UNITA torino

UNITA’ DI RICERCA DI TORINO
Direttore: Prof. Silvio Aime
L’attività di ricerca relativa all’anno 2002, nel campo dello studio di nuovi agenti di contrasto
per MRI, si è svolta seguendo diverse linee di ricerca:
Ricerca di nuovi complessi di Gd(III) con caratteristiche ottimali per l’ottenimento di
alte relassività
Nel corso degli anni sono stati ottenuti risultati particolarmente interessanti per quanto
riguarda la comprensione dei fattori responsabili della relassività dei complessi paramagnteici
di Gd(III) e Mn(II) al fine di realizzare mezzi di contrasto per MRI sempre più efficienti.
Oltre al ruolo del tempo di reorientazione molecolare è stata messa in evidenza l’importanza
del tempo di scambio della molecola di acqua coordinata. Essa dipende sia da fattori
strutturali che di carica residua del complesso, nonchè dalla formazione di addotti ternari con
substrati vari e di coppie ioniche con i controioni.
Sono state individuate nuove classi di leganti eptadentati che, nella formazione dei
complessi con il Gd(III), danno origine a composti con caratteristiche ottimali per il
trasferimento dell’informazione paramagnetica, quali due molecole di acqua di sfera interna,
un valore di τM molto corto corto (tra 10 e 90 ns) e una scarsa tendenza a formare addotti
ternari con anioni organici di vario tipo.
Due dei leganti sintetizzati hanno struttura completamente nuova rispetto a quelle ben note
del DTPA e del DOTA e sono stati chiamati rispettivamente AAZTA e DHPTA (Fig. 1); un
terzo composto molto interessante è invece un derivato del DOTMA funzionalizzato con un
sostituente idrofobico che ne rende possibile l’interazione con HSA e con altri substrati
macromolecolari.
L’aumento della velocità di rilassamento dei protoni dell’acqua riceve contributi anche
dallo scambio prototropico. Nella classe di complessi caratterizzati da valori molto lunghi
-
OOC
COO
-
N
COO
H3C
-
N
N
N
COO
OH
HO
-
OOC
-
Figura 1
AAZTA
N
Gd 3+ N
-
COO COO -
OOC
DHPTA
della velocità di scambio dell’acqua coordinata, lo scambio prototropico, per l’acqua
direttamente coordinata al centro paramagnetico, può essere caratterizzato mediante misure
rilassometriche in funzione del pH della soluzione. Si è dimostrato che in una serie di
complessi di Gd(III) di bisamidi del DTPA, dotati di tempi di scambio della molecola di
acqua coordinata molto lunghi, è possibile modulare la velocità di scambio dei soli protoni
attraverso l’introduzione sulla gabbia del legante di sostituenti con diversa carica. Nei
complessi funzionalizzati con gruppi carichi positivamente lo scambio prototropico
catalizzato dagli OH- della soluzione a pH basico risulta decisamente accelerato.
1
Imaging Molecolare
L’attività di ricerca di agenti di targeting di specifiche tipologie cellulari è proseguita
perseguendo le due strade già delineate nell’anno precedente:
a) Riconoscimento di recettori sovraespressi dalle cellule tumorali:
Sono stati sintetizzati e caratterizzati rilassometricamente vari complessi di Gd(III)
derivatizzati con il peptide CCK8, in grado di riconoscere i recettori delle colecistochinine
sovraespressi sulle cellule tumorali. Dal momento che il numero di tali recettori non è molto
elevato è stato necessario progettare sistemi multimerici che potessero portare in prossimità e
all’interno della cellula un numero elevato di complessi paramagnetici. Si sono presi in
considerazione sistemi in cui i chelati di Gd(III) fossero legati alla struttura carrier in modo
covalente e non.
Tutti i sistemi sintetizzati sono poi stati testati in opportune linee cellulari verificando che
l’uptake da parte delle cellule avvenisse effettivamente attraverso il riconoscimento del
peptide CCK8.
b) Utilizzo di sistemi di trasporto cellulare
Le cellule tumorali esibiscono un aumento della sintesi di DNA e del metabolismo
energetico rispetto alle analoghe non trasformate. Ciò determina una maggiore necessità di
determinati metaboliti, tra cui aminoacidi e composti cationici quali ad esempio arginina, che
devono quindi essere trasportati attraverso la membrana cellulare.
Si sono quindi sintetizzati una serie di complessi di Gd(III) derivati del DTPA contenenti
aminoacidi carichi positivamente e varie poliammine. Tra questi, hanno dato risultati
particolarmente interessanti il Gd-DTPABAG (funzionalizzato con agmatina), il GdDTPAGln (funzionalizzato con Glutammina) e il Gd-DTPALys (funzionalizzato con Lisina).
