Review - Blood Transfusion

Transcript

Review
The contribution of molecular diagnosis
to erythrocyte immunohaematology, with particular regard
to null phenotypes
GianLodovico Molaro, Giorgio Reali
Pordenone, Genova
For many years after the discovery of the ABO
system at the beginning of the last century and the
start of transfusion therapy, the erythrocyte blood
group antigens were considered of interest uniquely
in sero-immunology, important only for transfusion
matches and immunohaematological investigations,
but lacking any practical, clinical significance as an
expression of specific diseases.
This belief was overturned by the increasing
number
of
observations
made
by
immunohaematologists in the following decades.
It was seen that some subjects carried variants
of the red cell phenotypes most commonly found in
the population and, in particular, some subjects were
identified with null phenotypes (a widely used
nomenclature suggested by Ceppellini to Levine),
otherwise known as minus-minus or silent
phenotypes.
As is well-known, in these phenotypes the red
blood cells lack all the antigens of a given blood
group system1,2.
The fact that carriers of phenotypic variants of
some particular systems had morphological and
functional abnormalities of the erythrocytes,
sometimes accompanied by clinically obvious
organic disorders, suggested that there was a
connection between the blood groups and the
diseases, thus stimulating researchers to clarify these
relationships.
Thus the biochemists and molecular biologists
Prof. Giorgio Reali
c/o IBMDR
Via Volta 19/5
16128 Genova
Italy
18
Per lungo tempo, dopo la scoperta del sistema
ABO agli inizi del secolo scorso e l'avvio della terapia
trasfusionale, gli antigeni gruppoematici eritrocitari
sono stati considerati come una caratteristica di
interesse unicamente siero-immunologico, importante
solo ai fini della trasfusione e delle indagini
immunoematologiche, ma senza significato sul piano
della pratica clinica come espressione di malattie
specifiche. Tale convinzione si dimostrò superata
dalle osservazioni, sempre più numerose, compiute
nei successivi decenni dagli immunoematologi circa
l'esistenza di soggetti portatori di varianti dei fenotipi
eritrocitari più comunemente riscontrati nelle
popolazioni e, in particolare, di quelli che sono stati
denominati, seguendo un suggerimento verbale di
Ceppellini a Levine, null (o, anche, minus-minus o
silenti). Si tratta, come è ben noto, di fenotipi
caratterizzati dall'assenza sulle emazie di tutti gli
antigeni "propri" di un determinato sistema
gruppoematico1,2. Il fatto che i portatori di queste
particolari varianti fenotipiche riguardanti alcuni
sistemi presentavano anomalie morfologiche e
funzionali delle emazie, talvolta accompagnate da
disturbi organici clinicamente evidenti, era un motivo
per suggerire l'esistenza di un rapporto fra i gruppi
sanguigni e le malattie e, quindi, per stimolare gli
studiosi a chiarirne gli aspetti.
Così, agli immunoematologi si sono affiancati i
biologi molecolari ed i biochimici negli studi in grado
di delucidare la composizione chimica delle
componenti la membrana dell'eritrocita, che
risultavano essere associate alle proprietà antigeniche
gruppoematiche, valutando, nel contempo, anche il
loro ruolo funzionale nella biologia dell'emazia3,4.
L'avvento negli ultimi due decenni delle metodiche
Blood Transf 2003; 1: 18-40
Molecular diagnosis of null erythrocyte phenotypes
joined the immunohaematologists in studies aimed
at elucidating the chemical composition of the
components of the red cell membrane, which had
been found to be associated with the antigenic
properties of the red blood cell groups. At the same
time their functional role in the biology of blood was
evaluated3,4.
Over the last two decades, the development of
molecular biology methods capable of studying
genes and their abnormalities directly, using gene
amplification techniques with polymerase chain
reaction (PCR), cloning, gene transfection and DNA
sequencing, has allowed more precise definition of
the relationships between erythrocyte phenotypes
and genotypes, and has also demonstrated how some
aspects of human pathology depend on allelic
variants, in their turn derived from mutations in the
genes responsible for particular red cell
phenotypes5,6.
This review presents the contributions made by
the most recent molecular research in red cell
immunology, identifying and analysing the genetic
abnormalities that underlie the rarer phenotypic
variants and the null phenotypes.
