06 2016 Colorazione dei preparati istologici

Colorazionedeipreparatiistologici
• Percolorazione siintendeunprocedimento
cherendecoloratedeterminateporzionidei
preparatimicroscopici
• Percolorante siintendeunamolecolasolubile
fornitadicolorepropriocapacedilegarsi
stabilmenteasubstraticellularietissutali
• Ilterminesubstrato puòessereriferitoadun
compostochimicobendefinitooaduna
strutturacitologicaoistologicaidentificabile
morfologicamente
Colorazionedeipreparatiistologici
•coloranti biologici sono quelle sostanze che hanno la proprietà di rendere
visibili le strutture biologiche nei preparati microscopici.
•I coloranti si raggruppano in due grandi categorie:
•coloranti naturali
•coloranti artificiali
•I coloranti naturali
•di derivazione animale (per es. carminio)
•di derivazione vegetale (per es. ematossilina e orceina),
•sono poco numerosi e in genere scarsamente conosciuti dal punto di vista
chimico
•alcuni di essi (per es. l’indigo e l’orceina) si ottengono oggi per sintesi.
•I coloranti artificiali, una volta indicati con il nome generico di «coloranti
di anilina », sono più propriamente designati come « coal-tar (catrame)
dyes »
STRUTTURADEICOLORANTI
• Icolorantisonoingenerecompostiorganici
dellaseriearomatica
• constanodiduecomponenti
– cromoforo
– auxocromo
• Leduecomponentiinsiemeformanoil
colorantecompleto
cromoforo
• nelcromoforo,sitrovanosempreraggruppamenti
atomicidaiqualidipendeilcolore.
Proprietàdelcromoforo
• Lapresenzadipiùgruppicromofori,
aumental’intensitàdelcolore
• Ilcoloreèdovutoall’assorbimento
selettivodialcunelunghezzed’ondadella
luce
• Lalucetrasmessaoriflessadaunadata
sostanza,privatadellelunghezzed’onda
chehaassorbito,apparecolorata
auxocromo
• ilcromoforo,puressendocolorato,
nonhaproprietàcoloranti:èsoltanto
uncromogeno(generatoredicolore)
• perchéilcoloranteacquistila
proprietàdicoloraredevecontenere
anche ungrupponotocome
auxocromo
Proprietàdell’auxocromo
•
•
L’auxocromoèungruppochimicoionizzabile,unitocovalentemente al
cromoforo
L’auxocromoèresponsabile:
– dellasolubilità inacquadelcolorante
– dellasuaionizzabilità
– dellacapacitàdicontrarrelegamistabili(spessomediantelegamiditipo
salino) conleproteine oconaltricomponenti deitessuti
•
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•
•
•
Asecondadellacaricaassuntainsoluzione,l’auxocromopuòessere
– acido (quandoionizzacomeanione)
– basico (quandoionizzacomecatione)
Questacaratteristicageneralafondamentaledistinzionedeicoloranti
istologiciinacidi ebasici
Laclassificazionenontienequindicontodellaconcentrazionedegli
idrogenioninellelorosoluzioni
Tiene invececontoselapartesignificativadelcolorante,l’auxocromo,è
anionicaocationica
Perquesteragioniicolorantidovrebberoessereclassificatipiù
propriamentein«anionici»e«cationici».
Tipidiauxocromo
• Gliauxocromiacidisonoigruppi:
– solfonico (-SO3Hilpiùfrequente)
– carbossilico (-COOH)
– idrossilico (-OH)
• Gliauxocromibasici sono:
– ilgruppoaminico (-NH2)edisuoiderivati
– imetalli (nellecosiddettelacche)
• Icolorantivengonoingenerepostiin
commerciosottoformadisali:
– Acidi:comesalidisodio,talvoltadipotassio,di
calcio odiammonio
– Basici:comecloruri, talvoltacomeacetatiosolfati
Elencodeicoloranti
SeguendoleindicazionicontenutenelConn’s Biological Stains,icoloranti
biologicisielencanoinbaseallanaturadelcromoforo,neiseguentigruppi
esottogruppi:
I.Nitrosocoloranti(chinoneoxime) (FastgreenO,verdenaftoloB).
