Membrane Biologiche
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Membrane Biologiche
Membrane Biologiche preservano l’individualità della cellula hanno permeabilità altamente selettiva pompe confine attivo canali controllano il flusso di informazione recettori specifici movimento verso i nutrienti risposta agli ormoni percezione della luce ... generano e ricevono segnali chimici ed elettrici Nelle cellule eucariotiche le membrane interne di organelli quali: il reticolo endoplasmatico, l’apparato di Golgi, il mitocondrio etc. mantengono la distinzione tra gli organelli e il cytosol. La membrana cellulare doppio strato: molecole non covalentemente legate fluido bidimensionale (A) Elettro-micrografia della membrana plasmatica di un globulo rosso (sezione trasversale) (B) disegno schematico della vista trasversale (C) disegno schematico tridimensionale Proprietà comuni a tutte le membrane biologiche 1. strutture “a foglio” (doppio strato) di spessore 510 nm 2. principalmente proteine e lipidi (rapporto tra pesi che varia tra 1:4 e 4:1) tenute insieme da legami non-covalenti a. lipidi: regione idrofilica + regione idrofobica b. proteine: pompe, canali, recettori, trasduttori di energia, enzimi. 3. Le 2 facce del doppio strato sono diverse (asimmetria) 4. Strutture fluide: a. rapidi spostamenti di lipidi e proteine sul singolo strato b. lenti flip-flop Funzioni delle proteine della membrana cellulare connessione citoscheletro-doppio strato matrice extracellulare cellule vicine recezione e trasduzione di segnali chimici Cellula animale funzionante: sono necessarie molte proteine di membrana diverse Circa il 30% delle proteine codificate nelle cellule animali sono proteine di membrana I vari modi in cui le proteine si associano con il doppio strato Attraversando la membrana con 1. una singola elica a, (possono essere covalentemente legate ad un acido grasso inserito nel monostrato) 2. eliche a multiple, 3. b sheet “arrotolato” (b barrel) Interagendo con un solo strato con 4. un a elica anfifilica, 5. un acido grasso, 6. via un oligosaccaride 7. e 8. Molte sono ancorate alle membrane via legami non covalenti con un’altra proteina Alcune proteine speciali formano pori nella membrana cellulare che permettono il passaggio di molecole. pdb Esempio di pompa di protoni (rodopsina). Viene utilizzata l’energia luminosa (H.Luecke et al., Science 286:255260, 1999.) In viola il retinolo. Lipidi (o acidi grassi) Funzionano da molecole di combustibile riserve di energia molecole segnale componenti delle membrane Sono insolubili in acqua solubili in solventi organici (es. cloroformio) La forma e la natura anfipatica delle molecole lipidiche favorisce la formazione spontanea di doppi-strati in mezzo acquoso Molecole idrofiliche: contengono gruppi carichi o gruppi polari che possono formare legami elettrostatici o legami idrogeno con le molecole d’acqua Molecole idrofobiche: tutti o la maggior parte degli atomi sono non carichi o non polari insolubili in acqua 1 mm2 area di doppio strato 5 × 106 molecole lipidiche, 109 molecole lipidiche nella membrana plasmatica di una piccola cellula animale Lipidi (o acidi grassi) catene di [da 14 a 24] atomi di carbonio (C) legati tra loro con un legame singolo (saturi) doppio o triplo (insaturi) valenze libere: legate a atomi di idrogeno (H) primo C = gruppo carbossilico (COOH). Generico lipide [n:m] con n = # C; m = # doppi legami Fluidità = f(n,m)= f(lunghezza, grado di saturazione) formula di struttura di un lipide insaturo Acido Grasso Forma ionizzata Un acido grasso è composto da una catena idrocarburica idrofobica a cui è attaccata un gruppo carbossilico idrofilico. Acidi grassi più comuni: Acido palmitico o Palmitato (n=16, m=0) Acido oleico o Oleato (n=18, m=1) Acidi differenti hanno differenti catene modello Space-filling Formula strutturale modello Ball-and-stick Principali