Mercodia Apo(a) ELISA

Transcript

Mercodia
Apo(a) ELISA
Directions for Use
Mode d’emploi
Instruzioni per l’uso
Bruksanvisning
Gebrauchsinformation
Instrucciones para el uso
Brugsanvisning
10-1106-01
REAGENTS FOR 96 DETERMINATIONS
Manufactured by/Hersteller/Fabriqué par/
Fabricado por/Prodotto da/Fremstillet af/
Tillverkad av
Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A,
SE-754 50 Uppsala,
Sweden, Schweden, Suède, Suecia, Svezia, Sverige
EXPLANATION OF SYMBOLS USED ON LABELS/ERKLÄRUNG DER SYMBOLE AUF DEN
ETIKETTEN/EXPLICATION DES SYMBOLES UTILISES SUR LES ETIQUETTES/EXPLICACIÓN DE
LOS SÍMBOLOS UTILIZADOS EN LAS ETIQUETAS/SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE
ETICHETTE/FORKLARING AF SYMBOLER ANVENDT PÅ ETIKETTER/FÖRKLARING AV
SYMBOLERNA SOM ANVÄNDS PÅ ETIKETTERNA
∑ = 96
Reagents for 96 determinations
Reagenzien für 96 Bestimmungen
Réactifs pour 96 mesures
Reactivos para 96 determinaciones
Reagenti per 96 rilevazioni
Reagens til 96 bestemmelser
Reagenser för 96 bestämningar
Expiry date
Verfallsdatum
A utiliser avant
Fecha de caducidad
Data di scadenza
Udløbsdato
Utgångsdatum
Store between 2–8°C
Lagerungstemperatur 2–8°C
A conserver entre 2 et 8 °C
Conservar a entre 2–8°C
Conservare tra i 2–8°C
Opbevar ved 2–8°C
Förvara vid 2–8°C
LOT
Lot No.
Lot Nr.
N° de lot
Nº lote
Lotto n.
Partinr.
Lotnr.
IVD
For in vitro diagnostic use
Zum Gebrauch in der in vitro-Diagnose
Ce kit est réservé à l'utilisation diagnostique in vitro
Para uso diagnóstico in vitro
Per l’uso diagnostico in vitro
Til in vitro-diagnosticering
För in vitro diagnostiskt bruk
Directions for Use
© Mercodia 2009
5
Gebrauchsinformation
17
Mode d’emploi
29
Instrucciones para el uso
41
Instruzioni per l’uso
53
Brugsanvisning
65
Bruksanvisning
77
4
Mercodia Apo(a) ELISA provides a method for the quantitative determination of human
apolipoprotein(a) in serum or plasma.
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
Apolipoprotein(a), Apo(a), is a glycoprotein linked by disulphide bridges to apolipoprotein B in
the lipoprotein(a) (Lp(a)) particle. Apo(a) is formed by three different structural domains. One
ofthe domains, called kringle 4, is present in multiple copies, the number of which varies and is
genetically determined, giving rise to different sizes of Apo(a) and consequently Lp(a). Depending on the method used, six to 23 isoforms of Apo(a) ranging from about 300 to 900 kD have
been identified (1,2,15,16). Most individuals have one or two Apo(a) isoforms, although in some
subjects no Apo(a) band can be detected when analyzed in SDS-gel electrophoresis followed by
immunoblotting (3).
Recently, much interest has been focused on Lp(a) since there is a lot of evidence that circulating levels represents an independent risk factor for coronary vascular disease. The Lp(a) level
has been found to be an inherited risk factor for ischaemic heart disease (4–8). High Lp(a) levels
have been demonstrated in familial hypercholesterolemia and its measurement may be clinically
useful for risk prediction in these patients (9,10).
Results have also been published on Lp(a) as a strong indicator for cerebrovascular disease
(11,12).
Apo(a) is homologous to the protease zymogen plasminogen (13,14).
Lp(a) inhibits plasminogen activation and recent studies have shown that Apo(a) and Lp(a)
compete with plasminogen for binding to the plasminogen receptor. These properties of Apo(a)
may explain the association of high Lp(a) concentrations with myocardial infarction.
PRINCIPLE OF THE PROCEDURE
Mercodia Apo(a) ELISA is a solid phase two-site enzyme immunoassay. It is based on the direct
sandwich technique in which two monoclonal antibodies are directed against separate antigenic
determinants on the Apo(a) molecule. During incubation Apo(a) in the sample react with peroxidase-conjugated anti-Apo(a) antibodies and anti-Apo(a) antibodies bound to microtitration
well. A simple washing step removes unbound enzyme labeled antibody. The bound conjugate is
detected by reaction with 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. The reaction is stopped by adding acid
to give a colorimetric endpoint that is read spectrophotometrically.
5
English
INTENDED USE
WARNINGS AND PRECAUTION
• For in vitro diagnostic use. Not for internal or external use in humans or animals.
• The content of this kit and their residues must not be allowed to come into contact with
ruminating animals or swine.
• The Stop Solution in this kit contains 0.5 M H2SO4. Follow routine precautions for handling
hazardous chemicals.
• All patient specimens should be handled as if capable of transmitting infections.
Warning! This kit contains reagents that may be infectious!
This kit contains reagents manufactured from human blood components. The source of
material have been tested by immunoassay for hepatitis B surface antigen, antibodies for
Hepatitis C virus and antibodies for HIV virus and found to be negative. Nevertheless, all
recommended precautions for the handling of blood derivates should be observed. Please
refer to HHS Publication no. (CDC) 88-8395 or corresponding local/national guide-lines on
laboratory saftey procedures.
MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
• Pipettes for 25 µl, 50 µl, 200 µl, 500 µl and 5.0 ml (repeat pipettes preferred for addition of
enzyme conjugate solution, Substrate TMB and Stop Solution)
• Beakers and cylinders for reagent preparation
• Redistilled water
• Test tubes, 5 ml
• Microplate reader with 450 nm filter
• Plate shaker (The recommended velocity is 700-900 cycles per minute, orbital movement)
• Microplate washing device
• Magnetic stirrer
6
English
REAGENTS
Each Mercodia Apo(a) ELISA kit contains reagents for 96 wells, sufficient for 41 samples,
2 Controls and one Calibrator curve in duplicate. For larger series of assays, use pooled
reagents from packages bearing identical lot numbers. The expiry date for the complete kit is
stated on the outer label. The recommended storage temperature is 2–8°C.
Coated Plate
1 plate
96 wells
Ready for use
(mouse monclonal anti-Apo(a))
8-well strips
For unused microplate wells completely reseal the bag by using adhesive tape. Store at 2-8°C,
use within two months.
Calibrators 1, 2, 3, 4
4 vials
500 µl
Lyophilized
Add 500 µl redist.
(human Apo(a))
Concentration indicated on vial label. Color coded yellow
water per vial.
For storage of reconstituted Calibrators for more than one week, store at –20°C.
Calibrator 0
Color coded yellow
1 vial
500 µl
Ready for use
Enzyme Conjugate 11X
1 vial
(Peroxidase conjugated mouse monoclonal Anti-apo(a))
700 µl
Preparation,
see below.
Enzyme Conjugate Buffer
Color coded blue
7 ml
Ready for use
1 vial
Controls (H),(L)
2 vials
500 µl
Lyophilized
Apo(a) concentration indicated on vial label
Add 500 µl redist.
(Mean ±3 S.D.)
water per vial.
For storage of reconstituted Controls for more than one week, store at –20°C.
Pretreatment Solution
1 vial
5 ml
Ready for use
Sample Buffer 5X
2 bottles
50 ml
Color coded red
Dilute each bottle with 200 ml redistilled water to make sample buffer.
Note! Precipitate may occur when stored at 2-8°C. Allow Sample Buffer 5X to reach room
temperature. Mix until precipitate has dissolved.
1 bottle
Wash buffer 21X
Dilute with 1000 ml redistilled water to make wash solution
Storage after dilution: 2-8°C for 4 weeks.
50 ml
Substrate TMB
Colorless solution
Note! Light sensitive!
1 vial
22 ml
Ready for use
Stop Solution
0.5 M H2SO4
1 vial
7 ml
Ready for use
7
Preparation of enzyme conjugate solution
Prepare the needed volume of enzyme conjugate solution by mixing Enzyme Conjugate 11X in
Enzyme Conjugate Buffer (1+10) according to the table. When preparing enzyme conjugate
solution for the whole plate, pour all of the Enzyme Conjugate Buffer into the Enzyme Conjugate
11X vial. Mix gently. Store at 2-8°C. Use within 2 weeks.
Numbers of strips
12 strips
6 strips
4 strips
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme
Conjugate Buffer
1 vial
300 µl
200 µl
1 vial
3.0 ml
2.0 ml
SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING
Serum
Collect blood by venipuncture, allow to clot, and separate the serum by centrifugation. Specimen
may be stored for 1 week at 2-8°C. For longer periods store samples at -20°C. Avoid repeated
freezing and thawing.
Plasma
Collect blood by venipuncture into tubes containing EDTA or heparin as anticoagulant, and
separate the plasma fraction. Specimen may be stored for 1 week at 2-8°C. For longer periods
store samples at -20°C. Avoid repeated freezing and thawing.
PREPARATION OF SAMPLES
All samples and Controls have to be pretreated as follows:
1
2
3
4
Sample/Control
Mix and incubate for 1 hour at room temperature
Add sample buffer and mix.
25 µl
25 µl
5.0 ml
As a result of this procedure the samples will be diluted 1/202. This dilution is stable for 1 week
at 2–8°C.
If the concentration of Apo(a) in the sample is >1000 U/l, dilute the pretreated and diluted
sample (1/202) further in sample buffer, e.g. 1/4 giving a final dilution of 1/808.
8
Prepare enzyme conjugate solution, wash solution and sample buffer. Perform each determination in duplicate for Calibrators, Controls and samples. Prepare a calibrator curve for each assay
run. Avoid pipetting solution onto the walls.
Add to anti-Apo(a) wells
Calibrators
Samples
Controls
1
2
3
4
5
6
Calibrators
25 µl
–
–
Pretreated samples
–
25 µl
–
Pretreated Controls
–
–
25 µl
Enzyme conjugate solution
50 µl
50 µl
50 µl
Incubate on a shaker (700-900 rpm) for 1 hour at room temperature (18–25°C).
Wash 6 times with 700 µl per well using an automatic plate washer with overflow-wash
function. Do not include soak step in washing procedure.
Or manually,
Discard the reaction volume by inverting the microplate over a sink. Add 350 µl wash
solution to each well. Discard the wash solution, tap firmly several times against absorbent
paper to remove excess liquid. Repeat 5 times. Avoid prolonged soaking during washing
procedure.
7 Add 200 µl Substrate TMB
8 Incubate for 15 minutes
9 Add 50 µl Stop Solution.
Put the plate on the shaker for 5 seconds to ensure mixing of Substrate and Stop Solution.
10 Measure the absorbance at 450 nm and evaluate.
Read within 30 minutes.
Note! To prevent contamination between the conjugate and substrate, separate pipettes are
recommended.
INTERNAL QUALITY CONTROL
Internal plasma pools with low, intermediate and high Apo(a) concentration should routinely be
assayed as samples, and results charted from day to day, it is good laboratory practice to
record the following data for each assay: kit lot number, reconstitution dates of kit components:
OD values for the blank, Calibrators and Controls.
CALCULATIONS OF RESULTS
Computerized calculations
The concentration of Apo(a) is obtained by computerized data reduction of the absorbance for
the Calibrators, except for Calibrator 0, versus the concentration using cubic spline regression.
Multiply the concentration of the samples with the dilution factor (e.g. × 202)
9
English
TEST PROCEDURE
Manual calculation
1. Plot the absorbance values obtained for the Calibrators, except for Calibrator 0, against the
Apo(a) concentration on a lin-lin paper and construct a calibrator curve.
2. Read the concentration of the Controls and samples from the calibrator curve.
3. Multiply the concentration of the Controls and the samples with the dilution factor
(e.g. x 202).
Example
of worksheet
Example
of worksheet
Values
obtained
8 weeks
old kit.
Values
obtained
withwith
an 8an
weeks
old kit.
Wells
Identity
A450
MeanMean
conc. U/l*
1A–BWells
Calibrator
0,061/0,064
Identity0
A450
conc. U/l
1C–D1A–B Calibrator
1** 0
0,194/0,197
Calibrator
0.061/0.064 62,6
**
1E–F1C–D Calibrator
2
0,535/0,537
Calibrator 1
0.194/0.197 224,2 62.6
1G–H
Calibrator
3** 2
1,129/1,131
0.535/0.537 565,6224.2
1E–F
Calibrator
2A–B1G–H Calibrator
4** 3
1,835/1,837
Calibrator
1.129/1.131 1131,2
565.6
2C–D2A–B Control
L
0,239/0,242
Calibrator
4
1.835/1.837 83,81131.2
2E–F2C–D Control
H L
0,515/0,515
Control
0.239/0.242 215,483.8
2G–H
Sample
1 H
0,286/0,286
2E–F
Control
0.515/0.515 104,5
215.4
3A–B2G–H Sample
2 1
0,562/0,563
Unknown
0.286/0.286 238,4
104.5
3C–D3A–B Sample
3 2
1,070/1,073
Unknown
0.562/0.563 525,4
238.4
*
Result
multipliedUnknown
by dilution
3C–D
3 factor (× 202). 1.070/1.073
525.4
**
Concentration indicated on vial label.
* Result multiplied by dilution factor (× 202).
Example
of calibrator
curve
Example
of calibrator
curve
A typical
calibrator
curvecurve
is shown
below.below.
Do notDo
usenot
thisuse
curve
determine
actual assay
A typical
calibrator
is shown
thistocurve
to determine
actual assay
results.
results.
2
O.D. 450 nm
1.5
1
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
U/l
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
10 As with all diagnostic tests, a definitive clinical diagnosis should not be based on the results of
a single test, but should be made by the physician after all clinical findings have been evaluated.
Grossly lipemic, icteric or hemolysed samples do not interfere in the assay.
As with all diagnostic tests, a definitive clinical diagnosis should not be based on the results of
a single test, but should be made by the physician after all clinical findings have been
evaluated.
Grossly lipemic, icteric or hemolysed samples do not interfere in the assay.
Comparison studies between Mercodia Apo(a) ELISA and Mercodia Apo(a) RIA have been
Comparison studies between Mercodia Apo(a) ELISA and Mercodia Apo(a) RIA have been
performed with 45 samples assayed in 2-replicates on 2 occasions. The values found, show a
performed
withbetween
45 samples
assayed
in 2-replicates
occasions. The values found, show a
good
correlation
the two
techniques,
r=1.00 on
(see2 figure).
goodthe
correlation
two techniques,
r=1.00
(see
figure).
Thus,
expected between
values forthe
Mercodia
Apo(a) RIA
can be
used
for Mercodia Apo(a) ELISA as
well.Thus, the expected values for Mercodia Apo(a) RIA can be used for Mercodia Apo(a) ELISA as
well.
Mercodia Apo(a) ELISA ( U/l)
1250
1000
750
500
250
0
0
250
500
750
1000
1250
Mercodia Apo(a) RIA (U/l)
EXPECTED
EXPECTEDVALUES
VALUES
Good practice dictates that each laboratory establishes its own expected range of values. The
Good practice
laboratory
establishes
its own
range
values. The
following
resultsdictates
obtainedthat
witheach
Mercodia
Apo(a)
RIA may serve
as expected
a guide until
theoflaboratory
following
results
obtained
Apo(a) RIA may serve as a guide until the laboratory
has
gathered
sufficient
data with
of itsMercodia
own.
has gathered sufficient data of its own.
The
level has been
studied
in three
different
materials:
TheApo(a)
Apolipoprotein(a)
level
has been
studied
in three
different materials:
A Normals1, n=171, Sweden (Caucasian)
A Normals1, n=171, Sweden (Caucasian)
B Normals1, n=203, Canada (Caucasian-Asian, heterogeneous)
B Normals1, n=203, Canada (Caucasian-Asian, heterogeneous)
C Patients with familial hypercholesterolemia (FH), n=113, Canada (Caucasian-Asian,
C Patients with familial hypercholesterolemia (FH), n=113, Canada (Caucasian-Asian,
heterogeneous)
heterogeneous)
The group of normals were individuals chosen from the general population and with no apparent
cardio and/or cerebrovascular disease.
The distribution is shown in the following figures.
The three groups investigated did not show any age or sex differences in their apolipoprotein
(a) levels.
No significant difference in apolipoprotein(a) levels was found between the group of normals
11
from Sweden and the group of normals from Canada.
The group of FH patients had significantly higher apolipoprotein(a) levels than the group of
normals from the same region (p<0.001, Wilcoxon rank sum test).
The following apolipoprotein(a) concentrations for median, 75th, 85th and 95th percentiles
English
COMPARISION
WITH
MERCODIA
APO(a)
RIARIA
COMPARISION
WITH
MERCODIA
APO(a)
English
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
The group of normals were individuals chosen from the general population and with no apparent
cardio and/or cerebrovascular disease.
The distribution is shown in the following figures.
The three groups investigated did not show any age or sex differences in their Apo(a) levels.
No significant difference in Apo(a) levels was found between the group of normals from
Sweden and the group of normals from Canada.
The group of FH patients had significantly higher Apo(a) levels than the group of normals from
the same region (p<0.001, Wilcoxon rank sum test).
The following Apo(a) concentrations for median, 75th, 85th and 95th percentiles were
obtained for the different groups.
Normals, Sweden
Normals, Canada
FH, Canada
Median
U/l
75th perc.
U/l
85th perc.
U/l
95th perc.
U/l
131
117
294
448
379
660
612
525
863
795
1044
1544
Cumulative frequency (%)
Apo(a) distribution in normals and FH patients (Canada)
12
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
0
1600
1700
1800
1900
2000
2100
1700
1800
1900
2000
2100
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
1600
10
1500
20
1500
30
1400
40
1400
Distribution of FH patients (Canada)
1300
U/l
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
0
100
Relative frequency (%)
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
40
English
0
English
Distribution of normals (Canada)
30
20
10
U/l
Distribution of normals (Sweden)
40
30
20
10
U/l
13
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Detection limit
The detection limit is 0.05 U/l calculated as three standard deviations above the Calibrator 0.
This corresponds to a sample concentration of 10 U/l when the sample is diluted 1/202.
Recovery
Recovery upon addition is 96–111 % (mean 102 %).
Hook effect
Samples with a concentration of up to 9600 U/l can be measured without giving falsely low
results if they are pretreated and diluted 1/202 as described above.
Precision
Samples pretreated and diluted 1/202 on one occasion and stored at –20°C until the assays
were performed. Each sample was analyzed in 4 replicates on nine different occasions.
Sample
1
2
3
Obtained value
U/l
83
196
485
within
assay
3.3
2.9
2.4
Coefficient of variation %
between
total
assay
assay
4.0
3.6
1.8
5.2
4.7
3.0
Samples pretreated and diluted 1/202 on each test occasion. Each sample was analyzed in 5
replicates on five different occasions.
Sample
4
5
6
Obtained value
U/l
103
251
744
within
assay
3.1
3.6
2.4
Coefficient of variation %
between
total
assay
assay
4.2
3.7
5.2
5.2
5.2
5.7
Specificity
A concentration of up to 10 g/l of plasminogen gives no measurable cross-reactivity in the assay.
(Clinical concentration of plasminogen is below 2.1 g/l.)
Apolipoprotein B has no measurable crossreaction.
14
14
Mercodia Apo(a) ELISA kit is calibrated against a highly purified, fully validated, commercial
Lp(a) preparation.
The concentration of Apo(a) is expressed in Units/l.
It is not possible to express the concentration of Apo(a) in mass units as there are at least six
different isoforms described with molecular weights varying from approximately 300 kD to
900 kD (1,2,15,16). Thus each patient sample will contain different proportions of the different
isoforms. Therefore no exact conversion factor can be given between Units of Apo(a) and
milligrams of Apo(a).
1 Unit of Apo(a) is approximately equal to 0.7 mg Lp(a) protein.
WARRANTY
The performance data presented here was obtained using the procedure indicated. Any change
or modification in the procedure not recommended by Mercodia AB may affect the results, in
which event Mercodia AB disclaims all warranties expressed, implied or statutory, including the
implied warranty of merchantability and fitness for use.
Mercodia AB and its authorised distributors, in such event, shall not be liable for damages
indirect or consequential.
15
English
CALIBRATION
16
ZIELSETZUNG
Mercodia Apo(a) ELISA bietet eine Methode zur quantitativen Bestimmung von humanem
Apolipoprotein(a) in Serum oder Plasma.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG DES TESTS
DAS TESTPRINZIP
Mercodia Apo(a) ELISA ist ein Festphasenimmunoassay. Er basiert auf der direkten
Sandwichtechnik, bei der zwei monoklonale Antikörper gegen separate Antigene auf dem
Apo(a)-Molekül gerichtet sind. Während der Inkubation reagiert das Apo(a) in der Lösung mit
den Anti-Apo(a) Antikörpern im Peroxidase-konjugat und den Anti-Apo(a)-Antikörpern, welche
auf der Mikrotiterplatte gebunden sind. Durch einfaches Waschen werden ungebundene, durch
Enzym gekennzeichnete Antikörper entfernt. Das gebundene Konjugat wird durch 3,3’,5,5’Tetramethylbenzidin sichtbar gemacht. Durch Zugabe von Säure wird die Reaktion gestoppt. Der
daduch erhaltene colorimetrischen Endpunkt wird spektrophotometrisch abgelesen.
