COASET™ FVII

COASET™ FVII - 82 1900 63
Il kit va usato per la determinazione dell’attivita’ del fattore VII nel plasma per il rilevamento
di livelli elevati o di un deficit di Fattore VII o ancora per il monitoraggio di pazienti in terapia
sostitutiva.
Principio
Tromboplastina, Ca +
1. FXFVII
2
→ FXa
FXa
→ Peptide + pNA (colore giallo)
2. S-2765
Il metodo si basa su un principio a due fasi. Nella prima fase il fattore X e’ attivato a fattore Xa
attraverso la via estrinseca (FVII-thromboplastina) . Durante questo processo il Fattore VII e’
completamente trasformato in FVIIa senza interferenza nel test nella fase di preattivazione del
FVII.
Nella seconda fase il FXa generato idrolizza il substarto cromogenico S-2765 liberando pNA. Il
colore sviluppato dalla pNA prodotta viene monitorato a 405 nm ed e’ direttamente proporzionale
all’attività del FVII presente nel campione .
Composizione
Il kit Coaset FVII kit contiene:
1.S-2765
1 vial
Sunstrato cromogenico (N-a-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA),
(8 mg) con aggiunta di mannitolo (eccipiente).
2. Bovine Serum Albumin
1 vial
BSA 20%
3. Buffer stock solution
1 vial
Tris 1.0 mol/L, pH 7,4
4. Factor X
1 vial
Fattore X, bovino, 3,1 IU.
5.CaCl2
1 vial
Soluzione di calcio cloruro, 40 mmol/L.
6.Thromboplastin
1 vial
Tromboplastina da placenta umana.
Precauzioni
Ogni unitá di sangue utilizzata nella preparazione di reagenti di origine umana é stata analizzata
con metodologia approvata dall’ FDA ( agenzia USA per il controllo di alimenti e medicinali) per
evidenziare una eventuale presenza di antigene di superficie dell’ epatite B, e di anticorpi anti
HIV 1 e 2 e anti epatite C, risultando negativa. Tuttavia, dato che nessun test puó completamente
escludere la presenza di tali agenti patogeni nel sangue, i reagenti di origine umana contenuti
nel kit vanno maneggiati ed eliminati con cautela.15
Classe di pericolo: Skin Irrit.2, H315; Eye Irrit.2, H319
Indicazionei di pericolo: H315: Provoca irritazione cutanea. H319: Provoca grave irritazione
oculare.
Consigli di prudenza: P264: Lavare accuratamente le mani dopo l’uso. P280:Indossare guanti/
indumenti protettivi/ Proteggere gli occhi/il viso. P302+P352: IN CASO DI CONTATTO CON LA
PELLE: lavare abbondantemente con acqua e sapone. P332+P313: In caso di irritazione della
pelle: consultare un medico. P305+P351+P338: IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI:
sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è
agevole farlo. Continuare a sciacquare. P337+P313: Se l’irritazione degli occhi persiste,
consultare un medico.
Per l’impiego diagnostico in vitro.
Preparazione
1.S-2765: Ricostituire con 6 mL di acqua sterile11 per ottenere una concentrazione di
1,87 mmol/L.
2. Bovine Serum Albumin: Pronta all’uso
3. Buffer stock solution: Diluire nel seguente modo prima dell’utilizzo:
1) 1 volume di soluzione madre con 19 volumi di acqua sterile11.
2) a 100 volumi di questa soluzione aggiungere 1 volume of BSA 20%. (Tris-BSA tampone,
soluzione di lavoro, contenente 0,2% BSA)
4. Factor X : riconstituire con 1.0 mL acqua sterile11. Prima dell’uso, diluire ulteriormente
mescolando 1 volume di Fattore X con 3 volumi di Tris-BSA tampone di lavoro, per ottenere
una soluzione con concentrazione di 0,8 IU/mL.
5.CaCl2: pronto all’uso.
6.Thromboplastin: Ricostituire con 4.0 mL di acqua sterile11Prima dell’uso, diluire
ulteriormente mescolando 1 volume of Tromboplastina con 4 volumi of Tris-BSA buffer
soluzione di lavoro.
Conservazione e Stabilità
I reagenti sigillati e conservati a 2-8°C sono stabili fino alla data di scadenza stampata
sull’etichetta. Evitare la contaminazione da microorganismi una volta aperti i flaconi.
