experimental therapy of beta-thalassemia based on the induction of

EXPERIMENTAL THERAPY OF BETA-THALASSEMIA BASED ON THE INDUCTION OF FETAL HEMOGLOB
I. The HPFH phenotype
II. Experimental model systems for the study of therapeutic agents for the induction of
erythroid differentiation and gamma-globin gene expression: the human erythroleukemia K562
cells
III. Cultures of human stem cells: an innovative system for testing the erythro-differentiating
activity of novel molecules of possible interest for the therapy of hemoglobinopathies
I. The HPFH phenotype
In some patients affected by beta-thalassemia a anomalous expression of gamma globin genes
has been observed; this leads is some cases to an increase of the level of HbF from 2.5% al
20%. This increase of HbF causes a clinical phenotype known as HPFH (High Persistence of
Fetal Hemoglobin). In HPFH the expression of fetal gamma-globin genes is maintained even in
the adult stage. Large deletions involving the delta and beta globin genes are claimed to be
responsible of a subclass of HPFH, in which both globin genes are activated. In addition, point
mutations of the gamma-globin gene promoter might be involved in another subclass of HPFH.
The exact molecular mechanism leading elevated expression of gamma-globin genes, however,
still unknown, despite the fact that a relationship between these mutations/alterations and the
HPFH phenotype appears to be a solid observation.
Patients with HPFH exhibit a positive clinical status, since the activation of gamma-globin
genes is associated with an increase of HbF, and this partly overcomes the problems caused by
the lack of HbA in thalassemia syndromes.
With the aim of mimic the HPFH phenotype, several research groups have evaluated
compounds able to induce erythroid differentiation and expression of embryo-fetal hemoglobins.
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II. Experimental model systems for the study of therapeutic agents for the induction of
erythroid differentiation and gamma-globin gene expression: the human erythroleukemia
K562 cells
Among cellular systems available for the screening of drugs able to induce erythroid
differentiation and possibly involved in reactivation of HbF production, the human
erythroleukemia K562 cell line has been largely exploited. This cell line has been indeed
proposed as a useful in vitro model to study the molecular mechanism(s) regulating the
expression of embryonic and fetal human globin genes, as well as to determine the therapeutic
potential of new differentiation-inducing compounds. The K562 cell line has been isolated from
a patient with chronic myelogenous leukemia (CML) in blast crisis. This cell line exhibits a low
proportion of Hb-synthesizing cells under standard cell growth conditions, but it is capable of
undergoing erythroid differentiation when treated with a variety of compounds, such as hemin,
cytosine arabinoside (ara-C), butyrates,5-azacytidine, chromomycin and mithramycin,
tallimustine, cisplatin and cisplatin analogo, rapamycin, angelicin. Unlike hemin, most of these
inducers inhibit cell growth and activate terminal cell division of K562 cells, as demonstrated by
culturing K562 cells in semi-solid medium. In these experimental conditions, large-sized
colonies are not differentiated, while small-sized colonies do contain large amounts of
hemoglobin.
Fig.1 and Fig.2 show typical results obtained inducing K562 to erythroid differentiation. Only
erythroid-induced K562 cells originate a red pellet, indicating accumulation of large amounts of
hemoglobins. Great advantages of this system are reproducibility of the induction process and
availability of easy detection protocols. Weekly medium changes are required to sustain in vitro
cell growth. Treatment of K562 cells with inducers is carried out by adding the appropriate drug
concentrations at the onset of the cell cultures (cells are seeded at 30,000 cells/ml). The
medium, usually, is not changed during the induction period.
Fig.2 shows the most used approach to follow erythroid induction of K562 cells. The first is the
benzidine-assay. To this aim, 5 ml of a K562 cell suspension is diluted 1:1 with ice-cooled
benzidine solution and K562 cells assuming a blue-stain are counted under a microscope. This
assay is performed daily. Fig.2A shows a comparison between a control K562 cell population
and erythroid-induced K562 cells. Fig.1 (right side of the panel) shows a typical kinetic of
appearance of benzidine positive cells. Monitoring cell number/ml is at this stage important, in
order to determine activation of terminal stages of differentiation, involving block of cell growth.
Following erythroid induction of K562 cells, Hb Portland and Hb Gower 1 accumulate, due to
increase in the expression of human embryonic and fetal globin genes. This is usually
monitored by cellulose-acetate gel electrophoresis (see Fig.2B).
Northern blotting (Fig.2C) and RT-PCR (Fig.2, D and E) are used to determine the effects of
erythroid inducers on the expression of globin genes (example of the results obtained is shown
in Fig.2). These experiments conclusively demonstrated that K562 do not express the adult beta
and delta-globin genes and, within alpha-like globin genes, the zeta-globin genes are the most
actively transcribed genes.
