FoxP1 (SP133) - Menarini Diagnostics
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FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody Identificazione Prodotto N° Catalogo 44602 44603 44290 Descrizione FOXP1 0,1 R (SP133) FOXP1 1 R (SP133) FOXP1 RTU R (SP133) Definizione Dei Simboli P pronto uso C concentrato A asciti E siero S supernatante DIL DOC# DIS range di diluizione di concentrato numero documento distribuito da Finalità D’Uso Questo anticorpo è destinato per l’uso diagnostico in vitro (IVD). Anticorpo FoxP1 è indicato per i laboratori qualificati per l’identificazione qualitativa tramite microscopio ottico della presenza di antigeni associati in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina utilizzando metodi di test IHC (immunoistochimici). L’uso di questo anticorpo è indicato, a seguito di una diagnosi patologica differenziale su base clinica, come ausilio all’identificazione e alla sottoclassificazione di linfomi diffusi a grandi cellule B nel contesto di pannelli anticorpali, dell’anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici sottoposti alla valutazione di un patologo qualificato. Sommario E Spiegazione I linfomi diffusi a cellule B grandi (DLBCL), sebbene siano considerati una singola categoria nella classificazione dell’Organizzazione mondiale della sanità, rappresentano molto probabilmente entità clinicopatologiche diverse, difficili da separare con una tecnica standard1,2. Dal punto di vista clinico, l’introduzione dell’immunochemioterapia nel trattamento dei DLBCL ha migliorato in modo significativo i risultati per i pazienti, rispetto alla sola chemioterapia3,4. Tuttavia, quasi un terzo di questi pazienti diventa refrattario o presenta ricadute5. Per questi motivi, è molto importante individuare e stratificare fattori biologici e/o clinici per quei pazienti che presentano rischi elevati di ricaduta. Studi sulla profilazione dell’espressione genica (GEP) hanno dimostrato che un linfoma diffuso a cellule B grandi (DLBCL) può essere diviso in modo riproducibile nei sottotipi prognosticamente importanti di cellule tipo B di centro germinativo (GCB), cellule di tipo B attivate (ABC) e non classificate DLBCL.2,6,7 Se trattate con un regime contenente ciclofosfamide, doxorubicina, vincristina e prednisone (CHOP) o altri regimi del tipo CHOP (trattati con CHOP), i pazienti con GCB-DLBCL hanno una maggiore sopravvivenza indipendentemente dall’Indice prognostico internazionale.3-5,8 Il valore prognostico della classificazione GEP rimane significativo per i pazienti DLBCL trattati con rituximab più terapia CHOP o tipo CHOP (trattati con R-CHOP).8 I sottotipi GCB e ABC hanno meccanismi patogenetici diversi che impatteranno lo sviluppo di terapie mirate.6 Altri studi GEP hanno caratterizzato anche il linfoma mediastinale primario a cellule B grandi (PMBL) come distinto rispetto ad altri sottotipi di DLBCL e con una buona prognosi, simile al GCB-DLBCL.9 Nonostante la solidità dei GEP nella sottoclassificazione dei DLBCL, le tecniche GEP non sono applicabili alla pratica clinica di routine a causa del tempo rilevante, della competenza tecnologica e risorse necessarie che sono scarse. Perciò, è utile che l’applicazione traslazionale della classificazione GEP nell’espressione proteica da parte di cellule tumorali venga sviluppata attraverso la colorazione immunoistochimica (IHC) di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. Recentemente, sono stati sviluppati approcci diversi mediante algoritmi immunofenotipici con piccoli pannelli di biomarcatori di anticorpi per tradurre le solide informazioni di studi molecolari in una piattaforma clinica di routine.10-14 È stato utilizzato un pannello di anticorpi, CD10, BCL6, MUM1/IRF4, GCET1, FoxP1, LMO2 e BCL2, per determinare l’origine dei GCB o dei non-GCB e ciascun algoritmo ha diverse soglie percentuali di colorazione positiva.10-14 Nell’algoritmo di Colomo10, il DIS A.Menarini Diagnostics S.r.l. Via Sette Santi, 3 50131 Firenze Italy DOC# MEN35031000 IT Rev. 0,0 Cell Marque Corporation 6600 Sierra College Blvd Rocklin California 95677 USA EMERGO EUROPE Molenstraat 15, 2513 BH The Hague NL FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody fenotipo