17
Deutsch
Apolipoprotein(a), Apo(a), ist ein Glykoprotein, das über Disulfidbrücken mit dem Apolipoprotein
B eines Lipoprotein-Partikels (a) (Lp(a)) verbunden ist. Eine der Domänen, genannt Kringle 4,
ist in multiplen Kopien vorhanden, in einer variierenden Anzahl, die genetisch bedingt ist. Die
Anzahl wiederum bedingt die variierende Größe des Apo(a) und folglich auch des Lp(a). Je
nach verwendeter Methode, sind sechs bis 23 Isoformen von Apo(a) zwischen 300 und 900
kD identifiziert worden (1, 2, 15, 16). Die meisten Menschen haben eine oder zwei Apo(a)Isoformen; es kommt jedoch auch vor, dass kein Apo(a)-Band durch Analyse mit SDS-GelElektrophorese und anschließendem Immunoblot (3) nachgewiesen werden kann.
In letzter Zeit ist das Lp(a) ins Zentrum der Aufmerksamkeit gerückt, da vieles dafür spricht, dass die
Konzentration von Lp(a) im Blut einen unabhängigen Risikofaktor für koronare Herzkrankheiten
darstellt. Man hat herausgefunden, dass die Lp(a)-Konzentration zu den erblichen Risikofaktoren
von ischämischen Herzkrankheiten (4–8) zählt. Hohe Lp(a)-Konzentrationen sind bei familiärer
Hypercholesterinämie nachgewiesen worden, weswegen die Messung der Konzentration bei
diesen Patienten zur Risikoeinschätzung klinisch sinnvoll sein könnte (9,10).
Des Weiteren sind Ergebnisse veröffentlicht worden, die darauf hinweisen, dass Lp(a) ein
starker Indikator für zerebrovaskuläre Erkrankungen darstellt (11,12).
Apo(a) ist homolog zu der Protease Zymogen Plasminogen (13,14).
Lp(a) hemmt die Aktivierung des Plasminogens, und neue Untersuchungen haben gezeigt,
dass Apo(a) und Lp(a) mit dem Plasminogen um die Bindung des Plasminogen-Rezeptors
konkurrieren. Diese Eigenschaft des Apo(a) könnte die Assoziation von hohen Lp(a)Konzentrationen mit einem erhöhten Myokardinfarktriskiko erklären.
WARNUNG UND VORSICHTSMAßNAHMEN
• Zum Gebrauch in der in vitro Diagnostik. Nicht für innere oder äußere Anwendung bei
Mensch und Tier.
• Der Inhalt dieses Kits oder seine Rückstände dürfen nicht in Kontakt mit Wiederkäuern oder
Schweinen kommen.
• Die Stop Solution in diesem Kit enthält 0.5 M H2SO4. Bitte Routinevorkehrungen für
gefährliche Chemikalien beachten!
• Alle Patientenproben sollten als potentiell infektiös behandelt werden.
Warnung! Dieses Kit enthält Reagenzien, die infektiös sein können!
Dieses Kit enthält Reagenzien, die aus menschlichen Blutbestandteilen hergestellt worden sind.
Das Spendermaterial ist durch Immunoassay auf Hepatitis-B-Oberflächenantigen, Antikörper
für den Hepatitis-C-Virus und auf Antikörper für den HIV-Virus getestet und für negativ
befunden worden. Dennoch sollten alle erforderlichen Sicherheits-maßnahmen für den
Umgang mit Blutderivaten eingehalten werden. Beachten Sie hierzu bitte die HHS Publication
no. (CDC) 88-8395 oder entsprechende regionale/nationale Richtlinien zu labortechnischen
Sicherheitsmaßnahmen.
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
• 25 µl, 50 µl, 200 µl, 500 µl und 5.0 ml Multipipetten (vorzugsweise Mehrfachpipetten für
die Zugabe des Enzymkonjugatlösung, des Substrate TMB und der Stop Solution)
• Becherglas und Messzylinder für die Aufbereitung der Reagenzien
• Doppelt destilliertes Wasser
• Reaktionsgefäße, 5 ml
• Photometer mit 450 nm Filter
• Plattenschüttler (Die empfohlene Geschwindigkeit liegt bei 700-900 Umdrehungen pro
Minute, OrbitalBewegung)
• Waschvorrichtung für die Mikrotiterplatten
• Magnetrühre
18
REAGENZIEN
Jedes Mercodia Apo(a) ELISA Kit enthält Reagenzien für 96 Brunnen, ausreichend für
41 Proben, 2 Controls und eine Kalibratorkurve im Duplikat. Für größere Assay-Serien ist es
empfehlenswert, Reagenzien, die miteinander vermischt werden sollen, aus Packungen mit
derselben Lot-Nummer anzuwenden. Das Verfallsdatum für das komplette Kit ist auf dem Etikett
der Packung vermerkt. Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2–8°C.
19
Deutsch
Coated Plate
1 Platte
96 Brunnen
Gebrauchsfertig
(monoklonale anti-Apo(a) der Maus)
8 Brunnen-Strips
Die unbenutzten Mikrotiterstreifen können in der mit Klebeband versiegelten Originalverpackung bei 2–8°C bis zu zwei Monate lang aufbewahrt werden.
4 Fläschchen 500 µl
Gefriergetrocknet
(humanes Apo(a))
500 µl doppelt destill.
Die Konzentration ist auf den Fläschchen angegeben.
Wasser pro Fläschchen
Gelbfärbung
hinzufügen
Lagerung von rekonstituierten Calibrators länger als eine Woche erfordern eine temperatur
von –20°C.
Calibrator 0
Gebrauchsfertig
Gelbfärbung
Zubereitung s. unten
(Peroxidase konjugiertes monoclonales Anti-Apo(a) der Maus)
1 Fläschchen
7 ml
gebrauchsfertig
Blaufärbung
Controls (H), (L)
Gefriergetrocknet
Apo(a)-Konzentration wird auf dem Etikett angegeben
500 µl doppelt dest.
(Mittelwert ± 3 S.D.)
Wasser pro Fläschchen
hinzufügen.
Lagerung von rekonstituierten Calibrators länger als eine Woche erfordern eine temperatur
von –20°C.
1 Fläschchen
5 ml
Gebrauchsfertig
Sample Buffer 5X
2 Flaschen
50 ml
Um Probenpuffer herzustellen
Rotfärbung.
mit 200 ml bidestill. Wasser
pro Flasche verdünnen.
Achtung! Aufgrund der Lagerung bei 2-8°C kann es zu Ausfällungen kommen. Lassen Sie den
Sample Buffer 5X auf Raumtemperatur kommen. Solange schütteln oder verwirbeln, bis sich
die Ausfällungung gelöst hat.
Wash Buffer 21X
1 Flasche
50 ml
Im Verhältnis 1+20 mit 1000 ml bidestill. Wasser verdünnen, um Waschlösung herzustellen.
Lagerung nach Verdünnung: 4 Wochen bei 2-8°C
Substrate TMB
1 Flasche
22 ml
Gebrauchsfertig
Farblose Lösung. Achtung! Lichempfindlich!
Stop solution
1 Flasche
7 ml
Gebrauchsfertig
0.5 M H2SO4
Vorbereitung der Enzymkonjugatlösung
Stellen Sie die benötigte Menge von Enzymkonjugatlösung her, indem Sie Enzym Conjugate 11X
mit Enzyme Conjugate Buffer (1+10) entsprechend der folgenden Tabelle mischen. Wenn Sie die
Enzymkonjugatlösung für die ganze Platte vorbereiten, schütten Sie die gesamte Menge Enzym
Conjugate Buffer in das Fläschchen Enzym Conjugate 11X. Vorsichtig mischen. Innerhalb von 2
Wochen (2-8°C) aufbrauchen.
Anzahl Streifen
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme
Conjugate Buffer
12 Streifen
6 Streifen
4 Streifen
1 Fläschchen
300 µl
200 µl
1 Fläschchen
3.0 ml
2.0 ml
PROBENGEWINNUNG UND HANDHABUNG
Serum
Entnehmen Sie Blut durch Venenpunktion, lassen Sie es gerinnen und trennen Sie anschließend
das Serum durch Zentrifugieren. Die Proben können bei 2-8°C eine Woche lang gelagert werden. Längere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von -20°C. Vermeiden Sie mehrmaliges
Einfrieren und Auftauen.
Plasma
Entnehmen Sie Blut durch Venenpunktion in Röhrchen, die EDTA oder Heparin als Antikoagulans
enhalten, und trennen Sie die Plasmafraktionen auf. Die Proben können bei 2-8°C eine Woche
lang gelagert werden. Längere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von -20°C. Vermeiden Sie
mehrmaliges Einfrieren und Auftauen.
Vorbereitung der Proben
Alle Proben und Controls müssen wie folgt vorbereitet werden:
1
2
3
4
Proben/Control
Mischen und eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubieren
Probenpuffer hinzufügen und mischen
25 µl
25 µl
5.0 ml
Als Ergebnis dieses Vorgangs sind die Proben 1/202 verdünnt. Diese Lösung ist bei 2–8°C
eine Woche lang haltbar.
Wenn die Konzentration des Apo(a) in der Lösung >1000 U/l ist, muss die
vorbereitete und verdünnte Lösung (1/202) mit Hilfe von Probenpuffer weiter verdünnt werden,
z. B. durch Zugabe von 1/4 mit einer endgültigen Verdünnung 1/808.
20
TESTDURCHÜRUNG
Bereiten Sie die Enzymkonjugatlösung, die Waschlösung und den Probenpuffer vor. Führen Sie
jede Bestimmung der Calibrators, Controls und Proben im Duplikat aus. Es sollte für jeden Assay
eine Kalibratorkurve gemacht werden. Vermeiden Sie die Lösung gegen die Reaktionsgefäßwände zu pipettieren.
Calibrators
Proben
Controls
1
2
3
4
5
Calibrators
25 µl
–
–
Vorbereitete Proben
–
25 µl
–
Vorbereitete Controls
–
–
25 µl
Enzymkonjugatlösung
50 µl
50 µl
50 µl
Auf einem Schüttler (700-900 rpm) bei Zimmertemperatur (18–25°C)1 Stunde lang
inkubieren.
6 6 mal waschen mit 700 µl pro Vertiefung unter Verwendung eines PlattenWaschautomaten mit Überlauf-Waschfunktion. Einwirkzeit während der Waschprozedur
sollte vermieden werden.
Wird manuell gewaschen, bitte folgendermaßen vorgehen:
Reaktionsvolumen verwerfen, durch Umdrehen der Mikrotiterplatte über einem
Ausgussbecken. 350 µl Waschlösung in jede Vertiefung geben. Waschlösung verwerfen
und mehrmals kräftig gegen saugfähiges Papier schlagen, um überschüssige Flüssigkeit
zu entfernen. 5-mal wiederholen. Längere Einwirkzeiten während der Waschprozedur
vermeiden.
7 200 µl Substrate TMB hinzugeben
8 Anschließend Lösung 15 Minuten inkubieren.
9 50 µl Stop Solution hinzufügen. Stellen Sie die Platte 5 Sekunden lang auf den Schüttler,
um sicher zu gehen, dass sich das Substrate TMB gut mit der Stop Solution vermischt hat.
10 Messen Sie die Absorbanz bei 450 nm und werten sie aus. Das Resultat sollte innerhalb
von 30 Minuten abgelesen werden.
Beachten Sie ! Um Kontaminationen zwischen dem Konjugat und dem Substrat zu vermeiden,
empfehlen wir Ihnen separate Pipetten zu verwenden.
INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE
Interne Serumpoole mit niedriger, mittlerer und hoher Apo(a)-Konzentration sollten routinemäßig
als Proben behandelt und die Ergebnisse täglich aufgezeichnet werden. Es wird jedem Labor
empfohlen, folgende Daten für jede Probe zu protokollieren: Kit-Lot-Nummer, Haltbarkeitsdaten
der Kitkomponenten, Absorptionswerte (OD-Werte) der Blanks, Calibrators und Controls.
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Computergestützte Berechnung
Es kann eine computergestützte Berechnung der Absorptionswerte der Calibrators – mit
Ausnahme von Calibrator 0 – und deren Konzentration mithilfe einer kubischen Regression
erfolgen, um die Konzentration des Apo(a) der Lösung mit unbekannter Konzentration
(Proben) zu errechnen. Multiplizieren Sie die Konzentration der Proben mit dem Verdünnungsfaktor
(z. B. × 202).
21
Deutsch
In die anti-Apo(a)-Vertiefungen geben
Manuelle Berechnung
1. Zeichnen Sie die für die Calibrators (außer Calibrator 0) erhaltenen Absorptionswerte im
Verhältnis zur den Apo(a)-Konzentrationswerten auf einem lin-lin-Papier ein und erstellen
Sie eine Kalibratorkurve.
2. Lesen Sie die Konzentrationswerte der Controls und die Proben aus der Kalibratorkurve ab.
3. Multiplizieren Sie die Konzentrationswerte der Controls und die Proben mit dem
Verdünnungsfaktor (z. B. × 202).
Beispiel von Resultaten
Werte, ermittelt mit einem 8 Wochen alten Kit.
Kavitäten
Identität
A450
Mittelwert Konz. U/l*
1A–B
Calibrator 0
0,061/0,064
1C–D
Calibrator 1**
0,194/0,197
62,6
1E–F
Calibrator 2**
0,535/0,537
224,2
1G–H
Calibrator 3**
1,129/1,131
565,6
2A–B
Calibrator 4**
1,835/1,837
1131,2
2C–D
Control L
0,239/0,242
83,8
2E–F
Control H
0,515/0,515
215,4
2G–H
Probe 1
0,286/0,286
104,5
3A–B
Probe 2
0,562/0,563
238,4
3C–D
Probe 3
1,070/1,073
525,4
*
Ergebnis multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor (× 202).
**
Die Konzentration ist auf dem Fläschchen angegeben.
22
Beispiel einer Kalibratorkurve
Beispiel einer Kalibratorkurve
Hier
Kalibratorkurve
gezeigt.
Sie soll
Berechnung
aktuelleraktueller
Hier ist
isteine
einetypische
typische
Kalibratorkurve
gezeigt.
Sienicht
soll zur
nicht
zur Berechnung
Hier ist eine typischewerden.
Kalibratorkurve gezeigt. Sie soll nicht zur Berechnung aktueller
Testergebnisse
Testergebnisse benutzt
benutzt werden.
Testergebnisse benutzt werden.
2
2
Deutsch
Deutsch
Deutsch
O.D. 450 nm
O.D. 450 nm
1.5
1.5
1
1
0.5
0.5
0
00
1
0
2
1
2
3
3
U/l
U/l
4
5
4
6
5
6
GRENZEN
DES
VERFAHRENS
GRENZEN
GRENZENDES
DESVERFAHRENS
VERFAHRENS
Wie bei
bei allen diagnostischen
diagnostischen Tests sollte
sollte auch hier
hier eine endgültige
endgültige klinische Diagnose
Diagnose nicht auf
auf
Wie
Wie beiallen
allen diagnostischenTests
Tests sollteauch
auch hiereine
eine endgültigeklinische
klinische Diagnosenicht
nicht auf
Resultaten einzelner
einzelner Testsberuhen,
beruhen, sondernvielmehr
vielmehr erstdann
dann vomArzt
Arztgestellt
gestelltwerden,
werden,
den
denResultaten
Resultaten einzelnerTests
Tests beruhen,sondern
sondern vielmehrerst
erst dannvom
vom Arzt
gestellt werden,
wenn
wenndie
dieErgebnisse
Ergebnissealler
allerklinischen
klinischenund
undLaborbefunde
Laborbefundeausgewertet
ausgewertetworden
wordensind.
sind.
Lipemic, Icteric oder hämolysierte Proben beeinträchtigen den Versuch nicht.
VERGLEICH
VERGLEICH MIT
MIT MERCODIA
MERCODIAAPO(a)
APO(a) RIA
RIA
VERGLEICH
MIT
MERCODIA
RIA und Mercodia Apo(a) RIA sind mit 45 Proben
Vergleichsstudien
zwischen
MercodiaAPO(a)
Apo(a) ELISA
Vergleichsstudien zwischen Mercodia Apo(a) ELISA und Mercodia Apo(a) RIA sind mit 45 Proben
Vergleichsstudien
zwischen
ELISA undinMercodia
Apo(a)
RIA sind mituntersucht
45 Proben
durchgeführt worden,
die Mercodia
bei zweiApo(a)
Gelegenheiten
doppelter
Wiederholung
durchgeführt worden,
zwei
Gelegenheiten
in doppelter
Wiederholung
untersucht
durchgeführt
diedie
bei bei
zwei
Gelegenheiten
doppelter
Wiederholung
untersucht
wurden. Die worden,
ermittelten
Werte
zeigen
eine hohe inKorrelation
zwischen
den beiden
Verfahren,
wurden.Die
Dieermittelten
ermitteltenWerte
Wertezeigen
zeigen
eine
hohe
Korrelation
zwischen
den
beiden
Verfahren,
wurden.
eine
hohe
Korrelation
zwischen
den
beiden
Verfahren
mit
r=1.0 (vgl. Abb.). Somit können die Werte für Mercodia Apo(a) RIA auch für Mercodia Apo(a)
r=1.0 (vgl.
Somit
RIA auch
auch für
fürMercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a)
r=1.0
(vgl.Abb.).
Abb.).
Somitkönnen
könnendie
dieWerte
Wertefür
für Mercodia
Mercodia Apo(a)
Apo(a) RIA
ELISA an
verwendet
werden.
ELISAverwendet
verwendetwerden.
werden.
ELISA
1250
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
250
0
00
0
250
250
500
750
1000
500
750
1000
1250
1250
23
23
23
ERWARTETE
WERTE
ERWARTETE WERTE
Es wird empfohlen, dass
dass jedes
jedes Labor
Labor durch
durchVersuchsreihen
Versuchsreiheneigene
eigeneReferenzwerte
Referenzwerteetabliert.
etabliert.Die
Die
folgenden Resultate,
vonvon
Mercodia
Apo(a)
RIA ermittelt
worden worden
sind, können
folgenden
Resultate,diedie
Mercodia
Apo(a)
RIA ermittelt
sind,alskönnen als
Orientierung dienen, bis das Labor genügend eigene Daten gewonnen hat.
Die
bei drei verschiedenen
Populationen
Die Apolipoprotein(a)-Konzentration
Apo(a)-Konzentration ist bei drei ist
verschiedenen
Populationen
untersuchtuntersucht
worden: worden:
A Normale1,
Normale1,n=171,
n=171,Schweden
Schweden (Kaukasier)
(Kaukasier)
B Normale1,
Normale1,n=203,
n=203,Kanada
Kanada(Kaukasier-Asiaten,
(Kaukasier-Asiaten,heterogen)
heterogen)
C Patienten
Patientenmit
mitfamiliärer
familiärerHypercholesterinämie
Hypercholesterinämie
(FH),
n=113,
Kanada
(Kaukasier-Asiaten,
(FH),
n=113,
Kanada
(Kaukasier-Asiaten,
heterogen)
heterogen)
Die Gruppe
Gruppe der
der Normalen
Normalen bestand
bestandaus
ausPersonen
Personenaus
ausder
derallgemeinen
allgemeinenBevölkerung,
Bevölkerung,beibeidenen
denen
Die
keine kardiologische
kardiologische und/oder
und/oder zerebrovaskuläre
zerebrovaskuläre Erkrankung
Erkrankung aufgetreten
aufgetreten war.
war.
keine
Die
und Abbildungen
Abbildungen deutlich.
deutlich.
DieVerteilung
Verteilung wird
wird inin den
den folgenden
folgenden Zahlen
Zahlen und
Die
drei untersuchten
untersuchtenGruppen
Gruppen
zeigten
keinerlei
oder geschlechtsabhängige
Die drei
zeigten
keinerlei
alters-altersoder geschlechtsabhängige
Apolipoprotein(a)-Konzentration.
Unterschiede in Bezug auf die Apo(a)-Konzentration.
Es zeigten
sich keine Unterschiede
signifikanten Unterschiede
in der Apo(a)-Konzentration zwischen
der
Keine
signifikanten
in der Apolipoprotein(a)-Konzentration
zeigten sich
Gruppe
ausNormalen
Schwedenaus
undSchweden
der Gruppe
ausNormalen
Kanada an.
zwischender
derNormalen
Gruppe der
undder
derNormalen
Gruppe der
aus Kanada.
Die Gruppe
Gruppeder
derFH-Patienten
FH-Patientenhatte
hatteeine
einesignifikant
signifikant
höhere
Apo(a)-Konzentration als die
Die
höhere
Apolipoprotein(a)-Konzentration
Gruppe
der Normalen
aus derselben
Region Region
(p<0.001,
Wilcoxon
rank sum
test).
als die Gruppe
der Normalen
aus derselben
(p<0.001,
Wilcoxon
rank
sum test).