2.Nitrocoloranti (ac.picrico,giallonaftolo).
3.Colorantiazoici, suddivisiin:
monoazoici(orange G,cromotropo 2R,ponceaux 2R);
diazoici (rossoCongo, Sudan IV,bruno Bismark);
poliazoici(nerodiclorazolio E,rossoSirius F 3B).
4.Salididiazonio: copulandosiconicompostifenolicinativipresenti
neitessutidannoluogoacolorantiazoici(Fastred GG,fastgarnet
GBC).
5.Copulantiazoici,usatisottoformadifosfati,acetatiealtriesteri
nellaistotopochimica enzimatica(alfaebeta-naftolo,naftoliAS).
6.Saliditetrazolio. Fungonodaaccettatoridiidrogenodandoluogo
aformazani fortementecoloratilàdovesirealizzanoossidazioni
enzimatiche odialtranatura(nitrobluditetrazolio).
7.Colorantistilbenici (diaminefastyellow AocurcuminaS).
Elencodeicoloranti
8.Colorantidellaseriedell’arilmetano,divisiin:
a)Difenilmetani (auramina O,unfluorocromo);
b)Diamminotrifenilmetani (FastgreenFCF,verdebrillante);
c)Triamminotrifenilmetani (pararosanilina,Fucsinaacida,
cristal violetto);
d)Idrossitrifenilmetani (ac.rosolico,violettocromoCG);
e)Mono- edinaftilfenilmetani (bluVittoria4R,R,B,blu
notte).
9Colorantixantenici:
a)Aminoxanteni [pironine (pironina GoY);succineine
(rodamminaS);rosanine (sulforodammjna B);rodammine
(rodamminaB)];
b)Idroxanteni ofluoroni (eosinaB;floxina B,rosaBengala
G).
Elencodeicoloranti
10.Colorantiacridinici, usaticomecolorantiefluorocromi
(aranciodiacridina,acriflavina,fosfina).
11.Colorantiefluorocromichinolinici (pinacianolo e
pseudoisocianina).
12.Colorantimetinicipolimetinici (astra violettoFFerossi
d’astrazone).
13.Colorantitiazolici (primulina,tioflavina S eT).
14.Colorantichinone-imminici:
a)Indamine (bluditoluilene);
b)Indofenoli (indossine);
c)Azine [eurodine (rossoneutro);rosinduline (azocarminio B);safranine
(safraninaO);induline (induline,nigrosine)];
d)Oxazine (bludicresile brillante,bluNilo,rossoDarrow,orceina,
gallocianina);
e)Tiazine (tionina,bludimetilene,azzurroB).
Elencodeicoloranti
15. Colorantiammino- eidrossichetonici (cromogenoI).
16.Colorantiantrachinonici:
a)Idrossiantrachinoni (rossodializarinaS,purpurina);
b)Amminoantrachinoni (oil blueN,violettoSudanR,bludi
alizarinaacida).
17.Indigo-coloranti (indigocarminio).
18.Ftalocianine (alcian blu8GX,Luxol fastblueMBS).
19.Colorantinaturali (ematossilina,carminio,
zafferano).
20.Reagenticromogenidiversi.
21.Colorantineutri.