In conclusion, this cell line appears to be committed to differentiate along the embryo-fetal
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erythroid differentiation pathway.
However, K562 cells do express also HbF, particularly when induced to differentiation by
certain molecules, including butyrates, apicidin and valproate. This feature could be of interest
for the development of HbF inducers useful for treatment of beta-thalassemia and sickle cell
disease.
III. Cultures of human stem cells: an innovative system for testing the
erythro-differentiating activity of novel molecules of possible interest for the therapy of
hemoglobinopathies.
Un sistema cellulare molto utile per identificare molecole in grado di stimolare la produzione di
HbF è rappresentato da precursori umani delle cellule eritroidi. Queste cellule staminali
totipotenti, oltre ad essere presenti fisiologicamente nell'individuo, hanno la capacità di
riprodursi e di differenziare, sotto determinati stimoli, divenendo così un potenziale modello per
la valutazione di eventuali alterazioni dell'espressione di geni globinici embrio-fetali.
Precedentemente questi precursori eritroidi non sono stati considerati un buon modello
sperimentale in quanto erano studiati utilizzando un sistema di coltura semisolida che impediva
sia un'analisi quantitativa, sia la caratterizzazione biochimica ed immunologica dello sviluppo
cellulare.
Negli ultimi anni è stata messa a punto una nuova tecnica che prevede il trattamento dei
progenitori emopoietici in un sistema di coltura liquido. Questa tecnica prevede due fasi: nella
prima fase le cellule isolate da sangue periferico di un soggetto sano o affetto da una patologia
emopoietica, come l'anemia falciforme o la beta-talassemia, vengono seminate in terreno
alfa-MEM 1x, addizionato del 10% di medium condizionato derivante dalla linea cellulare di
carcinoma di vescica 5637, esprimente numerosi fattori nucleari e proteici necessari per la
crescita delle cellule staminali emopoietiche totipotenti. L'impiego di ciclosporina A favorisce in
questo stadio la selezione delle cellule staminali dai linfociti presenti nella coltura.
Alternativamente, per la selezione può essere necessario raccogliere le cellule non adese,
lavarle e trattarle con anticorpi monoclonali associati a biglie magnetiche che riconoscono il
recettore CD34, permettendo l'esclusione completa dei monociti, dei macrofagi e della maggior
parte dei linfociti.
La seconda fase, detta anche eritropoietina-dipendente, consiste nel coltivare le cellule isolate
in un terreno di coltura adatto, addizionato dell'ormone eritropoietina, 30% di FBS,
2-mercaptoetanolo, albumina, glutamina e desametasone che permette la proliferazione e la
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maturazione delle cellule staminali, dapprima in normoblasti cromatici e poi in eritrociti
enucleati.
Questa tecnica permette di ottenere un alto numero di cellule in coltura ed una purificata
popolazione cellulare che può quindi essere utilizzata per condurre studi relativi all'induzione
del differenziamento eritroide, sia su cellule staminali provenienti da soggetti normali, che da
soggetti affetti da patologie del sistema emopoietico. Questo sistema di coltura è estremamente
affidabile poiché il la quantità relativa delle emoglobine prodotte dalle cellule differenziate è del
tutto simile a quella rilevato in vivo.
La coltura di cellule primarie potrebbe quindi essere utilizzabile nello studio dei meccanismi
cellulari e molecolari relativi all'induzione farmacologia di HbF e potrebbe diventare in futuro un
metodo valido per valutare la risposta individuale di pazienti affetti da emoglobinopatie a terapie
farmacologiche eritro-differenzianti.
Molti dati sono riportati in letteratura relativi a composti che sono stati testati su questo nuovo
modello cellulare; ad esempio, l'idrossiurea, un inibitore della sintesi di DNA, è stato dimostrato
essere in grado di indurre produzione di HbF. Le cellule staminali usate in questo studio
provenivano da pazienti affetti sia da anemia falciforme, che da b-talassemia; l'idrossiurea ha
indotto per il primo tipo di patologia un incremento di HbF di due-cinque volte maggiore rispetto
a quello rilevato nelle cellule staminali non trattate; nel caso in cui le cellule erano state isolate
da pazienti affetti da beta-talassemia si è assistito ad un incremento variabile dal 1.3% al 6.2% .
Questo modello sperimentale ha permesso di saggiare l'attività differenziante di numerose
molecole già conosciute con un'affidabilità maggiore, trattandosi di cellule che fisiologicamente
sono presenti nel nostro organismo.
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