Oltre alle prove di uptake fatte in “vitro” in coltura cellulare, alcuni di questi composti sono
stati testati in “vivo” su modelli di ratti in cui erano state impiantate le stesse cellule tumorali
delle linee utilizzate per gli esperimenti in “vitro”.
Agenti di contrasto CEST
Un’ulteriore linea di ricerca condotta nell’unità locale di Torino ha riguardato lo sviluppo
di una nuova categoria di agenti di contrasto diagnostici per la tomografia NMR chiamati
agenti CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer). Tali composti sono accomunati dalla
presenza di protoni in scambio lento, sulla scala dei tempi NMR, con l’acqua di bulk. Ciò
significa che la velocità di scambio con il solvente dei protoni mobili dell’agente CEST (k ex)
deve essere inferiore alla differenza tra la loro frequenza di risonanza e quella dei protoni
dell’acqua. Se in questa situazione viene applicato un impulso rf alla frequenza di risonanza
dei protoni mobili dell’agente CEST questi si saturano trasferendo così parte della loro
saturazione al segnale dell’acqua di bulk. La diminuzione dell’intensità del segnale dell’acqua
è il fattore responsabile della comparsa di un contrasto negativo nell’immagine di risonanza
magnetica. Su questa base, l’uso di complessi metallici paramagnetici risulta essere
particolarmente vantaggioso poiché il metallo paramagnetico è in grado di aumentare
notevolmente la separazione delle frequenze di risonanza permettendo l’irradiazione di
protoni con k ex elevate (il trasferimento di saturazione è direttamente correlato a k ex). Il
vantaggio di questa tipologia di agenti diagnostici rispetto a quelli convenzionali si basa sul
fatto che è possibile, in linea di principio, osservare un contrasto indipendente dalla
concentrazione dell’agente CEST. Questa condizione, basata sulla presenza di almeno 2 set
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differenti di protoni mobili sulla molecola CEST, è un requisito fondamentale per sviluppare
agenti diagnostici sensibili a parametri diagnostici come pH, T, concentrazione di metaboliti,
potenziale redox, attività enzimatica,… Per questo motivo, sono stati sintetizzati e
caratterizzati diversi complessi macrociclici contenenti ioni paramagnetici lantanoidei (in
particolare Pr, Nd, Eu, Tb, Tm ed Yb) nei quali è possibile irradiare sia protoni mobili
appartenenti al legante (di natura amidica) oppure protoni di molecole di acqua direttamente
coordinate al centro paramagnetico.La responsività al parametro diagnostico può essere
realizzata sia sfruttando variazioni di k ex, sia sfruttando variazioni strutturali che influenzano
le frequenze di risonanza o il numero di coordinazione del metallo paramagnetico.
Pubblicazioni
1. Aime S., Frullano L., Geninatti Crich S. Compartmentalization of a gadolinium complex
in the apoferritin cavity: a route to obtain high relaxivity contrast agents for magnetic
resonance imaging. Angew Chem Int Ed Engl, 41,1017-9, 2002.
2. Aime S., Delli Castelli D., Terreno E. Novel pH-reporter MRI contrast agents. Angew
Chem Int Ed Engl, 41, 4334-6, 2002.
3. Dickins R.S., Aime S., Batsanov A.S., Beeby A., Botta M., Bruce J.I., Howard J.A., Love
C.S., Parker D., Peacock R.D., Puschmann H. Structural, luminescence, and NMR studies
of the reversible binding of acetate, lactate, citrate, and selected amino acids to chiral
diaqua ytterbium, gadolinium, and europium complexes. J Am Chem Soc, 124, 12697-705,
2002.
4. Botta M., Casellato U., Scalco C., Tamburini S., Tomasin P., Vigato P.A., Aime S., Barge
A. Heterodinuclear Ln-Na complexes with an asymmetrical macrocyclic compartmental
Schiff base. Chemistry , 8, 3917-26, 2002.
5. Aime S., Cabella C., Colombatto S., Geninatti Crich S., Gianolio E., Maggioni F. Insights
into the use of paramagnetic Gd(III) complexes in MR-molecular imaging investigations.
J Magn Reson Imaging, 16, 394-406, 2002.
6. Monzani E., Curto M., Galliano M., Minchiotti L., Aime S., Baroni S., Fasano M.,
Amoresano A., Salzano A.M., Pucci P., Casella L. Binding and relaxometric properties of
heme complexes with cyanogen bromide fragments of human serum albumin. Biophys J.,
83, 2248-58, 2002.
7. Aime S., Delli Castelli D., Fedeli F., Terreno E. A paramagnetic MRI-CEST agent
responsive to lactate concentration. J. Am. Chem. Soc., 124, 9364-5, 2002.