Die folgenden
folgenden Apo(a)-Konzentrationen
für die mittlere,
75.,
85. und75.,
95.85.
Perzentile
für
Die
Apolipoprotein(a)-Konzentrationen
für die
mittlere,
und 95.wurden
Perzentile
die
verschiedenen
Gruppen
ermittelt.
wurden für die verschiedenen Gruppen ermittelt.
Mittlere
U/l
Normale, Schweden
Normale, Kanada
FH, Kanada
131
117
294
75. Perz.
U/l
85. Perz.
U/l
95. Perz.
U/l
448
379
660
612
525
863
795
1044
1544
Apo(a) -Verteilung bei Normalen und FH-Patienten (Kanada)
(FH-Patienten)
24
24
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
0
1600
1700
1800
1900
2000
2100
1700
1800
1900
2000
2100
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
1600
10
1500
20
1500
30
1400
40
1400
Verteilung bei FH-Patienten (Kanada)
1300
U/l
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
200
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
100
Relative Frequenz (%)
20
10
Deutsch
Deutsch
Verteilung bei Normalen (Kanada)
40
30
U/l
Verteilung bei Normalen (Schweden)
40
30
20
10
U/l
25
TESTCHARAKTERISIERUNG
TESTCHARAKTERISIERUNG
Nachweisgrenze
Nachweisgrenze
Die
durch
dreidrei
Standardabweichungen
über
demdem
DieNachweisgrenze
Nachweisgrenzeliegt
liegtbei
bei0.05
0.05U/l,
U/l,definiert
definiert
durch
Standardabweichungen
über
Calibrator 0.
Calibrator 0.
Das entspricht einer Lösungskonzentration von 10 U/l bei einer Verdünnung von 1/202.
Das entspricht einer Lösungskonzentration von 10 U/l bei einer Verdünnung von 1/202.
Wiederfindung
Wiederfindung
Die Wiederfindung nach Zugabe beträgt 96–111 % (Mittelwert 102 %).
Die Wiederfindung nach Zugabe beträgt 96–111 % (Mittelwert 102 %).
Hookeffekt
Hookeffekt
Bei Proben mit einer Konzentration bis zu 9600 U/l wurde kein Hook-Effekt festgestellt, wenn
Bei Proben mit einer Konzentration bis zu 9600 U/l wurde kein Hook-Effekt festgestellt, wenn sie
sie entsprechend der Anleitung oben vorbehandelt und 1/202 verdünnt werden.
entsprechend der Anleitung oben vorbehandelt und 1/202 verdünnt werden.
Präzision
Präzision
Es wurden Proben untersucht, die einmal vorbereitet und 1/202 verdünnt worden waren und
Es wurden
Proben untersucht,
die einmal
vorbereitet
worden waren
die
bis zur Untersuchung
bei –20°C
gelagert
wurden.und
Jede1/202
Probeverdünnt
wurde neunmal
in vier und die
bis zur Untersuchung
bei –20°C gelagert wurden. Jede Probe wurde neunmal in vier
Wiederholungen
analysiert.
Wiederholungen analysiert.
Probe
1
2
3
Mittelwert
U/l
83
196
485
während des
Assay %
3.3
2.9
2.4
Variationskoeffizient
zwischen den
Total
Assay %
Assay %
4.0
3.6
1.8
5.2
4.7
3.0
Die Proben wurden bei jedem Testdurchlauf vorbehandelt und 1/202 verdünnt. Jede Probe
wurde fünfmal in fünf Wiederholungen analysiert.
Probe
4
5
6
Spezifität
Spezifität
Mittelwert
U/l
103
251
744
während des
Assay %
3.1
3.6
2.4
Variationskoeffizient
zwischen den
Total
Assay %
Assay %
4.2
3.7
5.2
5.2
5.2
5.7
Eine
EineKonzentration
Konzentrationan
anPlasminogenen
Plasminogenenvon
vonbis
biszuzu10
10g/lg/lergibt
ergibtkeine
keinemessbare
messbareKreuzreaktivität
Kreuzreaktivität
während
währendder
derUntersuchung
Untersuchung(Die
(Dieklinische
klinischeKonzentration
Konzentrationvon
vonPlasminogen
Plasminogenliegt
liegtunter
unter2.1
2.1g/l.).
g/l.).
Apolipoprotein
B
zeigt
keine
messbare
Kreuzreaktion.
Apolipoprotein B zeigt keine messbare Kreuzreaktion.
26
26
KALIBRIERUNG
HAFTUNG
Die hier aufgeführten Durchführungsdaten wurden mit dem indizierten Verfahren gewonnen.
Jede von Mercodia AB nicht empfohlene Veränderung oder Modifizierung des Verfahrens kann
die Resultate beeinträchtigen. In diesem Fall lehnt Mercodia AB jede explizierte, implizierte oder
gesetzliche Garantie ab, die implizierte Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen.
Mercodia AB und deren Vertreter können dann weder für direkte Schäden noch für
Folgeschäden haftbar gemacht werden.
27
Deutsch
Das Mercodia Apo(a) ELISA Kit wurde mit einer stark gereinigten, für vollständig
valide befundenen, handelsüblichen Lp(a)-Lösung kalibriert.
Die Apo(a)-Konzentration wird in U/l-Einheiten ausgedrückt.
Es ist nicht möglich, die Apo(a)-Konzentration in Masse-Einheiten auszudrücken, da
mindestens sechs verschiedene Isoformen mit einem zwischen 300 kD und 900 kD (1, 2, 15, 16)
variierenden Molekulargewicht beschrieben wurden. Somit wird jede Patientenprobe
verschiedene Proportionen der unterschiedlichen Isoformen enthalten. Daher kann kein exakter
Umwandlungsfaktor zwischen den Einheiten des Apo(a) und Milligram Apo(a) festgelegt
werden.
1 Einheit Apo(a) entspricht annähernd 0.7 mg Lp(a)-Protein.
28
UTILISATION PREVUE
Le test Mercodia Apo(a) ELISA fournit une méthode de détermination des quantités
d’apolipoprotéine(a) humaine présente dans le sérum ou le plasma.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
PRINCIPE DE LA PROCÉDURE
Le test Mercodia Apo(a) ELISA consiste en un dosage immunologique enzymatique à double site,
en phase solide. Il repose sur une technique de type “sandwich direct”, dans laquelle deux
anticorps monoclonaux sont dirigés contre deux déterminants antigéniques distincts de la
molécule d’Apo(a). En phase d’incubation, l’Apo(a) de l’échantillon réagit avec
les anticorps anti-Apo(a) péroxydase-conjugués et les anticorps anti-Apo(a) fixés aux puits de
microtitration. Un rinçage simple élimine les anticorps marqués non liés. Le conjugué est détecté
par réaction avec la 3,3’,5,5’- tétraméthylbenzidine. Pour arrêter la réaction, on ajoute de l’acide.
Cette solution fournit un point d’évaluation colorimétrique, qui sera lu par spectrophotométrie
29
Français
L’apolipoprotéine a, Apo(a), est une glycoprotéine reliée par des ponts disulfures à
l’apolipoprotéine B au sein de la particule de lipoprotéine (a) (Lp(a)). L’Apo(a) est constituée de
trois domaines structuraux différents. Un de ces domaines appelé kringle 4, est présent en de
multiples copies dont le nombre varie et est génétiquement déterminé, ce qui conduit à
différentes tailles d’Apo(a) et par conséquent de Lp(a).
En fonction de la méthode utilisée, on a pu identifier entre 6 et 23 isoformes d’Apo(a) dont
les tailles sont comprises entre 300 et 900 kD environ (1,2,15,16). La plupart des individus
possèdent une ou deux isoformes d’Apo(a), encore que chez certains sujets aucune bande
d’Apo(a) n’est détectée lors de l’analyse par électrophorèse sur gel-SDS suivie d’une recherche
par immunoblot (3).
Récemment, la Lp(a) a suscité beaucoup d’intérêt. En effet, de nombreuses preuves existent
quant au fait que son taux circulant représente un facteur de risque indépendant pour la
maladie vasculaire coronarienne (4-8). On a démontré que le taux de Lp(a) est un facteur de
risque héréditaire pour la maladie cardiaque ischémique. Des niveaux élevés de Lp(a) ont été
observés dans l’hypercholestérolémie familiale et sa mesure peut être cliniquement utile pour
l’évaluation du risque chez ces patients (9, 10).
Des résultats ont également été publiés selon lesquels la Lp(a) est considérée comme un
indicateur important de la maladie vasculaire cérébrale (11,12).
L’Apo(a) présente un degré important d’homologie avec la protéase zymogène plasminogène
(13,14).
La Lp(a) inhibe l’activation du plasminogène et des études récentes ont montré que l’Apo(a)
et la Lp(a) entrent en compétition avec le plasminogène au niveau du récepteur de ce dernier.
Ces propriétés de l’Apo(a) pourraient expliquer l’association entre les concentrations élevées de
Lp(a) et l’infarctus du myocarde.
AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
• Ce kit est réservé à l’utilisation diagnostique in vitro. Ne convient pas à l’usage interne ou
externe chez les humains ou les animaux.
• Vous devez éviter tout contact entre le contenu ou les résidus de ce kit et les ruminants ou
les suidés.
• La Stop Solution fournie contient 0.5 M d’acide sulfurique (H2SO4). Respectez les
précautions habituelles relatives à l’utilisation de produits chimiques dangereux.
• Tous les spécimens patients doivent être traités comme des échantillons potentiellement
contagieux.
Avertissement: Ce kit contient des réactifs qui peuvent s’avérer infectieux.
Ce kit contient des réactifs fabriqués à partir de composants sanguins humains. Le matériel a
été soumis à des dosages enzymatiques visant à détecter l’antigène de surface de l’hépatite
B ainsi que les anticorps du virus HIV et du virus de l’hépatite C. Ces tests ont donné des
résultats négatifs. Toutefois, il convient de respecter toutes les précautions recommandées pour
la manipulation des dérivés sanguins. Reportez-vous pour ce faire à la publication HHS n°(CDC)
88-8395 ou aux directives nationales ou locales correspondantes sur les procédures de sécurité
en laboratoire.
MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI
• Pipettes de 25 µl, 50 µl, 200 µl, 500 µl et 5.0 ml (pipettes à répétition recommandées pour
l’ajout la solution de l’enzyme conjuguée, de Substrate TMB et de Stop Solution)
• Béchers et éprouvettes cylindriques pour la préparation des réactifs
• Eau redistillée
• Tubes à essai de 5 ml
• Lecteur de microplaques avec filtre de 450 nm
• Agitateur-secoueur de plaques (Le régime recommandé est de700-900 tours par minute,
mouvement orbital)
• Dispositif de rinçage des microplaques
• Agitateur magnétique
30
RÉACTIFS
Chaque kit de Mercodia Apo(a) ELISA contient suffisamment de réactifs pour 96 puits, soit une
quantité permettant de traiter 41 échantillons, 2 Controls et une courbe d’étalonnage en
double. Pour des séries de dosage plus importants, mélangez des réactifs de kits portants des
numéros de lots identiques. La date de péremption du kit figure sur l’étiquette apposée à
l’extérieur. La température de stockage recommandée est comprise entre 2 et 8°C.
Wash Buffer 21X
1 flacon
50 ml
Diluez 1+20 avec 1000 ml d’eau redist. pour préparer la solution de lavage
Stockage après dilution: 2-8°C pour 4 semaines.
Substrate TMB
1 fiole
22 ml
Prête à l’emploi
Solution incolore. Remarque: cette solution est sensible `la lumière!
Stop Solution
0,5 M H2SO4
1 fiole
7 ml
31
Français
Coated Plate
1 plaque
96 puits
(anticorps monoclonaux anti-Apo(a) de souris)
bandes de 8 puits
Les puits de microtitration non utilisés peuvent être conservés pendant deux mois entre 2-8°C
après les avoir replacés dans leur emballage hermétiquement fermé à l’aide de papier adhésif.
4 fioles
500 µl
Lyophilisé
(Apo(a) humaine) Code couleur: jaune
Ajouter 500 µl d’eau
Concentration indiquée sur l’etiquette du flacon
redist. par fiole
Pour le stockage et la reconstitution des Calibrators au-delà d’une semaine, conservez-les à
–20°C.
Calibrator 0
1 fiole
500 µl
Code couleur: jaune
1 fiole
700 µl
À préparer, voir
(Peroxydase conjuguée à
ci-dessous
l’anti Apo(a) monoclonal de souris)
1 fiole
7 ml
Code couleur: bleu
Controls (H), (L)
2 flacones 500 µl
Lyophilisé
Concentration d’Apo(a) indiquée sur l’etiquette du flacon
Ajouter 500 µl d’eau
(Moyenne ± 3 S.D.)
redist. par fiole
Pour le stockage et la reconstitution des Controls au-delà d’une semaine, conservez-les à
–20°C.
1 fiole
5 ml
Prête l’emploi
Sample Buffer 5X
2 flacones 50 ml
Code couleur rouge. A diluer chaque flacon avec 200 ml d’eau destillé pour préparer le
tampon de l’echantillon. Remarque: Un précipité peut se former aux températures comprises
entre 2 et 8°C. Placez Sample Buffer 5X à température ambiante jusqu’à ce que sa température soit égale à celle de la piéce. Secouez-le jusqu’á ce que le précipité soit dissous.
Préparation du conjugué enzymatique
Préparez le volume nécessaire en diluant d’Enzyme Conjugate 11X avec d’Enzyme Conjugate
Buffer (1+10) en suivant les indications du tableau ci-dessous. Lors de la préparation du conjugué enzymatique pour une plaque entière, transférer tout le tampon du Enzyme Conjugate
Buffer dans le flacon du Emzyme Conjugate 11X. Mélanger sans agiter.
Stockage aprés dilution: 2-8° C, 2 semaines.
Nombre de
bandes
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme Conjugate
Buffer
12 bandes
6 bandes
4 bandes
1 fiole
300 µl
200 µl
1 fiole
3.0 ml
2.0 ml
COLLECTE ET MANIPULATION DES SPÉCIMENS
Sérum
Collectez le sang par ponction veineuse, attendez la coagulation, puis isolez le sérum par centrifugation. Les échantillons peuvent être stockés pedant une semaine à une température comprise
entre 2 et 8°C. Pour les conservar plus longtemps, stockez-les à une température de -20°C.
Evitez de les congeler et les décongeler plusieurs fois.
Plasma
Collectez le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l’EDTA ou de l’heparine
comme anticoagulant et isolez le plasma. Les échantillons peuvent être stockés pedant une
semaine à une température comprise entre 2 et 8°C. Pour les conservar plus longtemps, stockezles à une température de -20°C. Evitez de les congeler et les décongeler plusieurs fois.
Préparation des échantillons
Tous les échantillons et les Controls doivent être prétraités comme suit:
1
2
3
4
Échantillon/Control
25 µl
25 µl
Mélangez et laissez incuber pendant 1 heure à température ambiante
5.0 ml
Ajouter le tampon de l’échantillon et mélangez
A l’issue de cette procédure, les échantillons présentent une dilution de 1/202. Cette dilution
reste stable pendant une semaine à 2–8°C. Si la concentration en apolipoprotéine(a) dans
l’échantillon est > 1000U/I, poursuivez la dilution de l’échantillon prétraité et dilué dans le
tampon de l’échantillon, par ex. ce qui aboutit à une dilution finale de 1/808.
32
PROCÉDURE DE TEST
Preparez la solution de l’enzyme conjuguée, la solution de lavage et le tampon de l’échantillon.
Réalisez chaque détermination en double pour les Calibrators, les Controls et les échantillons
inconnus. Préparez une courbe d’étalonnage pour chaque dosage. Eviter de pipeter les
solutions vers les parois du tube.
Ajoutez aux puits d’Apo(a)
Calibrators
Échantillons
Controls
1
2
3
4
5
Note: Pour éviter les contaminations du conjugué avec le substrat, il est recommandé d’utiliser
des pipettes différentes.
CONTRÔLE DE QUALITÉ INTERNE
Des mélanges de plasma internes dont la concentration en Apo(a) est faible, intermédiaire et
élevée doivent systématiquement être soumis à un dosage, comme des mélanges de
concentration échantillons, et les résultats doivent être reportés sur un graphique journalier.
C’est une bonne pratique pour un laboratoire d’enregistrer les données suivantes pour chaque
dosage: numéro de lot du kit, dates de reconstitution des composants, valeurs OD du blanc, des
Calibrators et des Controls.
33
Français
Calibrators
25 µl
–
–
–
25 µl
–
Échantillons prétraités
Controls prétraités
–
–
25 µl
Conjugué enzymatique
50 µl
50 µl
50 µl
Laissez incuber sur un agitateur-secoueur de plaque (700-900 rpm) pendant 1 heure
à température ambiante (18–25°C).
6 Lavez 6 fois avec 700 µl par puit avec un laveur de plaques automatique en utilisant la
fonction aspiration verticale. Evitez l’étape de trempage dans la procédure de lavage.
Ou lavez manuellement:
Jetez le volume réactionnel en retournant la plaque au-dessus d’un évier. Ajoutez 350 µl
de solution de lavage dans chaque puit. Jetez la solution de lavage, tapez fermement
plusieurs fois sur un papier absorbant pour ôter l’excès de liquide. Répétez 5 fois.
Evitez les trempages prolongés pendant l’étape de lavage.
7 Ajoutez 200 µl de Substrate TMB
8 Laissez incuber pendant 15minutes
9 Ajoutez 50 µl de Stop Solution. Placez la plaque sur un agitateur-secoueur pendant
5 secondes, afin que le mélange Substrate TMB et Stop Solution s’effectue bien.
10 Lisez la densité optique à 450 nm et calculez les résultats.
La lecture doit se faire dans les 30 minutes.
CALCUL DES RÉSULTATS
Calcul par ordinateur
Pour calculer la concentration en Apo(a), il est possible par ordinateur de réduire les données
d’absorbance des Calibrators, à l’exception du Calibrator 0, comparées à la concentration, en
appliquant une équation de régression de la spline cubique.
Multipliez la concentration des nouveaux échantillons par le facteur de dilution (par exemple
×202).
Calcul manuel
1. Placez les points correspondants aux valeurs d’absorbance obtenues pour les Calibrators, à
l’exception du Calibrator 0, en fonction de la concentration en Apo(a) sur du papier pour
graphiques lin-logarithmiques et tracez la courbe d’étalonnage.
2. Lisez la concentration des Controls et des échantillons à partir de cette courbe.
3. Multipliez la concentration des Controls et des échantillons par le facteur de dilution
(par ex. × 202).
Exemple de résultats
Valeurs obtenues avec un kit datant de 8 semaines.
Puits
Identité
A450
1A–B
Calibrator 0
0,061/0,064
1C–D
Calibrator 1**
0,194/0,197
1E–F
Calibrator 2**
0,535/0,537
1G–H
Calibrator 3**
1,129/1,131
2A–B
Calibrator 4**
1,835/1,837
2C–D
Control L
0,239/0,242
2E–F
Control H
0,515/0,515
2G–H
Échantillon 1
0,286/0,286
3A–B
Échantillon 2
0,562/0,563
3C–D
Échantillon 3
1,070/1,073
*
Résultat multiplié par le facteur de dilution (× 202).
**
Concentration indiquée sur l’etiquette du flacon.
34
Conc. moy. U/l*
62,6
224,2
565,6
1131,2
83,8
215,4
104,5
238,4
525,4
Courbe
Courbe d’étalonnage
d’étalonnage
La
est est
uneune
courbe
d’étalonnage
type. Ne
l’utilisez
pas pour
La courbe
courbeprésentée
présentéeci-dessous
ci-dessous
courbe
d’étalonnage
type.
Ne l’utilisez
pas pour
déterminer
déterminer les
les résultats
résultats des
des dosages
dosages réels.
réels.
2
O.D. 450 nm
1.5
1
Français
Français
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
U/l
LIMITES DE LA PROCÉDURE
LIMITES
Comme
pourDE
tousLA
lesPROCÉDURE
tests de diagnostic, le diagnostic clinique définitif ne doit pas reposer sur
Comme
pour tous
tests
deildiagnostic,
le diagnostic
clinique
définitif
ne doitdepas
reposer
les
conclusions
d’unlesseul
test:
doit être posé
par le médecin
après
évaluation
tous
les sur
les conclusions
d’un seul test: il doit être posé par le médecin après évaluation de tous les
résultats
cliniques.
L’hémolyse,
l’ictére ou la lipémie n’affectent pas le dosage.
résultats
cliniques.
COMPARAISONAVEC
AVECMERCODIA
MERCODIA
APO(a)
COMPARAISON
APO(a)
RIARIA
Des
Des études
études comparatives
comparatives entre
entre Mercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a) ELISA
ELISA et
et Mercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a) RIA
RIA ont
ont été
été réalisées
réalisées
avec
45 échantillons
échantillons dosés
dosés àà 22 occasions
occasions en
en double
double exemplaire.
exemplaire.
avec 45
Lesvaleurs
valeursobtenues
obtenuesmontrent
montrentune
une
bonne
corrélation
entre
les deux
techniques,
r=1.00
Les
bonne
corrélation
entre
les deux
techniques,
r=1.00
(voir
(voir
figure).
figure).
