Gigantino Rafaela, Aprea Gennaro, Capriglione Teresa, Odierna

I Vertebrati ectotermi
del Parco Regionale del Matese, 2002
A cura di Odierna G. e Guarino F.M., pp. 57-64
Caratteristiche genomiche dei Vertebrati ectotermi
del Parco del Matese. II. Distribuzione
di elementi trasponibili, Tc1-simili,
tra i Vertebrati ectotermi del Parco del Matese.
GIGANTINO RAFFAELA, APREA GENNARO,
CAPRIGLIONE TERESA, ODIERNA GAETANO
Dipartimento di Biologia Evolutiva e Comparata
Università degli Studi di Napoli Federico II
Abstract
We assayed the presence of Tc1-like transposable elements, belonging to the transposable
Tc1/mariner family, in various specimens of fish (Gasterosteus aculeatus, Scardinius
erythrophthalmus, and Salmo trutta), amphibians (Triturus italicus, Salamandrina
tergiditata, Rana synklepton esculenta, and R. italica), and reptiles (Podarcis muralis, P.
sicula, Lacerta bilineata, Chalcides chalcides, Anguis fragilis , Natrix natrix and Coluber
viridiflavus) inhabiting the Regional Matese Park. The analysis was carried out by
means of southern blot hybridisation using as probe trunked element isolated in an
Antarctic fish, Chionodracus hamatus. Specific hybridisation patterns were observed
on DNA of all the assayed fish and amphibian species, whereas, among the reptiles,
hybridisation signals were revealed only in N. natrix. The obtained results appear
interesting for the evolution of the Tc1-like transposons, which appear able to invade
preferentially the genome of ectothermal vertebrate species inhabiting watery
environments or damp zones.
Introduzione
Gli elementi trasponibili (TEs) sono componenti ubiquitari del genoma sia dei
procarioti che degli eucarioti (Berg & Howe, 1989). I TEs sono capaci di muoversi nel genoma da una posizione ad un’altra e di inserire proprie copie in nuove
locazioni cromosomiche. Anche se il ruolo di questi elementi non è ancora del
tutto chiarito, il loro impatto nell’organizzazione del genoma e nei riarrangiamenti
cromosomici sembra probabile (Berg & Howe, 1989). Ad esempio, inserzioni di
elementi trasponibili sono alla base di molte mutazioni con importanti effetti
fenotipici, come la beta-talassemia o l’emofilia A. (Berg & Howe, 1989). Gli
elementi trasponibili vengono classificati in base alla loro struttura ed al meccanismo di trasposizione. In base a ciò è possibile suddividerli in trasposoni di Classe
I e Classe II (Berg & Howe, 1989). Gli elementi di Classe I, ritrovati solamente
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GIGANTINO ET AL
negli eucarioti e molti dei quali caratterizzati dalla presenza di lunghe estremità
ripetute (LTR), traspongono nel genoma tramite un intermedio a RNA, a sua
volta retro-trascritto nel DNA dalla trascrittasi inversa. Pertanto i TEs della classe
I sono noti anche come retrotrasposoni. Tra gli elementi più noti di tale classe
ricordiamo Copia, R1 e R2 di Drosophila melanogaster, le sequenze LINE (long
interspersed elements) e SINE (short interspersed elements) dei mammiferi (Berg
& Howe, 1989).
Gli elementi di Classe II, DNA-trasposoni, costituiscono una classe di TEs molto
eterogenea, ritrovati in tutti i viventi. La peculiarità di questi elementi è la presenza
alle loro estremità di ripetizioni terminali invertite (dette TIR, dall’inglese Terminal
Inverted Repeats), sequenze di lunghezza variabile (10-80bp) non presenti nei
retrotrasposoni. I TIR vengono riconosciuti da uno specifico enzima, la trasposasi,
codificata nei DNA-trasposoni autonomi dalla sequenza compresa tra i TIR. Essi
possono essere suddivisi in due sottoclassi, rispettivamente Sottoclasse I e Sottoclasse
II, in base alla presenza o assenza dell’impronta DD[35]E o DD[34]D (dove D=
acido aspartico, E=acido glutammico e [n]=distanza espressa in numero di residui
amminoacidici nella sequenza primaria) nella loro trasposasi. Attualmente si ritiene
che questa impronta ricada nel sito catalitico dell’enzima (Capy et al., 1989).