8. Aime S., Barge A., Batsanov A.S., Botta M., Castelli D.D., Fedeli F., Mortillaro A.,
Parker D., Puschmann H. Controlling the variation of axial water exchange rates In
macrocyclic lanthanide(III) complexes. Chem Commun (Camb), 21, 1120-1, 2002.
9. Aime S., D'Amelio N., Fragai M., Lee Y.M., Luchinat C., Terreno E., Valensin G. A
paramagnetic probe to localize residues next to carboxylates on protein surfaces. J Biol
Inorg Chem, 7, 617-22, 2002.
10. Aime S., Barge A., Delli Castelli D., Fedeli F., Mortillaro A., Nielsen F.U., Terreno E.
Paramagnetic lanthanide(III) complexes as pH-sensitive chemical exchange saturation
transfer (CEST) contrast agents for MRI applications. Magn Reson Med,47, 639-48, 2002.
11. Digilio G., Bracco C., Barbero L., Chicco D., Del Curto M.D., Esposito P., Traversa S.,
Aime S. NMR conformational analysis of antide, a potent antagonist of the gonadotropin
releasing hormone. J Am Chem Soc,124, 3431-42, 2002.
12. Yerly F., Hardcastle K.I., Helm L., Aime S., Botta M., Merbach A.E. Molecular dynamics
simulation of [Gd(egta)(H2 O)]- in aqueous solution: internal motions of the poly(amino
3
carboxylate) and water ligands, and rotational correlation times. Chemistry,8, 1031-9,
2002.
13. Aime S., Anelli L., Botta M., Brocchetta M., Canton S., Fedeli F., Gianolio E., Terreno E.
Relaxometric evaluation of novel manganese(II) complexes for application as contrast
agents in magnetic resonance imaging. J Biol Inorg Chem, 7, 58-67, 2002.
14. Aime S., Botta M., Mainero V., Terreno E. Separation of intra- and extracellular lactate
NMR signals using a lanthanide shift reagent. Magn Reson Med, 47, 10-3, 2002.
15. Aime S., Cravotto G., Geninatti Crich S., Giovenzana G.B., Ferrari M., Palmisano G.,
Sisti M. Synthesis of the Gd(III) complex with a tetrazole-armed macrocyclic ligand as a
potential MRI contrast agent. Tetrahedron Lett, 43, 783-786, 2002.
16. Stchedroff M.J., Aime S., Gobetto R., Salassa L., Nordlander E. Os-187 subspectra in H-1
and P-31{H-1} spectra of triosmium carbonyl clusters. Magn Reson Chem, 40, 107-113,
2002.
17. Aime S., Diana E., Gobetto R., Milanesio M., Valls E., Viterbo D. Structural and
spectroscopic study of the dihydrogen bond in an imine triosmium complex.
Organometallics, 21, 50-57, 2002.
18. Aime S., Canton S., Geninatti Crich S., Terreno E. H-1 and O-17 relaxometric
investigations of the binding of Mn(II) ion to human serum albumin. Magn Reson Chem,
40, 41-48, 2002.
19. Dunand F.A., Aime S., Geninatti Crich S., Giovenzana G.B., Merbach A.E. Coordination
equilibrium in an Ln(III) macrocyclic chelate modulated by a reversible interaction with a
weakly donor substituent. Magn Reson Chem, 40, 87-92, 2002.
20. Aime S., Cavallotti C., Gianolio E., Giovenzana G.B., Palmisano G., Sisti M. One-step
synthesis of a new eight- membered cyclic ligand from glycine, formaldehyde and
hypophosphorous acid. Tetrahedron Letters, 43, 8387-8389, 2002.
21. Raymond N., Doble D.M.J., Sunderland C.J., Hajela S., Wang J., Botta M., Barge A.,
Giraudo S., Aime S. Fast water exchange go complexes: Applications to MRI. Abstr Pap
Am Chem S., 223, 018-INOR Part 2, 2002.
22. Aime S., Bertone F., Gobetto R., Milone L., Russo A., Stchedroff M.J., Milanesio M. The
effect of ligand basicity on the unconventional hydrogen-bond in H(mu-H)Os-3(CO)(10)L
(L = amine) derivatives. Inorg Chim Acta, 334, 448-454, 2002.
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Studio della chimica delle polveri
La ricerca effettuata durante l’anno 2002 ha riguardato lo studio di diversi tipi di polveri
respirabili tra cui gli asbesti e le silici amorfe e cristalline, il biossido di titanio, le fibre
artificiali sostitutive all’amianto.