non-GCB è stato stabilito se MUM1/IRF4 era positivo (≥ 25% di cellule tumorali). I casi negativi per MUM1/IRF4 e positivi (≥ 25% di cellule tumorali) per CD10 erano considerati il fenotipo di GCB. Anche i casi negativi per MUM1/IRF4 e CD10 e positivi per BCL6 (≥ 25% di cellule tumorali) sono stati assegnati al gruppo di GCB. Infine, i casi negativi per i 3 marcatori sono stati considerati non classificati.10 Nell’algoritmo di Hans11, i tumori sono stati assegnati al fenotipo GCB ed erano positivi CD10 (≥ 30% di cellule tumorali) da solo o CD10 e BCL6 (≥ 30% di cellule tumorali). Se erano negativi sia CD10 sia BCL6, il caso veniva considerato di origine non GCB. Se entrambi BCL6 erano positivi e MUM1/IRF4 (≥ 30% di cellule tumorali) era positivo, al caso veniva assegnata un’origine non GCB, mentre se MUM1/IRF4 era negativo (< 30% di cellule tumorali), il caso veniva assegnato al fenotipo GCB.11 L’algoritmo Hans mostrava un’elevata concordanza con i risultati GEP (86%).11 Secondo l’algoritmo di Muris12, i casi positivi (≥ 30% di cellule tumorali) per CD10 venivano assegnati al fenotipo GCB. I casi negativi per CD10 venivano differenziati secondo l’espressione di MUM1/IRF4 (≥ 30% di cellule tumorali) nel fenotipo ABC o GCB. In seguito è stata utilizzata la colorazione BCL2 per separare 2 diversi gruppi pronostici (1 e 2).12 Le 2 fasi dell’algoritmo di Muris sono state utilizzate per valutare lo stato del GCB rispetto quello dell’ABC ed è stato applicato l’impatto pronostico degli algoritmi.12 Anche se l’algoritmo di Muris presentava un’elevata concordanza con i risultati GEP, esso presentava un basso livello di sensibilità e di specificità. L’algoritmo di Choi13 dimostrava che i casi positivi per il GCET1 (≥ 80% di cellule tumorali) e per il MUM1/IRF4 (≥ 80% di cellule tumorali) e/o per il FoxP1 (≥ 80% di cellule tumorali) o negativi per il CD10 e il BCL6 (≤ 30% di cellule tumorali) venivano assegnati al gruppo non GCB. II casi positivi per il CD10 (≥ 30% di cellule tumorali), il GCET1 (≥ 80% di cellule tumorali) senza espressione di MUM1, o positivi per il BCL6 senza espressione di FoxP1 venivano classificati come GCB.13 Questo studio ha indicato l’importanza del FoxP1 nella sottoclassificazione dei DLBCL. Choi et al hanno quindi modificato il loro approccio alla sottoclassificazione dei DLBCL focalizzandosi sul FoxP1. Il tumori che erano positivi per FoxP1 e GCET1 sono stati assegnati al sottogruppo GCB, ma se FoxP1 era positivo e GCET1 negativo, i tumori appartengono al fenotipo ABC. Nel caso in cui FoxP1 sia negativo ma MUM-1/IRF4 sia positivo, esso appartiene comunque al fenotipo ABC finché non viene espresso il CD10. Questo metodo modificato sottolinea il ruolo di FoxP1, MUM1/IRF4 e di GCET1 nella sottoclassificazione dei DLBCL.15 L’algoritmo di Choi presentava una concordanza molto elevata con i risultati GEP (87%).13, 15 Nella classificazione modificata di Nyman delle cellule tipo B attivate 14, i casi di espressione di MUM1/IRF4 o FoxP1 venivano considerati appartenenti al sottogruppo ABC e il resto dei casi veniva assegnato al sottotipo GCB. Nell’algoritmo di Tally recentemente descritto15, il metodo comprendeva un numero uguale di marcatori GCB (GCET1 e CD10) e di marcatori di non-GCB (FoxP1 e MUM1/IRF4). Questo algoritmo è stato formulato a partire dalla coppia di immunotipi con un numero maggiore di antigeni positivi. Poiché per ciascun tipo vengono utilizzati due anticorpi, l’antigene LMO2 determina il fenotipo (GCB o nonGCB) quando il punteggio è uguale nelle due categorie.15 Di questi algoritmi pubblicati, quello di Choi è il più predittivo dei risultati GEP e della sopravvivenza, ma è il meno semplice. Esso richiede l’utilizzo di cinque anticorpi, due dei quali non sono comunemente utilizzati nella maggior parte dei laboratori immunoistochimici (GCET1 e FoxP1). Le immunocolorazioni per BLC6 sono tecnicamente difficili da eseguire e da interpretare.11 Oltre a questi problemi, l’algoritmo Choi utilizza vari cutoff per la determinazione della positività degli anticorpi e richiede un’interpretazione sequenziale dei risultati. Un tentativo di affrontare alcuni di questi punti problematici ha portato all’esame di due ulteriori algoritmi. A