Alla Sottoclasse I degli elementi con il motivo DDE per la trasposasi, appartiene
la superfamiglia Tc1/mariner i cui componenti hanno le estremità ripetute ed
invertite che terminano con una sequenza altamente conservata (CAGTGC), sono
lunghi 1300-1600 bp e contengono una ORF codificante per una trasposasi di
347 aminoacidi (Brezinsky et al., 1990; Anderson et al., 1992; Avancini et al.,
1996). I Tc1/mariner rappresentano i DNA-trasposoni più diffusi negli eucarioti,
essendo presenti dai protozoi ai vertebrati. Una così ampia distribuzione degli
elementi Tc1/mariner in specie di diversi phyla è stata spiegata ipotizzando o un
trasferimento verticale tramite un antenato ancestrale di questi elementi presente
prima della divergenza delle principali linee filetiche, o un trasferimento orizzontale relativamente recente.
Di recente presso il nostro laboratorio è stata analizzata una famiglia di sequenze
ripetute di DNA nell’ice-fish dell’Antartide, Chionodraco hamatus (Capriglione et
al., 2001). La sequenza dell’unità monometrica, denominata pIF, ha mostrato
una significativa similarità con gli elementi trasponibili Tc1. Infatti pIF ha il sito
catalitico D,D35E che caratterizza la famiglia delle traspostasi dei trasposoni Tc1/
mariner, anche se l’ORF per tale enzima è risultata degenerata (264 aa invece dei
putativi 347aa) (Capriglione et al., 2001; Capriglione et al., 2001. Abstracts of
the 3rd A. Dohrn Workshop, Ischia, Naples, June 1-2). Nel presente lavoro, usando
come sonda elementi Tcch1 abbiamo saggiata la presenza di elementi Tc1-simili
in esemplari delle varie specie di vertebrati ectotermi rinvenute nel Parco del Matese.
Sequenze Tc1-simili nei vertebrati ectotermi del Matese
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Materiale e metodi
Di seguito è riportato il sesso, il numero e la provenienza degli esemplari studiati (il numero tra parentesi indica il toponimo riportato in Guarino et al. di
questo volume):
Gasterosteus aculeatus: 3 maschi e 3 femmine [presso Fontana del Colle, Gallo
(21)]; Scardinius erythrophthalmus: 4 maschi [Lago Matese, San Gregorio Matese
(29)]; Salmo trutta: 3 juveniles [Fiume Lete, tra Fontana del Cannello e la Licia,
Letino (3)]; Triturus italicus: 3 maschi [Sorgente Sogli, Faicchio (3)]; Salamandrina
tergiditata: 2 maschi [Vallone dell’inferno, Piedimente Matese (32)]; Rana
synklepton esculenta: 2 maschi [presso Ponte Fossaceca, Gallo (20)], 5 maschi e 1
femmina [presso Fontana del Colle, Gallo (21)]; R. italica: 4 maschi e 1 femmina
[presso Fontana del Colle, Gallo (21)], 2 femmine [Rio Fosso, località Filette,
Petraroja (40)], 1 femmina [torrente Reviola, Cusano Mutri, (18)], 2 maschi e 3
femmine [acquedotto romano, Fontevecchia, Faicchio, (5)]; Podarcis sicula: 2 femmine [Lago Letino, Letino (9)], 1 femmina [Nocelle presso Pozzo Capuano, Civitella
Licinia (12)], 1 maschio [Fontana Nicandro, Valle Agricola (34)], 2 maschi [sponde
del Lago Matese, San Gregorio Matese (29)], 2 maschi [Vallone dell’Inferno,
Piedimonte Matese (32)], 5 femmine e 1 maschio [Strada Gallo-Letino, Gallo
(25)], 2 maschi e 2 femmine [Rio Fosco presso Masseria Gagliardi, Petraroja (45)];
P. muralis: 2 femmine [sponde Lago Letino, Letino (9)], 2 femmine e 2 maschi [il
Campo, Civitella Licinia (15)], 2 maschi e 2 femmine [presso Fontana Nicandro,
