globuli rossi per il fatto che possiedono un nucleo. Effettuata la conta assoluta dei GB; il conteggio differenziale (FORMULA LEUCOCITARIA) consente di misurare la percentuale di ogni tipo cellulare presente (non sempre fatto). Per effettuare la conta assoluta usate camere di conta (Burker) o contaglobuli automatizzati; per la conta differenziale il metodo più usato è l’esame al microscopio dello striscio di sangue. Intervallo di riferimento GB totali: 4000 - 11000/μl MEGACARIOCITOPOIESI I megacariociti sono i precursori delle piastrine circolanti; Le piastrine sono determinanti nell’EMOSTASI, ossia impediscono le emorragie formando una sorta di tappo sulle lesioni dei capilari e favoriscono la coagulazione del sangue; La proliferazione e la maturazione delle piastrine è regolata da un ormone simile all’Epo, ossia la TROMBOPOIETINA (TPO). Le piastrine circolanti non possiedono il nucleo, perso durante la maturazione; si colorano in blu chiaro ed hanno numerosi granuli citoplasmatici contenenti elementi importanti per l’emostasi; Il numero di piastrine circolanti è mantenuto in limiti ristretti, regolato da fattori come la loro massa totale nell’organismo ed il rilascio di TPO; In risposta a stimoli adeguati la quantità può aumentare fino a tre volte. Il conteggio delle piastrine (PLT) è uno dei parametri dell’emostasi; Una diminuzione delle piastrine circolanti (TROMBOCITOPENIA) può essere causato da un difetto del midollo o da un’emorragia, che però è evidente solo al di sotto delle 40000 piastrine/mm3. Intervallo di riferimento piastrine: 150.000 – 450.000/μl Metabolismo del Ferro Ogni ml di globuli rossi richiede 1 mg di Fe Ogni giorno la richiesta di Fe è di 20-25 mg → 95% riciclato (da eritrociti distrutti nel turnover cellulare e dal catabolismo dell’emoglobina). Il Fe libero è tossico → in deposito legato a proteine (ferritina ed emosiderina) Assorbimento del ferro Avviene a livello gastro-intestinale, con un massimo a livello del duodeno (favorito dal valore di pH); Il livello di assorbimento è variabile: assimilata solo la quantità sufficiente a coprire le perdite, il resto è eliminato; Favoriscono l’assorbimento di ferro non EME: volume ed acidità del succo gastrico, acido ascorbico, acido citrico (riduzione del metallo a ione ferroso); ostacolano l’assorbimento di ferro non EME : fibre, polifenoli, tannini, farmaci antiacido ecc. Deposito e trasporto del ferro Circa il 10-20% del ferro corporeo totale è immagazzinato come FERRITINA, presente essenzialmente nel fegato, nella milza, e nel tessuto eritropoietico. La componente proteica è data dall’APOFERRITINA e nella cavità interna possono essere immagazzinati più di 4500 atomi di ferro sotto forma di un complesso polinucleare in associazione con fosfato. La ferritina del siero (Ferritinemia) si ritrova in concentrazioni molto basse (20280 μg/l), dimostrando di essere un ottimo indicatore delle riserve di ferro nei tessuti: valori molto elevati sono indicazione di un sovraccarico di ferro (leucemia, neoplasie, emocromatosi…), valori molto bassi indicano deplezione delle riserve di ferro (anemia sideropenica, deficit nutrizionali, emorragie, gravidanza,......). Anche l’emosiderina è una proteina di deposito del ferro: deriva dalla ferritina, che ha subito parziale ‘digestione’, e composta da materiale glucidico, proteico e lipidico; presente come complessi insolubili nelle cellule del SRE, più difficilmente mobilizzabili. Il ferro assunto nella mucosa intestinale è trasferito al sangue, dove si lega ad una proteina di trasporto, la TRANSFERRINA (Tf), una β-globulina plasmatica sintetizzata dal fegato che presenta due siti per la captazione degli ioni ferrici, alle estremità Ne C- terminali Si lega a recettori di membrana specifici (TfR) sui precursori degli eritrociti e cede loro il ferro necessario per la sintesi dell’eme nei mitocondri. Normalmente