Par conséquent, les valeurs attendues pour Mercodia Apo(a) RIA peuvent également être
Par conséquent, les valeurs attendues pour Mercodia Apo(a) RIA peuvent également être
utilisées pour Mercodia Apo(a) ELISA.
utilisées pour Mercodia Apo(a) ELISA.
1250
1000
750
500
250
0
0
250
500
750
1000
1250
35
35
VALEURS
ATTENDUES
VALEURS ATTENDUES
La déontologie incite chaque laboratoire à établir sa propre gamme de valeurs.
Les résultats
résultats suivants
suivantsobtenus
obtenusavec
avecle le
Mercodia
Apo(a)
peuvent
de guide
testtest
Mercodia
Apo(a)
RIA RIA
peuvent
servirservir
de guide
jusqu’à ce que le laboratoire ait rassemblé suffisamment
suffisamment de
de données
données provenant
provenant de
de ses
ses propres
propres
sources.
Le
ététrois
étudié
sur troisdifférents:
matériaux différents:
Le taux
taux de
de l’apolipoprotéine(a)
l’Apo(a) a été étudiéasur
matériaux
A
Normaux1,n=171,
n=171,Suède
Suède (Caucasiens)
(Caucasiens)
A Normaux1,
BB Normaux1,
Normaux1,n=203,
n=203,Canada
Canada(Caucasiens-Asiatiques,
(Caucasiens-Asiatiques,hétérogènes)
hétérogènes)
C Patients
Patientsavec
avecune
une
hypercholestérolémie
familiale
(FH), n=113,
(Caucasienshypercholestérolémie
familiale
(FH), n=113,
CanadaCanada
(CaucasiensAsiatiques, hétérogènes)
Le groupe “normal” rassemblait des individus choisis parmi la population générale et qui ne
Le groupe “normal” rassemblait des individus choisis parmi la population générale et qui ne
présentait
présentait pas
pas de
de maladies
maladies cardio
cardio et/ou
et/ou cérébrovasculaires.
cérébrovasculaires.
Les trois
trois groupes
groupes étudiés
étudiés n’ont
n’ont pas
pas montré
montré de
de différences
différences dans
dans leur
leur taux
taux d’Apo(a)
d’apolipoprotéine(a)
Les
en fonction
en
fonction
de
l’âge
ou
du
sexe.
de l’âge ou du sexe.
Aucune
entre
Aucune différence
différence significative
significative n’a
n’apu
puêtre
êtreobservée
observéedans
dansleletaux
tauxd’apolipoprotéine(a)
d’Apo(a) entre les sujets
les
sujets de
normaux
Suèdenormaux
et ceux du
normaux
du Canada.
normaux
Suède de
et ceux
Canada.
LeLegroupe
avait
un un
niveau
significativement
plusplus
élevéélevé
en apolipoprotéine(a)
groupedes
despatients
patientsHFHF
avait
niveau
significativement
en Apo(a) que le
groupe
normalnormal
de la même
région région
(p<0.001,
Wilcoxon
rank sum
que
le groupe
de la même
(p<0.001,
Wilcoxon
ranktest).
sum test).
Les
pour la médiane
percentiles
85 et 95 75,
ont 85
pu
Les concentrations
concentrations suivantes
suivantes en
enApo(a)
apolipoprotéine(a)
pouretlales
médiane
et les75,
percentiles
être95obtenus
pourobtenus
les différents
groupes.
et
ont pu être
pour les
différents groupes.
Normaux, Suède
Normaux, Canada
FH, Canada
médiane
U/l
percent. 75
U/l
perc.85
U/l
perc.95
U/l
131
117
294
448
379
660
612
525
863
795
1044
1544
Distribution de l’Apo(a) chez les sujets normaux et les patients HF
(Canada)
36
36
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
0
1800
1900
2000
2100
1900
2000
2100
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
1800
10
1700
20
1700
30
1600
40
1600
Distribution des patients avec HF (Canada)
1500
U/l
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
0
100
U/l
Distribution des sujets normaux (Suède)
Français
Fréquence relative (%)
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Français
Distribution des sujets normaux (Canada)
40
30
20
10
40
30
20
10
U/l
37
37
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES
CARACTÉRISTIQUES
Limites de détectionDE PERFORMANCES
Limites
de détection
La limite de détection est de 0.05 U/l (trois écarts-type au-dessus du Calibrator 0)
La limite de détection est de 0.05 U/l (trois écarts-type au-dessus du Calibrator 0)
Ceci correspond à une concentration de l’échantillon de 10 U/l lorsque la dilution de
Ceci correspond à une concentration de l’échantillon de 10 U/l lorsque la dilution de
l’échantillonest
estde
de1/202.
1/202.
l’échantillon
Récupération
Récupération
Ledosage
dosageen
enretour
retourdonne
donneune
unevaleur
valeurcomprise
compriseentre
entre96–111
96–111%
%(moyenne
(moyenne102
102%).
%).
Le
Effet crochet
Effet crochet
Leséchantillons
échantillonsdont
dontlalaconcentration
concentration
supérieure
à 9600U/l,
peuvent
mesurés
Les
estest
supérieure
à 9600U/l,
peuvent
être être
mesurés
sans sans
donnerde
defaux
fauxrésultats
résultatsbas,
bas,dans
danslalamesure
mesureoù
oùilsilssont
sontprétraités
prétraitésetetdilués
dilués1/202
1/202comme
commedécrit
décrit
donner
ci-dessus.
ci-dessus.
Précision
Précision
Envue
vuede
deréaliser
réaliserdes
desdosages,
dosages,des
deséchantillons
échantillonspréalablement
préalablementtraités,
traités,dilués
dilués1/202
1/202etetstockés
stockésàà
En
–20°Cont
ontété
étéfabriqués.
fabriqués.Chaque
Chaque
échantillon
a été
analysé
4 exemplaires
à 6 occasions
–20°C
échantillon
a été
analysé
en 4enexemplaires
à 9 occasions
différentes.
différentes.
Échantillon
1
2
3
Valeur Moyenne
U/l
83
196
485
% pendant
le dosage
3.3
2.9
2.4
Coefficient de variation
% entre
% total
les dosages
du dosage
4.0
3.6
1.8
5.2
4.7
3.0
Échantillons prétraités et dilués 1/202 à chaque occasion de test. Chaque échantillon a été
analysé en 5 exemplaires à 5 occasions différentes.
Échantillon
4
5
6
Valeur Moyenne
U/l
103
251
744
% pendant
le dosage
3.1
3.6
2.4
Coefficient de variation
% entre
% total
les dosages
du dosage
4.2
3.7
5.2
5.2
5.2
5.7
Spécificité
Une concentration de plasminogène supérieure à 10 g/l donne des réactions croisées non
mesurables lors du dosage. (La concentration clinique de plasminogène est inférieure à 2.1 g/l)
L’apolipoprotéine B n’a pas de réactions croisées mesurables.
38
38
ETALONNAGE
Le kit Mercodia Apo(a) ELISA est étalonné à l’aide d’une préparation commerciale de Lp(a)
hautement purifiée et entièrement validée.
La concentration de l’Apo(a) est exprimée en Unités/l.
Il n’est pas possible d’exprimer la concentration en Apo(a) en unités de masse dans la mesure
où l’on décrit au moins 6 isoformes différentes, avec des poids moléculaires variant
approximativement entre 300 kD et 900 kD (1,2,15,16).
Chaque échantillon patient contiendra donc les différentes isoformes en proportions diverses.
Par conséquent, il n’est pas possible de donner un facteur de conversion exact entre les Unités
d’Apo(a) et les milligrammes d’Apo(a).
1 Unité d’Apo(a) est approximativement égale à 0.7 mg de Lp(a) protéine.
Les données de performances présentées dans ce document ont été obtenues lors de tests
respectant la procédure indiquée. Tout changement ou modification dans la procédure, non
recommandé par Mercodia AB, est susceptible d’affecter les résultats. Si la procédure n’est pas
respectée, Mercodia AB décline toute responsabilité concernant les garanties exprimées, légales
ou implicites, y compris la garantie implicite relative à la qualité marchande et à la conformité
d’usage de ce kit.
Mercodia AB et ses distributeurs agréés ne pourront être tenus pour passibles de dommages
indirects ou immatériels si la procédure décrite n’est pas respectée.
39
Français
GARANTIE
40
USO PREVISTO
Mercodia Apo(a) ELISA es un método para la medición cuantitativa de apolipoproteína(a)
humana en suero o plasma.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL TEST
PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
Mercodia Apo(a) ELISA es un inmunoensayo enzimático de fase sólida en dos emplazamientos.
Se basa en la técnica de sandwich directa en la que se dirigen dos anticuerpos monoclonales
contra determinantes antigénicos separados en la molécula de Apo(a). Durante la
incubación, la Apo(a) de la muestra reacciona con anticuerpos anti-Apo(a) conjugados en
peroxidasa y anticuerpos anti-Apo(a) ligados con pocillo de microtitración. Un paso de limpieza
simple elimina el anticuerpo etiquetado de enzima sin ligar. El conjugado ligado se detecta por
reacción con tetrametilbencidina 3,3’,5,5’. La reacción se detiene añadiendo ácido para dar un
punto final colorimétrico que se alcanza
espectrofotométricamente.
41
Español
La apolipoproteína(a), Apo(a), es una glucoproteína ligada por puentes de disulfido con
apolipoproteína B en la partícula de lipoproteína(a) (Lp(a)). Apo(a) está formada por tres
dominios estructurales diferentes. Uno de los dominios, denominado kringle 4, está presente
en copias múltiples de número variable y determinado genéticamente, dando lugar a diferentes
tamaños de Apo(a) y, en consecuencia, Lp(a) . Dependiendo del método que utilizado, han sido
identificados entre 6 y 23 isoformas de Apo(a) que varían aproximadamente entre 300 y 900 kD
(1,2,15,16). La mayoría de individuos tienen una o dos isoformas Apo(a), aunque en algunos
casos no es posible detectar ninguna frecuencia de Apo(a) cuando se analiza con electroforesis
en gel SDS seguida de inmuno-blot (3).
Últimamente se ha dedicado un gran interés a la Lp(a) debido a la existencia de numerosas
evidencias de que su nivel de circulación constituye un factor de riesgo independiente para
enfermedad coronaria vascular. Se ha comprobado que el nivel de Lp(a) constituye un factor de
riesgo heredado para cardiopatía isquémica (4–8). Se han demostrado niveles altos de Lp(a) en
hipercolesterolemia familiar, y su medición puede ser clínicamente útil para la predicción de
riesgos en estos pacientes (9,10).
También se han publicado resultados de Lp(a) como un fuerte indicador de enfermedad
cerebrovascular (11,12).
Apo(a) es un homólogo de plasminógeno zymógeno proteasa (13,14).
Lp(a) inhibe la activación de plasminógeno, y estudios recientes han demostrado que Apo(a)
y Lp(a) compiten con el plasminógeno en el ligado de receptor del plasminógeno. Estas
propiedades de Apo(a) pueden explicar la asociación de concentraciones altas de Lp(a) con
infarto de miocardio.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
• Para emplear en diagnóstico in vitro. No para uso interno o externo en humanos o animales.
• No se debe permitir que el contenido de este kit y sus residuos entre en contacto con
animales rumiantes o porcinos.
• La Stop Solution de este kit contiene 0,5 M H2SO4. Emplear las precauciones comunes para
la manipulación de sustancias químicas peligrosas.
• Todos los especímenes de pacientes deben ser tratados como capaces de transmitir
infecciones.
Advertencia! Este kit contiene reactivos que pueden ser infecciosos!
Este kit contiene reactivos fabricados con componentes de sangre humana. Las fuentes de
material han sido probadas con inmunoensayo para antígeno de superficie de hepatitis B y
para anticuerpos de la hepatitis C y para anticuerpos del virus VIH con resultado negativo.
Sin embargo, se deben usar todas las precauciones recomendadas para la manipulación
de derivados de sangre. Véase la publicación HHS número (CDC) 88-8395 o la normativa local
/ nacional correspondiente en materia de procedimientos de seguridad en laboratorios.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO INCLUIDOS
• Micropipetas de 25 µl, 50 µl, 200 µl, 500 µl y 5.0 ml (para la adición disolución de
conjugado enzimático, Substrate TMB y Stop Solution se prefieren las pipetas de repetición)
• Cubetas y probetas para preparar los reactivos
• Agua redestilada
• Probetas de 5 ml
• Lector de microplacas con filtro de 450 nm
• Agitador de placas (La velocidad recomendable es de 700-900 vueltas por minuto,
movimiento orbital)
• Aparato para lavar microplacas
• Agitador magnético
42
REACTIVOS
Cada kit Mercodia Apo(a) ELISA contiene reactivos para 96 pocillos, suficientes para 41
muestras, 2 Controls y una curva de Calibración en duplicado. Para series de ensayos grandes,
usar reactivos colectivos de envases con números de lote idénticos. La fecha de caducidad del
kit completo está indicada en la etiqueta exterior. La temperatura de almacenaje recomendada
es de 2–8°C.
Wash Buffer 21X
1 botella
50 ml
Diluir 1+20 con 1000 ml aqua bidest. para hacer solución de lavado
Almacenaje después de diluir: 2-8°C durante 4 semanas
Substrate TMB
1 frasco
Solución incolora. Atención! Fotosensible!
Stop solution
0.5 M H2SO4
1 frasco
22 ml
Preparada para usar
7 ml
Preparada para usar
43
Español
Coated Plate
1 placa
96 pocillos
Preparada para usar
(anti-Apo(a) monoclonal de ratón) cintas de 8 pocillos
Para cintas de microtitración sin utilizar, cerrar la bolsa con cinta adhesiva y conservar a 2–8°C
durante dos meses.
4 frascos
500 µl
Liofilizada
(Apo(a) humana) Código de color amarillo
Añadir 500 µl de agua
Concentración indicada en la etiqueta del frasco.
redest. por frasco
Para el almacenaje de Calibrators reconstituidos durante más de una semana, conservar a
–20°C.
Calibrator 0
1 frasco
500 µl
Preparada para usar
Código de color amarillo
1 frasco
700 µl
Preparación, ver abajo
(Anti-Apo(a) monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa)
1 frasco
7 ml
Preparada para usar
Código de color azul
Controls (H), (L)
2 frascos
500 µl
Liofilizada
Concentración de Apo(a) indicada en
Añadir 500 µl de agua
bidest. por frasco
la etiqueta del frasco
(Media ± 3 S.D.)
Para el almacenaje de Controls reconstituidos durante más de una semana, conservar a –20°C.
1 frasco
5 ml
Preparada para usar
Sample Buffer 5X
2 botellas
50 ml
Codificado en rojo. Diluir cada botella con 200 ml de aqua bidestil. para preparar el tampon
de muestra. Atención! Puede producirse un precipitado cuando se conserva a 2-8°C. Dejar que
el Sample Buffer 5X alcance la temperatura ambiente. Agitar o pasar por vórtex hasta que se
disuelva el precipitado.
Preparación de la disolución conjugado enzimático
Preparar el volumen necessario de la disolutión conjugado enzimático por dilución del Enzyme
Conjugate 11X en Enzyme Conjugate Buffer (1+10) según la siguiente tabla. Si se usa toda la
placa , verter completamente el tampon Enzyme Conjugate Buffer al vial Enzyme Conjugate 11X.
Mezclar suavemente.
Almacenaje después de diluir: 2-8°C , 2 semanas.
Numéro de cintas
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme Conjugate
Buffer
12 cintas
6 cintas
4 cinas
1 frasco
300 µl
200 µl
1 frasco
3.0 ml
2.0 ml
TOMA Y MANIPULACIÓN DE ESPECÍMENES
Suero
Recoger la sangre por venipunción, dejar coagular y separar el suero por centrifugación. Los especímenes se pueden conservar durante 1 semana a 2-8°C. Para periodos mas largos conservar
las muestras a -20°C. Evitar la congelación y descongelación repetidas.
Plasma
Recoger la sangre por venipunción en tubos que contienen EDTA o heparina como anticoagulente y separar la fracción de plasma. Los especímenes se pueden conservar durante 1 semana
a 2-8°C. Para periodos mas largos conservar las muestras a -20°C. Evitar la congelación y
descongelación repetidas.
Preparación de muestras
Todas las muestras y Controls se deben tratar previamente, como se indica a continuación:
1
2
3
4
Muestra/Control
Mezclar e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente
Añadir tampón de muestra y mezclar
25 µl
25 µl
5.0 ml
Como resultado de este procedimiento las muestras se diluirán a 1/202. Esta dilución es estable
durante 1 semana a 2–8°C.
Si la concentración de Apo(a) en la muestra es >1000 U/l, diluir la muestra pretratada y diluida
(1/202) con tampón de muestra; por ejemplo 1/4 para una dilución final de1/808.
44
PROCEDIMIENTO DE TEST
Preparar disolución de conjugado enzimático, solución de lavado y tampon de muestras.
Realizar cada determinación en duplicado para Calibrators, Controls y muestras. Preparar una
curva de Calibración para cada ensayo. Evitar el pipetado de soluciones en las paredes de
tubo.
Aviso! Usar pipetas distintas para prevenir contaminación entre conjugado y substrato.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Los pools de plasma internos con concentración de Apo(a) baja, media y alta se deben ensayar
rutinariamente como muestras, anotando los resultados día a día. Es un buen procedimiento de
laboratorio registrar los datos siguientes para cada ensayo: número de lote del kit; fechas de
reconstitución de los componentes del kit: Valores OD para teórico, Calibrators y Controls.
45
Español
Añadir en pocillos anti-Apo(a)
Calibrators
Muestras
Controls
1 Calibrators
25 µl
–
–
–
25 µl
–
2 Muestras pretratadas
3 Controls pretratados
–
–
25 µl
4 Disolución de conjugado enzimático 50 µl
50 µl
50 µl
5 Incubar en un agitador (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura ambiente (18–25°C).
6 Lavar 6 veces con 700 µl/pocillo mediante Lavador de placas automático con función de
sobre-flujo de lavado. No usar el paso de remojo durante el proceso.
O manualmente:
Verter el líquido invirtiendo la microplaca en una pila. Añadir 350 µl de solución de lavado,
golpeando firmemente la placa contra papel absorbente para eliminar todo el líquido en
exceso. Repetir 5 veces. Evitar remojo prolongado durante el proceso.
7 Añadir 200 µl de Substrate TMB
8 Incubar durante 15 minutos
9 Añadir 50 µl de Stop Solution.
Colocar la placa en el agitador durante 5 segundos para asegurar la mezcla de substrate y
Stop Solution.
10 Medir la absorbancia a 450 nm y evaluar.
Leer en un lapso de 30 minutos.
CÁLCULO DE RESULTADOS
Cálculo computarizado
Para obtener la concentración de Apo(a) se debe hacer una reducción de datos computarizada
de la absorbancia para los Calibrators, excepto el Calibrator 0, contra la concentración usando
regresión cúbica. Multiplicar la concentración de las muestras por el factor de dilución
(p. ej., × 202).
Cálculo manual
1. Trazar los valores de absorbancia obtenidos para los Calibrators, excepto el Calibrator
0, como función de la concentración de Apo(a), en un papel lin-lin y construir la curva de
Calibración.
2. Leer la concentración de los Controls y muestras de la curva de Calibración.
3. Multiplicar la concentración de los Controls y las muestras con el factor de dilución (p. ej.,
× 202).
Ejemplo de hoja de trabajo
Valores obtenidos con un kit de 8 semanas.
Pocillos
Identidad
A450
Promedio Conc.U/l*
1A–B
Calibrator 0
0,061/0,064
1C–D
Calibrator 1**
0,194/0,197
62,6
1E–F
Calibrator 2**
0,535/0,537
224,2
1G–H
Calibrator 3**
1,129/1,131
565,6
2A–B
Calibrator 4**
1,835/1,837
1131,2
2C–D
Control L
0,239/0,242
83,8
2E–F
Control H
0,515/0,515
215,4
2G–H
Muestra 1
0,286/0,286
104,5
3A–B
Muestra 2
0,562/0,563
238,4
3C–D
Muestra 3
1,070/1,073
525,4
*
Resultado multiplicado por el factor de dilución (× 202).
**
Concentración indicada en la etiqueta del frasco.
46
2G–H
3A–B
3C–D
Desconocido 1
Desconocido 2
Desconocido 3
0,286/0,286
0,562/0,563
1,070/1,073
104,5
238,4
525,4
* Resultado multiplicado por el factor de dilución (× 202).
Curvade
deCalibración
Calibración
Curva
Abajosesemuestra
muestrauna
unacurva
curvade
deCalibración
Calibración típica.
típica.No
No usar
usar esta
esta curva
curva para
para determinar
Abajo
determinar resultados
reales de los
ensayos.
resultados
reales
de los ensayos.
2
O.D. 450 nm
1.5
1
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
U/l
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Tal
como ocurre con todas
pruebas de diagnóstico, un diagnóstico clínico definitivo no se
LIMITACIONES
DELlas
PROCEDIMIENTO
COMPARACIÓNCON
CON
MERCODIA
APO(a)
COMPARACIÓN
MERCODIA
APO(a)
RIARIA
Español
debe
hacer ocurre
sobre lacon
base
de los
de diagnóstico,
una prueba única,
sino que debe
hacerlo
el médico
Tal como
todas
lasresultados
pruebas de
un diagnóstico
clínico
definitivo
no se
después de evaluarse todos los hallazgos clínicos.
debe hacer sobre la base de los resultados de una prueba única, sino que debe hacerlo el médico
Las muestra lipémicas., ictérias o hemolizados no interfieren en el ensayo.
después de evaluarse todos los hallazgos clínicos.