causa dei problemi creati dal BCL6, è stato rimosso dall’algoritmo Hans, con la conseguente creazione di un nuovo algoritmo Hans*). La capacità generale dell’algoritmo di Hans* di predire la cellula di origine e la sopravvivenza era simile a quella dell’algoritmo di Hans originale. Questa minore differenza nella capacità di prognosi viene controbilanciata dalla facilità d’uso dell’algoritmo di Hans modificato. La rimozione del BCL6 dall’algoritmo di Choi, la risistemazione dell’ordine dell’esame di anticorpi e la standardizzazione della positività (il 30% delle cellule tumorali) ha prodotto un nuovo algoritmo (Choi*) più facile da utilizzare dell’originale e con una capacità simile di predire la cellula di origine e l’EFS. La predizione di OS, anche se statisticamente significativa, era leggermente calata, se paragonata all’algoritmo originale; tuttavia questa diminuzione era compensata dalla facilità d’uso. Tutti gli algoritmi hanno una caratteristica simile: alcuni anticorpi hanno la precedenze su altri per l’ordine di esame. Rimuovendo l’ordine di esame e valutando i risultati di quattro anticorpi selezionati, è stato creato un algoritmo di Tally. Questo algoritmo di Tally comprende gli antigeni GCB specifici CD10 e GCET1 e gli antigeni ABC specifici MUM1 e FoxP1. L’antigene GCB specifico LMO2 viene utilizzato solo come elemento risolutivo per la classificazione del tumore. L’algoritmo di Tally mostra una migliore capacità di predire la cellula di origine di qualsiasi altro algoritmo esaminato in questo studio. Esso divide anche i pazienti con DLBCL in due gruppi con OS ed EFS significativamente diversi. Anche se l’algoritmo di Tally è il migliore nella predizione della cellula di origine, anch’esso ha qualche inconveniente. Innanzitutto, richiede l’utilizzo di tre anticorpi comunemente in commercio ma non comunemente utilizzati in molti laboratori immunoistochimici: GCET1, FoxP1 e LMO2. In secondo luogo, l’interpretazione di GCET1, FoxP1 e LMO2 può essere problematica, dal momento che alcuni tumori evidenziano un elevato sfondo o una colorazione non specifica. Perciò, FoxP1 è utile nella classificazione dei DLBCL ed è necessario un elevato cutoff (≥80%) per FoxP1 per ottenere un’elevata specificità per il sottotipo ABC. Principi E Procedure L’anticorpo primario citato può essere utilizzato quale anticorpo primario per la colorazione immunoistochimica delle sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. In generale, la colorazione immunoistochimica insieme al sistema di rilevazione biotina-streptavidina consente la visualizzazione degli antigeni tramite l’applicazione sequenziale di un anticorpo specifico (anticorpo primario) all’antigene, di un anticorpo secondario (anticorpo di collegamento) all’anticorpo primario, un complesso enzimatico e un substrato cromogeno con fasi di lavaggio interposte. In alternativa può essere utilizzato un sistema di rilevamento privo di biotina. L’attivazione enzimatica del cromogene causa la produzione di una reazione visibile sul sito dell’antigene. Il campione può essere quindi contro colorato ed è possibile applicarvi del copri vetrino. I risultati vengono interpretati utilizzando un microscopio ottico e consentono la diagnosi differenziale dei processi pato-fisiologici, associabili o meno a un particolare antigene. I prodotti prediluiti sono diluiti in modo ottimale per l’uso con un’ampia varietà di kit di rivelazione offerti da altri produttori. 2 MEN Template #0.2 FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody Materiali E Metodi 12. Ematossilina o altro contro colorante Per i dettagli specifici dei lotti dei seguenti, fare riferimento all’etichetta del prodotto: 14. Blocco perossido per uso con HRP 1. 