nel sangue 1/9 di tutta la transferrina è saturata in entrambi i siti di legame, i 4/9 in uno dei due siti e i restanti 4/9 presentano siti insaturi (fondamentali per la captazione del ferro libero). La sua sintesi avviene con una velocità inversamente proporzionale alle scorte di ferro. Di conseguenza la concentrazione di transferrina plasmatica tende ad aumentare in caso di sideropenia. (Transferrinemia: 240-380 mg/dl) Deposito Produzione GR Valutazione di laboratorio dello stato del ferro 1. Striscio di sangue periferico ANEMIA MICROCITICA IPOCROMICA DA CARENZA DI FERRO Notare le piccole cellule con un stretto bordo di emoglobina situato in zona periferica, in contrasto con le sporadiche cellule completamente colorate (emoglobinizzate) derivanti da sangue appena trasfuso nel paziente 2. Ferro nel siero (SIDEREMIA) Ferro non legato all’emoglobina, misurato con metodo colorimetrico e spesso in abbinamento con la Capacità Totale di Legare il Ferro. Essendo la quota di ferro libero nel sangue trascurabile (perché tossico), la sideremia di fatto misura il ferro legato alla transferrina: la quota di transferrina legata coincide con il valore della sideremia. Effettuata al mattino, dopo digiuno di 12 ore e dopo sospensione di trattamenti farmacologici a base di ferro per 12-24 ore. Aspetti patologici: si ha diminuzione di ferro nelle infezioni croniche e nei tumori maligni; si ha aumento nell’avvelenamento da ferro, nell’emolisi intravascolare, nella necrosi epatica, nell’anemia perniciosa e nell’emocromatosi. 3. Capacità Totale di Legare il Ferro (TIBC) Misura la capacità delle proteine plasmatiche di legare il ferro: è una misura indiretta della transferrina (TRANSFERRINEMIA). Dopo aver aggiunto un eccesso di Fe3+, per saturare tutti i siti leganti della transferrina, e aver lavato via l’eccesso, si determina, con metodo colorimetrico, la quantità di ferro capace di saturare al 100% la transferrina plasmatica. Valori di riferimento: 250-450 μg/dl Aumento in caso di carenza di ferro, in caso di danno epatico acuto ed in gravidanza, diminuzione in emocromatosi, in cirrosi del fegato, in sovraccarico di ferro, in malattie croniche e in casi di malnutrizione 4. Saturazione della Transferrina Percentuale di saturazione : Sideremia x 100 TIBC Valori di riferimento: 20-50 % Aumento in caso di anemia sideroblastica, nell’avvelenamento da ferro, nell’emolisi cardiovascolare e nell’emocromatosi, mentre si ha diminuzione in caso di carenza di ferro e in malattie croniche. 5. Ferritina sierica (FERRITINEMIA) La ferritina presente nel plasma, in una concentrazione molto bassa, è in equilibrio con quella presente nei tessuti → buon indicatore dei depositi di ferro. Misurata con tecniche IRMA o ELISA; Valori di riferimento: 20-250 μg/l per l’uomo e 10-200 μg/l per la donna e i bambini; Utile per distinguere anemie microcitiche ipocromiche causate da carenza di ferro da quelle con diversa eziologia (associate a malattie croniche) Valori elevati si hanno in processi infiammatori, nelle malattie epatiche, nei tumori maligni; valori bassi (<10 μg/l) si hanno in caso di carenze di ferro. ANEMIE Definizione: Riduzione quantità Hb circolante negli eritrociti del sangue periferico I valori della concentrazione di Hb devono essere inferiori a: 11 g/dl per i bambini e in gravidanza 12 g/dl per donne 13 g/dl per i maschi Per convenzione si considera la concentrazione di Hb supponendo che il volume ematico rimanga costante. Ciò non avviene in alcune situazioni cliniche: Emorragia acuta Gravidanza (> volume plasmatico) Ritenzione idrica Esami di laboratorio di routine nella diagnosi dell’anemia 1. Esame Emocromocitometrico 2. Indicatori metabolismo Ferro 3. Conteggio Reticolociti 4. Striscio sangue periferico (esame morfologia eritrocitaria) 5. Bilirubina 6. LDH 1. Esame Emocromocitometrico Comprende: Conta globuli rossi, globuli