Losestudios
estudioscomparativos
comparativosentre
entreMercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a)ELISA
ELISAy yMercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a)RIA
RIAseserealizaron
realizaroncon
con
Los
46
45muestras
muestrasensayadas
ensayadasenen22réplicas
réplicasenen22ocasiones.
ocasiones.Los
Losvalores
valoreshallados
halladosmuestran
muestranuna
unabuena
buena
45
correlación
correlaciónentre
entrelas
lasdos
dostécnicas,
técnicas,r=1,00
r=1,00(ver
(verlalafigura).
figura).
Por
loslos
valores
previstos
parapara
Mercodia
Apo(a)
RIA también
se pueden
usar para
Portanto,
tanto,
valores
previstos
Mercodia
Apo(a)
RIA también
se pueden
usar para
Mercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a)ELISA.
ELISA.
1250
1000
750
500
250
0
0
250
500
750
1000
1250
47
La buena práctica dicta que cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores
previstos. Los resultados siguientes obtenidos con Mercodia Apo(a) RIA pueden servir como guía
hasta que el laboratorio haya recopilado suficientes datos propios.
Espanol
˜
VALORES PREVISTOS
VALORES PREVISTOS
La buena práctica dicta que cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores
previstos. Los resultados siguientes obtenidos con Mercodia Apo(a) RIA pueden servir como
guía hasta que el laboratorio haya recopilado suficientes datos propios.
Se ha estudiado el nivel de apolipoproteína(a) en tres materiales diferentes:
A Normales1, n=171, Suecia (caucásico)
B Normales1, n=203, Canadá (caucásico-asiático, heterogéneo)
C Pacientes con hipercolesterolemia familiar (FH), n=113, Canadá (caucásico-asiático,
heterogéneo)
El grupo de normales estaba constituido por individuos elegidos entre la población general y
sin presentar enfermedad cardiovascular y/o cerebrovascular aparente.
La distribución se muestra en las figuras siguientes.
Los tres grupos investigados no presentaron ninguna diferencia por edad o sexo en sus
niveles de Apo(a).
No se encontró ninguna diferencia significativa en los niveles de Apo(a) entre el
grupo de normales de Suecia y el grupo de normales de Canadá.
El grupo de pacientes FH tenía niveles de Apo(a) significativamente más altos que el grupo
de normales de la misma región (p<0,001, Wilcoxon rank sum test).
Para los diferentes grupos se obtuvieron las siguientes concentraciones de Apo(a)
para los percentiles promedio, 75, 85 y 95.
Normales, Suecia
Normales, Canadá
FH, Canadá
Promedio
U/l
75 perc.
U/l
85 perc.
U/l
95 perc.
U/l
131
117
294
448
379
660
612
525
863
795
1044
1544
Distribución de Apo(a) en normales y pacientes FH (Canadá)
48
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
0
1600
1700
1800
1900
2000
2100
1700
1800
1900
2000
2100
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
1600
10
1500
20
1500
30
1400
40
1400
Distribución de pacientes FH (Canadá)
1300
U/l
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
0
100
Frecuencia relativa (%)
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
30
20
Espanol
˜
Español
Distribución de normales (Canadá)
40
30
20
10
U/l
Distribución de normales (Suecia)
40
10
U/l
4949
CARACTERÍSTICAS DE
CARACTERÍSTICAS
DERENDIMIENTO
RENDIMIENTO
Límite de
de detección
detección
Límite
El límite de detección es de 0,05 U/l, calculado como tres desviaciones estándar sobre el
El límite de detección es de 0,05 U/l, calculado como tres desviaciones estándar sobre el
Calibrator 0.
Calibrator 0.
Esto corresponde a una concentración de muestra de 10 U/l cuando la muestra se diluye a
Esto corresponde a una concentración de muestra de 10 U/l cuando la muestra se diluye a
1/202.
1/202.
Recuperación
Recuperación
La recuperación en adición es de 96–111 % (media 102 %).
La recuperación en adición es de 96–111 % (media 102 %).
Efecto Hook
Hook
Efecto
Las muestras con una concentración hasta 9.600 U/l se pueden medir sin dar resultados
Las muestras con una concentración hasta 9.600 U/l se pueden medir sin dar resultados
falsamente bajos si se pretratan y diluyen a 1/202 tal como se describe arriba.
falsamente bajos si se pretratan y diluyen a 1/202 tal como se describe arriba.
Precisión
Precisión
Muestras pretratadas y diluidas a 1/202 en una ocasión, y guardadas a –20°C hasta la
Muestras
y diluidas
a 1/202
una ocasión,
y guardadas
a –20°C
hasta la
realizaciónpretratadas
de los ensayos.
Cada muestra
fueenanalizada
en 4 réplicas
en nueve
ocasiones
realización
diferentes. de los ensayos. Cada muestra fue analizada en 4 réplicas en nueve ocasiones
diferentes.
Muestra
Valor promedio
U/l
1
2
3
83
196
485
Coeficiente de variación
dentro de
entre
total
ensayo %
ensayo %
ensayo %
3,3
2,9
2,4
4,0
3,6
1,8
5,2
4,7
3,0
Muestras pretratadas y diluidas a 1/202 en cada ocasión de prueba. Cada muestra fue analizada
en 5 réplicas en cinco ocasiones diferentes.
Muestra
Valor promedio
U/l
4
5
6
Especifidad
Especifidad
103
251
744
Coeficiente de variación
dentro de
entre
total
ensayo %
ensayo %
ensayo %
3.1
3.6
2.4
4.2
3.7
5.2
5.2
5.2
5.7
Una concentración de hasta 10 g/l de plasminógeno no da reacción cruzada mensurable en el
Una concentración de hasta 10 g/l de plasminógeno no da reacción cruzada mensurable en el
ensayo. (Concentración clínica del plasminógeno inferior a 2,1 g/l.)
ensayo.
La apolipoproteína B no tiene reacción cruzada mensurable,
(Concentración clínica del plasminógeno inferior a 2,1 g/l.)
La apolipoproteína B no tiene reacción cruzada mensurable.
50
CALIBRACIÓN
El kit Mercodia Apo(a) ELISA se calibra con preparación Lp(a) comercial altamente purificada y
totalmente validada.
La concentración de Apo(a) se expresa en unidades/l.
No es posible expresar la concentración de Apo(a) en unidades de masa debido a que hay
por lo menos seis isoformas diferentes descritas con pesos moleculares entre aproximadamente
300 kD y 900 kD (1, 2, 15, 16). Así, cada muestra de paciente contendrá diferentes proporciones
de las distintas isoformas.
Por consiguiente, no se puede dar un factor de conversión exacto entre unidades de Apo(a)
y miligramos de Apo(a).
1 La unidad de Apo(a) es aproximadamente igual a 0,7 mg Lp(a) de proteína.
GARANTÍA
51
Español
Los datos de funcionamiento presentados aquí se obtuvieron utilizando el procedimiento
indicado. Cualquier cambio o modificación en el procedimiento recomendado por Mercodia AB
puede afectar a los resultados, en cuyo caso Mercodia AB rechaza todas las garantías
expresadas, implícitas o reglamentarias, incluso la garantía de comercialización implícita y la
aptitud de empleo.
En tal caso, Mercodia AB y sus distribuidores autorizados no serán responsables por daños
indirectos o consecuenciales.
52
USO PROPOSTO
Mercodia Apo(a) ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa della
apolipoproteina(a) umana nel siero o nel plasma.
SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST
La apolipoprotein(a), Apo(a), è una glicoproteina legata da ponti sulfidici alla apolipoproteina B
nella lipoprotein(a) (particella Lp(a)). La Apo(a) è formata da tre diversi domini strutturali. Uno
dei domini, chiamato kringle 4, è presente in copie multiple, di numero variabile e determinate
su base genetica, questo porta a dimensioni diverse di Apo(a) e di conseguenza di Lp(a). In
relazione al metodo utilizzato, sono state identificate da 6 a 23 isoforme di Apo(a) che variano
da 300 a 900 kD (1,2,15,16). La maggior parte degli individui ha una o due isoforme di Apo(a),
anche se in alcuni soggetti non è possibile rilevare alcuna banda di Apo(a) quando si eseguono
le analisi mediante SDS-gel elettroforesi seguita da immunoblotting (3).
Recentemente è stato dedicato molto interesse alla Lp(a) sulla base di un gran numero di dati
che indicano che il loro livello in circolo rappresenta un fattore di rischio indipendente per le
malattie vascolari coronariche. E’ stato scoperto che il livello di Lp(a) rappresenta un fattore di
rischio ereditario per le malattie cardiache di natura ischemica (4–8). E’ stata dimostrata la
presenza di livelli elevati di Lp(a) nella ipercolesterolemia familiare e la sua misurazione può
essere utile dal punto di vista clinico per la previsione dei rischi in questi pazienti (9,10).
Sono stati inoltre pubblicati i risultati di studi eseguiti sulla Lp(a) che indicano questa sostanza
come un forte indicatore di malattie cerebrovascolari (11,12).
Apo(a) è omologa alla proteasi di zimogeno plasminogeno (13,14).
Lp(a) inibisce l’attivazione del plasminogeno e studi recenti hanno dimostrato che Apo(a) e
Lp(a) competono con il plasminogeno per il legame al recettore plasminogeno. Queste
propertà di Apo(a) possono spiegare l’associazione tra concentrazioni elevate di Lp(a) e infarto
miocardico.
Mercodia Apo(a) ELISA è un metodo di immunoanalisi enzimatica a due siti a fase solida.
E’basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali vengono diretti
contro determinanti antigenici separati sulla molecola Apo(a). Durante l’incubazione la Apo(a)
presente nel campione reagisce con gli anticorpi anti-Apo(a) coniugati a perossidasi e gli
anticorpi anti-Apo(a) legati al pozzetto per microtitolazione. Un semplice passaggio di lavaggio
rimuove gli enzimi non legati gli anticorpi etichettati dall’enzima non legati. Il coniugato
legato viene rilevato mediante reazione con 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina. La reazione viene
interrotta mediante l’aggiunta di acido per fornire un endpoint colorimetrico che viene letto
spettrofotometricamente.
53
Italiano
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
PRECAUZIONI E AVVISI
• Per uso diagnostico in vitro. Non per uso interno o esterno nell’uomo o negli animali.
• Il contenuto di questo kit e i suoi residui non devono venire a contatto con animali
ruminanti o suini.
• La Stop Solution contenuta in questo kit contiene 0.5 M H2SO4. Seguire le precauzioni di
routine per la manipolazione delle sostanze chimiche pericolose.
• Tutti i campioni prelevati dai pazienti devono essere manipolati come materiale infettivo.
Avvertenza! Questo kit contiene reagenti che possono essere infettivi!
Questo kit contiene reagenti derivati da componenti ematici di origine umana. La fonte del
materiale è stato testato mediante immunodosaggio per la presenza di antigene di superficie
dell’epatite B e per anticorpi per il virus dellépatite C e per anticorpi per il virus dell´HIV e sono
risultati negativi. Tuttavia, osservare tutte le precauzioni consigliate per la manipolazione dei
derivati ematici. Consultare la pubblicazione HHS n.(CDC) 88-8395 o le linee guida locali /
nazionali corrispondenti relative alle procedure di sicurezza per gli esami di laboratorio.
MATERIALE RICHIESTO MA NON INCLUSO
• Pipette da 25 µl, 50 µl,200 µl, 500 µl e 5.0 ml (riutilizza le pipette in dotazione per
l’aggiunta il tampone per l’enzima coniugato, Substrate TMB e Stop Solution)
• Beakers e cilindri per la preparazione di reagenti
• Acqua ridistillata
• Provette per il test da 5 ml
• Lettore micropiastra con filtro da 450 nm
• Shaker della piastra (La velocità raccomandata è di 700-900 giri/minuto, movimento
orbitale)
• Dispositivo per il lavaggio delle micropiastre
• Miscelatore magnetico
54
REAGENTI
Ciascun kit Mercodia Apo(a) ELISA contiene reagenti per 96 prove, sufficienti per 41 campioni,
2 Controls ed una curva di calibratura in duplicato. Per serie più ampie di esami, usare gruppi
di reagenti provenienti da confezioni che riportano identici numeri di lotto. La data di scadenza
del kit viene indicata sull’etichetta esterna. La temperatura di conservazione consigliata è
2–8°C.
55
Italiano
Coated Plate
1 piastra
96 pozzetti
Pronti per l’uso
(anti-Apo(a) monoclonale di topo)
8-strisce per pozzetti
Per le strisce di microtitolazione non utilizzati, sigillare nuovamente la confezione con nastro
adesivo e conservare a 2–8°C per due mesi.
4 fiale
500 µl
Liofilizzato
(Apo(a) di origine umana) Codice colore giallo
Aggiungere 500 µl di acqua
di ridist. per fiala
Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala
Per la conservazione del Calibrator ricostituito per periodi superiori ad una settimana,
conservare a –20°C.
Calibrator 0
1 fiala
500 µl
Pronto per l’uso
Codice colore giallo
Enzyme Coniugate 11X
1 fiala
700 µl
Preparato, vedi di seguito
(Anti-apo(a) monoclonale coniugata a perossidasi di topo)
Enzyme Coniugate Buffer
1 fiala
7 ml
Pronto per l’uso
Codice colore azzurro
Controls (H), (L)
2 fiale
500 µl
Liofilizzato
Concentrazione Apo(a) indicata
Aggiungere 500 µl di acqua
sull’etichetta della fiala
di ridist.per fiala
(Media ± 3 DS)
Per la conservazione del Controls ricostituito per periodi superiori ad una settimana, conservare
a –20°C.
1 fiala
5 ml
Pronto per l’uso
Sample Buffer 5X
2 bottiglia
50 ml
Rosso colore codificato
Diluire ciascuno bottiglia con 200 ml d’aqua ridist. per fare diluenti peri campioni. Nota!
Precipitato può servire quando conservato a 2-8 °C. Lasciare che Sample Buffer 5X raggiunga
la temperatura ambiente. Agitare o mescolare forte fino a che il precipitato venga dissolto.
Wash Buffer 21X
1 flacone
50 ml
Diluire 1+20 con 1000 ml di acqua di ridist. per fare la soluzione de lavaggio
Conservazione dopo la diluizione: 2-8 °C per 4 settimane
Substrate TMB
1 fiala
22 ml
Pronto per l’uso
Soluzione incolore. Nota! Prodotto fotosensibile!
Stop Solution
1 fiala
7 ml
Pronto per l’uso
0.5 M H2SO4
Preparazione della soluzione enzima coniugato
Preparare il volume necessario della soluzione enzima coniugato mescolando di Enzyme
Conjugate 11X con di Enzyme Conjugate Buffer (1+10). in base alla tabella sottostante. Quando
si prepara la soluzione enzima coniugato per tutta la piastra, versare tutto il tampone Enzyme
Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 11X. Mescolare lievemente.
Conservazione dopo la diluzione: 2-8°C per 2 settimane.
Numero di strice
Enzyme Conjugate
11X
Enzyme Conjugate
Buffer
12 strice
6 strice
4 strice
1 fiala
300 µl
200 µl
1 fiala
3.0 ml
2.0 ml
PRELIEVO E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI
Siero
Prelevare il sangue mediante venopuntura, lasciare che coaguli e quindi separare il siero mediante centrifugazione. I campioni possono essere conservati per 1 settimana a 2-8°C. Per periodi
più lunghi conservare i campioni a -20°C. Non ricongelare e scongelare i campioni.
Plasma
Prelevare il sangue direttamente in vena con provette contenenti EDTA o eparina come anticoagulante, e separare la frazione del plasma. I campioni possono essere conservati per 1 settimana
a 2-8°C. Per periodi più lunghi conservare i campioni a -20°C. Non ricongelare e scongelare i
campioni.
Preparazione dei campioni
Tutti i campioni e i Controls devono essere pre-trattati nel modo indicato di seguito:
1
2
3
4
Campione/Control
Mescolare e incubare per 1 ora a temperatura ambiente
Aggiungere il Sample Buffer e mescolare
25 µl
25 µl
5.0 ml
Mediante questa procedura I campioni vengono diluiti 1/202. Questa diluizione è stabile per 1
settimana a 2–8°C.
Se la concentrazione di Apo(a) presente nel campione è >1000 U/l, diluire
ulteriormente il campione pre-riscaldato e diluito (1/202) nel Sample Buffer, ad es. 1/4 deve dare
una diluizione finale pari a 1/808.
56
PROCEDURA DEL TEST
Preparare il tampone per l’enzima coniugato, la soluzione di lavaggio e il diluente peri campioni.
Eseguire ciascuna misurazione in duplicato per i Calibrators, i Controls e le incognite. Preparare
una curva di calibratura per ciascun esame. Evitare di pipettare le soluzioni sulle pareti della
provetta.
Aggiungere ai pozzetti per anti-Apo (a) Calibrators
Campione
Controls
–
–
1 Calibrators
25 µl
2 Campioni pre-trattati
–
25 µl
–
3 Controls pre-trattati
–
–
25 µl
4 Soluzione enzima coniugato
50 µl
50 µl
50 µl
5 Incubare su uno shaker (700-900 rpm) per 1 ore a temperatura ambiente (18–25°C).
6 Lavare 6 volte con 700 µl per pozzetto usando un lavatore automatico per piastre con la
funzione traboccare-lavare. Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione
immersione.
O manualmente,
Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo. Aggiungere
350 µl di soluzione di lavaggio ad ogni pozzetto. Eliminare la soluzione di lavaggio,
sbattere con forza diverse volte contro carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
Ripetere 5 volte. Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura di lavaggio.
7 Aggiungere 200 µl di Substrate TMB
8 Incubare per 15 minuti
9 Aggiungere 50 µl di Stop Solution.
Mettere la piastra sullo shaker per 5 secondi per assicurarsi di miscelare il Substrate TMB
con la Stop Solution.
10 Misurare l’assorbanza 450 nm e valutare.
Leggere entro 30 minuti.
CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO
I pool plasmatici interni con concentrazioni Apo(a) basse, intermedie e elevate devono essere
esaminati di routine come campione e i risultati devono essere indicati nei tracciati ogni giorno.
E’ buona pratica di laboratorio registrare i dati elencati di seguito per ciascun esame: numero
di lotto del kit; data della riconstituzione dei componenti del kit: valori OD per il modulo,
Calibrators e Controlli.
57
Italiano
Nota! Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate
pipette distinte.
CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolo computerizzato
Al fine di ottenere la concentrazione della Apo(a), usando una regressione cubica eseguire il
calcolo computerizzato dei dati sull’assorbanza relativi ai Calibrators, eccetto il Calibrator 0, in
confronto alla concentrazione. Moltiplicare la concentrazione dei campioni con il fattore di
diluizione (es. × 202).
Calcolo manuale
1. Tracciare i valori relativi all’assorbanza ottenuti per i Calibrators, eccetto il Calibrator 0, in
confronto alla concentrazione di Apo(a) su un foglio quadrettato e costruire una curva di
calibratura .
2. Leggere la concentrazione dei Controls e dei campioni dalla curva di calibratura .
3. Moltiplicare la concentrazione dei Controls e dei campioni con il fattore di
diluizione (es. × 202).
Esempio di tabulato
Valori ottenuti con un kit di 8 settimane.
Pozzetti
Identità
A450
Conc. media U/l*
1A–B
Calibrator 0
0,061/0,064
1C–D
Calibrator 1**
0,194/0,197
62,6
1E–F
Calibrator 2**
0,535/0,537
224,2
1G–H
Calibrator 3**
1,129/1,131
565,6
2A–B
Calibrator 4**
1,835/1,837
1131,2
2C–D
Control L
0,239/0,242
83,8
2E–F
Control H
0,515/0,515
215,4
2G–H
Campione 1
0,286/0,286
104,5
3A–B
Campione 2
0,562/0,563
238,4
3C–D
Campione 3
1,070/1,073
525,4
*
Il risultato viene moltiplicato per il fattore di diluizione (× 202).
**
Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala.
58
Curva
Curva di
di calibratura
calibratura
Curva
diviene
calibratura
Di
illustrate
Di seguito
seguito
viene
illustrateuna
unacurva
curvadidicalibratura
calibraturarappresentativa.
rappresentativa.Non
Nonusare
usarequesta
questacurva
curvaper
per
stabilire
ii risultati
reali
Di
seguito
viene illustrate
una curva di calibratura rappresentativa. Non usare questa curva per
stabilire
risultati
reali dell’esame.
dell’esame.
stabilire
i risultati reali dell’esame.
2
2
1.5
O.D. O.D.