13. Diluenti di anticorpi 15. Blocco avidina-biotina Concentrazione di immunoglobulina dell’anticorpo 16. Reagente di controllo negativo 2. Dettagli sull’origine 17. Soluzione montante 18. Copri vetrino Reagenti Forniti 19. Microscopio ottico (40-400x) Prediluito Il prodotto anticorpo primario citato contiene il reagente pronto per l’uso. Conservazione E Manipolazione Conservare a 2-8 °C. Non congelare. Il tasso di concentrazione di immunoglobuline prediluite per questo prodotto è di 2,5-10 µg/ml. Per garantire un’erogazione adeguata di reagente e la stabilità dell’anticorpo dopo ciascuna analisi, riposizionare il tappo e riporre immediatamente il flacone in frigorifero in posizione verticale. Concentrato Il prodotto anticorpo primario citato contiene reagente concentrato. Ogni reagente di anticorpi è provvisto di data di scadenza. Se conservato adeguatamente, il reagente resta stabile fino alla data indicata sull’etichetta. Non utilizzare il reagente oltre la data di scadenza relativa al metodo di conservazione indicato. Sia il formato prediluito sia quello concentrato di questo anticorpo sono diluiti in Tampone Tris, pH 7,3-7,7, con BSA 1% e azoturo di sodio <0,1%. Il tasso di concentrazione di immunoglobulina concentrata per questo prodotto è di 125-375 µg/ml. Non vi sono segni evidenti che indichino l’instabilità di questo prodotto. Pertanto, è consigliabile eseguire contemporaneamente controlli positivi e negativi sui campioni da testare. Contattare il Servizio Clienti A.Menarini Diagnostics in caso di segni sospetti d’instabilità del reagente. La gamma operativa di diluizione raccomandata per il prodotto concentrato è di 1:100-1:500 e si trova sull’etichetta del prodotto. Isotipo: IgG Prelievo Di Campioni E Preparazione Per L’Analisi Ricostituzione, Miscelazione, Diluizione, Titolazione L’anticorpo prediluito è pronto all’uso e ottimizzato per la colorazione. Non è necessaria alcuna ricostituzione, miscelazione, diluizione o titolazione. L’anticorpo concentrato è ottimizzato per essere diluito entro il range di diluizione. I tessuti ordinariamente trattati, fissati in formalina tamponati neutri, inclusi in paraffina sono adatti all’uso con questo anticorpo primario. Il fissativo consigliato per i tessuti è formalina neutra tamponata al 10%. È possibile che si ottengano risultati variabili dovuti a processi di fissaggio prolungati o speciali come la decalcificazione di preparati di midollo osseo. L’utente deve convalidare la diluizione operativa del prodotto concentrato. Differenze nelle procedure tecniche e nel trattamento del tessuto in laboratorio possono produrre importanti variabilità nei risultati e richiedere di conseguenza l’uso regolare di controlli (fare riferimento alla sezione Procedure di controllo della qualità). Ogni sezione va tagliata per garantire uno spessore adeguato (circa 3 μm) e posizionata su un vetrino con carica positiva. I vetrini contenenti la sezione di tessuto possono essere cotti per almeno 2 ore (ma non oltre le 24 ore) in un forno a una temperatura di 58-60 °C ± 5 °C. Materiali E Reagenti Necessari Ma Non Forniti Avvertenze E Precauzioni I seguenti reagenti e materiali possono essere necessari per la colorazione ma non sono forniti con l’anticorpo primario: 1. 1. 2. Evitare il contatto di reagenti con occhi e membrane di mucose. Se i reagenti vengono a contatto con aree sensibili, lavare con abbondante acqua corrente. Tessuto di controllo positivo e negativo 2. Vetrini per microscopio, caricati positivamente 3. Forno per essicazione in grado di mantenere una temperatura di 5860 °C ± 5 °C 3. 4. Ampolle o bagni di colorante 5. Timer Etanolo o alcool reagente 8. Acqua deionizzata o distillata 9. Pentola a pressione elettrica per la fase di pretrattamento del tessuto 5. L’utente è tenuto a convalidare i tempi di incubazione e le temperature. 10. Sistema di rilevamento e cromogeno 11. Soluzioni per lavaggio 3 MEN Template #0.2 I campioni dei pazienti e tutti i materiali che entrano a contatto con loro devono essere manipolati come materiali a rischio biologico e smaltiti con adeguate precauzioni. Non pipettare mai con la bocca. 4. Evitare la contaminazione microbica di reagenti, per non causare risultati scorretti. 6. Xilene o sostituto di xilene 7. Manipolando i reagenti adottare ragionevoli precauzioni. Quando si manipolano materiali sospetti carcinogeni o tossici (ad esempio xilene) servirsi di guanti monouso e di grembiuli di laboratorio. FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody 6. I reagenti prediluiti, pronti all’uso sono stati diluiti in modo ottimale e un’ulteriore diluizione può causare una perdita di colorazione antigenica. 