1. S-2765: una volta ricostituito il substrato è stabile 6 mesi a 2-8°C.
2. Bovine Serum Albumin: il flacone aperto è stabile 1 settimana 2-8°C.
3. Buffer stock solution: la soluzione madre è stabile per 2 mesi a 2-8°C. Tris-BSA tampone di
lavoro è stabile per 5 giorni a 2-8°C.
4. Factor X : il FX ricostituito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
ITALIAN- Revision 11/2014
5. CaCl2: è stabile a 2-8°C sino alla data di scadenza stampata sull’etichetta.
6. Thromboplastin: la tromboplastina ricostituita e’ stabile per 1 mese a 2-8°C.
Reagenti non inclusi:
— Pool di Plasma umano normale come calibrante, il quale deve essere calibrato contro
uno Standard Internazionale I campioni di plasma ottenuti da almeno 20 donatori sani.
10-30 mL di plasma citratato (9 volumi di sangue e 1 volume di sodio citrato 0.1 mol/L)
vengono prelevati da ciascun donatori. I primi 3-5 mL di sangue vengono scartati. Il
plasma viene preparato centrifugando a 2000xg per 20 minuti. Uguali quantità di plasma
di ciascun donatore vengono miscelati insieme e dispensati in piccole aliquote e congelate
immediatamente. Il plasma normale è stabile per 1 anno a –70°C o per 3 mesi a –20°C.
Evitare il ricongelamento. Scongelare rapidamente a 37°C immediatamente prima dell’uso.
— Acido acetico 20% o acido citrico 2%.
— Acqua sterile11
Materiali necessari ma non inclusi nel kit:
— Fotometro, 405 nm (e 490 nm per metodi micropiastra)
— Termostato 37°C ±0,2°C. Verificare che la distribuzione della temperatura nel termostato sia
regolare ed uniforme.
— Calibrare le pipette con accuratezza dell’ 1% o superiore.
— Provette di plastica
— Cuvette Semi-micro
—Vortex
— Dispensatore/diluitore dei campioni
—Cronometro
— Centrifuga, 2000xg
Raccolta dei campioni e preparazione
Mescolare 9 parti di sangue con 1 parte di sodio citrato 0.1mol/L. Scartare i primi 3-5 mL di
sangue. Centrifugare a 2000xg per 20 minuti.
Separare il plasma dalle cellule ematiche entro 2 ore dalla raccolta. Se il plasma non viene
testato immediatamente, conservarlo a 2-8°C o a temperatura ambiente per un massimo di
4 ore. Il plasma puo’ essere dispensato in aliquote e conservato congelato a -70°C per un
massimo di 3 mesi. Evitare il ricongelamento. Scongelare rapidamente a 37°C appena prima
dell’utilizzo.
Controllo di Qualità
Per un programma completo di controllo di qualità si raccomanda di usare controlli normali e
anormali 13 . I valori assegnati per i controlli utilizzati dovrebbero essere riferiti ad uno Standard
Internazionale. Ogni laboratorio deve stabilire i propri valori di media e deviazione standard e
istituire anche un programma di controllo di qualità per il monitoraggio dei test di laboratorio. I
controlli vanno analizzati almeno ogni otto ore secondo le buone pratiche di laboratorio. Riferirsi
a Westgard et al. per identificare e risolvere eventuali situazioni fuori controllo 14 .
Procedimento
a) Preparare una Miscela Reagente mescolando:
1 part
tromboplastina diluita
5 parts FX 0,8 IU/mL
3 parts CaCl2 40 mmol/L
La Miscela Reagente preparata è stabile per 30 minuti a 37°C o 3 ore a 2-8°C.
b) Preparazione dei calibranti.
Una curva di calibrazione è richiesta per ciascuna serie di analisi. Plasma umano normale,
calibrato contro lo Standard Internazionale, viene usato quale calibrante. Questo plasma
viene diluito in Tris-BSA tampone di lavoro nel seguente modo:
%FVII
Diluizione con Tris-BSA tampone di lavoro
200
1:500
100
1:1000
50
1:2000
25
1:4000
12.5
1:8000
c) Preparazione dei campioni.
I campioni vengono diluiti 1:1000 in Tris-BSA tampone di lavoro. I plasmi diluiti sono stabili
per almeno 2 ore a2-8°C. Per ottenere risultati ottimali, si raccomanda l’uso di diluitori ad alta
precisione.
d) esecuzione del test
Un bianco reagente (utilizzare Tris BSA tampone di lavoro al posto del campione) dovrebbe
essere incluso in ciascuna serie.
Riscaldare il volume necessario all’analisi, di substrato e la Miscela Reagente, a 37°C.