450 nm
450 nm
1.5
1
1
0.5
0.5
0
0
0
1
2
0
1
2
3
4
5
6
U/l
3
4
5
6
U/l
LIMIITIDELLA
DELLAPROCEDURA
PROCEDURA
LIMIITI
LIMIITI
DELLAesame
PROCEDURA
Come
diagnostico,
Comeper
perqualsiasi
qualsiasi
esame
diagnostico,una
unadiagnosi
diagnosiclinica
clinicadefinitiva
definitivanon
nondeve
deveessere
esserebasata
basatasui
sui
Come
esame
diagnostico,
unafatta
diagnosi
clinica
definitiva
non
deve
essere
basata
sui
risultati
didiqualsiasi
un
test,
daldal
medico
dopo
averaver
valutato
tuttitutti
i referti
risultatiper
unsingolo
singolo
test,ma
madeve
deveessere
essere
fatta
medico
dopo
valutato
i referti
risultati
clinici.
clinici. di un singolo test, ma deve essere fatta dal medico dopo aver valutato tutti i referti
Grossolanamente campioni lipemic, itterico o hemolysed non interferiscono nell’analasi.
clinici.
CONFRONTO CON MERCODIA APO(a) RIA
CONFRONTO
CON
MERCODIA
APO(a)
RIA ELISA e Mercodia Apo(a) RIA con 45
CONFRONTO
CON
RIA
Sono stati eseguiti
studiMERCODIA
comparativi
traAPO(a)
Mercodia
Apo(a)
1250
Mercodia
Apo(a)
ELISA
( U/l)( U/l)
Mercodia
Apo(a)
ELISA
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
250
0
0
0
250
0
250 Mercodia
500 Apo(a) RIA
750 (U/l)
500
750
1000
1250
1000
1250
59
59 59
Italiano
Italiano
Italiano
Sono
stati
comparativi tra
Mercodia
ELISA eeMercodia
Apo(a)
4545
Sono
stati eseguiti
eseguiti studi
studi
MercodiaApo(a)
Apo(a)
Mercodia
Apo(a)RIA
RIAcon
con
campioni
esaminati
in comparativi
2-copie in 2traoccasioni.
I valoriELISA
osservati
dimostrano
una
buona
campioni
esaminati
in 2-copie
in 2inoccasioni.
I valoriI valori
osservati
dimostrano
una buonauna buona
campioni
esaminati
2-copie
2 occasioni.
osservati
dimostrano
correlazione
tra le dueintecniche,
r=1.00
(vedi figura).
correlazione
tra
tecniche,
r=1.00
figura).
correlazione
tra lele due
due
tecniche,
r=1.00 (vedi
(vedi
figura).
Quindi,i ivalori
valori
previsti
per Mercodia
Apo(a)
RIA possono
essere
usati
anche
per
Mercodia
Mercodia
Quindi,
essere
usati
anche
perper
Quindi,
i valoriprevisti
previstiper
perMercodia
MercodiaApo(a)
Apo(a)RIA
RIApossono
possono
essere
usati
anche
Mercodia
Apo(a)
ELISA.
Apo(a) ELISA.
Apo(a) ELISA.
VALORI PREVISTI
VALORI
La buonaPREVISTI
pratica di laboratorio prevede che ciascun laboratorio stabilisca il proprio range di
Lavalori
buona
praticaI dirisultati
laboratorio
prevede
che ciascun
stabilisca
il proprio
di e
previsti.
illustrati
di seguito
sono laboratorio
stati ottenuti
con Apo(a)
RIArange
Mercodia
valori
previsti.
I risultati
illustrati
seguitoilsono
stati ottenuti
con Apo(a)
RIA Mercodia
possono
servire
da guida
fino adiquando
laboratorio
ha raccolto
un numero
sufficientee di dati
possono
servire
da guida fino a quando il laboratorio ha raccolto un numero sufficiente di dati
per proprio
conto.
per proprio conto.
Il li vello di apolipoproteina è stato studiato in tre gruppi diversi:
IlAli vello
di Apo(a)
è stato
studiato
in tre gruppi diversi:
Normali
1, n=171,
Svezia
(Caucasico)
AB Normali
(Caucasico)
Normali1,1,n=171,
n=203,Svezia
Canada
(Caucasico-Asiatico, eterogeneo)
BC Normali
n=203,daCanada
(Caucasico-Asiatico,
eterogeneo)
Pazienti1,affetti
ipercolesterolemia
(FH) familiare,
n=113, Canada (Caucasico-Asiatico,
C Pazienti
affetti da ipercolesterolemia (FH) familiare, n=113, Canada (Caucasico-Asiatico,
eterogeneo)
eterogeneo)
Il gruppo di normali erano individui scelti tra la popolazione generale e non affetti in modo
malattieerano
cardioe/o cerebrovascolari.
Ilevidente
gruppo didanormali
individui
scelti tra la popolazione generale e non affetti in modo
evidente
da malattieviene
cardioe/o cerebrovascolari.
La distribuzione
illustrate
nelle cifre indicate di seguito.
LaI distribuzione
nelle cifre
di seguito.
tre gruppi cheviene
sonoillustrate
stati studiati
non indicate
mostravano
differenze di età o di sesso nei livelli di
I tre gruppi che sono stati studiati non mostravano differenze di età o di sesso nei livelli di
apolipoproteina(a).
Apo(a).
state
osservate
differenze
significative
livelliapolipoproteina(a)
Apo(a) tra il gruppotradiilnormali
NonNon
sonosono
state
osservate
differenze
significative
neineilivelli
gruppo di
della
Svezia
e ilSvezia
gruppo
normalididel
Canada.
normali
della
e ildigruppo
normali
del Canada.
significativamente
più elevati del
IlIlgruppo
apolipoproteina(a)
significativamente
più elevati del
gruppodidipazienti
pazientiFH
FHpresentava
presentavalivelli
livellididiApo(a)
gruppo di normali provenienti dalla stessa regione (p<0.001, test di Wilcoxon di somma dei
gruppo di normali provenienti dalla stessa regione (p<0.001, test di Wilcoxon di somma dei
ranghi).
ranghi).
Le concentrazioni di Apo(a) riportate di seguito per la media e per il 75°, 85° e 95°
Le concentrazioni di apolipoproteina(a) riportate di seguito per la media e per il 75°, 85° e 95°
percentile sono state ottenute per i diversi gruppi.
percentile sono state ottenute per i diversi gruppi.
Normali, Svezia
Normali, Canada
FH, Canada
Media
U/l
131
117
294
75° perc.
U/l
448
379
660
85° perc.
U/l
612
525
863
95° perc.
U/l
795
1044
1544
Distribuzione di Apo(a) nei normali e nei pazienti FH (Canada)
60
60
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
0
1600
1700
1800
1900
2000
2100
1700
1800
1900
2000
2100
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
Italiano
Italiano
1600
10
1500
20
1500
30
1400
40
1400
Distribuzione di pazienti FH (Canada)
1300
U/l
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
200
Frequenza relativa
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
100
Frequenza relativa
Frequenza relativa
Distribuzione dei normali (Canada)
40
30
20
10
U/l
Distribuzione dei normali (Svezia)
40
30
20
10
U/l
61
CARATTERISTICHE DELLE
CARATTERISTICHE
DELLEPRESTAZIONI
PRESTAZIONI
Limite di
di rilevamento
rilevamento
Limite
Il limite di rilevamento è 0.05 U/l calcolato come 3 deviazioni standard al di sopra del Calibrator
Il limite di rilevamento è 0.05 U/l calcolato come 3 deviazioni standard al di sopra del Calibrator 0.
0. Questo corrisponde ad una concentrazione del campione pari a 10 U/l quando il campione
Questo
ad una concentrazione del campione pari a 10 U/l quando il campione è
è diluitocorrisponde
1/202.
diluito 1/202.
Recupero
Recupero
Il recupero dopo l’aggiunta è pari a 96–111 % (media 102 %).
Il recupero dopo l’aggiunta è pari a 96–111 % (media 102 %).
Effetto ‘Hook’
Effetto
I campioni‘Hook’
che hanno una concentrazione fino a 9600 U/l possono essere misurati senza fornire
Irisultati
campioni
che hanno una
fino a 9600
U/l possono
misurati
senza
fornire
erroneamente
bassiconcentrazione
se vengono pre-trattati
e diluiti
1/202 essere
nel modo
descritto
sopra.
risultati erroneamente bassi se vengono pre-trattati e diluiti 1/202 nel modo descritto sopra.
Precisione
Precisione
I campioni sono stati pre-trattati e diluiti 1/202 in una sola occasione e quindi conservati a
I–20°C
campioni
stati pre-trattati
e diluiti
1/202 in Ciascun
una solacampione
occasione
e quindi
conservati
fino sono
al momento
dell’esecuzione
dell’esame.
è stato
analizzato
in 4 a
–20°C
momentodiverse.
dell'esecuzione dell'esame. Ciascun campione è stato analizzato in 4
copie infino
noveal occasioni
copie in nove occasioni diverse.
Campione
1
2
3
Valore medio
U/l
83
196
485
Coefficiente di variazione
all’interno
tra gli esami
totale
dell’esame %
%
esami %
3.3
2.9
2.4
4.0
3.6
1.8
5.2
4.7
3.0
I campioni sono stati pre-trattati e diluiti 1/202 in occasione di ciascun esame. Ciascun campione
è stato analizzato in 5 copie in 5 occasioni diverse.
Campione
4
5
6
Specificità
Specificità
Valore medio
U/l
103
251
744
Coefficiente di variazione
all’interno
tra gli esami
totale
dell’esame %
%
esami %
3.1
3.6
2.4
4.2
3.7
5.2
5.2
5.2
5.7
Una concentrazione
concentrazione fino
fino aa 10
10 g/l
g/ldidiplasminogeno
plasminogenofornisce
fornisceuna
unareattività
reattivitàcrociata
crociatanon
nonmisurabile
Una
misurabile nell’esame.
(La concentrazione
clinica del plasminogeno
inferiore
nell’esame.
(La concentration
clinica del plasminogeno
è inferiore a è2.1
g/l.) a 2.1 g/l.)
La
non ha
ha reazioni
reazioni crociate
crociate misurabili.
misurabil.
Laapolipoproteina
apolipoprotein BB non
62
CALIBRATURA
Il kit Mercodia per Apo(a) ELISA è calibrato in confronto ad un preparato Lp(a) commerciale
altamente purificato, completamente convalidato.
La concentrazione di Apo(a) viene espressa in Unità/l.
Non è possibile esprimere la concentrazione di Apo(a) in unità di massa poiché vi sono almeno
sei diverse isoforme descritte con peso molecolare che varia da circa 300 kD a 900 kD
(1,2,15,16). Ciascun campione prelevato dai pazienti contiene quindi percentuali diverse delle
diverse isoforme.
Non è possibile quindi fornire un fattore di conversione esatto tra le Unità di Apo(a) e
milligrammi di Apo(a).
1 Unità di Apo(a) è pari a circa 0.7 mg di proteina Lp(a).
GARANZIA
I dati sul rendimento presentati in questa sede sono stati ottenuti eseguendo la procedura
indicata. Eventuali cambiamenti o modifiche nella procedura che non sono stati consigliati dalla
Mercodia AB possono alterare i risultati. In tal caso la Mercodia AB annulla qualsiasi garanzia
esplicita, implicita o prevista per legge, compresa la garanzia implicita della commerciabilità e
della adeguatezza del prodotto per l’uso.
In tale eventualità, la Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati declinano qualsiasi
responsabilità per danni diretti o indiretti.
Italiano
63
64
TILSIGTET ANVENDELSE
Mercodia Apo(a) ELISA er en metode til kvantitativ bestemmelse af humant apolipoprotein(a) i
serum eller plasma.
OVERSIGT OG FORKLARING AF TESTEN
Apolipoprotein(a), Apo(a), er et glykoprotein, som er sammenkædet af disulfid-broer, til
apolipoprotein B i lipoprotein(a) (Lp(a)) partiklen. Apo(a) er formet af tre forskellige strukturelle
domæner. Et af domænerne, kaldet kringle 4, er til stede i mange kopier, hvis antal varierer og
er genetisk bestemt, hvilket forårsager forskellige størrelser af Apo(a) og efterfølgende Lp(a).
Afhængig af den anvendte metode, har man identificeret fra seks til 23 isoformer af Apo(a) i
området fra omkring 300 til 900 kD (1,2,15,16). De fleste mennesker har en eller to Apo(a)
isoformer, selvom der ikke kan konstateres et Apo(a)-bånd hos visse forsøgspersoner, ved
analyse i SDS-gel elektroforese efterfulgt af immunoblotting (3).
På det seneste har der været megen fokus på Lp(a), da der er mange beviser for, at dets
cirkulerende niveau af antikoagulationsmiddel udgør en selvstændig risikofaktor for hjerte/karsygdomme. Man har konstateret, at Lp(a) niveauet udgør en medfødt risikofaktor for
iskemisk hjertesygdom (4–8). Høje Lp(a) niveauer er blevet påvist i familiær hyperkolesterolæmi,
og dens måling kan være klinisk anvendelig til risikovurdering ved disse patienter (9,10).
Der er også offentliggjort resultater vedr. Lp(a) som en kraftig indikation for cerebrovaskulær
sygdom (11,12).
Apo(a) er homolog med protease zymogen plasminogen (13,14).
Lp(a) har hæmmende effekt på aktiveringen af plasminogen, og nye undersøgelser har vist,
at Apo(a) og Lp(a) konkurrerer med plasminogen om at binde plasminogen-receptoren. Disse
egenskaber hos Apo(a) kan forklare forbindelsen mellem høje Lp(a) koncentrationer og
myokardeinfarkt.
PRINCIP FOR PROCEDUREN
Mercodia Apo(a) ELISA er en tosidet solid phase enzym-immunoanalyse. Den er baseret på den
direkte sandwich-teknik, hvor to monoklonale antistoffer rettes mod separate antigene
determinanter på Apo(a) molekylet. Under inkubation reagerer Apo(a) i
prøven med peroxydase-konjugeret anti-Apo(a)-antistoffer og anti-Apo(a)-antistoffer bundet til
microtitreringsbrønden. En simpel skylning fjerner ubundet enzym-mærket antistof. Det bundne
konjugat registreres ved reaktion med 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin. Reaktionen stoppes ved at
tilsætte syre for at give et kolorimetrisk endepunkt, der aflæses spektrofotometrisk.
Dansk
65
ADVARSLER GO FORHOLDSREGLER
• Til in vitro-diagnostisering. Ikke til intern eller ekstern brug for mennesker eller dyr.
• Indholdet af dette sæt, samt rester deraf, må ikke komme i kontakt med drøvtyggende dyr
eller svin.
• Stop Solution i dette sæt indeholder 0.5 M H2SO4. Overhold almindelige forholdsregler for
håndtering af farlige kemikalier.
• Alle patientprøver skal håndteres som potentielt smittefarlige.
Advarsel! Sættet indeholder potientielt smittefarlige reagenser!
Sættet indeholder reagenser, der er fremstillet af humane blodkomponenter. Kildematerialet er
blevet testet ved immunanalyse for hepatitis B-overfladeantigen, antistoffer mod hepatitis C
virus og antistoffer mod HIV-virus og er fundet negativt. Men alle anbefalede forholdsregler for
håndtering af blodderivater skal overholdes. Se HHS Publication no.(CDC) 88-8395 eller
tilsvarende lokale/nationale retningslinjer for sikkerhedsprocedurer for laboratorier.
NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER
• Pipetter til 25 µl, 50 µl, 200 µl, 500 µl og 5.0 ml (repetitionspipetter foretrækkes til
tilsætning af enzymkonjugatopløsning, Substrate TMB og Stop Solution)
• Bægerglas og målebægre til klargøring af reagenser
• Redestilleret vand
• Reagensglas, 5 ml
• Mikropladeaflæser med 450 nm-filter
• Rystebord (Anbefalet hastighed er 700-900 omdrejninger per minut, orbital bevægelse)
• Skylleanordning til mikroplader
• Magnetisk røreanordning
66
REAGENSER
Hvert Mercodia Apo(a) ELISA sæt indeholder reagenser til 96 brønde, nok til 41 prøver, 2
Controls og en kalibratorkurve i duplet. Til større analyseserier skal der bruges puljereagenser
fra pakker med samme partinumre. Udløbsdatoen for hele sættet er angivet på den yderste
etiket. Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2–8°C.
67
Dansk
Coated Plate
1 plade
96 brønde
Klar til brug
(Monoklonalt anti-Apo(a) fra mus) 8-brøndstrimler
Ved ubrugte mikropladebrønde skal posen genforsegles med klæbebånd. Opbevares ved
2–8°C og bruges inden for 2 måneder
4 hætteglas
500 µl
Frysetørret
(humant Apo(a)) Farvekodet gul
Tilsæt 500 µl
redestilleret vand pr.
Koncentration angivet på hætteglassets etiket
hætteglas
Opbevaring af rekonstitueret Calibrator i mere end en uge bør ske ved –20°C.
Calibrator 0
1 hætteglas
500 µl
Klar til brug
Farvekodet gul
1 hætteglas
700 µl
Klargøring, se
(Peroxidase-konjugeret fra mus
nedenfor
monoklonalt Anti-Apo(a))
1 hætteglas
7 ml
Klar til brug
Farvekodet blå
Controls (H), (L)
2 hætteglas
500 µl
Frysetørret
Apo(a) koncentration angivet på
Tilsæt 500 µl
hætteglassets etiket
redestilleret vand pr.
hætteglas
(Gennemsnit ± 3 S.D.)
Opbevaring af rekonstitueret Controls i mere end en uge bør ske ved –20°C.
1 hætteglas
5 ml
Klar til brug
Sample Buffer 5X
2 flasker
50 ml
Farvekodet rød. Fortynd hver flaske med 200 ml redestilleret vand for lave prøve buffer.
Bemærk! Der kan forekomme bundfald, når det opbevares ved 2-8 °C. Lad Sample Buffer 5X
nå stuetemperatur. Omryst eller bland med vortex-blander, indtil bundfaldet er opløst.
Wash Buffer 21X
1 flaske
50 ml
Fortynd 1+20 med 1000 ml redestilleret vand for at lave vaske opløsning
Opbevaring efter fortynding:
2-8 °C i 4 uger
Substrate TMB
1 hætteglas
22 ml
Klar till brug
Farveløs opløsning. Bemærk! Lysfølsom!
Stop Solution
1 hætteglas
7 ml
Klar till brug
0,5 M H2SO4
Forberedelse af enzymkonjugatopløsning
Klargör den påkrævede mængde af enzymkonjugatopløsning ved at fortynde Enzyme Conjugate
11X med Enzyme Conjugate Buffer (1+10) i henhold till till tabellen nedenfor. Hvis der forberedes enzymkonjugatopløsning til en hel plade, hæld hele indholdet af Enzyme Conjugate Buffer
over i Enzyme Conjugate 11x røret. Bland forsigtigt.
Oppbevaring efter fortynding: 2 uger (2-8 °C)
Antal strimler
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme Conjugate
Buffer
12 strimler
6 strimler
4 strimler
1 hætteglas
300 µl
200 µl
1hætteglas
3.0 ml
2.0 ml
UDTAGNING OG HÅNDTERING AF PRØVER
Serum
Tag blod ved venepunktur, lad det koagulere, og adskil serummet ved centrifugering Prøver kan
opbevares ved 2-8°C i en uge. Længere opbevaring skal ske ved -20°C. Undgå at nedfryse og
optø af flere omgange.
Plasma
Tag blod ved venepunktur i rør med EDTA eller heparin som antikoagulant, og adskil plasmafraktionen. Prøver kan opbevares ved 2-8°C i en uge. Længere opbevaring skal ske ved -20°C.
Undgå at nedfryse og optø af flere omgange.
Klargøring af prøver
Alle prøver og Controls skal forbehandles på følgende måde:
1
2
3
4
Prøve/Control
Bland og inkuber i 1 time ved stuetemperatur
Tilsæt prøve buffer og bland
25 µl
25 µl
5,0 ml
Som et resultat af denne procedure fortyndes prøverne med 1/202. Denne fortynding kan holde
i en uge ved 2–8°C.
Hvis koncentrationen af Apo(a) i prøven er >1000 U/l, fortyndes den forbehandlede og
fortyndede prøve (1/202) yderligere i prøve buffer, f.eks. 1/4 hvilket giver en endelig fortynding
i forholdet 1/808.
68
TESTPROCEDURE
Klargør enzymkonjugatopløsning, vaske opløsning og prøve buffer. Udfør hver bestemmelse i
duplet for Calibrators, Controls og prøver. Lav en kalibratorkurve for hver analyskørsel. Undgå
at pipetteopløsninger kommer på glassets vægge.
Tilsæt til anti-Apo(a) brønde
Calibrators
Prøver
Controls
1 Calibrators
25 µl
–
–
2 Forbehandlede prøver
–
25 µl
–
3 Forbehandlede Controls
–
–
25 µl
4 Enzymkonjugatopløsning
50 µl
50 µl
50 µl
5 Inkuber på et rystebord (700-900 rpm) i 1 time ved stuetemperatur (18–25°C).
6 Vask 6 gange med 700 µl per brønd, anvend en automatisk pladevasker med overflow
funktion. Benyt ikke soak funktion i vaske proceduren.
Eller manuelt:
Bortkast væsken i pladen ved at vende den på hovedet over en vask. Tilsæt 350 µl
vaske opløsning til hver brønd. Bortkast vaske opløsningen, bank pladen flere gange mod
absorberende papir for at fjerne overskydende væske. Gentag 5 gange. Undgå at forlænge
perioden hvor brøndene står med væske i løbet af vaskeperioden.