7. I reagenti concentrati possono essere diluiti in modo ottimale in base alla convalida dell’utente. Qualsiasi diluente utilizzato non specificatamente raccomandato da questo documento deve essere quindi convalidato dall’utente sia per la compatibilità sia per l’effetto sulla stabilità. 8. Se utilizzato secondo le istruzioni il prodotto non è classificato come sostanza pericolosa. Il conservante nel reagente è azoturo di sodio in misura inferiore allo 0,1% e alle concentrazioni dichiarate non soddisfa i criteri UE REACH (registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche) per le sostanze pericolose. Procedure Di Controllo Della Qualità Controllo Positivo Del Tessuto È necessario effettuare un controllo positivo del tessuto per ciascuna procedura di colorazione eseguita. Il tessuto può contenere sia cellule che componenti con colorazione positiva e negativa e serve sia come tessuto di controllo positivo che negativo. I tessuti di controllo devono provenire da un’autopsia recente, da una biopsia o da campioni chirurgici preparati o fissati prima possibile, in modo identico alle sezioni da esaminare. L’uso di una sezione di tessuto fissata o trattata diversamente dai campioni da esaminare, servirà per fornire un controllo di tutti i reagenti e le fasi del metodo, eccetto il fissaggio e il trattamento del tessuto. 9. L’utente deve convalidare qualunque condizione di conservazione diversa da quelle specificate nel foglietto illustrativo. Un tessuto con una colorazione positiva debole è più indicato per effettuare un controllo ottimale della qualità e per rilevare livelli minori di degradazione del reagente. Il controllo tissutale positivo per l’anticorpo primario citato, può comprendere quanto segue: 10. Il diluente può contenere albumina di siero bovino e il supernatante può contenere siero bovino. I prodotti contenenti siero bovino fetale e i prodotti contenenti albumina di siero bovino vengono acquistati presso fornitori commerciali. I certificati di origine della sorgente animale utilizzata in questi prodotti sono nell’archivio di Cell Marque. I certificati sostengono che le origini bovine provengono da Paesi che presentano un rischio trascurabile di BSE e dichiarano che le origini bovine sono statunitensi e canadesi. Controllo Positivo Del Tessuto 11. Come per qualsiasi prodotto derivato da sorgenti biologiche, è necessario seguire procedure corrette di manipolazione. Procedura Passo-Passo Se si utilizza un sistema di rilevamento HRP, collocare i vetrini in un bloccante perossido per 10 minuti, quindi sciacquare. Se si utilizza un sistema di rilevamento AP, saltare questo passaggio. 3. Applicare l’anticorpo e incubare per 10 - 30 minuti, quindi sciacquare. Discrepanze Inspiegabili Segnalare immediatamente all’assistenza clienti di A.Menarini Diagnostics tutte le discrepanze inspiegabili rilevate nei controlli. Se i risultati del controllo di qualità non soddisfano le specifiche, i risultati del paziente non sono validi. Vedere la sezione Risoluzione dei problemi di questo inserto. In tal caso, è necessario identificare e correggere il problema e ripetere l’intera procedura con i campioni del paziente. 4. Per la rivelazione del polimero in 2 fasi, il sistema applica l’amplificatore in base alle istruzioni del produttore 5. Applicare il reagente di rivelazione per il numero di minuti raccomandato dal produttore, quindi sciacquare. 6. Applicare una quantità generosa di cromogeno e incubare per 1 - 10 minuti, quindi sciacquare. 7. Disidratare e applicare il vetrino coprioggetto. Nucleare Per il controllo negativo del tessuto, è possibile impiegare lo stesso tessuto utilizzato per il controllo positivo del tessuto. La varietà di tipi di cellule presenti nella maggior parte delle sezioni dei tessuti forniscono siti di controllo negativi, che devono essere tuttavia verificati dall’utente. I componenti che non si colorano devono dimostrare l’assenza di colorazione specifica e fornire un’indicazione sulla colorazione di fondo non specifica. Se è presente una colorazione specifica nei siti di controllo negativi del tessuto, i risultati con i campioni del paziente devono essere considerati non validi. Colorazione Manuale 2. Nucleare Linfonodo Controllo Negativo Del Tessuto Protocollo di colorazione