lipidi di membrana: fosfolipidi, glicolipidi e colesterolo I più abbondanti sono i fosfolipidi Esempio di fosfolipide: la fosfatidilcolina Ciascun doppio legame forma un ginocchio nella coda. Molecole idrofobiche in acqua le molecole d’acqua si organizzano in gabbie che circondano la molecola idrofobica le “gabbie” sono strutture più ordinate dell’acqua circostante la loro formazione aumenta l’energia libera il costo di energia libera è minimizzato se le molecole idrofobiche “clusterizzano” in modo da coinvolgere il numero minimo di molecole d’acqua nella formazione della gabbia Le molecole idrofobiche e idrofiliche interagiscono in modo diverso con l’acqua (A) (B) L’acetone è polare e può avere interazioni elettrostatiche con le molecole d’acqua anch’esse polari l’acetone si scioglie facilmente in acqua Il 2-metilpropano è idrofobico virtualmente insolubile in acqua formazione della gabbia d- e d+ : cariche parziali atomi polari rosso/blu atomi non-polari grigio Le molecole lipidiche (lipidi) formano spontaneamente aggregati che nascondono le code idrofobiche all’interno ed espongono le teste idrofiliche all’acqua micelle (~ sferiche) doppi strati (~ piani) (A) lipidi cuneiformi (sopra) formano micelle, mentre lipidi cilindrici (sotto) formano doppi strati piani. (B) sezione trasversale La chiusura spontanea del doppio-strato fosfolipidico promuove la formazione di compartimenti chiusi Fosfolipidi cilindrici formazione spontanea doppio-strato Forza che determina la formazione del doppio strato Proprietà auto-riparatrici formazione di un piccolo strappo bordo accessibile all’acqua (energeticamente sfavorito) eliminazione mediante ridistribuizione dei lipidi (nelle membrane cellulari degli eucarioti “strappi” più grandi sono riparati dalla fusione con vescicole intra-cellulari) La presenza di bordi accessibili all’acqua è energeticamente sfavorita formazione di compartimenti chiusi natura anfipatica dei fosfolipidi formazione delle cellule Il doppio-strato lipidico è un fluido bidimensionale Il primo esperimento che dimostrò che i lipidi possono muoversi liberamente nel doppio-strato (1970) fu fatto su doppi-strati sintetici. Due tipi di doppi strati sintetici: liposomi: micelle sferiche (⊘ = 25 nm 1 mm, a seconda della preparazione) doppi strati planari (black membranes): formati su un foro tra 2 compartimenti acquosi Liposomi Elettromicrofotografia di una vescicola La struttura a doppio strato è chiaramente visibile Disegno della sezione trasversale di un piccolo liposoma black membrane Questi doppi-strati planari appaiono neri quando si formano su un piccolo foro Le black membranes sono utilizzate per misurare le proprietà di permeabilità delle membrane sintetiche Langmuir-Blodgett I film di Langmuir-Blodgett sono ottenuti dalla deposizione di monostrati su un substrato solido Quando le molecole sono depositate sulla superficie dell’acqua sono inizialmente poco impacchettate (“fase gassosa”) Aumentando la pressione passano ad una “fase liquida” E quindi ad una “fase solida” Surface pressure (mN/m) Molecole anfifiliche sulla superficie dell’acqua si dispongono come monostrati in cui la parte idrofobica si posiziona all’interfaccia acqua-aria Solid phase Liquid phase Gas phase Molecular area (nm 2/molecule) bilancia di Wilhelmy La compressione è fatta muovendo una barriera sulla superficie dell’acqua Una bilancia di Wilhelmy è utilizzata per misurare i cambiamenti della pressione superficiale Barriera Deposizioni di Langmuir-Blodgett I substrati: Idrofilici Vetro e quarzo Lastrine di metallo composte di ossidi di cromo, alluminio o stagno Argento e oro (substrati conduttori) arsenuri di silicio o gallio (semiconduttori) Idrofobici Mica e HOPG (Highly Ordered Pyrolytic Graphite Y-type X-type Z-type Mobilità Misura di mobilità delle molecole lipidiche Si “costruisce” una molecola lipidica con una testa