7 Tilsæt 200 µl Substrate TMB
8 Inkuber i 15 minutter
9 Tilsæt 50 µl Stop Solution.
Placer pladen på et rystebord i 5 sekunder for at sikre blandingen af Substrate TMB og Stop
Solution.
10 Aflæs optisk densitet ved 450 nm, og beregn resultaterne.
Aflæs inden for 30 minutter
Obs! For at forhindre kontermination mellem konjugatet og substratet, anbefales det at
anvende særskilte pipetter.
INTERN KVALITETSKONTROL
BEREGNING AF RESULTATERNE
Databehandlet beregning
For at finde koncentrationen af Apo(a) skal der foretages en databehandlet datareduktion af
absorbans for Calibrators, bortset fra Calibrator 0, mod koncentrationen vha. en cubic regression.
Koncentrationen af de prøver multipliceres med fortyndingens faktor (f.eks. × 202).
69
Dansk
Interne plasmapuljer med lave, mellem og høje Apo(a)-koncentrationer skal regelmæssigt
analyseres som prøver, og resultaterne afbildes fra dag til dag. Der er god laboratoriepraksis at
registrere følgende data for hver analyse: sættes partinummer; rekonstitueringsdatoer for
sættets komponenter: OD-værdier for blindprøver, Calibrators og Controls.
Manuel beregning
1. Plot de absorbansværdier, der er opnået for Calibrators, bortset fra Calibrator 0, mod
Apo(a)-koncentrationen på et dobbeltlogaritmisk papir og tegn en kalibratorkurve.
2. Aflæs koncentrationen for Controls og de prøver fra kalibratorkurven.
3. Multiplicer koncentrationen af Controls og de prøver med fortyndingens faktor
(f.eks. × 202).
Eksempel på resultater
Eksempel på resultater
Værdier
opnåetmed
medetet88uger
ugersgammel
gammelsæt.
sæt.
Vædier opnået
Identitet
450
Brønde
Identitet
AA450
1A–B
Calibrator0 0
0,061/0,064
1A–B
Calibrator
0.061/0.064
1C–D
Calibrator0.31
1** U/l
0,194/0,197
1C–D
Calibrator
0.194/0.197
1E–F
Calibrator1.11
2** U/l
0,535/0,537
1E–F
Calibrator
0.535/0.537
1G–H
Calibrator2.8
3**U/l
1,129/1,131
1G–H
Calibrator
1.129/1.131
2A–B
Calibrator
4**U/l
1,835/1,837
2A–B
Calibrator 5.6
1.835/1.837
2C–D
ControlL L
0,239/0,242
2C–D
Control
0.239/0.242
2E–F
ControlHH
0,515/0,515
2E–F
Control
0.515/0.515
2G–H
Prøve 11
0,286/0,286
2G–H
Ukendt
0.286/0.286
3A–B
Prøve 22
0,562/0,563
3A–B
Ukendt
0.562/0.563
3C–D
Prøve 33
1,070/1,073
3C–D
Ukendt
1.070/1.073
*
Resultat multipliceret med fortyndningens faktor (× 202).
*** Koncentration
Resultat multipliceret
med
fortyndingens
faktor
angivet på
hætteglassets
etiket
. (× 202).
*
Gennensnit
Gennemsnitkonc.
konc.U/l
U/l*
62,6
62.6
224,2
224.2
565,6
565.6
1131,2
1131.2
83,8
83.8
215,4
215.4
104,5
104.5
238,4
238.4
525,4
525.4
Eksempel
Eksempel på
på kalibreringskurve
kalibreringskurve
Der vises
visesenentypisk
typisk
kalibreringskurve.
ikke denne
til at bestemme
kalibreringskurve.
BrugBrug
ikke denne
kurve tilkurve
at bestemme
faktiske faktiske
analyseresultater.
2
O.D. 450 nm
1.5
1
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
U/l
PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER
Som ved alle diagnosticeringsanalyser må en definitiv klinisk diagnose ikke baseres på
70
resultaterne
af en enkelt analyse, men skal foretages af lægen, efter at alle kliniske resultater er
blevet bedømt.
PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER
Som ved alle diagnosticeringsanalyser må en definitiv klinisk diagnose ikke baseres på
resultaterne af en enkelt analyse, men skal foretages af lægen, efter at alle kliniske resultater
er blevet bedømt.
Stærkt lipæmiske, ikteriske eller hæmolyserede prøver forstyrret ikke analysen.
SAMMENLIGNINGMED
MED
MERCODIA
APO(a)
SAMMENLIGNING
MERCODIA
APO(a)
RIARIA
Sammenlignende
Mercodia
Apo(a)
ELISA
og Mercodia
Apo(a)
RIA erRIA er
Sammenlignendeundersøgelser
undersøgelsermellem
mellem
Mercodia
Apo(a)
ELISA
og Mercodia
Apo(a)
blevet
blevetforetaget
foretagetmed
med45
45prøver,
prøver,der
derereranalyseret
analyseret22gange
gangeved
ved2 2lejligheder.
lejligheder.DeDefundne
fundneværdier
værdier
viser
viserenengod
godkorrelation
korrelationmellem
mellemdedetototeknikker,
teknikker,r=1.00
r=1.00(se
(sediagram).
diagram).
De
Mercodia
Apo(a)
RIARIA
kan kan
ogsåogså
anvendes
for Mercodia
Apo(a)Apo(a)
Deforventede
forventedeværdier
værdierforfor
Mercodia
Apo(a)
anvendes
for Mercodia
ELISA.
ELISA.
1250
1000
750
500
250
0
0
250
500
750
1000
1250
FORVENTEDE VÆRDIER
God praksis foreskriver, at hvert laboratorium fastlægger sine egne intervaller for forventede
værdier. Følgende resultater, der opnås med Mercodia Apo(a) RIA, kan fungere som en
vejledning, indtil laboratoriet selv har indsamlet tilstrækkelige data.
Dansk
Gruppen med raske var udvalgte personer fra den almindelige befolkning og uden nogen
tilsyneladende hjerte-kar- og/eller cerebrovaskulær sygdom.
Fordelingen er vist i de følgende diagrammer.
De tre undersøgte grupper viste ingen alders- eller kønsmæssige forskelle i deres
apolipoprotein(a)-niveauer.
Der blev ikke fundet nogen markant forskel i apolipoprotein(a)-niveauerne mellem grupperne
med raske fra Sverige og gruppen med raske fra Canada.
71
Gruppen med FH-patienter havde markant højere apolipoprotein(a)-niveauer end gruppen
med raske fra det samme område (p<0.001, Wilcoxon rank sum test).
Følgende apolipoprotein(a)-koncentrationer for median, 75, 85 og 95 percentiler blev opnået
Dansk
Apolipoprotein(a) niveauet er blevet undersøgt i tre forskellige materialer:
A Raske1, n=171, Sverige (kaukasisk)
B Raske1, n=203, Canada (kaukasisk-asiatisk, heterogen)
C Patienter med familiær hyperkolesterolæmi (FH), n=113, Canada (kaukasisk-asiatisk,
heterogen)
FORVENTEDE VÆRDIER
God praksis foreskriver, at hvert laboratorium fastlægger sine egne intervaller for forventede
værdier. Følgende resultater, der opnås med Mercodia Apo(a) RIA, kan fungere som en
vejledning, indtil laboratoriet selv har indsamlet tilstrækkelige data.
Apo(a) niveauet er blevet undersøgt i tre forskellige materialer:
A Raske1, n=171, Sverige (kaukasisk)
B Raske1, n=203, Canada (kaukasisk-asiatisk, heterogen)
C Patienter med familiær hyperkolesterolæmi (FH), n=113, Canada (kaukasisk-asiatisk,
heterogen)
Gruppen med raske var udvalgte personer fra den almindelige befolkning og uden nogen
tilsyneladende hjerte-kar- og/eller cerebrovaskulær sygdom.
Fordelingen er vist i de følgende diagrammer.
De tre undersøgte grupper viste ingen alders- eller kønsmæssige forskelle i deres
Apo(a)-niveauer.
Der blev ikke fundet nogen markant forskel i Apo(a)-niveauerne mellem grupperne med
raske fra Sverige og gruppen med raske fra Canada.
Gruppen med FH-patienter havde markant højere Apo(a)-niveauer end gruppen
med raske fra det samme område (p<0.001, Wilcoxon rank sum test).
Følgende Apo(a)-koncentrationer for median, 75, 85 og 95 percentiler blev opnået for de
forskellige grupper.
Median
U/l
Raske, Sverige
Raske, Canada
FH, Canada
131
117
294
75 perc.
U/l
448
379
660
85 perc.
U/l
95 perc.
U/l
612
525
863
795
1044
1544
Apo(a) fordeling af raske og FH-patienter (Canada)
72
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
20
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
1400
10
1300
40
1300
Fordeling af FH-patienter (Canada)
1200
U/l
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
30
Dansk
Dansk
0
100
0
200
Relativ frekvens (%)
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
100
Fordeling af raske (Canada)
40
30
20
10
U/l
Fordeling af raske (Sverige)
40
30
20
10
U/l
73
YDEEVNE
YDEEVNE
Registreringsgrænse
Registreringsgrænse
Registreringsgrænsen
Registreringsgrænsen er
er 0.05
0.05 U/l,
U/l, beregnet
beregnet som
som to
to standardafvigelser
standardafvigelser over
over Calibrator
Calibrator 0.
0.
Dette
svarer
prøvekoncentration
prøven
fortyndet
1/202.
Dette
svarer
til til
en en
prøvekoncentration
påpå
1010
U/l,U/l,
nårnår
prøven
er er
fortyndet
1/202.
Genfinding
Genfinding
Genfinding efter tilsætning er 96–111 % (gennemsnit 102 %).
Genfinding
Hook
Hook effect
effect
Prøver med en koncentration på op til 9600 U/l kan
kan måles
måles uden
uden at
at få
få falsk
falsklave
laveresultater,
resultater,hvis
hvis
disse er forbehandlede og fortyndede 1/202 som beskrevet ovenfor.
Nøjagtighed
Prøver, der er forbehandlede
opbevaret
vedved
–20°C,
forbehandlede og
ogfortyndede
fortyndede1/202
1/202ved
vedenenlejlighed
lejlighedogog
opbevaret
–20°C,
indtil analyserne blev gennemført. Hver prøve analyseres 4 gange ved 9 forskellige lejligheder.
Prøve
1
2
3
Gennemsnit
U/l
83
196
485
inden for
analyse %
3.3
2.9
2.4
Variationskoefficient
mellem
samlet
analyse %
analyse %
4.0
3.6
1.8
5.2
4.7
3.0
Prøver, der er forbehandlede og fortyndede 1/202 ved hver testlejlighed. Hver prøve analyseres
5 gange ved 5 forskellige lejligheder.
Prøve
4
5
6
Specificitet
Specificitet
Gennemsnit
U/l
103
251
744
inden for
analyse %
3.1
3.6
2.4
mellem
samlet
analyse %
analyse %
4.2
3.7
5.2
5.2
5.2
5.7
En koncentration
koncentration på
påop
optiltil10
10g/l
g/lplasminogen
plasminogengiver
giveringen
ingenmålelig
måleligkrydsreaktion
krydsreaktioni undersøgelsen.
i
(Klinisk
koncentration
plasminogen af
er plasminogen
under 2.1 g/l.)er under 2.1 g/l.)
undersøgelsen.
(Kliniskafkoncentration
Apolipoprotein B har ingen målbar krydsreaktion.
74
74
KALIBRERING
Mercodia Apo(a) ELISA sættet er kalibreret mod en meget renset, helt valideret, kommerciel
Lp(a) klargøring.
Koncentrationen af Apo(a) udtrykkes i Units/l (enheder/l).
Det er ikke muligt at udtrykke koncentrationen af Apo(a) i måleenheder, da der er mindst
seks forskellige isoformer beskrevet med molekylevægt, der varierer mellem ca. 300 kD og
900 kD (1,2,15,16). Dermed vil hver patientprøve indeholde forskellige proportioner af de
forskellige isoformer.
Derfor kan der ikke gives en præcis omsætningsfaktor mellem enheder af Apo(a) og
milligram af Apo(a).
1 enhed af Apo(a) er næsten lig med 0,7 mg Lp(a) protein.
GARANTI
De angivne ydeevnedata blev opnået ved hjælp af den angivne fremgangsmåde. Alle
ændringer af fremgangsmåden, der ikke anbefales af Mercodia AB, kan påvirke resultaterne,
og i dette tilfælde ophæver Mercodia AB alle garantier, det være sig udtrykkelige, stiltiende
eller lovbefalede, herunder den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt
formål.
I et sådant tilfælde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distributører ikke drages til
ansvar for indirekte skader eller følgeskader.
Dansk
75
76
AVSEDD ANVÄNDNING
Mercodia Apo(a) ELISA är ett test för kvanitativ bestämning av humant apolipoprotein(a) i serum
eller plasma.
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET
Apolipoprotein(a), Apo(a), är ett glykoprotein som är bundet till apolipoprotein B i lipoprotein(a)
(Lp(a))-partikeln genom disulfidbryggor. Apo(a) bildas av tre olika strukturella domäner. En av
domänerna, kringla 4, finns i flera kopior och antalet varierar och bestäms genetiskt, vilket ger
upphov till olika storlekar av Apo(a) och följdaktligen Lp(a) . Beroende på vilken metod som
har använts har mellan 6 och 23 isoformer av Apo(a) på cirka 300 till 900 kD identifierats
(1,2,15,16). De flesta människor har en eller två Apo(a)-isoformer, men hos vissa personer kan
inget Apo(a)-band detekteras vid analys med SDS-gel-elektrofores som följs av immunoblotting
(3).
Den senaste tiden har Lp(a) fått stor uppmärksamhet eftersom det finns många bevis för att
cirkulerande halter av Lp(a) utgör en obeoende riskfaktor för kardiovaskulär sjukdom. Lp(a)halter har visat sig vara en nedärvd riskfaktor för ischemisk hjärtsjukdom (4–8). Höga Lp(a)halter har påvisats vid familjär hyperkolesterolemi och det kan vara kliniskt betydelsefullt att
kunna mäta dessa halter, för att förutsäga riskerna hos dessa patienter (9,10).
Resultat har även publicerats som visar att Lp(a) är en stark indikator för cerebrovaskulär
sjukdom (11,12).
Apo(a) är homolog till proteasproenzymet plasminogen (13,14).
Lp(a) hämmar plasminogenaktiveringen och nyligen genomförda studier har visat att Apo(a)
och Lp(a) konkurrerar med plasminogenet om att binda till plasminogenreceptorn. Dessa
egenskaper hos Apo(a) skulle kunna förklara sambandet mellan höga Lp(a)-koncentrationer
och hjärtinfarkt.
TESTPRINCIP
Mercodia Apo(a) ELISA är en tvåsidig enzymimmunanalys med fast fas. Den baserar sig på
”sandwich”-teknik, med två monoklonala antikroppar som är riktade mot separata antigena
determinanter på Apo(a)-molekylen. Under inkubation reagerar Apo(a) i provet med
peroxidaskonjugerade Apo(a)-antikroppar och Apo(a)-antikroppar som är bundna till en
mikrotiterbrunn. En enkel tvätt avlägsnar obunden enzymmärkt antikropp. Det bundna
konjugatet detekteras genom reaktion med 3,3’,5,5’-tetrametylbensidin. Reaktionen avbryts
genom att syra tillsätts, för att ge en kolorimetrisk slutpunkt som avläses spektrofotometriskt.
Svenska
77
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
• För in vitro-diagnostiskt bruk. Ej för internt eller externt bruk på människor eller djur.
• Innehållet i detta kit eller rester därav får inte komma i kontakt med idisslande djur eller
svin.
• Stop Solution i detta kit innehåller 0,5 M H2SO4. Följ rutinmässiga försiktighetsåtgärder för
hantering av farliga kemikalier.
• Alla patientprover ska hanteras som om de vore smittbärande.
Varning: Detta kit innehåller reagenser som kan vara smittsamma!
Kitet innehåller reagenser som är framställda av humana blodkomponenter. Källmaterialet har
med hjälp av immunanalys testats på förekomst av hepatit B-ytantigen, antikroppar mot hepatit
C virus och antikroppar mot HIV virus och funnits vara negativt. Alla försiktighetsåtgärder för
hantering av blodderivat ska dock iakttas. Information finns i HHS, publikationsnr. (CDC) 888395 eller i motsvarande lokala/nationella riktlinjer för säkerhetsprocedurer på laboratorier.
MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ TILLHANDAHÅLLS
• Pipett för 25 µl, 50 µl, 200 µl, 500 µl och 5.0 ml (repeterbara pipetter är att föredra för
tillsats av enzymkonjugatlösning, Substrate TMB och Stop Solution)
• Bägare och mätglas för framställning av reagens
• Destillerat vatten
• Provrör, 5 ml
• Mikrotiterplattläsare med 450 nm filter
• Plattskak (Rekommenderad hastighet är 700-900 varv per minut, orbital rörelse)
• Tvättutrustning för mikrotiterplattor
• Magnetomrörare
78
REAGENSER
Varje Mercodia Apo(a) ELISA-kit innehåller reagenser för 96 brunnar (räcker till 41 prover), två
Controls och en kalibratorkurva i duplikat. För större analysserier används sammanslagna
reagenser från förpackningar med identiska lotnummer. Utgångsdatum för hela kitet står på
ytteretiketten. Rekommenderad förvaringstemperatur är 2–8°C.
Coated Plate
1 platta
96 brunnar
Färdig att användas
(monoklonal mus-anti-Apo(a)) Strips med 8 brunnar
För oanvända mikrotiterstrips, återförslut påsen med tejp. Förvara vid 2–8°C och använd inom
två månader.
4 flaskor
500 µl
Fystorkat
(humant Apo(a))
Tillsätt 500 µl destillerat
Koncentrationen anges på flaskans etikett. Gul färgmärkning
vatten per flaska
För rekonstituerade Calibrators som ska förvaras i över en vecka rekommenderas en förvaringstemperatur på –20°C.
Calibrator 0
1 flaska
500 µl
Gul färgmärkning
1 flaska
700 µl
Späd enligt nedan
(peroxidaskonjugerat monoklonal mus-Anti-apo(a))
1 flaska
7 ml
Blå färgmärkning
Controls (H), (L)
2 flaskor
500 µl
Frystorkat
Apo(a)-koncentrationen anges på flaskans etikett
Tillsätt 500 µl destillerat
(Genomsnitt ± 3 S.D.)
vatten per flaska
För rekonstituerade Controls som ska förvaras i över en vecka rekommenderas en förvaringstemperatur på –20°C.
1 flaska
5 ml
Sample Buffer 5X
2 flaskor
50 ml
Röd färgmärkning.
Späd ut varje flaska med 200 ml destillerat vatten för att bereda provbuffert.
Obs! Fällning kan förekomma när lösningen förvarats vid 2-8°C. Låt Sample Buffer 5X nå
rumstemperatur. Mixa tills fällningen har lösts upp.
Wash Buffer 21X
1 flaska
50 ml
Späd 1+20 med 1000 ml destillerat vatten för att bereda tvättlösning
Förvaring efter spädning: 2-8°C i 4 veckor
Substrate TMB
1 flaska
22 ml
Färglös vätska. Observera! Ljuskänslig!
Stop solution
1 flaska
7 ml
0,5 M H2SO4
Svenska
79
Beredning av konjugatlösning
Gör i ordning önskad mängd enzymkonjugatlösning genom att blanda Enzyme Conjugate 11X
med Enzyme Conjugate Buffer (1+10) enligt tabellen nedan. Vid beredning av enzymkonjugatlösning till hela plattan, hälls hela innehållet av Enzyme Conjugate Buffer i flaskan med Emzyme
Conjugate 11X. Blanda varsamt.
Förvaring efter spädning: 2-8°C i 2 veckor.
Antal strips
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme Conjugate
Buffer
12 strips
6 strips
4 strips
1 flaska
300 µl
200 µl
1 flaska
3.0 ml
2.0 ml
PROVTAGNING OCH HANTERING
Serum
Ta blod genom venpunktion, låt det koagulera och separera serumet genom centrifugering. Prover kan förvaras vid 2-8°C i en vecka. För längre tidsperioder ska proverna förvaras vid -20°C.
Undvik upprepad frysning och upptining.
Plasma
Ta blod genom venpunktion i rör som innehåller EDTA eller heparin som motverkar koagulation
och separera plasmadelen genom centrigfugering. Prover kan förvaras vid 2-8°C i en vecka. För
längre tidsperioder ska proverna förvaras vid -20°C. Undvik upprepad frysning och upptining.
Beredning av prover
Alla prover och Controls måste förbehandlas enligt följande:
1
2
3
4
Prov/Control
Blanda och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur
Tillsätt provbuffert och blanda
25 µl
25 µl
5,0 ml
Detta förfarande gör att proverna blir spädda till 1/202. Spädningen är stabil vid 2–8°C i en
vecka.