raccomandato per l’anticorpo primario citato: Deparaffinizzazione, reidratazione e recupero dell’epitopo; il metodo preferito è l’utilizzo delle tecniche di smascheramento termoindotto dell’epitopo (HIER, Heat Induced Epitope Retrieval). Il metodo preferito consente nello stesso tempo la deparaffinizzazione, la reidratazione e il recupero dell’epitopo. Al termine, sciacquare 5 volte con acqua distillata o deionizzata. Visualizzazione Tonsilla Utilizzare i controlli positivi noti solo per monitorare le adeguate prestazioni dei tessuti trattati e dei reagenti del test, non come aiuto per formulare una diagnosi specifica dei campioni del paziente. Se i controlli positivi del tessuto non si colorano positivamente in modo adeguato, i risultati con i campioni da esaminare devono essere considerati non validi. Istruzioni Per L’uso 1. Tessuto Reagente Di Controllo Negativo È necessario eseguire un controllo negativo del reagente per ciascun campione per riuscire a interpretare meglio i risultati. Per valutare colorazioni non specifiche viene utilizzato un controllo negativo del reagente invece dell’anticorpo primario. Il vetrino dovrà essere trattato con controllo negativo del reagente, abbinandosi alle specie ospiti dell’anticorpo primario e avendo idealmente la stessa concentrazione 4 MEN Template #0.2 FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody di IgG. Il periodo di incubazione del reagente di controllo negativo deve essere uguale a quello dell’anticorpo primario. 1. Questo reagente è esclusivamente per uso professionale dal momento che l’immunoistochimica è un processo a fasi multiple che richiede una formazione specialistica per la scelta adeguata di reagenti, tessuti, fissaggio, trattamenti; della preparazione del vetrino per immunoistochimica e dell’interpretazione dei risultati di colorazione. Interpretazione Dei Risultati La procedura di immunostaining causa la precipitazione di un prodotto di reazione colorato ai siti antigenici localizzati dall’anticorpo primario. Fare riferimento al foglietto illustrativo del sistema di rilevamento per reazioni del colore previsto. È opportuno che un patologo qualificato esperto in procedure immunoistochimiche valuti i controlli su tessuti positivi e negativi prima di interpretare i risultati. Ad uso esclusivo di laboratorio. 3. Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. 4. La colorazione del tessuto dipende dalla manipolazione e dal trattamento precedenti del tessuto. Fissaggio inadeguato, congelamento, scongelamento, lavaggio, asciugatura, riscaldamento, sezionamento o contaminazione con altri tessuti o fluidi possono produrre artefatti, l’intrappolamento dell’anticorpo o risultati falsonegativi. Variazioni nel fissaggio e nei metodi di inclusione, come anche le irregolarità intrinseche del tessuto possono provocare risultati non uniformi. Controllo Positivo Del Tessuto Esaminare prima il controllo positivo del tessuto colorato per determinare se tutti i reagenti funzionano correttamente. La presenza di un prodotto di reazione con colorazione appropriata nelle cellule target indica una reattività positiva. Fare riferimento al foglietto illustrativo del sistema di rilevamento per reazioni del colore previsto. A seconda della durata del periodo di incubazione e della potenza dell’ematossilina utilizzata, la contro colorazione darà luogo ad una colorazione da azzurro chiaro a blu scuro nei nuclei delle cellule. Una contro colorazione eccessiva o incompleta può compromettere l’interpretazione corretta dei risultati. Se il controllo positivo del tessuto non si colora positivamente, i risultati con i campioni da esaminare sono considerati non validi. 5. Una contro colorazione eccessiva o incompleta può compromettere l’interpretazione corretta dei risultati. 