LACCHE
• Lelacchecostituisconounaclasse
particolaredicolorantibasici
• Sitrattadicolorantibasiciincuil’auxocromo
èunmetallo
• Hannolargoimpiegoperl’intensità ela
stabilitàdelcolore
• Imetallipiùusatinellelaccheperuso
istologicosonoalluminio,ferroecromo
• Gliallumi (dipotassio,diferroammoniacale)
formanolaccheconalcunicoloranti,come
l’emateina,dandoluogoacomplessi
fortementecolorati
ematossilina
•
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•
•
•
trovalargoimpiegoinistologiaedinistochimica,comecolorantenucleare
èunalaccaalluminicadell’emateina,comunementeindicatacome
ematossilina
L’ematossilinaèinrealtàunasostanzaestrattadallegnodiunalbero
originariodelcentroAmerica,ilcampeggio (Haematoxylon campechianum)
L’ematossilinadiperséèpraticamenteincoloreedincapacedicolorare
L’ematossilinavieneossidataademateina(cheècolorataecostituisceil
cromoforo)efattareagireconallumepotassico(solfatodoppiodialluminio
epotassio,KAl(SO4)2)
Siformacosìlalaccacompletadefinitaemallume
• Inparticolarel’emallume vieneutilizzatoperlostudiodella
basofilia
• Puòaccadere(eccezioni)peròchel’emallume
– Coloraanchestruttureabitualmentenonbasofile
– noncolora,viceversa,alcunestrutturetipicamentebasofile
MODALITA’DIESECUZIONEDELLECOLORAZIONI
• Colorazioneinblocco(intotoowhole-mount) èla
colorazionediframmentiditessuto,diunorgano
odiunembrioneprimachesianoinclusie
sezionati
• colorazionedisezioni: puòavveniresiaconle
sezioniadese avetrini,siaconfettelibere
• Colorazionidirette: sonoquelleincuiilpreparato
nonrichiedetrattamentiparticolariprimadi
essereimmersonellasoluzionecolorante
• Colorazioniindirette: sonoquelleincui
l’immersionenelbagnodicolorazionedeveessere
precedutada unamordenzatura
mordenti
• Alcunimetodidicolorazionecomportanolacosiddetta
mordenzatura
• Questaoperazioneconsisteneltrattareiltessutoconun
compostocapacedifissaresudiessodeigruppiacidiobasici,
iqualialorovoltapotrannolegarsiconuncolorantebasicoo
acido
• Ilcompostochecostituiscequestoterminedicollegamentofra
iltessutoeilcolorantesichiamamordente
• Lamaggiorpartedeimordentiimpiegatiinistologiasono
ossidanti
– acidocromico,acidofosfomolibdico, acidofosfowolframico,
acidonitrico
– cloruri diPb, Zn,Hg
– permanganatodipotassio
– iodio
– ac.picrico,ecc.
MODALITA’DIESECUZIONEDELLECOLORAZIONI
• colorazioniprogressive: ilprocessodicolorazioneè
arrestatoquandoilpreparatoharaggiuntoilcolore
desiderato
• colorazioniregressive: ilpreparatoèsovracolorato e
poidecolorato(differenziato),finchénonassumeil
coloredesiderato
• Incondizioniideali,qualiquellericercateperle
reazioniistochimiche,lecolorazionidevonoessere
progressiveetaliche,unavoltaassuntoilcolorante
dapartedelleporzionidelpreparatocheglisono
affini,nonsiabbiaulteriorecolorazionedialtre
strutture
• Lecolorazioniregressivesonoutiliinistologiain
quantopermettonodidimostrarestrutturedifficilida
colorareconmetodiprogressivi
MODALITA’DIESECUZIONEDELLECOLORAZIONI
•
colorazionisemplici:siusaunsolocolorante
•
colorazionicomplesse: siusanopiùcoloranti,
contemporaneamente oinsuccessionel’unodietrol’altro
•
Colorazionivitali
sonoquelleapplicate adelementi(celluleoanimali)viventi(Vedi
esameafrescodicelluleetessuti)
•
Questecolorazionipresuppongonol’interventodiprocessivitali
perl’assunzioneelalocalizzazionedelcoloranteall’internodi
celluleonellasostanzaintercellulare
•
Nell’usocomunevieneimpiegatoiltermine
– colorazionevitale quando ilcoloranteèsomministratoadun