bianchi e formula leucocitaria, piastrine Dosaggio Hb, Ht 2. Indicatori metabolismo del ferro Sideremia: ferro plasmatico Valori di riferimento: ~50-150 μg/dl Transferrinemia plasmatica: espressa come TIBC (“capacità totale di legare il ferro”), dà la misura di ferro che la transferrina del plasma è in grado di legare. Valori riferimento: 250 - 450 μg/dl Saturazione transferrinica (%): rapporto percentuale fra sideremia e TIBC Valori riferimento: 20 - 50% Ferritina plasmatica: è in equilibrio con la Ferritina dei depositi; ci dà un’indicazione sulle riserve di ferro che possono venire mobilizzate per la sintesi dell’Hb Valori riferimento: 20-250 μg/l uomini, 10-200 μg/l donne 5. Bilirubina La bilirubina è un prodotto del catabolismo dell'emoglobina; è un pigmento di colore giallo-rossastro; Proviene per l’80% dalla distruzione di globuli rossi senescenti nel SRE e per il 20% dal catabolismo di emoproteine (mioglobina, citocromi, catalasi); L'emoglobina contenuta nei GR viene catabolizzata e l'eme che viene liberato viene convertito nel SRE in biliverdina, grazie all’eme-ossigenasi, con distacco del ferro e della globina: HO-1 BVR Bilirubina EME Biliverdina La biliverdina diventa bilirubina grazie all’enzima biliverdina-reduttasi. Questa è la bilirubina non coniugata (o indiretta), è insolubile e quindi per essere trasportata all'interno del sangue deve essere legata ad una proteina sierica prodotta dal fegato, l'albumina. All’interno delle cellule epatiche si distacca dall'albumina e viene coniugata con acido glucuronico con formazione della bilirubina diretta o coniugata. Nelle patologie in cui viene distrutta troppa emoglobina oppure l'eliminazione di bilirubina non funziona bene, quest’ultima si accumula nel sangue e nel corpo → IPERBILIRUBINEMIA = ITTERO Si possono distinguerne diverse forme: a) ittero emolitico, dovuto ad elevata distruzione di globuli rossi (anemie ereditarie, quali la talassemia, anemie tossiche e immunologiche, incompatibilità fra sangue materno e fetale). In questo tipo di ittero aumenta principalmente o esclusivamente la frazione libera della bilirubina, ovvero l’ indiretta. b) ittero da alterazione di escrezione della bilirubina da parte del fegato (epatiti virali, tossiche o dismetaboliche, cirrosi, cancro); c) ittero da stasi di bile (ostruzioni delle vie biliari intra o extraepatiche, da calcoli, restringimenti e compressioni); Valori di riferimento nel siero: Bilirubina Totale: 0,3 -1,1 mg/dl Bilirubina Diretta: 0 - 0,4 mg/dl Bilirubina Indiretta: 0,3-1 mg/dl Classificazione anemie Diversi sono i criteri i base ai quali si possono classificare varie forme di anemia: 1. Sulla base del contenuto di emoglobina, l’anemia può essere IPOCROMICA o NORMOCROMICA; 2. Sulla base delle dimensioni degli eritrociti può essere NORMOCITICA, MICROCITICA o MACROCITICA; 3. Su base fisiopatologica, che relaziona le anemie ai diversi meccanismi che le determinano, che sono principalmente di due tipi: INSUFFICIENTE PRODUZIONE MIDOLLARE, cui si associa un numero normale o ridotto di reticolociti (ANEMIE NORMO-IPORIGENERATIVE). ANOMALIE DEL SANGUE CIRCOLANTE, CON PERDITA O DISTRUZIONE DI EMAZIE CIRCOLANTI (numero reticolociti normale o aumentato) (ANEMIE RIGENERATIVE). Per un primo, iniziale orientamento, dunque, si effettua un emocromo, da cui, oltre al dosaggio di emoglobina, si valuta il valore dell’MCV, mediante il quale si possono classificare le anemie così: ANEMIE MICROCITICHE NORMO-IPORIGENERATIVE MCV < 80 fl e numero assoluto reticolociti normale o basso Anemia sideropenica Talassemia Anemie associate a malattie croniche Anemia sideroblastica Sono tutte associate a sintesi emoglobinica anomala o ridotta Anemia sideropenica Causata da carenza di ferro, è l’anemia più frequente in assoluto. È dovuta allo squilibrio tra le esigenze di ferro per la sintesi di Hb e la disponibilità presente