Valle Agricola (34)], 2 maschi [sponde del Lago Matese, San Gregorio Matese
(29)], 5 femmine e 1 maschio [Strada Gallo-Letino, Gallo (25)]; Lacerta bilineata:
2 maschi [sponde Lago Letino, Letino (9)], 1 maschio [Le mandre, Civitella Licinia
(14)], 1 femmina [Campo, Civitella Licinia (15)], 1 femmina [Chianezze, Civitella
Licinia (16)], 1 femmina [Tortora, San Gregorio Matese (26)], 2 femmine [Rio
Fosco presso Masseria Gagliardi, Petraroja (45)]; 1 giovane di femmina (bordo
strada strada Petraroja-Cusano Mutri (46)], 1 maschio [presso fontana Nicandro,
Valle Agricola (34)]; Chalcides chalcides: 4 femmine e 1 maschio (c/o fontana
Prati, Gallo (2)]; Anguis fragilis: 1 maschio e 2 femmine [presso Fontana Nicandro,
Valle Agricola (34)]; Natrix natrix: 1 maschio e 1 femmina [Vallone dell’Inferno,
Piedimonte Matese (32)], 2 giovani [c/o fontana Cannello, Letino (3)], 1 giovane
[Località Pantano, Civitella Licinia (41)]; Coluber viridiflavus: 1 femmina [San
Gregorio Matese (39)].
Estrazione del DNA
Da tutti gli esemplari il DNA è stato estratto dalle sospensioni cellulari utilizzate
per allestire i cromosomi. Dopo almeno due lavaggi in 1xTE (10 mM Tris, 1 mM
EDTA), le cellule sono state sospese in un congruo volume di 1xTE. Dopo
omogeneizzazione in SDS e digestione con Proteinasi K, il DNA è stato estratto
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GIGANTINO ET AL
mediante centrifugazione in Cloroformio, Fenolo, Alcool isamilico (25:24:1)
Preparazione della sonda di ibridazione pIF e marcatura con digoxigenina
La sonda è stata ottenuta e marcata direttamente mediante PCR dal DNA di
C. hamatus usufruendo di una specifica coppia di primers designata per amplificare pIF da DNA di tale teleosteo (F: 5’-ACCATCAGTAACACACTACGCCGCC3’; R: 5’-TGGGCAACACGGACTTTCAACTCC-3’) (Capriglione et al. 2001). L’amplificazione è stata condotta in un volume finale di 50 µl contenente, 10 pmol
di ciascun primer, buffer1(Gibco-BRL), 2 µM MgCl2(Gibco-BRL), 0.2 µM
dNTP, 150 ng di DNA genomico e 2,5 unità di Taq-DNA-polimerasi (GibcoBRL). Dopo denaturazione per 5 minuti a 94°C, sono stati condotti 35 cicli di
amplificazione (30 secondi di denaturazione a 94°C, 30 secondi di annealing a
55°C, 1 minuto di polimerizzazione a 72°C, e 7 minuti di estensione finale a
72°C).
Ibridazione
I DNA delle diverse specie esaminate sono stati digeriti con Hae III a 37°C
O.N., corsi su gel di agarosio all’1% a 25 V O.N. e trasferiti su filtri di nitrocellulosa
Hybond-C-pure (Amersham). I filtri ottenuti sono stati preibridati in una miscela costituita da 5xSSC, 1% Blocking reagent, 0.1% N-lauril-sarcosina e 0,02%
SDS per 4 ore a 50°C. L’ibridazione è stata condotta a 55°C O.N. utilizzando la
stessa mix di preibridazione alla quale è stata aggiunta la sonda marcata e denaturata
mediante bollitura per 10 minuti. Dopo lavaggi in 2xSSC, 0,1% SDS a temperatura ambiente, è stato effettuato un lavaggio finale in 0,5xSSC, 0,1% SDS a 50°C.
I filtri sono stati quindi esposti ad anticorpi antidigoxigenina coniugati con fosfatasi
alcalina, diluiti 1:5000 in tampone indicato dalla casa fornitrice (tampone 1 Roche). Dopo più lavaggi nello stesso tampone più uno finale in tampone 3,
l’anticorpo coniugato con fosfatasi è stato rilevato mediante esposizione O.N. a
37°C alla mix di colorazione, bloccata poi con lavaggi in 1xTE.