animalevivo
– colorazionesopravitale,quando ilcoloranteèusatopertrattare
tessutiocelluleisolate,ancoravive,dopo l’allontanamento
dell’animaledicuifacevanoparte
fattoricheinfluenzanol’azionedeicoloranti
• L’azionedifferenzialedeicolorantidipendedafattoriinsitinel
tessuto:
–
–
–
–
–
–
–
–
affinitàchimicafraivaricostituentideltessutoeicoloranti
concentrazionedeicostituentichereagisconoconilcolorante
permeabilitàdeicostituenti
ilpH
laforzaionica
laconcentrazionedelcolorante
latemperaturadelbagnodicolorazione
lafissazione cuiestatosottopostoiltessuto
• Labuona riuscitadimoltimetodi dicolorazione dipende proprio daltipo
difissativoimpiegato
• Nonèbenconosciuto ilmeccanismoattraversoilqualeilfissativo
favoriscelasuccessivacolorazione
• Perquestalaragione, perogni metodo dicolorazione, sispecificail
fissativopiùadatto
ESECUZIONEDELLECOLORAZIONISUSEZIONI
• Icolorantisonosolubiliinacqua
• Perlacolorazioneènecessariochelesezionisiano
idratate
• Seiltessutoerastatoinclusoinparaffina,questaviene
rimossa immergendolesezioniinunsolvente
intermediario(xilolo)
• Lesezioni vengonopoitrasferiteinetanolo(oacetone)
assoluto,perallontanarel’intermediario,equindiin
etanolo(oacetone)atitolodecrescente,finoall’acqua
distillata
• Lacolorazioneavvieneperimmersionedellasezionenel
bagnocolorante
• ingeneresegueunlavaggioinacquaoinsoluzioni
particolari,asecondadelcoloranteimpiegato
disidratazione
• Seguedisidratazionealcolica
• occorredisidratarelasezioneperapplicareil
vetrinocoprioggetto conl’interposizionediuna
soluzionedimontaggio
• Ladisidratazioneavvienemedianteetanolo(o
acetone)atitolocrescente, finoall’etanolo(o
acetone)assoluto,
• Seguediafanizzazioneinliquidointermediario
(xiloloosuccedanei)
Montaggiodellesezionicolorate
•Dopo la colorazione, il preparato viene
montato,
•in tale modo il tessuto viene imbibito da una
sostanza con lo stesso indice di rifrazione del
vetro
• inoltre viene racchiuso tra due strati di vetro
(portaoggetto-coprioggetto), con il mezzo di
montaggio interposto
•Ciò fa si che la luce non venga rifratta nel
passaggio attraverso i vari strati.
•Il vetrino portaoggetto è più spesso, di forma
rettangolare
•il vetrino coprioggetto è più sottile
Mezzidimontaggio nonidrosolubili
imezzidimontaggiopossonoesserenonidrosolubilio
idrosolulubili
•
•
Imezzidimontaggiononidrosolubili sonousatipiùfrequentemente
sitrattaperlopiùdiresinesintetichechegarantisconopreparatistabili,
alriparodallapolvereedall’essiccamento,conmantenimentoneltempo
delcoloredelpreparato
• Naturali:
– balsamodelCanadà (terpeni,ac.Carbossilicoedesteri),
– Balsamodammara
– Camsal,Euparal
• Sintetici
– Compostistabiliinertisolubiliinxilolo;prodotti
commerciali:Permount Picolite,Klermount ,DPX,
Clearmount,Polymount
Mezzidimontaggio idrosolubili
•
Imezzidimontaggioidrosolubili siimpieganoallorchélanaturadel
substrato (adesempio,lipidi)oilmezzodicolorazionenonconsentanola
disidratazioneeladiafanizzazione
•
moltousatoèilglicerolo,dasolo oinsoluzionecongelatina.
•
Vengonousateinsiemeanchealtresostanzechesolidificanoinacqua
(gommaarabica,gelatina)oppureaumentanol’indicedirifrazione(Salio
zuccheri)oimpedisconolosviluppodimuffe(fenolo,timolo)
•
Ipreparatimontaticonmezziidrosolubilivannolutati,cioèsigillatilungoil
bordodelvetrinocoprioggetto (conceralacca oaltromezzoanalogo),per
impedirel’essiccamentoel’insudiciamentodelmezzodimontaggio.
