ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe
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ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe
ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe Z-2016-200 20 (0.2 ml) Z-2016-50 5 (0.05 ml) Per la rilevazione degli alfa-satelliti del cromosoma X e della regione del satellite III del cromosoma Y mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH) . . . . Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC Sonda polinucleotide marcata in fluorescenza per la rilevazione degli alfa-satelliti del cromosoma X e della regione del satellite III del cromosoma Y mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH). Pronto all’uso Descrizione Prodotto: Contenuto: Sonda ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe (PL3) in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi coniugati con un fluorocromo arancio (ZyOrange, analogo alla Rodamina, eccitazione a 547 nm ed emissione a 572 nm) che marca le sequenze degli alfa-satelliti del centromero del cromosoma X e polinucleotidi coniugati con un fluorocromo verde (ZyGreen, analogo alla FITC, eccitazione a 503 nm ed emissione a 528 nm) che marca la regione del satellite III del del cromosoma Y Prodotto: Z-2016-200: 0.2 ml (20 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) Z-2016-50: 0.05 ml (5 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) Specificità: La sonda ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe (PL3) è progettata per rilevare gli alfa-satelliti del centromero del cromosoma X così come la regione del satellite III del cromosoma Y in tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina o in campioni cellulari tramite ibridazione in situ fluorescente. Stabilità/Conservazione: La sonda ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe (PL3) deve essere conservata a 16/-22°C al buio ed è stabile fino alla data indicata sull’etichetta. Utilizzo: Questo prodotto è un dispositivo per uso diagnostico in vitro (in base alle direttive EU 98/79/EC). L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da personale qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. Precauzioni: Leggere il manuale d’uso prima dell’utilizzo! Non usare i reagenti dopo la data di scadenza riportata sull’etichetta. Questo prodotto contiene sostanze (in piccoli volumi e piccole concentrazioni) dannose per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Prendere le appropriate misure protettive (guanti monouso, occhiali protettivi, abbigliamento da laboratorio). Se i reagenti vengono in contatto con la pelle lavare abbondantemente con acqua. Principio del Metodo: La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. La formazione del duplex (con gli alfa satelliti del cromosoma X e la regione del satellite III del cromosoma Y nel campione) può essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati Istruzioni: Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post fissazione) piuttosto che l’allestimento del campione dovrebbero essere ottimizzati dall’utilizzatore a seconda della natura del campione e dei propri bisogni. Denaturazione e ibridazione 1. Utilizzare 10µl di ZytoLight CEN X/Y Dual Color Probe (PL3) per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino copri oggetto (22 mm x 22 mm a seconda della dimensione del campione). Sigillare il vetrino copri oggetto con fixogum o con colla analoga. 3. Denaturare a 75°C (± 2°C) per 10 minuti utilizzando una piastra calda La temperatura di denaturazione può dipendere da vari fattori come la fissazione o l’età del campione pertanto potrebbe essere necessaria l’ottimizzazione di tale temperatura (73°C-77°C) 4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37°C in una stufa ventilata E’ importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughino durante l’ibridazione E’ possibile condurre le fasi di denaturazione/ibridazione mediante l’utilizzo di piastre a controllo automatico della temperatura come il ThermoBrite™ StatSpin. Risultati Mediante l’utilizzo di filtri appropriati, i segnali di ibridazione degli alfasatelliti del cromosoma X appariranno arancio mentre i segnali di ibridazione della regione del satellite III del cromosoma Y appariranno verdi. In interfase le cellule normali maschili o in cellule maschili senza aberrazione dei cromosomi X e Y si distingueranno due segnali distinti uno verde ed uno arancione. In cellule normali femminili o in cellule femminili senza aberrazioni del cromosoma X si distingueranno due segnali distinti di colore arancione In cellule con aneuploidia del cromosoma X o Y si avrà la formazione di un diverso pattern di segnale. Al fine di valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe essere effettuata assieme a dei controlli. Si consiglia l’utilizzo di almeno un campione in cui il numero di copie dei cromosomi X e Y sia noto. Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene. A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di un segnale, devono essere considerati come un unico segnale. Bibliografia Coussens L, et al. (1985) Science 230: 1132-9. Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: 134-6. Slamon DJ, et al. (1987) Science 235: 177-82. Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN 0 19 963327 4. Ultima versione: 11 Gennaio 2010 (4.5) Marchi di fabbrica: ZytoVision® e ZytoLight ® sono marchi di fabbrica della ZytoVision