che contiene uno "spin label” Spin label: gruppo NO spin spaiato paramagnetico individuabile con EPR moto e orientamento del lipide etichettato flip-flop (migrazione da un monostrato all’altro) < 1 volta / mese scambio di posizione con il vicino (all’interno dello stesso monostrato)~107 volte / sec rotazioni intorno all’asse e flessioni delle code Diffusione laterale rapida Coefficiente di diffusione, D ~ 10-8 cm2/sec attraversamento di una cellula batterica (~2 mm) in circa 4 sec Fluidità La fluidità della membrana deve essere ben regolata Alcune attività enzimatiche cessano se la viscosità del doppio strato supera un valore di soglia doppio strato lipidico sintetico (un solo tipo di fosfolipide) transizione liquido cristallo (o gel) temperatura caratteristica della transizione di fase più corta è la catena e maggiore il numero di doppi legami minore è la temperatura di transizione Catena corta Doppi legami (cis) minore interazione tra le code presenza di ginocchi impaccamento più difficile NOTA BENE: Batteri, lievito o altri organismi, la cui temperatura fluttua con quella dell’ambiente, aggiustano la composizione di acidi grassi delle loro membrane per mantenerne relativamente costante la fluidità. Se la temperatura si abbassa, per esempio, vengono sintetizzati più lipidi con doppi legami cis per evitare la cristallizazione. 4 sono i principali fosfolipidi della membrana cellulare di molti mammiferi: fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, and sfingomielina. serina isolata per la prima volta nella mielina Solo la testa della fosfotidilserina ha una carica negativa netta, le altre sono neutre a pH fisiologico I 4 fosfolipidi costituiscono più della metà della massa di lipidi della maggior parte delle membrane (tabella) Altri fosfolipidi presenti in basse quantità sono però molto importanti funzionalmente (es: inositol fosfolipide: ha un ruolo cruciale nella trasmissione del segnale) Il doppio strato lipidico di molte membrane cellulari è composto anche di colesterolo e glicolipidi Le membrane cellulari degli eucarioti contengno un’elevata quantità di colesterolo (fino ad una molecola per fosfolipide) formula disegno schematico modello space-filling Le molecole di colesterolo si orientano con i gruppi idrossili vicini alle teste polari dei fosfolipidi. Il loro anello steroide rigido interagisce con le teste immobilizzandole parzialmente Il colesterolo rende il doppio strato meno deformabile diminuendone la permeabilità a piccole molecole solubili Se da una parte il colesterolo rende il doppio-strato meno fluido, dall’altra (ad alte concentrazioni) impedisce l’impaccamento e quindi la cristallizzazione Table 10-1. Approximate Lipid Compositions of Different Cell Membranes PERCENTAGE OF TOTAL LIPID BY WEIGHT LIPID LIVER CELL RED BLOOD MYELIN MITOCHONDRION ENDOPLASMIC E. COLI PLASMA CELL (INNER AND RETICULUM BACTERIUM MEMBRANE PLASMA OUTER MEMBRANE MEMBRANES) Cholesterol 17 23 22 3 6 0 Phosphatidylethanolamine 7 18 15 25 17 70 Phosphatidylserine 4 7 9 2 5 trace Phosphatidylcholine 24 17 10 39 40 0 Sphingomyelin 19 18 8 0 5 0 Glycolipids 7 3 28 trace trace 0 Others 22 13 8 21 27 30 Batteri: Eucarioti: quasi un solo tipo di fosfolipide, non c’è colesterolo composizione variata, alto livello di colesterolo La membrana cellulare contiene “zattere” ipidiche (Lipid Rafts) che sono ricche in sfingolipidi, colesterolo e alcuni tipi di proteine Nella maggior parte dei casi vari tipi di lipidi si alternano in modo casuale nello strato. In presenza di sfingolipidi (e in in genere di lipidi con code lunghe e sature) è favorita la formazione di microdomini (lipid rafts) di dimensioni ~70nm in diametro. Poichè i lipidi concentrati nei lipid rafts sono più lunghi e più dritti, i rafts costituiscono zone più spesse della membrana dove sono meglio accolte alcune proteine Si ritiene che i lipid rafts