The various molecular biology techniques used
in the field of immunohaematology will also be
presented. These methods overcome the limitations
of low sensitivity and specificity or complexity of
performance associated with the traditional
techniques of direct or indirect agglutination, in liquid
phase, solid phase or on column5,6.
Molecular genetic analyses in
immmunohaematology
The most frequently cited and used application
of molecular biology in red blood cell immunology
is the determination of the phenotype and/or genotype
of a foetus during a pregnancy. This is done using
cells from the amniotic fluid, chorionic villus, or
trophoblast or even foetal cells circulating in the blood
of immunised mothers (usually Rh-negative with antiD antibodies) and establishes whether the foetus
carries the antigen against which the mother has
antibodies.
In addition, the analysis of DNA in samples of
peripheral blood from a patient who has recently
received massive transfusions or chronic
transfusional therapy allows the recipient's genotype
di biologia molecolare per lo studio diretto dei geni
e delle loro anomalie, utilizzando le tecniche
dell'amplificazione genica mediante la polymerase
chain reaction (PCR), la clonazione, la trasfezione
dei geni, e lo studio delle sequenze del DNA genico,
ha offerto e continua ad offrire non soltanto la
possibilità di meglio precisare i rapporti esistenti tra
il fenotipo eritrocitario e il rispettivo genotipo, ma
anche di dimostrare come alcuni aspetti della
patologia umana dipendano da varianti alleliche, a
loro volta derivate da mutazioni dei geni responsabili
della comparsa di particolari fenotipi eritrocitari5,6.
Questa rassegna si propone appunto di presentare
i contributi apportati dalle più recenti ricerche di
biologia molecolare compiute nell'ambito
dell'immunoematologia
eritrocitaria
per
l'identificazione e l'analisi delle anomalie dei geni, che
sono alla base delle varianti fenotipiche più rare e
dei fenotipi null.
Sarà esposto anche l'aspetto riguardante l'impiego
delle metodiche di studio della biologia molecolare
nel campo delle indagini immunoematologiche,
metodiche che si sono rivelate utili per superare i
limiti delle tradizionali tecniche di agglutinazione,
diretta od indiretta, in fase liquida, solida o su
colonna, a causa della loro ridotta sensibilità e
specificità o complessità di esecuzione 5,6.
L'impiego delle analisi di genetica molecolare
in immunoematologia
L'applicazione più frequentemente citata ed
utilizzata della biologia molecolare in
immunoematologia eritrocitaria riguarda la
determinazione del fenotipo e/o genotipo del feto in
corso di gravidanza, utilizzando le cellule del liquido
amniotico, dei villi coriali o del trofoblasto o, ancora,
le cellule fetali presenti nel circolo sanguigno dei madri
immunizzate (in genere Rh-negative con anticorpi antiD) per stabilire se il figlio è portatore dell'antigene
verso cui è diretto l'anticorpo materno.
Inoltre, nei soggetti recentemente sottoposti ad
una trasfusione massiva oppure a una terapia
trasfusionale cronica, l'analisi del DNA nei campioni
del sangue periferico consente di stabilire il genotipo
del ricevente e di superare, in presenza di un
microchimerismo post-trasfusionale, le incertezze che
derivano dalle indagini praticate con l'impiego delle
convenzionali tecniche di emoagglutinazione.
19
GL Molaro, G Reali
to be determined. This overcomes the uncertainties
arising from investigations using conventional
haemagglutination techniques when posttransfusional microchimaerism is present.
Nevertheless, determining the red blood cell
(RBC) genotype is important in other situations
besides those described above; for example in cases
of autoimmune haemolytic anaemia, and in the
research for phenotypically identical blood to use
in autoantibody absorption techniques 6-10.
The problem of pre-transfusional compatibility
in carriers of particular phenotypic variants, for
example non-African (and non-Afro-Americans)
Fy(a-b-) subjects, is another important application
of molecular diagnosis.
In this context, Olsson et al.11 used a practical
application of DNA analysis to study the three major
alleles at the locus of the FY gene of the Duffy system
(Fya, Fyb, Fy): the demonstration of the allelic variants
of the genes coding for the antigens of this system
allowed resolution of the problem of pretransfusional
compatibility in carriers of this phenotype when they
develop alloimmunisation.
The most recent molecular genetic studies have
revealed that the antigen expression on blood cells,
that is, the serologically determined phenotype,
frequently does not correspond with the results of
the molecular investigations of the gene.