nei depositi. Il midollo, così, non riesce a produrre emazie sufficienti né a dotarle di una sufficiente quantità di Hb e s’instaura un’anemia ipocromica e microcitica. Le cause della carenza di ferro possono essere: Gravidanze; Emorragie digestive occulte (ulcera peptica, tumori intestinali, malattie infiammatorie croniche intestinali, varici esofagee); Malassorbimento (gastrectomia totale o parziale, celiachia); Scarso apporto alimentare (dieta esclusivamente vegetariana, lattanti con dieta esclusivamente lattea) Talassemie (EMOGLOBINOPATIE) Le talassemie (ANEMIA MEDITERRANEA) sono un gruppo eterogeneo di emopatie ereditarie recessive, caratterizzate dalla RIDOTTA O ASSENTE SINTESI dell'emoglobina (ipocromia). Ridotta sintesi catene α → α -TALASSEMIE Ridotta sintesi catene β → β -TALASSEMIE α -TALASSEMIE Malattia ereditaria autosomica recessiva e che si manifesta fenotipicamente con vari livelli di patologia ematologica. Infatti, in ogni cromosoma 16 si trovano due geni globinici, quindi ogni individuo possiede 4 geni α; α- la gravità della malattia varia in base al numero di geni deleti. α0-talassemie: sintesi α -catene soppressa α +-talassemie: sintesi α -catene ridotta 1. Delezione un gene = Portatore silente 2. Delezione due geni= Talassemia minor (tratto talassemico) 3. Delezione tre geni = Malattia da HbH 4. Delezione quattro geni = Idrope fetale placentare Genotipo fenotipo Hb Bart Emoglobina / Normal --- Normal /- Silent carrier --- Normal /- - or -/- -thal. trait 2-10% in newborn Mild hypochromic anemia. -/-- Hb H disease 20-40% newborn; 5-40% Hb H in adults Hemolytic disease; ineff. erythropoiesis --/-- Hydrops fetalis ~100% in cord blood Stillborn, anemic macerated fetus. β -TALASSEMIE In ogni cromosoma 11 c’è un locus β-globinico, quindi gli individui eterozigoti avranno un gene normale ed uno alterato, mentre gli omozigoti avranno entrambi i geni alterati β0-talassemie: sintesi β -catene soppressa (Talassemia Major, Morbo di Cooley o anemia mediterranea) β +-talassemie: sintesi β -catene ridotta (Talassemia Minor) Non è evidenziabile immediatamente alla nascita (HbF, α2γ2); verso i 3-6 mesi si manifesterà eritropoiesi inefficace causata da emolisi intramidollare Genotype Phenotype Hematologic Findings Heterozygote (/) Silent carrier or thalassemia minima Normal Heterozygote (/ or /) Thalassemia minor Mild hypochromic anemia. Homozygote or compd hetero. (/) Thalassemia intermedia Moderate hemolytic anemia & ineffective erythropoiesis Homozygote or compd hetero. (/) Thalassemia major Severe hemolytic anemia & ineffective erythropoiesis Anemie associate a malattie croniche Malattie croniche, come infezioni croniche (tubercolosi, malaria), processi infiammatori cronici (artrite reumatoide, morbo di Crohn, collagenopatie), tumori maligni, sono caratterizzate da anemia microcitica ipocromica e non vanno per questo confuse con anemie da carenza di ferro: il difetto di base è un’inefficiente utilizzazione del ferro per l’eritropoiesi. Anemie sideroblastiche Gruppo eterogeneo di disordini eritrocitari che presentano difettosa sintesi dell’EME da parte degli eritroblasti. DIAGNOSI DI LABORATORIO: Anemia IPOCROMICA MICROCITICA Presenza nel midollo di sideroblasti ad anello nel midollo (eritroblasti abnormi in cui il ferro non emoglobinico si distribuisce in granuli disposti ad anello in zona perinucleare) → necessità di esame al microscopio Sono sia congenite che acquisite; > Sideremia, Saturazione Transferrinica,Ferritina ANEMIE MACROCITICHE NORMO-IPORIGENERATIVE MCV >100 fl e numero assoluto reticolociti normale o basso ANEMIE MEGALOBLASTICHE Alterata sintesi del DNA → Nucleo ridotto rispetto al citoplasma Dovute a carenze di fattori alimentari (vitamina B12 e/o folati) o di costituenti fisiologici (Fattore Intrinseco) o alla presenza di anticorpi diretti contro il fattore intrinseco Anemia