aiutino a concentrare spazialmente queste proteine per permettere loro di lavorare in concerto. La maggior parte dei lipidi appartenenti ad un mono-strato si muovono in modo indipende dai loro partners sull’altro mono-strato. Nei lipid rafts, invece, le lunghe code dei lipidi interagiscono da uno strato all’altro. Modello di lipid rafts nella rete collegata all’apparato di Golgi Glicosfingolipidi e colesterolo sono ritenuti fomare rafts nel doppio strato. Proteine con segmenti trans-membrana sufficientemente lunghi preferiscono risiedere nei lipid rafts e questo provoca la loro segregazione per il trasporto in vescicole. Proteine che legano carboidrati (lectina) possono aiutare a stabilizzare i rafts. La asimmetria del doppio strato è funzionalmente importante Esempio: distribuzione dei lipidi nel doppio strato lipidico nei globuli rossi umani fosfatidiletanolamina fosfatidilserina sfingomielina fosfatidilcolina il colesterolo è supposto essere distribuito omogeneamente glicolipidi Fosfatidilserina, carica, nello strato interno significativa differenza di carica tra le due metà del doppio strato Alcuni esempi di utilità dell’asimmetria segnali extracellulari attivano la PI 3-chinasi, che fosforila l’inositol-fosfolipide. Varie molecole segnale intracellulari si legano ai lipidi fosforilati e sono quindi portate sulla membrana dove possono interagire e rilasciare il segnale all’interno della cellula Altri segnali estracellulari attivano le fosfolipasi che tagliano i fosfolipidi. I frammenti di lipidi agiscono poi da molecole segnale per rilasciare il segnale all’interno della cellulal. Siti di taglio delle differenti fosfolipasi. Le fosfolipasi A1 e A2 tagliano i legami esterici, mentre le C e D i legami fosfoesterici. La asimmetria del doppio strato è funzionalmente importante Esempio: distribuzione dei lipidi nel doppio strato lipidico nei globuli rossi umani fosfatidiletanolamina fosfatidilserina sfingomielina fosfatidilcolina il colesterolo è supposto essere distribuito omogeneamente glicolipidi Fosfatidilserina, carica, nello strato interno significativa differenza di carica tra le due metà del doppio strato L’asimmetria viene sfruttata per distinguere le cellule vive da quelle morte Apoptosi (morte programmata) fosfatidilserina (normalmente confinata nel monostrato interno) rapidamente migra in quello esterno fosfatidilserina esposta sulla superficie i macrofagi sono indotti alla fagocitosi La traslocazione della fosfatidilserina nelle cellule apoptotiche avviene via 2 meccanismi 1. 2. Il meccanismo che normalmente trasporta questi lipidi dall’esterno all’interno è bloccato Un meccanismo che trasferisce in modo aspecifico i fosfolipidi nelle due direzioni è attivato I glicolipidi Sono presenti su tutte le membrane con il più alto livello di asimmetria Sono presenti SOLO sul monostrato esterno (non-citosolico) preferibilmente nei lipid rafts. Tendono ad auto-associarsi legami H + forze di van der Waals tra le lunghe code saturate Gli zuccheri sono esposti sulla superficie della cellula ed hanno un ruolo rilevante nell’interazione della cellula con l’ambiente circostante fosfatidiletanolamina fosfatidilserina sfingomielina fosfatidilcolina glicolipidi glicolipidi 5% dei lipidi del monostrato esterno delle membrane cellulari sono presenti anche in alcune membrane intracellulari Il più complesso dei glicolipidi, il ganglioside, contiene degli oligosaccaridi con uno o più residui di acido sialico con una carica negativa glicolipide neutro Sono stati identificati più di 40 diversi gangliosidi Più abbondanti nella membrana delle cellule nervose (5-10% della massa totale di lipidi) Riassumendo 1 Vedi animazione le membrane biologiche consistono di un doppiostrato continuo di molecole lipidiche in cui sono immerse le proteine di membrana. Il doppio-strato si comporta come un fluido Le molecole lipidiche sono