The causes of this are mainly congenital, but can
also be acquired. The congenital forms include the
particular phenotypes with partial antigen D (or
mosaic D or variant D) or with weak D (once called
Du), in the Rh system12, 13.
DNA analysis can distinguish between
phenotypes with weak expression of the Rh antigen
complex and those in which the reduced expression
is due to a "partial" D: only subjects with the former
phenotype are not at risk of post-transfusional or
gestational alloimmunisation; the latter, on the other
hand, are at risk.
For example, it has been seen that about one third
of Rh-negative people have an intact, but inactive
RHD gene6 and that most Africans and about one
quarter of Afro-Americans who are D-negative carry
a non-functional RHD "pseudogene" (named
RHDΨ), 15% have hybrid RHD-CE-D genes14 (in
association with a VS+ V- phenotype) and only in
18% is the RHD gene completely absent.
These findings are different from those in
Europeans, among whom the D-negative phenotype,
20
L'accertamento del genotipo eritrocitario è
importante non soltanto nelle suddette situazioni, ma
anche nei casi di anemia emolitica autoimmune, per
la ricerca di emazie fenotipicamente identiche da
utilizzare nelle tecniche di assorbimento degli
autoanticorpi6-10.
Il problema della compatibilità pretrasfusionale
in portatori di particolari varianti fenotipiche, come,
ad esempio, in soggetti Fy(a-b-) non africani (né
afroamericani), è un'altra importante applicazione
della diagnostica molecolare. Al riguardo, Olsson et
al.11 hanno utilizzato un metodo di indagine del DNA
genico di pratica applicazione per lo studio dei tre
maggiori alleli al locus del gene FY del sistema Duffy
(Fya, Fyb, Fy): la dimostrazione delle varianti alleliche
dei geni che codificano per gli antigeni di questo
sistema consente di risolvere il problema della
compatibilità pretrasfusionale nei portatori del
suddetto fenotipo quando vanno incontro ad
alloimmunizzazione.
Dai più recenti studi di analisi di genetica
molecolare è emerso il dato del frequente riscontro
di situazioni nelle quali l'espressione degli antigeni
sulle emazie, cioè il fenotipo sierologicamente
determinato, non corrisponde ai risultati delle indagini
molecolari sul gene. Le cause di questa situazione
sono principalmente congenite, ma possono essere
anche acquisite. Tra le forme congenite vi sono quelle
dei particolari fenotipi con l'antigene D "parziale" (o
D "mosaico" o D variant) oppure con il D "debole"
(weak D, un tempo denominato Du), nell'ambito del
sistema Rh12, 13.
Con l'analisi del DNA genico è possibile
distinguere i fenotipi con una debole espressione del
complesso antigenico Rh da quelli la cui ridotta
espressione è dovuta invece a un D "parziale": solo i
soggetti con il primo fenotipo non sono esposti al
rischio di un'alloimmunizzazione post-trasfusionale
o gravidica; gli altri invece lo sono.
È stato, per esempio, osservato che un terzo
circa dei soggetti Rh-negativi possiede un gene RHD
intatto, ma inattivo6 e che la maggior parte dei
soggetti Africani e approssimativamente un quarto
degli afroamericani D-negativi è portatore di un
"pseudogene" RHD non funzionante (denominato
RHDΨ), con un 15% che possiede geni ibridi RHDCE-D14 (in associazione con un fenotipo VS+ V-)
e con soltanto un 18% totalmente privo del gene
RHD. Sono osservazioni in contrasto con quanto
avviene negli Europei, nei quali il fenotipo DBlood Transf 2003; 1: 18-40
Table I - Clinical applications of genetic DNA analysis for determining blood group antigens
-
Typing patients who have recently received massive or continuous transfusions
Identification of a foetus at risk of haemolytic disease of the newborn
Typing patients with RBCs covered by antibody immunoglobulins
Typing in cases of antigens "weakly" or "partially" expressed on blood
Determination of the state of homozygosity for the RHD gene
Resolution of discrepancies concerning ABO and Rh blood groups
Mass screening of blood donors negative for an antigen
Determination of the origin of circulating white cells in recipients of haematopoietic stem cell transplants
Investigations in cases of contested paternity or forensic studies.
apart from very rare exceptions, is associated with
deletion of the whole RHD gene. Finning et al15
recently proposed a PCR-based molecular biology
test to identify foetal RhD antigen, which can be
found in the plasma of pregnant women with anti-D
alloimmunisation.