Risultati
Segnali di ibridazioni con Tcch1 sono stati osservati sul DNA di tutte le
specie di pesci (G. aculeatus, S. erythrophthalmus e S. trutta) e di Anfibi esaminati (T. italicus, S. tergiditata, R. synklepton esculenta, e R. italica) (Fig. 1A). Tra i
Rettili studiati (P. muralis, P. sicula, L. bilineata, C. chalcides, A. fragilis, N. natrix
e C. viridiflavus) segnali di ibridazione con pIF sono stati osservati solo sul DNA
di N. natrix (Fig. 1B). È da notare che le reazioni di ibridazione con pIF hanno
prodotto pattern che differivano tra le specie esaminate (Fig. A e B), mentre all’interno della stessa specie non sono state rilevate differenze sia tra i sessi che tra
esemplari della stessa o di differenti popolazioni (evidenza non mostrata).
Sequenze Tc1-simili nei vertebrati ectotermi del Matese
61
Discussione
Gli elementi trasponibili della superfamiglia Tc1/mariner sono tra gli elementi
trasponibili quelli più studiati poiché presenti in svariati gruppi di eucarioti, dai
lieviti all’uomo (Auge-Gouillon et al., 1995). Tuttavia, a parte i mammiferi, studi
sulla presenza di elementi Tc1/mariner negli altri vertebrati sono scarsi. La presenza di elementi mariner-simili è stata di recente evidenziata nel teleosteo fugu,
Tetraodon fluvitilis (Mandrioli, 2000), mentre elementi Tc-1 like sono stati trovati nei Salmonidi (Goodier & Davidson, 1994) e in specie rappresentative di svariate famiglie di teleostei dell’Antartide (Capriglione et al., 2001). I risultati ottenuti nel presente lavoro sono importanti sia perché evidenziano per la prima volta
la presenza di elementi Tc1-like in varie altre specie di vertebrati ectotermi sia
perché forniscono interessanti informazioni sulla possibile evoluzione degli elementi trasponibili Tc1-simili, e dei trasposoni in generale. Il dato sulla trota fario,
Salmo trutta, conferma la presenza di tali elementi trasponibili tra i salmonidi,
mentre il dato sulla scardola, S. erythophthalmus, e sullo spinarello, G. aculeatus
evidenzia la loro presenza in teleostei d’acqua dolce sia primari che secondari.
Fig. 1. Suthern bloth di elementi Tcch1 digoxigenati su DNA di G. aculeatus(Ga), S. erythrophthalmus
(Se), S. trutta(Str), R. synklepton esculenta (Re), R. italica (Ri), T. italicus (Ti), S. tergiditata (Ste), P.
sicula (Ps), P. muralis (Pm), L. bilineata (Lb), N. natrix (Nn), C. viridiflavus (Cv), C. chalcides (Cc), A.
fragilis (Af).
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GIGANTINO ET AL
Infatti lo spinarello, appartenente alla famiglia dei Gasteroidae, è un pesce marino
che nella sua storia evolutiva ha invaso ripetutamente le acque dolci, mentre la
scardola, famiglia dei Cyprinidae, è un teleosteo esclusivamente d’acqua dolce.
Altrettanto diffusa sembrerebbe la presenza di elementi Tc1- like nel genoma degli Anfibi. Infatti tali elementi trasponibili sono stati rinvenuti nelle due specie di
urodeli studiate, entrambe della famiglia dei Salamandridae, e nelle due specie di
anuri considerate, R. synklepton esculenta e R. italica, entrambe della famiglia dei
Ranidae. Una così ampia distribuzione degli elementi Tc1/mariner in specie delle
diverse famiglie di teleostei e di Anfibi potrebbe essere spiegata ipotizzando che
un ipotetico elemento Tc1-like fosse presente fosse presente prima della divergenza delle principali linee filetiche. Tali elementi non verrebbero eliminati dalla pressione selettiva negativa perché la loro interferenza con il genoma è considerata
minima, anche grazie all’autoregolazione degli elementi trasponibili stessi una volta
inseriti in un genoma (Jensen et al., 1999). I differenti pattern di ibridazione
degli elementi Tc1-like osservati tra le specie esaminate potrebbero essere spiegate
dalla diversa amplificazione che tali elementi avrebbero avuto durante la durante
la diversificazione specifica. Tuttavia è noto che gli elementi trasponibili possono
invadere il genoma ospite anche tramite trasferimento orizzontale (Berg & Howe,
1989). Ad esempio, negli insetti è stato evidenziato che un dato elemento
trasponibile trovato in una specie può essere assente in specie ad essa strettamente
correlate ma trovarsi in altre filogeneticamente più distanti (Daniels et al., 1990;
Houck et al., 1991; Flavell & Smith, 1992; Robertson, 1993; Clark et al., 1994).