anfifiliche, le più numerose sono i fosfolipidi. Quando sono poste in acqua formano spontaneamente compartimenti chiusi e doppi strati Riassumendo 2 Ci sono 3 classi principali di molecole lipidiche: fosfolipidi, colesterolo e glicolipidi La composizione dei monostrati interno ed esterno è diversa e riflette la diversa funzione delle due faccie della membrana Differenti proporzioni di lipidi sono presenti in membrane di diverso tipo come nelle varie membrane di una singola cellula eucariotica Riassumendo 3 Acuni enzimi che legano le membrane richiedono la presenza di specifici gruppi sulla testa dei lipidi Acuni segnalatori estracellulari attivano le fosfolipasi che tagliano molecole selezionate di fosfolipide nella membrana plasmatica e generano frammenti che agiscono da segnali intracellulari Le proteine di membrana Sebbene i lipidi siano l’elemento base delle membrane le proteine svolgono la maggior parte delle funzioni specifiche. Le proteine forniscono alle membrane la loro specificità e, quindi, il tipo e il numero è molto variabile Nella membrana mielinica, che ha principalmente lo scopo di isolare gli assoni, meno del 25% in massa sono proteine. Nelle membrane coinvolte nella produzione di ATP (come la membrana interna dei mitocondri) circa il 75% sono proteine Una tipica membrana plasmatica è per circa il 50% della sua massa formata da proteine. I lipidi sono piccoli rispetto alle proteine 50% in massa 50 lipidi / proteina Proteine diverse sono associate in modo diverso con la membrana Completamente esposte all’esterno attaccate al doppio strato con legami covalenti (specifico oligosaccaride) Le regioni idrofobiche passano attraverso la membrana e interagiscono con le code e le regioni idrofiliche sono esposte all’acqua da entrambi i lati L’idrofobicità è maggiore se vi è attaccato un acido grasso In contatto solo con il cytosol ed associate con il monostrato interno o via un elica anfipatica o con una o più catene lipidiche covalentemente legate (acidi grassi o gruppi prenile*) Non interagiscono direttamente con il doppio strato, ma via legami non covalenti con altre proteine di membrana Prenolo (contrazione: alcool + isoprenoide) Si chiama estere il derivato della reazione di un alcool con un acido: L’unità C5H8 (in parentesi) è detta residuo isoprene. I prenoli sono i precursori di una varietà di composti tra cui gli steroidi, anche noti come isoprenoidi. R-COOH + R'-OH R-C=O-OR' Prenili Esteri e loro derivati. (prenil difosfati, ecc.) Il modo in cui una proteina si associa con la membrana riflette la sua funzione parte del centro di reazione di un batterio fotosintetico Una proteina transmembrana ha sempre un’unica orientazione nel doppio strato sintesi e inserzione asimmetriche differenti funzioni dei suoi domini citosolico e non-citosolico Nella maggior parte dei casi le proteine attraversano la membrana formando eliche legami peptidici polari legami H interni alla catena peptidica acqua assente dal doppio-strato proteine a molte eliche (vedi es 3) # max di legami H elica regolare Indice di idropatia: predizione dei tratti di a -elica transmembrana Valori positivi: idrofobici Valori negativi: idrofilici A= glicoproteina un singolo tratto a transmembranico B= batteriorodopsina 7 tratti a transmembranici C = frazione di proteine di membrana predette per E. coli, S. cerevisiae, e uomo. b barrels con un differente numero di b strands b-barrel (# b-strands: 8 22 ) più rigide delle a-eliche migliore cristallizzazione sono note varie strutture X abbondanti in mitocondri, cloroplasti ed in molti batteri; la maggior parte delle proteine transmembrana negli eucarioti è fatta di a-elica più flessibili cambiamenti nella disposizione più facili apertura e chiusura dei canali porine pori per far passare soluti le catene laterali polari all’interno, non-polari in interazione con le code del doppio-strato