perniciosa Forma anemica dovuta a carenza di vitamina B12, conseguente a mancata secrezione da parte delle cellule parietali dello stomaco del fattore intrinseco (per azione di autoanticorpi anti-FI); Si manifesta con il tipico quadro ematologico dell’anemia macrocitica megaloblastica, accompagnato da lesioni neurologiche e dell’epitelio del tubo gastroenterico; Numerosi farmaci possono indurre anemia megaloblastica, ed alcuni interferiscono con il metabolismo dei folati: il metotrexato ed il trimetoprim inibiscono l’enzima reduttasi che dà luogo alla forma attiva dell’acido folico; altri farmaci, come gli antiepilettici, i barbiturici, i contraccettivi orali inibiscono l’assorbimento dei folati. ANEMIE NORMOCITICHE IPORIGENERATIVE Sono anemie in cui si ha una riduzione quantitativa del tessuto midollare, o per diminuzione del numero assoluto di cellule staminali o per la presenza di cellule staminali anormali. Tali alterazioni coinvolgono non solo la linea eritroide, ma anche le altre linee, potendo quindi generare: Eritrocitopenia Leucopenia PANCITOPENIA Trombocitopenia Anemia aplastica, Sostituzione midollare, Anemia refrattaria (sindromi mielodisplastiche) ANEMIE IPER-RIGENERATIVE Sono anemie dovute a cause che risiedono nel sangue circolante e si rende evidente con la PERDITA o DISTRUZIONE DELLE EMAZIE CIRCOLANTI: ANEMIE EMORRAGICHE ACUTE ANEMIE EMOLITICHE E’ semplice distinguere tra le due situazioni, poiché il sanguinamento è manifesto (a meno di un sanguinamento interno) o i reperti di laboratorio indicano chiara emolisi (aumento di LDH e di bilirubina e diminuzione di aptoglobina). L’aumento dei reticolociti è quasi sempre presente in entrambi i casi. Anemia da emorragia Nelle anemie dovuta a emorragia (la risposta eritropoietica impiega circa una settimana per compensare la perdita di sangue; al contrario, si instaurano in poche ore trombocitopoiesi e leucocitopoiesi), in genere normocromiche e normocitiche, si verifica anossia tissutale che, a livello renale, entro 6-7 ore dall’evento causa un incremento di Epo che stimola l’eritropoiesi, che dopo 24-48 h si manifesta con l’aumento del numero di reticolociti circolanti. Se il sangue si riversa nelle cavità corporee o nei tessuti molli (invece che all’esterno), le cellule e l’emoglobina devono essere degradate: ciò provoca aumentati livelli ematici di urea e di bilirubina Anemie emolitiche Sono anemie dovute alla breve sopravvivenza delle emazie in circolo, dovute a : Difetti intracorpuscolari (intrinseci) Difetti extracorpuscolari (estrinseci) Il grado e la severità dell’anemia dipendono, ovviamente, dalla velocità con cui vengono distrutti gli eritrociti circolanti e dalla capacità del midollo di compensare tale perdita Anemie emolitiche da difetti intracorpuscolari Alterazioni membrana eritrocitaria Alterazioni da deficit enzimatici Alterazioni qualitative Hb (emoglobinopatie) Sindromi talassemiche (già viste) Alterazioni membrana eritrocitaria Importanza del mantenimento dell’integrità strutturale della membrana eritrocitaria, che deve resistere alle forze meccaniche che tendono a deformarla durante il passaggio attraverso i capillari: per resistere a tali forze ed allo stress osmotico, la membrana DEVE ESSERE DEFORMABILE → importante il ruolo delle proteine dello scheletro (spec. spectrina, actina); Deficit molecolari a carico di proteine dello scheletro di membrana provocano perdita di frammenti della membrana stessa, con diminuzione del rapporto superficie/volume e aumento di sensibilità cellulare alla lisi osmotica → SFEROCITOSI, ELLISSOCITOSI, STOMATOCITOSI ecc Difetti ereditari di enzimi eritrocitari La presenza di enzimopatie può essere associata ad alterazioni del metabolismo cellulare degli eritrociti, che può comportare una riduzione della sua vita media. Sono molto rare, ad eccezione del deficit di GLUCOSIO - 6-FOSFATO DEIDROGENASI (G6PDH) Il G6PDH, enzima della prima tappa della via dei pentoso-fosfati, è il solo mezzo per produrre NADPH nell’eritrocita; il NADPH consente agli eritrociti di resistere agli stress ossidativi (mediante produzione di GSH), ed un suo deficit impedisce ai GR di neutralizzare i fattori ossidanti, i quali provocano denaturazione ossidativa di molte proteine, compresa l’emoglobina che si distaccherà dalla membrana eritrocitaria precipitando come corpi di Heinz. Emoglobinopatie Le varianti strutturali delle catene emoglobiniche possono determinare emolisi; l’emoglobina patologica più nota e comune è l’emoglobina S (sickle, falce), in cui l’acido glutammico (idrofilico) in posizione 6 della catena β è sostituito da un residuo neutro di valina (idrofobico). Possono essere, tuttavia, presenti anche numerose altre sostituzioni, più o meno influenti sulle condizioni cliniche, anche in altre catene emoglobiniche (che daranno HbC,HbD, ecc), che danno origine a più di 600 varianti strutturali e funzionali note a tutt’oggi. La presenza dell’emoglobina S (HbS) dà origine alle SINDROMI FALCEMICHE: eterozigosi AS, omozigosi SS, emoglobinopatia SC, talasso-drepanocitosi. Anemia Falciforme (drepanocitica) Ne sono affetti soggetti in omozigosi per l’emoglobina S (SS). Il particolare aspetto a “falce” degli eritrociti è determinato dalla formazione di complessi proteici che si formano quando l’Hb è deossigenata: le catene proteiche assumono una conformazione tale da essere perfettamente impilabili determinando la formazione di lunghi filamenti insolubili le une alle altre, (fibrille emoglobiniche: tactoidi)ad alte concentrazioni. Gli eritrociti diventano, così, poco flessibili e deformabili, poco resistenti a forze meccaniche ed osmotiche, per cui vanno incontro a emolisi intravasale (vita ridotta). L’anemia emolitica è di gravità variabile, dura tutta la vita, e le evidenze cliniche sono sicuramente aumentata emolisi, aplasia midollare e dolorose occlusioni vascolari (crisi infartuali). Altre varianti: HbC: (in catena β, acido glutammico in posizione 6 sostituito da lisina) poco solubile, ma cristalli di HbC si sciolgono e gli eritrociti si trasformano in eritrociti a bersaglio o microsferociti HbE: (in catena β, la lisina sostituisce l’acido glutammico in posizione 26): < sintesi catene globiniche per cui il gene HbE determina anomalia strutturale con fenotipo Talassemico. HbD, E-beta-talassemia (HbE-βT), Emoglobine m, Metaemoglobinemia Esame dello striscio di sangue periferico: Necessaria l’elettroforesi delle emoglobine per dimostrare la presenza o meno di emoglobine anomale: WIKIPEDIA!!!!! Anemie emolitiche da difetti extracorpuscolari Le anemie emolitiche da difetti estrinseci sono classificabili: Anemie non immunoemolitiche Anemie immunoemolitiche (mediate da anticorpi) Anemie non immunoemolitiche Il tempo di vita degli eritrociti può diminuire se subiscono attacchi da parte di agenti fisici, chimici, meccanici, da parte di radiazioni, calore, enzimi, tossine ecc. Anemia emolitica da cause cardiache: (protesi valvolari, difetti intracardiaci, stenosi valvolare aortica): in questi casi si ha flusso ematico turbolento e danno meccanico alle emazie = emolisi. Anemia emolitica con depositi di fibrina: caratterizzata da emolisi quando gli eritrociti urtano contro la fibrina depositata nei vasi. Ipersplenismo: la milza, che normalmente distrugge i GR invecchiati, se subisce un aumento di volume (causato da malattie epatiche, leucemie, linfomi, ecc), provoca un aumento della distruzione eritrocitaria, anche di cellule normali. Anemia emolitica nelle infezioni: 1.Bartonellosi (il batterio aderisce alla membrana eritrocitaria) 2.Malaria (Plasmodium entra direttamente nel globulo rosso) Inoltre : Veleno di serpente Puntura di insetti Metalli Temperatura > 47- 49 °C Anemie immunoemolitiche Dovute alla presenza di anticorpi