Nel presente studio ciò si osserva anche nei Rettili esaminati. Infatti gli elementi
Tc1-like non sono stati rinvenuti nei Lacertidae (P. muralis, P. sicula e L. bilineata),
negli Scincidae (C. chalcides), negli Anguidae (A. fragilis), mentre nei due serpenti
esaminati, C. viridiflavus e N. natrix, entrambi appartenenti alla famiglia dei
Colibridae, elementi Tc-1 like erano assenti nel biacco ma presenti nella natrice
dal collare, N. natrix. I dati ottenuti nel presente studio, quindi, rafforzano l’ipotesi che le famiglie di elementi trasponibili si formino e vengano perse nel tempo
attraverso le linee evolutive. Probabilmente nella diffusione di molti elementi
trasponibili sono implicati eventi di trasferimento orizzontale, mentre , una volta
che tali elementi si sono integrati nel genoma ospite, il loro mantenimento è
determinato da una trasmissione verticale, attraverso la linea germinale durante la
riproduzione sessuale (Charlesworth et al., 1994).
I risultati da noi ottenuti suggeriscono anche che gli elementi trasponibli Tc1sembrano in grado di invadere il genoma di specie che vivono in ambienti acquatici
o in zone umide. Infatti, elementi Tc1-simili sono stati rinvenuti in tutti i Pesci e
gli Anfibi esaminati. Analogamente, tra i Rettili esaminati elementi Tc1-like sono
presenti solo nella natrice dal collare e non nel biacco, nell’orbettino, nella
Sequenze Tc1-simili nei vertebrati ectotermi del Matese
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luscengola e nei tre lacertidi. La natrice vive prevalentemente in specchi e corsi
d’acqua dove si nutre di rane e pesci, mentre gli altri Rettili hanno stili di vita
esclusivamente terrestri nutrendosi, a secondo i casi, di lacertidi o di
micromammiferi o di insetti (Barbieri et al., 1994; Bruno, 1998; Corti & Lo
Cascio, 1999). Tali dati suggeriscono quindi che il trasferimento orizzontale di
elementi Tc1 nel genoma dei vertebrati ectotermi sia stata verosimilmente di tipo
orizzontale e probabilmente usufruendo di un vettore diffuso negli ambienti
acquatici (sia marini che d’acqua dolce) e nelle in zone umide.
Ringraziamenti
Lavoro finanziato dalla Regione Campania. Esemplari catturati con autorizzazione del 1/06/2000 n. SCN/2D/2000/9213 del Ministero dell’Ambiente.
Riassunto
La presenza di elementi trasponibili Tc1- like è stata saggiata sul DNA di vari esemplari
matesani di pesci (Gasterosteus aculeatus, Scardinius erythrophthalmus e Salmo trutta),
Anfibi (Triturus italicus, Salamandrina tergiditata, Rana synklepton esculenta , e R. italica),
e Rettili (Podarcis muralis, P. sicula, Lacerta bilineata, Chalcides chalcides, Anguis fragilis,
Natrix natrix e Coluber viridiflavus). L’analisi è stata condotta mediante ibridazioni su DNA
delle specie su indicate, predigerito con Hae III, usando come sonda elementi Tc- 1 simili,
di un pesce antartico, Chionodraco hamatus, marcati con digoxigenina. Specifici patterns
di ibridazione sono stati osservati sul DNA di tutte le specie esaminate di pesci e di Anfibi,
mentre tra i Rettili esaminati segnali di ibridazione sono stati rilevati solo in N. natrix. I
risultati ottenuti risultano interessanti per l’evoluzione degli elementi trasponibili Tc1- simili, che sembrano capaci di invadere preferenzialmente il genoma delle specie di vertebrati
ectotermi che vivono in ambienti acquatici o in zone umide.