Om koncentrationen av Apo(a) i provet är >1000 U/l späds det förbehandlade och spädda
provet (1/202) ytterligare i provbuffert, 1/4 ger t.ex. en slutlig spädning på 1/808.
80
TESTFÖRFARANDE
Bered enzymkonjugatlösning, tvättlösning och provbuffert. Utför varje bestämning i duplikat
för Calibrators, Controls och prover. Gör en kalibratorkurva för varje analysomgång. Undvik att
pipettera lösningarna på rörväggarna.
Tillsätt till anti-Apo(a)-brunnar
Calibrators
Prov
Controls
1 Calibrators
25 µl
–
–
2 Förbehandlade prover
–
25 µl
–
–
–
25 µl
3 Förbehandlade Controls
4 Enzymkonjugatlösning
50 µl
50µl
50 µl
5 Inkubera på en plattskak (700-900 rpm) i 1 timme vid rumstemperatur (18–25°C).
6 Tvätta 6 gånger med 700 µl per brunn, använd en automatisk microtiterplatt-tvätt med
overflow-funktion. Använd inte soak-funktion vid tvättproceduren.
Eller manuellt,
Avlägsna reaktionslösningen genom att vända microtiterplattan upp och ner över en
slask. Tillsätt 350 µl tvättlösning till varje brunn. Avlägsna tvättlösningen, knacka
plattan bestämt flera gånger på absorberande papper för att ta bort överfödig vätska.
Upprepa 5 gånger. Undvik långvarig soak under tvättproceduren.
7 Tillsätt 200 µl Substrate TMB.
8 Inkubera i 15 minuter
9 Tillsätt 50 µl Stop Solution
Placera plattan på plattskaken i 5 sekunder för att säkerställa att Substrate TMB och Stop
Solution har blandats.
10 Mät absorbansen vid 450 nm och utvärdera.
Avläs inom 30 minuter.
Obs! För att undvika kontamination rekommenderas att separata pipetter används för konjugat
och substrat.
INTERN KVALITETSKONTROLL
Interna plasmapooler med låga, medelhöga och höga koncentrationer av Apo(a) bör
regelmässigt analyseras som prover och resultaten kartläggas dag för dag. Det tillhör goda
laboratoriesed att anteckna följande uppgifter vid varje analystillfälle: kitets lotnummer,
kitkomponenternas rekonstitueringssdatum samt optiska densitetsvärden för blank, Calibrators
och Controls.
BERÄKNING AV RESULTAT
Datorberäkning
81
Svenska
Koncentrationen av Apo(a) kan erhållas genom att använda kubisk regression i en datoriserad
datareduktion av absorbansen för Calibrators, förutom Calibrator 0, kontra koncentrationen.
Multiplicera koncentrationen för proverna med spädningsfaktorn (t.ex. × 202).
Manuell beräkning
1. Märk ut absorbansvärdena som erhålls för Calibrators, förutom Calibrator 0, mot Apo(a)koncentrationen på ett lin-linpapper och gör en kalibratorkurva.
2. Avläs koncentrationen för Controls och prover på kalibratorkurvan.
3. Multiplicera koncentrationen för Controls och prover med spädningsfaktorn (t.ex. × 202).
Exempel på resultat
Värden
som erhållits
med ett 8 veckor gammalt kit.
Exempel
på resultat
Brunnar
Identitetmed ett 8 veckor gammalt
A450 kit.
Medelvärde konc. U/l*
Värden som erhållits
1A–B
Calibrator 0
0,061/0,064
Medelvärde konc. U/l*
Brunnar
Identitet **
A450
1C–D
Calibrator 1
0,194/0,197
62,6
1A–B
Calibrator
0
0,061/0,064
**
1E–F
Calibrator 2
0,535/0,537
224,2
1C–D
Calibrator
0,194/0,197
62,6
1G–H
Calibrator 0,31
3** U/l
1,129/1,131
565,6
1E–F
Calibrator
1,11
0,535/0,537
224,2
** U/l
2A–B
Calibrator 4
1,835/1,837
1131,2
1G–H
Calibrator
1,129/1,131
565,6
2C–D
Control L 2,8 U/l
0,239/0,242
83,8
2A–B
Calibrator
1,835/1,837
1131,2
2E–F
Control H 5,6 U/l
0,515/0,515
215,4
2C–D
Control
0,239/0,242
83,8
2G–H
Prov 1 L
0,286/0,286
104,5
2E–F
Control
0,515/0,515
215,4
3A–B
Prov 2 H
0,562/0,563
238,4
2G–H
Okänd
0,286/0,286
104,5
3C–D
Prov 3 1
1,070/1,073
525,4
Okänd 2
0,562/0,563
238,4
* 3A–B
Resultaten har multiplicerats med spädningsfaktorn (× 202).
Okänd
3 på flaskans etikett.1,070/1,073
525,4
**3C–D
Koncentrationen
anges
* Resultaten har multiplicerats med spädningsfaktorn (× 202).
Kalibratorkurva
Kalibratorkurva
Nedan visas en representativ kalibratorkurva. Använd inte denna kurva för att bestämma
Nedan visas en representativ kalibratorkurva. Använd inte denna kurva för att bestämma
riktiga analysresultat.
riktiga analysresultat.
2
O.D. 450 nm
1.5
1
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
U/l
PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR
82
I likhet med andra diagnostiska tester ska inte en slutgiltig klinisk diagnos baseras på resultat
från ett enstaka test. Diagnos ska ställas av läkare när alla kliniska resultat har utvärderats.
PROCEDURENS BEGRÄNSNINGAR
I likhet med andra diagnostiska tester ska inte en slutgiltig klinisk diagnos baseras på resultat
från ett enstaka test. Diagnos ska ställas av läkare när alla kliniska resultat har utvärderats.
Starkt lipemiska, ikteriska eller hemolyserade prover påverkar inte testresultatet.
JÄMFÖRELSE
APO(a)
RIARIA
JÄMFÖRELSEMED
MEDMERCODIA
MERCODIA
APO(a)
Jämförelsestudier mellan Mercodia Apo(a) ELISA och Mercodia Apo(a) RIA har utförts med 45
Jämförelsestudier mellan Mercodia Apo(a) ELISA och Mercodia Apo(a) RIA har utförts med 45
prover som analyserades i två replikat vid två tillfällen. Värdena som erhölls visar på en god
prover som analyserades i två replikat vid två tillfällen. Värdena som erhölls visar på en god
korrelation mellan de två teknikerna, r= 1,00 (se figur).
korrelation
mellanvärdena
de två teknikerna,
1,00 (se
De förväntade
för Mercodiar=Apo(a)
RIAfigur).
kan därmed användas även för Mercodia
De förväntade
värdena för Mercodia Apo(a) RIA kan därmed användas även för Mercodia
Apo(a)
ELISA.
Apo(a) ELISA.
1250
1000
750
500
250
0
0
250
500
750
1000
1250
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Det tillhör god laboratoriesed att varje laboratorium fastställer sina egna förväntade värden.
Följande resultat som erhållits med Mercodia Apo(a) RIA kan tjäna som en vägledning till dess
att laboratoriet har samlat tillräckligt med egna uppgifter.
Apolipoprotein(a)-halterna har studerats i tre olika material:
A Normala1, n=171, Sverige (kaukasiska)
B Normala1, n=203, Kanada (kaukasiska-asiatiska, heterogena)
C Patienter med familjär hyperkolesterolemi (FH), n=113, Kanada (kaukasiska-asiatiska,
heterogena)
Svenska
Sven
Normalgrupperna bestod av individer som valts från den allmänna befolkningen och som inte
hade någon uppenbar kardiovaskulär och/eller cerebrovaskulär sjukdom.
Fördelningen visas i figurerna nedan.
De tre grupperna som undersöktes uppvisade inga ålders- eller könsrelaterade skillnader vad
gäller halterna av apolipoprotein(a).
Det fanns inte någon signifikant skillnad mellan apolipoprotein(a)-halterna hos
normalgruppen från Sverige och normalgruppen från Kanada.
Gruppen med FH-patienter hade avsevärt högre apolipoprotein(a)-halter än normalgruppen
83
från samma region (p<0,001, Wilcoxons rangsummetest).
Följande apolipoprotein(a)-koncentrationer för median, 75:e, 85:e och 95:e percentilen
erhölls för de olika grupperna.
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Det tillhör god laboratoriesed att varje laboratorium fastställer sina egna förväntade värden.
Följande resultat som erhållits med Mercodia Apo(a) RIA kan tjäna som en vägledning till dess
att laboratoriet har samlat tillräckligt med egna uppgifter.
Apoa)-halterna har studerats i tre olika material:
A Normala1, n=171, Sverige (kaukasiska)
B Normala1, n=203, Kanada (kaukasiska-asiatiska, heterogena)
C Patienter med familjär hyperkolesterolemi (FH), n=113, Kanada (kaukasiska-asiatiska,
heterogena)
Normalgrupperna bestod av individer som valts från den allmänna befolkningen och som inte
hade någon uppenbar kardiovaskulär och/eller cerebrovaskulär sjukdom.
Fördelningen visas i figurerna nedan.
De tre grupperna som undersöktes uppvisade inga ålders- eller könsrelaterade skillnader vad
gäller halterna av Apo(a).
Det fanns inte någon signifikant skillnad mellan Apo(a)-halterna hos normalgruppen från
Sverige och normalgruppen från Kanada.
Gruppen med FH-patienter hade avsevärt högre Apo(a)-halter än normalgruppen från samma
region (p<0,001, Wilcoxons rangsummetest).
Följande Apo(a)-koncentrationer för median, 75:e, 85:e och 95:e percentilen erhölls för de
olika grupperna.
Normala, Sverige
Normala, Kanada
FH, Kanada
Median
U/l
75:e perc.
U/l
85:e perc.
U/l
95:e perc.
U/l
131
117
294
448
379
660
612
525
863
795
1044
1544
Apo(a)-fördelningen för normala patienter och FH-patienter (Kanada)
84
100
75
Normals
50
FH patients
25
0
10
100
Apo(a) U/l
1000
0
U/l
8585
1800
1900
2000
2100
1800
1900
2000
2100
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
1700
Svenska
Svenska
1700
10
1600
20
1600
30
1500
40
1500
Fördelningen för FH-patienter (Kanada)
1400
U/l
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
200
2100
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
100
Fördelningen för normala patienter (Kanada)
40
30
20
10
U/l
Fördelningen för normala patienter (Sverige)
40
30
20
10
ANALYTISKA
ANALYTISKAPRESTANDAEGENSKAPER
PRESTANDAEGENSKAPER
ANALYTISKA PRESTANDAEGENSKAPER
Gräns
Gränsför
förpåvisbarhet
påvisbarhet
Gräns för påvisbarhet
Detektionsgränsen
är < 0,05 U/l och beräknas som tre standardavvikelser ovanför Calibrator 0.
Detektionsgränsen är < 0,05 U/l och beräknas som tre standardavvikelser ovanför Calibrator 0.
Detektionsgränsen
är < 0,05 U/l och beräknas
som provet
tre standardavvikelser
ovanför Calibrator 0.
Detta
motsvarar
en provkoncentration
på 10
späds
till 1/202.
Detta
motsvarar
en provkoncentration
på U/l
10 när
U/l när provet
späds
till 1/202.
Detta motsvarar en provkoncentration på 10 U/l när provet späds till 1/202.
”Recovery”
”Recovery”
”Recovery”
”Recovery”
vid tillsats är 96–111 % (i genomsnitt 102 %).
”Recovery” vid tillsats är 96–111 % (i genomsnitt 102 %).
”Recovery” vid tillsats är 96–111 % (i genomsnitt 102 %).
”Hook-effekt”
”Hook-effekt”
”Hook-effekt”
Prover
med en koncentration på upp till 9600 U/l kan mätas utan att de visar felaktigt låga
Prover med en koncentration på upp till 9600 U/l kan mätas utan att de visar felaktigt låga
Prover med
enförbehandlas
koncentrationoch
påspäds
upp till
kanbeskrivningen
mätas utan att
de visar felaktigt låga
resultat,
om de
till 9600
1/202U/l
enligt
ovan.
resultat, om de förbehandlas och späds till 1/202 enligt beskrivningen ovan.
resultat, om de förbehandlas och späds till 1/202 enligt beskrivningen ovan.
Precision
Precision
Precision
Proverna
förbehandlades och späddes till 1/202 vid ett tillfälle och förvarades vid –20°C tills
Proverna förbehandlades och späddes till 1/202 vid ett tillfälle och förvarades vid –20°C tills
Proverna förbehandlades
och späddes
till 1/202 ivid
tillfällevid
och
vid –20°C tills
analyserna
genomfördes. Varje
prov analyserades
fyraettreplikat
nioförvarades
olika tillfällen.
analyserna genomfördes. Varje prov analyserades fyrfaldigt vid nio olika tillfällen.
analyserna genomfördes. Varje prov analyserades fyrfaldigt vid nio olika tillfällen.
Prov
Medelvärde
Prov
Medelvärde
U/l
inom
mellan
totalt
U/l
inom
mellan
totalt
testet %
testet %
testet %
testet %
testet %
testet %
1
83
3,3
4,0
5,2
1
83
3,3
4,0
5,2
2
196
2,9
3,6
4,7
2
196
2,9
3,6
4,7
3
485
2,4
1,8
3,0
3
485
2,4
1,8
3,0
Proverna
vidvid
varje
testtillfälle.
Varje
provprov
analyserades
Provernaförbehandlades
förbehandladesoch
ochspäddes
späddestilltill1/202
1/202
varje
testtillfälle.
Varje
analyserades
förbehandlades
och
späddes till 1/202 vid varje testtillfälle. Varje prov analyserades
i Proverna
fem replikat
fem
olika
tillfällen.
femfaldigt
vidvid
fem
olika
tillfällen.
femfaldigt vid fem olika tillfällen.
Prov
Medelvärde
Prov
Medelvärde
U/l
inom
mellan
totalt
U/l
inom
mellan
totalt
testet %
testet %
testet %
testet %
testet %
testet %
4
103
3,1
4,2
5,2
4
103
3,1
4,2
5,2
5
251
3,6
3,7
5,2
5
251
3,6
3,7
5,2
6
744
2,4
5,2
5,7
6
744
2,4
5,2
5,7
Specificitet
Specificitet
Specificitet
En koncentration på upp till 10 g/l plasminogen ger ingen mätbar korsreaktivitet i analysen. (Den
Enkoncentration
koncentrationpå
på upp
upp till
till 10
10 g/l
ger ingen
mätbar korsreaktivitet
i analysen. (Den
En
g/l plasminogen
plasminogen
ingen
kliniska koncentrationen
av plasminogen
ligger ger
under
2,1mätbar
g/l.) korsreaktivitet i analysen.
kliniska
koncentrationen
av plasminogen
liggerligger
underunder
2,1 g/l.)
(Den
kliniska
koncentrationen
plasminogen
2,1 g/l.)
Apolipoprotein
B har ingenavmätbar
korsreaktion.
Apolipoprotein B har ingen mätbar korsreaktion.
Apolipoprotein B har ingen mätbar korsreaktion.
86
86
86
KALIBRERING
Kitet Mercodia Apo(a) ELISA kalibreras mot en mycket ren, validerad, kommersiell Lp(a)beredning.
Koncentrationen av Apo(a) uttrycks i enheter per liter (U/l).
Det går inte att uttrycka koncentrationen av Apo(a) i massenheter eftersom det finns minst
sex olika isoformer med molekylvikter som varierar från cirka 300 kD till 900 kD (1,2,15,16).
Därför innehåller varje patientprov olika proportioner av de olika isoformerna. Detta innebär att
ingen exakt omräkningfaktor kan anges mellan Apo(a)-enheter och
milligram Apo(a).
En enhet Apo(a) motsvarar ungefär 0,7 mg Lp(a)-protein.
GARANTI
De uppgifter som presenteras här erhölls med användning av påvisat förfarande. Förändringar
eller modifieringar av förfarandet som inte rekommenderas av Mercodia AB kan påverka
resultaten. I dessa fall frånsäger sig Mercodia AB allt ansvar, underförstått såväl som lagstadgat,
inklusive underförstådd säljbarhets- och användbarhetsgaranti.
Mercodia AB och dess auktoriserade återförsäljare skall i dessa fall inte hållas ansvariga för
direkta eller indirekta skador.
Svenska
87
REFERENCES/REFERENZEN/RÉFÉRENCES/REFERENCIAS/RIFERIMENTI/
REFERENCER/REFERENSER
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immunochemical measurement. Clin Chem 36: 2019–2026.
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11 Zenker G, Költringer P, Boné G, Niederkorn K, Pfeiffer K and Jürgens G (1986) Lipoprotein
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12 Murai A, Miyahara T, Fujimoto N, Matsuda M and Kameyama M (1986) Lp(a) lipoprotein as
a riskfactor for coronary heart disease and cerebral infarction. Atherosclerosis 59:199–204.
13 McLean JW, Tomlinson JE, Kuang WJ, Eaton DL, Chen EY, Fless GM, Scanu AM and
Lawn RM (1987) cDNA sequence of human apolipoprotein(a) is homologous to
plasminogen. Nature 330: 132–137.
14 Eaton DL, Fless GM, Kohr WJ, McLean JW, Xu QT, Miller CG, Lawn RM and Scanu AM (1987)
Partial amino acid sequence of apolipoprotein (a) shows that it is homologous to plasminogen
Biochemistry 84:3224–3228.
15 Lackner C, Boerwinkle E, Leffert CC, Rahmig T and Hobbs HH (1991) Molecular basis of
apolipoprotein(a) isoform size heterogenity as revealed by pulsed-field gel electrophoresis.
J Clin Invest 87:2153–2161.
16 Kamboh MI, Ferrell RE and Kottke BA (1991) Expressed hypervariable polymorphism of
apolipoprotein (a). Am J Hum Genet 49:1063–1074.
17 Solymoss BC, Marcil M, Wesolowska E, Gilfix BM, Lespérance J and Campeau L (1993)
Relation of coronary artery disease in women <60 years of age to the combined elevation
of serum lipoprotein(a) and total cholesterol to high-density cholestrolratio.
Am J Cardiol 72:1215–19.
88
Add Calibrators, pretreated Controls
and pretreated samples
Calibrators, vorbereitete Controls
und vorbereitete Proben beigeben
Ajout de Calibrators, de Controls
et d’échantillons prétraités
Añadir Calibrators, Controls pretrat
ados y muestras pretratadas
Aggiungere Calibrators, Controls
pre-trattati e campioni pre-trattati
Tilsæt Calibrators, forbehandlede
Controls og forbehandlede prøver
Tillsätt Calibrators, förbehandlade
Controls och förbehandlade prover
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
50 µl
Add enzyme conjugate solution
Enzymkonjugatlösung beifügen
Ajout du conjugué enzymatiqué
Añadir de la disolution conjugado enzimático
Aggiungere della soluzione enzime coniugato
Tilsæt enzymkonjugatopløsning
Tillsätt enzymkonjugatlösning
Incubate
Inkubieren
Incubation
1 hour at 18–25°C on a shaker
1 Stunde auf einem Schüttler bei 18–28°C
1 heure à 18–25°C sur un agitateur
secoueur de plaques
Incubar
1 hora a 18–25°C en un agitador de placas
Incubazione 1 ora a 18–25°C in una piastra shaker
Inkuber
1 time ved 18–25°C på et rystebord
Inkubera
1 timme vid 18–25°C på en plattskak
Wash
Waschen
Rinçage
Lavar
Lavare
Vask
Tvätta
6 times
6 mal
6 rinçages
6 veces
6 volte
6 gange
6 gånger
Add Substrate TMB
Substrate TMB beigeben
Ajout de Substrat TMB
Añadir Substrate TMB
Aggiungere Substrate TMB
Tilsæt Substrate-TMB
Tillsätt Substrate TMB
Incubate
Inkubieren
Incubation
Incubar
Incubazione
Inkuber
Inkubera
200 µl
15 minutes
15 Minuten
15 minutes
15 min
15 minuti
15 min
15 minuter
Add Stop Solution
50 µl Shake for 5 sec to
ensure mixing
50 µl Sicherstellen von Durch
mischung 5 Sek. schütteln
Ajout de Stop Solution
50 µl Secouer pendant 5
secondes pour bien mélanger
Añadir Stop Solution
50 µl Agitar durante 5 segundos
para asegurar el mezclado
Aggiungere Stop Solution 50 µl Scuotere per 5 secondi
per assi curarsi che sia tutto
mescolato
Tilsæt Stop Solution
50 µl Ryst i 5 sekunder for
sikre blanding
Tillsätt Stop Solution
50 µl Skaka i 5 sekunder för
att se till att lösningen blandas
Stop Solution beifügen
Measure A450
Messung A450
Mesure de A450
Medir A450
Misura A450
Aflæs A450
Mät vid A450
31-3104
Revised: 2009-05-06
31-3104
Revised 2006-12-19
X-O Graf Tryckeri AB
SUMMARY PROTOCOL SHEET/ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLBLATTES/
FEUILLE DE PROTOCOLE RESUMEE/HOJA DE RESUMEN DEL
PROTOCOLO/PROTOCOLLO DI
SINTESI/OVERSIGTSPROTOKOLARK/SAMMANFATTNINGSPROTOKOLL
Mercodia Apo(a) ELISA

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