• Esempi:SciroppodiApathy,GelatinadiHeringa
• Commerciali:Acquamount,Karion,Glicerol.gelatine
METACROMASIA
• Unparticolarecomportamentodialcunicolorantibasici,utile
perindaginiistochimiche,èlametacromasia
• Conquestoterminesiindicauncambiamento(oviraggio)del
colore,unavoltacheilcolorantesiastatoassuntoda
sostanze,definitecromotrope
• Icolorantimetacromaticisonobasici;nellapraticasonomolto
impiegaticolorantibasicibludellaseriedelletiazine,che
viranometacromaticamentealbluviolettooalrosavioletto
• Ilcolorepropriodelcoloranteinsoluzionediluitaèdetto
ortocromatico
• Alcunestrutturetissutaliappaionometacromatichesubito
dopolacolorazioneallorchéilpreparatoèesaminato
immersoinacqua
• poitornanoadessereortocromatichedopodisidratazionedel
preparatoinalcooletilico
• Sipuòcosìdistinguereunametacromasia
– alcoolresistente
– nonalcool-resistente
METACROMASIA
• Lesostanzecapacididaremetacromasiaalcoolresistenteneitessutianimalisonoglieteroglicani (ad
eccezionedell’acidoialuronico),lemucineepiteliali
(adeccezionediquelleneutre)
• Siritieneprobabilechenelcomplessotracolorantee
substrato,allorchélemolecoledelcolorantesono
vicineeordinateregolarmentenellospazio,si
stabilisconodelleinterferenze,responsabilidiuna
variazionedilegamedeicromoforie
conseguentemente diunavariazionedelcolore
Colorazionediunostrisciodisangue
Colorazionediunostrisciodisangue
MetodocombinatoMay-Grunwald-Giemsa,
secondoPappenheim,modificatodaFerrata.
• Sichiamaanchemetodopanottico.
• HaivantaggideiduemetodiMay-Grùnwald e
Giemsa,erimediaagliinconvenientidelprimo
(mancatacolorazionedellegranulazioni
azzurrofile deileucociti)eaquellidelsecondo
(coloresbiaditodeiglobulirossi,scarsa
differenziazionefralegranulazionineutrofilee
quelleazzurrofile).
• E’ilmetodopiùlargamenteusatoperlostudio
delsangueumanoallostatonormalee
patologico
• èottimoperlostudiodeiparassitidelsangue.
liquidicolorantiMay-Grunwald eGiemsa
• Sitrovanoincommerciogiàpreparati.
• Tuttieduesonoottenutimescolandoun
colorantebasico(dianilina)conuncolorante
acido.
• Ilcoloreacido èpertuttieduel’eosina
• ilcolorantebasico
– nelMay-Grunwaldèilbleudimetileneofficinale,
– nelGiemsaèl’azzurroIl.
Procedura:primopassaggio
•
•
•
•
•
conunapipettasiversasulvetrino illiquido coloranteMay-Grunwald (v.oltre)in
talequantitàcheilliquido ricopralostrisciomanon debordi dalvetro.
tuttalasuperficiedelvetrino rimanecoperta(illiquidoMay-Grunwald fissae
coloraaltempostesso).
Dopo treminuti siaggiunge acquadistillataagoccelentamente,finché la
diluizione dellasoluzione corrisponda aunapartediliquido coloranteedueparti
diacqua.Silasciaagireilcoloranteperaltri5-6minuti.
Complessivamentequindi lacolorazionecolliquido May-Grunwald devedurareda
6-9min.Perilmidollo osseooccorrono 5mdipiù.
Sicontrollalacolorazione almicroscopioconunobiettivo asecco,
– iglobuli rossidevono esserecoloratiinrosa;
– inucleideileucocitiinbleu pallido.
Procedura:secondopassaggio
•
•
•
•
•
•
Segueunbrevelavaggioinacquadistillataesuccessivacolorazionenel
liquidodiGiemsa diluitonellaproporzionedi1gocciaper1mldiacqua
distillata.
Laduratadellacolorazioneèdi5-8minperilsangue,e25-30minpergli
striscidimidolloosseo.
Illiquidocolorantevacambiatoognidueminuti.
E’opportunocontrollarealmicroscopioilgradodicolorazioneetogliereil
colorequandoinucleideileucocitisìsonocoloratiinvioletto(colorazione
progressiva).
Siprocedepoiallavaggiosottoilgettodellacannella;siasciugaconcarta
dafiltro,epoialcalore;
SimontaconbalsamodelCanadà neutrooppuresiprocedeanche
all’esamedirettoconl’immersionesenzacoprioggetto.
• Glieritrocitiedigranulieosinofilisicoloranoinrosaintenso;i
granulineutrofili(piùpiccolideglieosinofili)inrosaviolaceo
piùpallido,quelliazzurrofili inrossoviolaceo;ibasofiliin
bleu,inucleideileucocitiinvioletto.