Bibliografia
Anderson P., Emmons S.W., Moerman D.G., 1992 - Discovery of Tc1 in the nematode
Caenorhabditis elegans. In: N. Federoff & D. Botstein (eds), The dynamic genome.–
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, pp. 319-333.
Auge-Gouillon C., Bigot Y., Pollet N., Hamelin M.H., Meunier-Rotival M., Perriquet
G., 1995 - Human and other mammalian genomes contain transposons of the mariner
family. FEBS Lett., 368: 541-546.
Avancini R., Walden K., Robertson H., 1996 - The genomes of most animals have
multiple membrs of the Tc1 family of transposable elements. Genetica, 98: 131140.
Barbieri F., Caldonazzi M., Pedrini P., Zanghelli S., 1994 - Gli Anfibi e Rettili del
Parco Adamello-Brenta. Parco Adamello-Brenta, Trento, pp. 80.
Berg D.E., Howe M.M., 1989 - Mobile DNA. Washington, USA. Am. Soc. Microbiol.,
pp. 972.
Brezinsky L., Wang G., Humpreys Y., Hunt J., 1990 - The transposable element Uhu
from Hawaiian Drosophila-member of the widely dispersed class of Tc1-like
transposons. Nucl. Acid Res., 18: 2053-2059.
64
GIGANTINO ET AL
Bruno S., 1998 - Serpenti. Giunti, Firenze, pp. 256.
Capriglione T., Odierna G., Canapa A., Caputo V., Olmo E., 2000 - Transposon-like
sequence in Nototheniod fish. Ital. J. Zool. Supplement, 1: 123-126.
Capy P., Bazion C., Higuet D., Langin T., 1998 - Dynamics and evolution of transposable
elements. Landes Bioscence.
Charlesworth B., Sniegowski P., Stephan W.,1994 - The evolutionary dynamics of repetitive
DNA in eukaryotes. Nature, 371: 215-220.
Clark J.B., Madison W.P., Kidwell M.G., 1994 - Phylogenetic analysis supports horizontal
transfer of P transponable elements. Mol. Biol. Evol., 11: 40-50.
Corti C., Lo Cascio P., 1998 - I lacertidi d’Italia. L’Epos, Palermo, pp. 87.
Daniels S.B., Peterson K.R., Strausbaugh L.D., Kidwell M.G., Chovnick A., 1990 Evidence for horizzontal trasmission of the P transponible elements between
Drosophila species. Genetics, 124:339-355.
Doolittle W.F., Sapienza C., 1980 - Selfish genes, the phenotype paradigm and genome
evolution. Nature, 284: 601-603.
Flavell A. J., Smith D.B., 1992 - A Ty1-copia group retrotransposon sequence in a
vertebrate. Mol. Gen. Genet., 233:322-326.
Goodier J., Davidson W., 1994 - Tc1 transposon-like sequences are widely distributed in
salmonids. J. Mol. Biol., 241: 26-34.
Houck M.A., Clark J.B., Peterson K.R., Kidwell M.G., 1991- Possible horizontal transfer
of Drosophila genes by the mite Proctolaelaps regalis. Science, 253:1125-1129.
Jensen S., Gassama M-P., Heidmann T., 1999 - Taming of transposable elements by
homology-dependent gene silencing. Nat. Genet., 21: 209-212.
Lanza B., 1983 - Anfibi, Rettili (Amphibia, Reptilia), Italia, Consiglio Nazionale delle
Ricerche (“Guide per il riconoscimento delle specie animali delle acque interne italiane”, 27), pp. 196
Mandrioli M., 2000 - Mariner-like transposable elements are interspersed within the
rDNA-associated heterochromatin of the pufferfish Tetraodon fluviatis (Osteichthyes).
Chromosome Research, 8: 177-179.
Robertson H., 1993 - The mariner transponable element is widespersed in insects. Nature, London, 362: 241-245.