The advantages of this test are: 100% accuracy,
an investigation with results available in "real time",
and avoidance of the complications of invasive
procedures used to obtain foetal cells from amniotic
fluid or chorionic villa; furthermore, it avoids the
risk of a false positive result due to the inactive RHD
"psuedogene" (RHDΨ) in Blacks. It is clear that it is
important to improve the sensitivity of techniques
for determining the RHD gene in order to eliminate
or, at least, minimise the false negative results16.
In contrast, the differences between genotype and
blood cell antigen expression that can be found in
patients with lymphoproliferative diseases are
acquired phenomena.
Table I lists the applications of genetic DNA
analysis in Transfusion Medicine; it includes the uses
described above and some others
The contribution of molecular diagnosis to
the study of null phenotypes
The molecular biology studies so far carried out
to analyse the events leading to formation of gene
variants responsible for producing abnormal
phenotypes and, in particular, null phenotypes, have
shown that different molecular alterations of DNA
can occur and these may sometimes be present
together in the same gene.
The abnormalities include total or partial deletion
of a gene and various types of mutation: 1)
substitution of a single nucleotide in the DNA gene
sequence (missense mutations), 2) the so-called
negativo, salvo rarissime eccezioni, è associato a
una delezione dell'intero gene RHD.
Un test di biologia molecolare basato sull'impiego
della PCR è quello recentemente proposto da Finning
et al15 da impiegare per la determinazione dell'antigene
RhD del feto, rinvenibile nel plasma delle donne
gravide con alloimmunizzazione anti-D. I vantaggi
del test sono: possedere un'accuratezza del 100%,
essere un'indagine "real time", evitare le complicanze
delle procedure invasive praticate per ottenere le
cellule fetali del liquido amniotico e dei villi coriali e,
infine, nei soggetti di razza nera, evitare il rischio di
un falso risultato positivo dovuto allo "pseudogene"
RHD inattivo (RHDΨ). Da ciò, l'importanza di
migliorare la sensibilità delle tecniche di
determinazione del gene RHD, per eliminare, o ridurre
al minimo, l'evenienza anche di falsi risultati negativi16.
Di origine acquisita sono invece le discrepanze tra la
determinazione del genotipo e l'espressione degli
antigeni sulle emazie, che possono essere osservate
nei pazienti affetti da malattie linfoproliferative.
Nella Tabella I sono elencate le applicazioni sopra
ricordate dell'analisi del DNA genico in Medicina
Trasfusionale e in altri tipi di studio.
L'apporto della diagnostica molecolare allo
studio dei fenotipi null
Dall'insieme degli studi di biologia molecolare
sinora condotti per analizzare gli eventi che
conducono alla formazione delle varianti geniche
responsabili della produzione dei fenotipi abnormi
e, in particolare, di quelle che sono alla base dei
fenotipi null, è emerso che le alterazioni molecolari
del DNA possono essere diverse e, talvolta, essere
presenti insieme nello stesso gene.
Le anomalie riscontrate comprendono la delezione
totale o parziale di un gene e mutazioni di vario tipo,
21
GL Molaro, G Reali
frame shift mutations, due to a deletion or an insertion
of a single nucleotide with consequent shifting of
the reading and transcription frame of the messenger
RNA (nonsense mutation) and 3) a change of
nucleotides which form a different stop codon thus
reducing the length of the amino acid chain of the
protein produced.
A null phenotype (including, in the case of the
Rh genes, the Rhmod phenotype) may also be due to
the action of other genes which inhibit or suppress
the genes in the abnormal phenotypes. In yet other
cases, interactions between transmembrane proteins
of the red blood cell and their binding with the
cytoskeleton are altered6.
A preliminary mention should be made of the fact
that only some carriers of single null phenotypes
show morphological and functional alterations of the
blood, which may or may not have repercussions
on their health with the onset of clinical symptoms.
This is seen in subjects whose null phenotype
concerns antigens which are associated with various
glycoproteins of the red blood cell membrane,
particularly those that bind to the cytoskeleton of
the cell: a typical example is Rh deficiency
syndrome17.
In contrast, when the specificity of the missing
antigenic determinants is linked to an
immunodominant sugar of the gylcoproteins and
glycolipids that are arranged in the glycocalyx and
protrude from the membrane, morphological or
functional alterations of the red blood cells or
particular clinical disorders do not occur.