Aggiungere in una provetta di plastica:
Volumi
Calibranti, Campioni diluito o Tris-BSA tampone di lavoro (2-8°C)
200 µL
Incubare 3-4 minuti a 37°C
Miscela Reagente (37°C)
200 µL
Mescolare e Incubare 7 minuti a 37°C
S-2765 (37°C)
200 µL
Mescolare e Incubare 5 minuti a 37°C
Acido Acetico, 20% o acido citrico 2%
200 µL
Leggere le assorbanze con spettrofotometro a 405 nm contro bianco reagente. Il colore è stabile
per almeno 4 ore.
Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA)
Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy)
Calcolo
Riportare su carta millimetrata lineare l’ assorbanza (A405) degli standard rispetto alle loro
concentrazioni di Fattore VII. Leggere l’attività % FVII dei campioni sulla curva standard cosi’
ottenuta.
1.5
1.0
A405
Uso del kit
0.5
0.0
0
50
100
150
% FVII
200
Standard curve
Risultati
I risultati di FVII sono espressi in attivita’ (%).
Intervallo di Riferimento
Maschi 54-138 (2 SD, n = 31), Femmine 56 – 200 (2 SD, n = 30) 12.
Cratteristiche del metodo
Specificità e fattori interferenti
1) Aggiunta di IgG di coniglio anti FVII umano blocca > 98% dell’attività amidolitica.
2) Attività identiche di FVII furono ottenute su plasma normale prediluito (2-8 volte) sia in
tampone che in plasma carente di FVII, prima della diluizione 1:1000 per l’analisi.
3) L’analisi un campione con elevata concentrazione di FVII ( donna gravida 3rd trimestre) diluito
6 volte in plasma carente di FVII o in Tampone, ha dato rispettivamente risultati di attività di
FVII pari a 236% e 229%.
Nessuna interferenza dell’eparina fino a livelli di 0.5 IU/mL nel plasma.
Precisione
Micropiastra
CV% (entro il run)
n
CV% (Totale)
n
Media(% FVII)
119
3,55 5,6 35
35
3,55 4,9 35
Correlazione
SistemaPendenzaIntercetta
r
Metodo di riferimento
n
Micropiastra
0,97
11,2
0,96 FVII Recombiplastin (ACL Futura)
47
E’ stata condotto uno studio di comparazione contro un metodo ELISA analizzando campioni da
individui normali (n=27) ottenendo per i due metodi un valore medio (±+2SD) 108±25% e 102
±22% rispettivamente con Coatest FVII e metodo ELISA.
Come atteso, valori piu’ alti sono stai ottenuti con il metodo ELISA (51±14%) in confronto con
Coaset FVII (38 ±19%) nell’analisi di campioni di pazienti in terapia anticoagulante (n=42).
Linearità
Sistema
Micropiastra
12.5 - 200 % FVII
Sensibilità
Sistema
Micropiastra: 6.7 ÐmAbs /min per 1% di attività di FVII.
Limite di rilevabilità
Sistema
Micropiastra:
3% FVII.
Proocedura alternativa
Il test puo’ anche essere eseguito in micropiastra e conseguentemente permettere 120
determinazioni per kit. Bisogna avere cura di mantenere le condizioni di reazione come riportato
nel procedimento sopra descritto. Usando cambi di volume proporzionali, esempio da 200 uL a
50 uL, l’incubazione con il substrato dovrebbe essere prolungata da 5 a 7 minuti. Far partire il
cronometro quando la Miscela reagente viene aggiunta, in modo che ciascun campione venga
attivato per 7 minuti. Mantenendo lo stesso precedente intervallo di aggiunta, aggiungere quindi
il substrato S-2765, e con la stessa modalità aggiungere dopo 7 minuti, l’acido acetico o acido
citrico per bloccare la reazione. Sarebbe preferibile leggere le assorbanze con doppia lunghezza
d’onda in modo da compensare le differenze fra i pozzetti. Il ÐA(405-490nm) dovrebbe
preferibilmente essere 1
­ .1 di assorbanza, allo scopo di evitare una deplezione di substrato con
caduta di linearità. E’ molto importante utilizzare piastre che abbiano basso potere adsorbente di
proteine. Quindi micropiastre utilizzate per test immunologici non devono essere utilizzate. Inoltre
verificare che il termostato mantenga una temperatura distribuita uniformemente.
303348 R3 11/2014
PORTUGUÊS - Revisão do folheto 11/2014
DANSK - Metodeforskrift revision 11/2014
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Bibliography / Literatur / Bibliografía / Bibliographie / Bibliografia /Bibliografia /
Litteratur / Litteraturförteckning /
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Chromogenix da sua área.