Lo studio della chimica di queste polveri, ed in particolare della loro chimica di
superficie, ha avuto come principale obiettivo una maggiore comprensione dei fenomeni che
stanno alla base dell’interazione di esse col mezzo biologico e quindi la ricerca di quelle
proprietà responsabili di una loro tossicità a livello polmonare. In particolare sono stati
studiati: il ruolo del ferro presente alla superficie delle di silici (quarzi e terra di diatomee)
nella capacità di provocare trasformazione cellulare allo scopo di evidenziare una eventuale
correlazione con la una potenziale cancerogenicità, l’interazione della superficie della silice
con proteine interessate alla attivazione della risposta cellulare (proteine del complemento),
l’influenza dell’area superficiale delle polveri di TiO 2 ultrafini nell’attivazione della risposta
infiammatoria ed il ruolo della reattività di superficie degli amianti nel provocare danno
ossidativo attraverso l’inibizione del ciclo dei pentosi. E’ inoltre stato studiata l’inibizione
della reattività superficiale di un tipo di amianto in seguito a modificazioni termiche
utilizzabili come possibile metodo di inattivazione di tipo fisico. Per quanto riguarda le fibre
di amianto è stata effettuata una caratterizzazione del ferro superficiale di un tipo di amianto
(crocidolite) attraverso la voltammetria ciclica allo scopo di evidenziare le caratteristiche di
quella frazione di ioni responsabile della reattività superficiale.
Per quanto riguarda le fibre artificiali, in particolare le fibre ceramiche refrattarie (RCF), è
stata studiato l’effetto dell’idrofilia di superficie e del ricoprimento con ferro sulla risposta
cellulare.
L’attività di ricerca ha inoltre riguardato, attraverso di collaborazioni con altri laboratori
italiani e stranieri, lo studio di una selettività della risposta di cellule umane e di organismi
unicellulari (diatomee) verso silici cristalline ed amorfe, lo studio dei meccanismi alla base
della reattività di polveri utilizzate industrialmente per la produzione di metalli duri,
l’adsorbimento di proteine ed enzimi su silici ed amianti, la ricerca di possibili vie di
inattivazione chimica e biologica (bioremediation) di fibre di amianto.
Attraverso la spettrometria ESR è stata studiato il rilascio di radicali liberi in soluzione da
parte di polveri di quarzo variamente modificate attraverso trattamenti termici, macinazioni e
trattamenti chimici e il danno ossidativo causato da queste polveri su aminoacidi e peptidi. E’
stata inoltre studiata la reattività di superficie del quarzo con molecole e endogene
antiossidanti quali acido ascorbico e GSH.
Pubblicazioni
1. Elias Z., Poirot O., Danière M.C., Terzetti F., Bena F., Fenoglio I., Fubini B. Role of iron
and surface free radical activity of silica in the induction of morphological transformation of
Syrian hamster embryo (SHE) cells. Ann. Occup. Hyg., 46 suppl. 1, 176-180, 2002.
2. Governa M., Fenoglio I., Amati M., Valentino M., Bolognini L., Coloccini S., Volpe A.R.,
Carmignani M., Fubini B. Cleavage of the fifth component of human complement and release
of a split product with C5a-like activity by crystalline silica through free radical generation and
kallikrein activation. Toxicol. Appl. Pharm. 179, 129-36, 2002.
3. Hohr D., Steinfartz Y., Schins R. P. F., Knaapen A. M., Martra G., Fubini B. The surface
area rather than the surface coating determines the acute inflammatory response after instillation
of fine and ultrafine TiO2 in the rat. Int. J. Hyg. Environ. Health, 205, 239-244, 2002.
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4. Riganti C., Aldieri E., Bergandi L., Fenoglio I., Costamagna C., Fubini B., Bosia A.,
Ghigo D. Crocidolite asbestos inhibits pentose phosphate oxidative pathway and glucose 6phosphate dehydrogenase activity in human lung epithelial cells. Free Rad. Mol. Biol., 32,
938-949, 2002.
5. Tomatis M., Prandi L., Bodoardo S., Fubini B. Loss of surface reactivity upon heating
amphibole asbestos. Langmuir, 18, 4345-4350, 2002.
6. Tomatis M., Fenoglio I., Elias Z., Poirot O., Fubini B. Effect of thermal treatment of
refractory ceramic fibres on the induction of cytotoxicity and cell transformation. Ann. Occup.
Hyg., 46 suppl. 1, 176-180, 2002.
7. Elias Z., Poirot O., Danière M.C., Terzetti F., Binet S., Tomatis M., Fubini B. Surface
reactivity, citotoxicity and transfoming potency of iron-covered compared to untreated
refractory ceramic fibers. J. Tox. Envir. Health, 65, 2007-2027, 2002.
8. Prandi L., Tomatis M., Penazzi N.and Fubini B. Iron cycling mechanisms and related
modifications at the asbestos surface. Ann. Occ. Hyg., 46, 140-143, 2002.
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