This is the case for the following phenotypes:
Bombay (Oh) of the ABO system; Tj(a-) or p of the
P system; I-negative, i-negative of the I/i collection;
MkMk of the MNS system; Le(a-b-) of the Lewis
system or Pk of the GLOBE collection. All should
be considered as an only partially silent phenotype1.
The Rh deficiency syndrome
This term includes two clinically similar, but not
identical, entities that appear in subjects who have
the Rhnull or Rhmod (from modified) phenotype.
In order to be able to understand these two
phenotypes, some information must be given (albeit
in a very concise form) on the genetic and biochemical
nature of the Rh antigens.
The Rh antigenic complex is associated with 2
palmitolate membrane proteins, which are similar to
22
costituite da: 1) il cambiamento di un singolo
nucleotide della sequenza del DNA genico (mutazioni
missense), 2) le cosiddette frame shift, dovute ad
una delezione o a una inserzione di un singolo
nucleotide con conseguente slittamento del modulo
di lettura e della trascrizione nel RNA messaggero
(mutazione nonsense) e 3) il cambiamento dei
nucleotidi che provoca la formazione di un diverso
stop codon con conseguente riduzione della lunghezza
della catena amminoacidica della proteina prodotta.
Un fenotipo null (compreso, nel caso dei geni Rh, il
fenotipo Rhmod) può essere dovuto anche all'azione
di altri geni che condizionano la funzione dei geni in
causa nei fenotipi abnormi, esercitando su questi
un'azione inibitoria o soppressoria.
In altri casi, ancora, intervengono alterate
interazioni tra le proteine integrali della membrana
eritrocitaria e il loro legame con il citoscheletro6.
In via preliminare va anche precisato che soltanto
in una parte dei soggetti portatori dei singoli fenotipi
null è dimostrabile la presenza di alterazioni
morfologiche e funzionali delle emazie, che
determinano o meno ripercussioni sulle loro
condizioni di salute, con comparsa di sintomatologia
clinica. Ciò si osserva solamente in quei soggetti nei
quali il fenotipo null riguarda gli antigeni che sono
associati alle diverse glicoproteine della membrana
eritrocitaria e, specialmente, a quelle che si legano al
citoscheletro della cellula: ne è un esempio tipico la
Rh deficiency syndrome17.
Quando invece la specificità dei determinanti
antigenici mancanti è legata ad uno zucchero
immunodominante delle molecole delle glicoproteine
e dei glicolipidi che sono sistemati nel glicocalice e
sporgono dalla membrana, non compaiono alterazioni
morfologiche e funzionali delle emazie o particolari
disturbi clinici. È il caso dei seguenti fenotipi: il
Bombay (Oh) del sistema ABO, il Tj(a-) o p del
sistema P, l'I-negativo/i-negativo della Collection I/i,
l'MkMk del sistema MNS, il Le(a-b-) del sistema
Lewis o il Pk della collection GLOBE, che si deve
considerare come un fenotipo solo parzialmente
silente1.
La Rh deficiency syndrome
Il termine è comprensivo di due entità cliniche tra
loro simili, anche se non identiche, che compaiono
nei soggetti portatori rispettivamente dei fenotipi Rhnull
ed Rh mod (da modified).
each other, made of 417 aminoacids with a sequence
homology of 92% and a molecular weight between
30 and 32 kilodaltons. The polypeptide D antigen is
associated with one of these membrane proteins and
the "CE" antigen series, in four different
combinations, Ce, cE, ce, CE, is associated with
the other12,17,18. So far, 52 Rh antigens have been
assigned a number, although 7 of these are now
considered "obsolete".
The respective genes coding for their production,
RHD and RHCE, have structural homology and are
located on the short arm of chromosome 1, in
position p36.13-p34, spanning 75 kb of DNA. RHD
expresses the protein that carries the D antigen, while
RHCE expressed the other antigens of the Rh
system12,17,18.
Subjects with the regulator Rh null and Rh mod
phenotypes, besides having a total lack or extremely
reduced expression of the two proteins, also lack
(or carry an extremely small amount) a membrane
glycoprotein that is normally bound non-covalently
to the Rh polypeptide: this is the RhAG (Rhassociated glycoprotein), coded for by a gene
(RHAG) located on the short arm of chromosome
6, in position p21.11.