anti-eritrociti (γ-globuline), diretti contro antigeni della membrana eritrocitaria. E’ possibile la presenza di alloanticorpi o autoanticorpi. Alloanticorpi: Ab prodotti da un individuo contro antigeni eritrocitari di soggetti di specie omologa, ma geneticamente diversi dal soggetto che ha prodotto gli Ab: ciò accade, ad es., in seguito a: trasfusione sangue incompatibile o ancora per incompatibilità maternofetale: Malattia Emolitica del Neonato, MEN) Autoanticorpi: Ab prodotti da un individuo contro determinanti antigenici dei suoi stessi globuli rossi, che determinano un minore tempo di vita degli eritrociti. Le cause per le quali ciò avviene non sono chiare. In molti casi sono proprio i farmaci ad indurre la produzione di autoanticorpi o a legarsi ad anticorpi formando complessi che si legano alla superficie degli eritrociti, cui segue l’attivazione del complemento e lisi cellulare. 2 MECCANISMI: Oltre alle forme da farmaci, le anemie emolitiche autoimmuni possono essere classificate su caratteristiche specifiche degli anticorpi, che mostrano una certa eterogeneità: Auto Ab Caldi: presentano optimum attività a temperature > 30°Cper legarsi alle emazie. Al 90% sono IgG; definiti anche Ab Incompleti poiché non sono in grado di formare legami intercellulari e produrre, quindi, agglutinazione. Auto Ab Freddi (crioagglutinine): presentano optimum attività a 0-4°C e comunque agiscono a temperatura < rispetto quella corporea, perché il potere agglutinante diminuisce con l’aumentare della temperatura. Sono di tipo IgM (Ab Completi, in grado, quindi, di provocare agglutinazione) Un paziente con il sospetto di anemia emolitica autoimmune è valutato prima di tutto con il TEST DI COOMBS, diretto e indiretto. TEST DI COOMBS DIRETTO Consente l’accertamento della presenza di anticorpi incompleti ADESI ALLA SUPERFICIE DEI GR. Se, aggiungendo alle emazie del paziente il siero di Coombs, (contenente antiglobuline umane) si osserva il fenomeno dell'agglutinazione, il test è positivo; se non agglutinano, il test è negativo. La modalità diretta è utilizzata nella diagnosi della MEN (Malattia emolitica del neonato), delle MEA (Malattie emolitiche autoimmuni), per la visualizzazione delle reazioni trasfusionali (a causa del legame dei GR del donatore con anticorpi presenti in circolo nel ricevente) e nelle anemie immuno-mediate, legate all’assunzione di farmaci). TEST DI COOMBS INDIRETTO Consente l’accertamento della presenza di anticorpi incompleti PRESENTI NEL SIERO. L'esame avviene prelevando del siero al paziente, che viene messo a contatto con emazie normali, in cui siano noti gli antigeni presenti sulla membrana. Se, aggiungendo il siero di Coombs, avviene la reazione di agglutinazione, il test è positivo, cioè nel siero sono presenti gli anticorpi in esame. Il test di Coombs indiretto è uno dei tanti esami previsti in gravidanza o per la valutazione della compatibilità pre-trasfusionale (si ricorda che la trasfusione del sangue può essere effettuata soltanto tra gruppi sanguigni compatibili fra loro); una positività del test di Coombs quando viene fatto reagire il siero del soggetto che deve essere trasfuso con gli eritrociti del sangue da trasfondere mette in evidenza l'incompatibilità di quest'ultimo alla trasfusione. Ad es., al siero della madre (con eventuali anticorpi anti-D) si aggiunge il sangue del feto e quindi il siero di Coombs. La positività del test (presenza di agglutinazione) significa che sono presenti gli anticorpi anti-D. (il neonato può essere exsanguinotrasfusione con curato con sangue negativo, il feto con trasfusioni intrauterine) Rh Diagnosi di laboratorio in Anemia Emolitiche Reticolocitosi Iperbilirubinemia indiretta Urobilinogeno urinario e fecale aumentato Ipersideremia Aptoglobina diminuita Emopessina diminuita Presenza di Metaemalbumina Emoglobinemia ed emoglobinuria Test di COOMBS positivo