AVISOS E PRECAUÇÕES:
Cada unidade de dador utilizada na preparação de reagentes de origem humana foi testada por
métodos aprovados pela FDA, para a presença de HbSAg e para anticorpos contra HIV-1 e 2
e HCV, com resultados negativos. Contudo, como nenhum teste pode excluir completamente a
possibilidade da presença de doenças no sangue, a manipulação e a eliminação dos reagentes
de origem humana, deve ser feita com precaução. Manipule como potencialmente infeccioso.15
Classe de perigo: Irrit. Cut. 2, H315; Irrit. Ocular 2, H319
Advertências de perigo: H315, H319
Recomendações de prudência: P264, P280, P302 + P352, P332 + P313, P305 + P351 +
P338, P337 + P313
Produto para diagnóstico in vitro.
Venligst rekvirer den gældende udgave af metodeforskriften på dansk fra den lokale
Chromogenix distributør.
FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER:
Hver donor unit anvendt i dette præparat af human oprindelse er blevet testet med FDA
godkendte metoder for tilstedeværelse af Hepatitis B overflade antigen og antistoffer mod
HIV 1 og 2 og Hepatitis C og fundet værende negative. Da ingen test imidlertid fuldstændig
kan borteliminere risiko for tilstedeværelse af disse blod bårne sygdomme, bør håndtering og
bortskaffelse af reagenser af human oprindelse i dette produkt ske med omhu. Behandles som
potentielt smittefarligt.15
Fareklasse: Skin Irrit.2, H315 - Eye Irrit.2, H319
Sikkerhed sætninger: H315, H319
Præventive sætninger: P264, P280, P302+P352, P332+P313, P305+P351+P338, P337+P313
Dette produkt er til in vitro diagnostisk anvendelse.
COASET™ FVII - 82 1900 63
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1. G AVVISATI et al. Evaluation of a new chromogenic assay for Factor VII and its application in
patients on oral anticoagulant treatment. Br J Haematol 45, 343-352 (1980).
2. E BRUCKERT et al. Interrelationship of plasma triglyceride and coagulant Factor VII levels in
normotriglyceridemic hypercholesterolemia. Atherosclerosis 75, 129- 134 (1989).
3. J CARVALHO DE SOUSA et al. Phospholipase C sensitive FVII and FVII antigen in
hypertriglyceridemia. Nouv Rev Fr Hematol 31, 13-15 (1989).
4. J CARVALHO DE SOUSA et al. Plasma Factor VII, triglyceride concentration and fibrin
degradation products in primary hyperlipidemia: A clinical and laboratory study. Haemostasis
19, 83-90 (1989).
5. C HOFFMAN et al. Factor VII activity state in coronary artery disease. J Lab Clin Med 111,
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6. T MEADE et al. Haemostatic function and ischaemic heart disease. Principal results of the
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10.U SELIGHSON et al. Coupled amidolytic assay for Factor VII: its use with a clotting assay to
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11.National Committee for Clinical Laboratory Standards. Specifications for reagent water used
in the clinical laboratory, NCCLS Approved Standard: ASC-3.
12.JWJ VAN WERSCH. A chromogenic assay for coagulation factor VII: analytical performance
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15.RICHARDSON J H and BACKLEY W E. Eds.Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. US. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, HHS
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SVENSK - Instick revision 11/2014
För aktuell revision av detta insticksblad på svenska ber vi Er att kontakta Chromogenix
distributör.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR:
Varje givarenhet som använts för produktion av reagens av humant ursprung har testats med
för FDA godkända metoder för hepatit B ytantigen, antikroppar mot HIV 1 och 2 samt hepatit C
och funnits negativa. Eftersom inget test fullkomligt kan utesluta förekomst av blodburen smitta
skall försiktighet iakttagas vid hantering och bortskaffande av reagens innehållande material av
humant ursprung.15
Faroklass: Skin Irrit.2, H315 - Eye Irrit.2, H319
Säkerhet statements:H315, H319
Skyddsangivelser:P264, P280, P302+P352, P332+P313, P305+P351+P338, P337+P313
Denna produkt är för in vitro diagnostiskt användande
11/2014
τάξη κινδύνου: Skin Irrit.2, H315 - Eye Irrit.2, H319
Δηλώση(εις) κινδύνου: H315, H319
Δηλώση(εις) προφύλαξης: P264, P280, P302+P352, P332+P313, P305+P351+P338, P337+P313
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Revision:R3
Issued:11/2014
C.O.:449967
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