proteine di trasporto Fe attraverso la membrana esterna di un batterio 22 b-barrel + un dominio globulare Recettore di enzimi b-barrel usato come ancora per le proteina La gran parte delle proteine transmembrana nelle cellule animali sono glicosilate Le catene oligosaccaridi sono sempre nella parte non citosolica Il citosol è in genere un ambiente riducente questo diminuisce le probabilità che ci siano ponti S-S nella regione citosolica I ponti S_S si formano nella parte non-citosolica dove stabilizzano la struttura Le proteine transmembrana possono essere solubilizzate solo con detergenti (piccole molecole anfipatiche che fomano micelle in acqua) la parte idrofobica del detergente lega la parte idrofobica della proteina staccandola dai lipidi Poichè l’altra parte del detergente è polare, la proteina tende ad andare in soluzione e alcune molecole di lipide possono rimanere attaccate La parte polare del detergente può essere carica o no SDS è un detergente forte (solubilizza anche la proteina più idrofobica) denaturazione (spesso) ad opera del legame con il loro core idrofobico a volte si rinatura dopo rimozione del detergente Molte proteine possono essere solubilizzate con un detergente più leggero come il Triton X-100 e rimanere funzionali Pompa Na+-K+ funzionale: purificata e incorporata in vescicole di fosfolipidi. Presente nella maggior parte delle cellule animali, usa l’idrolisi dell’ATP per pompare Na+ fuori e K+ dentro la cellula La membrana cellulare dei globuli rossi è la più studiata di quelle eucariotiche reperibili in numero elevato relativamente pure la membrana plasmatica è la sola presente (non c’è nucleo, nè altri organelli) (in altre cellule la membrana plasmatica è meno del 5%) Micrografia a scansione elettronica di globuli rossi umani Forma biconcava; assenza di nucleo e altri organelli E’ facile preparare globuli rossi vuoti ("ghosts“): cellule in un mezzo con una concentrazione di sale minore di quella all’interno della cellula lisi l’emoglobina e le altre proteine citosoliche escono Le membrane dei ghosts possone essere studiate aperte o risaldate Durante la risaldatura si possono anche preparare vescicole inverse Come si determina da che parte “sporgono” le proteine transmembrana? Si attaccano covalentemente reagenti (radioattivi o fluorescenti) che non penetrano la membrana solubilizzazione con SDS autoradiografia o fluorescenza proteina transmembrana: etichetta sia all’esterno (nelle cellule intatte o nei ghosts saldati) che all’interno (nelle vescicole inverse) Esposizione di interno ed esterno ad enzimi proteolitici che non penetrano la membrana proteina transmembrana: digerita da entrambi i lati A. Colorazione con Coomassie blue B. Posizione delle principali proteine nel gel Glicoporina in rosso la grande quantità di carboidrati carichi negativamente la fa migrare lentamente come le proteine più grandi della banda 3 Ci sono circa 15 bande principali per un peso molecolare che va da 15000 a 250000 daltons. Tre proteine: spettrina, glicoproteina e banda 3 sono più del 60% (in peso) del totale delle proteine e ognuna di loro è disposta in modo differente nella membrana elettroforesi su gel di poliacrilamide con SDS delle proteine di membrana nei globuli rossi umani La maggior parte delle proteine di membrana associate con i globuli rossi sono legate dalla parte del citosol Spettrina ( 25% in massa proteine membrana 2.5 × 105 copie per cellula): filamento sottile (100 nm) Mantiene la forma biconcava delle cellule Eterodimero: 2 subunità simili, associate testa-testa per fomare un tetramero Le code di 4 o 5 tetrameri collegate da link con filamenti di actina ed altre proteine del citoscheletro Risultato finale: una rete flessibile che si estende su tutta la superficie citosolica della membrana che permette alle cellule di passare attraverso la strettoia dei capillari Individui (topi e uomini) anemici con anormalità nel gene della spettrina hanno cellule sferiche e fragili Ciascun eterodimero è formato da 2 catene polipeptidiche controavvolte attaccate non covalentemente tra loro in punti multipli Le teste fosforilate dove i dimeri si associano per formare il tetramero Le catenea e b sono composte in prevalenza di domini ripetuti di 106 amino acidi I dimeri di spettrina sono connessi da complessi formati da filamenti di actina (13 monomeri), adducina, e una molecola di tropomiosin Il citoscheletro è collegato alla membrana con un legame indiretto del tetrametro di spettrina ad alcune proteine della banda 3 via molecole di anchirina, o con quelle della banda 4.1 via glicoproteine Elettromicrografia del citoscheletro dal lato citosol La densità della rete di spettrina è appositamente diminuita per rendere visibili i dettagli: in una cellula normale è molto più densa La Batteriorodopsina è uno degli elementi del trasduttore di energia solare che fornisce energia ai batteri movie E’ una proteina transmembrana ad attraversamento multiplo (7 catene). Ciascuna molecola contiene un cromoforo (retinale). Il retinale è identico al cromoforo della rodopsina (vitamina A) Il retinale è legato covalentemente ad una lisina. Cromoforo eccitato da un singolo fotone cambiamento di forma piccoli cambiamenti conformazionali nella proteina trasferimento di un H+ da dentro a fuori della cellula. Trasferimento di protoni gradiente di H+ attraverso la membrana produzione di ATP da parte di una seconda proteina di membrana Canale per il potassio Esempio di Proteine di Membrana in complesso: Il centro di reazione fotosintetico batterico Struttura X: Il complesso consiste di quattro subunità: L, M, H, e un citocromo. Le subunità L e M formano il core del centro di reazione, ciascuna contiene 5 eliche a che attraversano il doppio strato. La localizzazione dei vari coenzimi di trasporto è mostrata in nero. Le proteine , come i lipidi, non cambiano strato (flip-flop) ma ruotano intorno ad un asse perpendicolare al piano del doppio strato (diffusione rotazionale) e molte sono anche in grado di muoversi lateralmente (diffusione laterale). La prima diretta evidenza della mobilità delle proteine di membrana è venuta da un esperimento dove le cellule di topo sono state artificialmente fuse con quelle umane per ottenere cellule ibride (eterocarioni). Sono stati usati due anticorpi etichettati diversamente per distinguere le proteine umane da quelle di topo. All’inizio i due tipi di proteine sono confinate nella loro metà in circa mezz’ora diffondono lateralmente e si mescolano le une con le altre La velocità di diffusione (laterale) si misura con 1. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) La proteina è marcata con un gruppo fluorescente (anticorpi con ligante fluorescente o DNA ricombinante che esprime la proteina fusa con la “green fluorescent protein, GFP). Il gruppo fluorescente è “sbiancato” (bleached) con un laser in una piccola area e si misura il tempo impiegato dalle forme unbleached a ripristinare il segnale nell’area (=tempo di diffusione) 2. FLIP ( fluorescence loss in photobleaching) Un laser irradia continuamente una piccola area ammazzando progressivamente il segnale totale I valori di diffusione per proteine differenti sono molto diversi a causa dell’interazione con altre proteine. La misura della velocità di diffusione per proteine “libere” indica che le membrane cellulari hanno una viscosità che è circa quella dell’olio di oliva 8 October 2008 The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the Nobel Prize in Chemistry for 2008 jointly to Osamu Shimomura, Marine Biological Laboratory (MBL), Woods Hole, MA, USA and Boston University Medical School, MA, USA, Martin Chalfie, Columbia University, New York, NY, USA Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP". See movie