6. L’interpretazione clinica di ogni colorazione positiva, o della sua assenza, deve essere valutata in un contesto anamnestico, morfologico e di altri criteri istopatologici, oltre che di altri test diagnostici. Questo anticorpo è destinato a essere utilizzato in un pannello di anticorpi, secondo il caso. Spetta al patologo qualificato assicurarsi di conoscere adeguatamente gli anticorpi, i reagenti, i pannelli diagnostici e i metodi utilizzati per produrre la preparazione colorata. È necessario eseguire la colorazione in un laboratorio certificato e autorizzato sotto la supervisione di un patologo responsabile della revisione dei vetrini colorati che garantisca l’adeguatezza dei controlli positivi e negativi. Controllo Negativo Del Tessuto Dopo il controllo positivo del tessuto, è necessario esaminare quello negativo per verificare la marcatura specifica dell’antigene target dall’anticorpo primario. L’assenza di colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto conferma l’assenza di reattività crociata tra l’anticorpo e le cellule o i componenti cellulari. Se si nota una colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto, i risultati con i campioni del paziente sono considerati non validi. La colorazione non specifica, se presente, sarà diffusa. Nelle sezioni di tessuto che non sono fissate in maniera ottimale, il tessuto connettivo potrebbe presentare una lieve colorazione sporadica. In questo caso è necessario utilizzare le cellule intatte per interpretare i risultati della colorazione. Le cellule necrotiche o degenerate mostrano una colorazione non specifica. 7. Anticorpi e reagenti pronti all’uso sono forniti in diluizione ottimale per un utilizzo conforme a quanto specificato nelle istruzioni. Qualsiasi deviazione dalle procedure di analisi raccomandate può inficiare i risultati. È indispensabile utilizzare e documentare controlli appropriati. Gli utenti che comunque modificano le procedure di analisi consigliate si assumono ogni responsabilità per l’interpretazione dei risultati. 8. Si forniscono prodotti concentrati in modo che l’utente possa successivamente diluirli in maniera ottimale per l’uso previsto nel rispetto di tecniche di validazione adeguate. Gli utenti sono tenuti a convalidare l’utilizzo di eventuali diluenti diversi da quelli qui raccomandati. Dopo la convalida degli anticorpi primari per l’uso, qualsiasi deviazione dalle procedure di analisi raccomandate può inficiare i risultati previsti. È indispensabile utilizzare e documentare controlli appropriati. Gli utenti che comunque modificano le procedure di analisi consigliate si assumono ogni responsabilità per l’interpretazione dei risultati. Tessuto Del Paziente I campioni del paziente devono essere esaminati per ultimi. L’intensità della colorazione positiva dovrà essere valutata nel contesto di qualsiasi colorazione di fondo del controllo negativo del reagente. Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l’antigene in questione non è stato rilevato, non che l’antigene è assente nelle cellule o nei tessuti esaminati. Un pannello di anticorpi può aiutare nell’identificazione di false reazioni negative (vedere la sezione Sintesi dei risultati previsti). È necessario anche esaminare la morfologia di ciascun campione del tessuto utilizzando una sezione colorata con ematossilina ed eosina durante l’interpretazione dei risultati immunoistochimici. I risultati morfologici del paziente e i dati clinici pertinenti devono essere interpretati da un patologo qualificato. 9. Questo prodotto non è destinato all’uso nella citometria a flusso. 10. I reagenti possono presentare reazioni inattese in tessuti non precedentemente testati. La possibilità di reazioni inattese anche in gruppi di tessuti già testati non può essere eliminata completamente a causa della variabilità biologica dell’espressione dell’antigene in neoplasie o in altri tessuti patologici. In caso di reazioni sospette, inattese documentate, contattare l’assistenza clienti di A.Menarini Diagnostics. 11. I tessuti di persone infette dal virus di epatite B e contenenti antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg) possono evidenziare una colorazione non specifica con perossidasi di rafano. Limitazioni 5 MEN Template #0.2 2. FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody 12. Se utilizzati in fasi di bloccaggio, i normali sieri della stessa origine animale, come l’antisiero secondario, possono causare risultati positivi o negativi falsi a causa dell’effetto degli autoanticorpi o degli anticorpi naturali. Studio Normale (continuato) 14. Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l’antigene in questione non è stato rilevato, non che l’antigene è assente nelle cellule o nei tessuti esaminati. Limitazioni Specifiche 2. Totale di Casi Testato Intestino tenue 1 1 Colon 1 1 Fegato 0 1 Ghiandola salivare 1 1 Cistifellea 1 1 Rene 1 1 Vescica 1 1 Prostata 1 1 Utero 0 1 Tuba di Falloppio 1 1 Uretere 1 1 Cervice 1 1 Muscolo scheletrico 0 1 Muscolo liscio 1 1 Cute 1 1 Nervo periferico 1 1 Mesotelio 0 1 Adipe 0 1 Placenta 1 1 Tessuto 13. È possibile che si ottengano falsi risultati positivi a causa di legami non immunologici di proteine o di prodotti di reazione al substrato. Essi possono anche essere causati dall’attività di pseudoperossidasi (eritrociti), attività di perossidasi endogena (citocromo C) o di biotina endogena (ad esempio: fegato, cervello, seno, rene) in base al tipo di tecnica di immunostaining utilizzata. 1. Casi Positivi I prodotti di anticorpi prediluiti sono ottimizzati come prodotti pronti all’uso. A causa della possibilità di variazione nella fissazione e nel trattamento dei tessuti, potrebbe essere necessario aumentare o diminuire il tempo di incubazione dell’anticorpo primario su campioni singoli. L’anticorpo, se utilizzato in combinazione con sistemi di rilevazione e relativi accessori, rileva antigeni che sopravvivono al normale fissaggio in formalina, al trattamento del tessuto e al sezionamento. Gli utenti che si discostano delle procedure di analisi consigliate sono responsabili per l’interpretazione e la convalida dei risultati, esattamente come in qualsiasi altra circostanza. glomeruli +/- Endotelio + Questo anticorpo colora numerosi tessuti normali, come indicato nella documentazione. Studio Su Tessuto Malato Sintesi Dei Risultati Previsti Casi Positivi Totale di Casi Testato Carcinoma colorettale 18 21 Carcinoma duttale invasivo della mammella 12 23 Linfoma diffuso a grandi cellule B 14 16 Consultare le seguenti tabelle di reattività: Tessuto Studio Normale Tessuto Casi Positivi Totale di Casi Testato Cervello 0 1 Corteccia surrenale 0 1 Ovaia 1 1 Cellule stromali +, epitelio - Pancreas 1 1 Dotti +, cellule dell’isolotto - Paratiroide 1 1 Pituitaria 0 1 Testicolo 0 1 Tiroide 1 1 Seno 0 1 Milza 1 1 Linfociti + Tonsilla 1 1 Cellule basali +, Linfociti + Timo 1 1 Midollo osseo 1 1 Polmone 1 1 Cuore 0 1 Esofago 1 1 Stomaco 1 1 Note Note Questo anticorpo colora tumori, come indicato nella documentazione. Risoluzione Dei Problemi 1. Se il controllo positivo mostra una colorazione più debole del previsto, controllare altri controlli positivi eseguiti durante la stessa colorazione per determinare se il problema dipende dall’anticorpo primario o da uno dei reagenti secondari comuni. Linfociti + 2. Se il controllo positivo è negativo, è necessario controllare altri controlli positivi esaminati durante la stessa analisi per determinare se la causa dipende dall’anticorpo primario o da uno dei reagenti secondari comuni. È possibile che i tessuti siano stati prelevati, fissati o deparaffinizzati in modo inappropriato. Seguire la procedura appropriata per prelevare, conservare e fissare i campioni. Cellule basali + 3. 6 MEN Template #0.2 Note Se si presenta un’eccessiva colorazione di fondo, possono essere presenti livelli elevati di biotina endogena. Una fase bloccante di biotina dovrà essere inclusa a meno che non sia utilizzato un FoxP1 (SP133) Rabbit Monoclonal Antibody 13 sistema di rilevamento privo di biotina; in questo caso la presenza di biotina non rappresenterebbe un fattore che contribuisce alla colorazione di fondo. 14 4. Se non è stata rimossa tutta la paraffina, è necessario ripetere l’operazione di deparaffinazione. 5. Se le sezioni di tessuto ripuliscono il vetrino, controllare i vetrini per accertarsi che siano caricati positivamente. Tra le altre possibilità che potrebbero pregiudicare l’adesione del tessuto vi sono un insufficiente essiccamento della sezione di tessuto sul vetrino prima della colorazione o un fissaggio in formalina neutra non adeguatamente tamponato. Anche lo spessore del tessuto potrebbe essere un fattore che contribuisce. 15 16 Per azioni correttive, fare riferimento alla sezione Procedura passo-passo, o contattare il servizio clienti A.Menarini Diagnostics. 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