RhAG has a molecular weight of 45-100
kilodalton and is also known as protein Rh50
(although this name is very ambiguous given that, in
the numerical nomenclature, Rh50 identifies the very
low frequency PFTT antigen present in a new
category of "partial D" subjects, the DFR
category)18.
Although the aminoacid sequence of RhAG has
approximately 40% homology with the Rh
glycoprotein, and with this latter forms the "Rh
protein family", RhAG does not seem to have
specific antigenic properties.
Other membrane glycoproteins associated with
Rh polypeptide, which form the group of so-called
Rh accessory glycoproteins, are also absent or
variably reduced in the two phenotypes of Rh
deficiency syndrome. This group includes the
glycoproteins of the LW antigenic determinants,
CD47 (Integrin-associated protein, IAP),
glycophorin B (GPB), glycoprotein FY (antigen Fy5)
and band 312, 17, 18.
The function of the whole complex of the "Rh
protein family" is not yet sufficiently clear and
further studies are necessary to determine whether
the whole complex plays a role in the transport of
Per un corretto inquadramento di questi due
fenotipi è necessario fornire alcune nozioni (sia pur
molto sintetiche) suIla genetica e sulla natura
biochimica degli antigeni Rh.
Il complesso antigenico Rh è associato a 2
proteine palmitolate della membrana, tra loro assai
simili, costituite da 417 aminoacidi con sequenze
omologhe al 92% e di peso molecolare compreso
fra 30 e 32 kilodalton. A una di esse è associato
l'antigene polipeptidico D e, all'altra, gli antigeni della
serie "CE" nelle quattro diverse combinazioni: Ce,
cE, ce, CE12,17,18. Va ricordato che la nomenclatura
numerica conta, oggi, 52 differenti antigeni Rh, anche
se 7 di essi sono da considerarsi "obsoleti"
I rispettivi geni che ne codificano la produzione,
l'RHD e l'RHCE, sono localizzati sul braccio corto
del cromosoma 1, in posizione p36.13-p34, con una
distribuzione su 75 kb del DNA, presentando tra
loro un'omologia strutturale. Il primo esprime la
proteina che porta l'antigene D, il secondo gli altri
antigeni del sistema Rh12,17,18.
I soggetti con i fenotipi Rhnull regolatore ed Rhmod,
oltre alla totale assenza o alla ridottissima espressione
delle due proteine, sono carenti (o portatori di una
quantità estremamente ridotta) di una glicoproteina
della membrana, che è normalmente legata, in
maniera non covalente, al polipeptide Rh: si tratta
della proteina RhAG (Rh-associated glycoprotein),
codificata da un gene (RHAG) situato sul braccio
corto del cromosoma 6, in posizione p21.11, di 45100 kilodalton e conosciuta anche come proteina
Rh50 (anche se tale denominazione è chiaramente
ambigua, dato che con Rh50 si identifica, nella
nomenclatura numerica, l'antigene a bassissima
frequenza PFTT, presente in una nuova categoria di
soggetti "D parziali", la categoria DFR)18.
La sua sequenza amminoacidica ha un'omologia,
approssimativamente per il 40%, con la glicoproteina
Rh, formando con essa la "Rh protein family", ma
non risulta essere portatrice di proprietà antigeniche
specifiche.
Sono assenti, o variamente ridotte, nei due fenotipi
della Rh deficiency syndrome anche altre
glicoproteine della membrana che risultano associate
al polipeptide Rh e che formano il gruppo delle
cosiddette Rh accessory glycoproteins. Questo
gruppo comprende le glicoproteine dei determinanti
antigenici LW, la CD47 (Integrin-associated protein,
IAP), la glicoforina B (GPB), la glicoproteina FY
(relativamente all'antigene Fy5) e la banda 312, 17, 18.
23
GL Molaro, G Reali
NH4 ions or other cations across the cell membrane,
as suggested by animal studies. It has also been
hypothesised that the Rh polypeptides could be
involved in maintaining the symmetry of membrane
phospholipids, acting as enzymes ("flippases" and
"floppases") in phospholipid switching (flip-flop)
between the internal and external layers of the
membrane3,12.
It is well know that there are two mechanisms
that produce the Rhnull phenotype: in some subjects
the phenotype is due to a regulatory or suppressor
gene on a locus other than that of the genes coding
for the Rh proteins (see later), whereas in others it is
caused by an amorph gene in the RH locus itself.
The genetic abnormalities found in these two
cases are different. As far as concerns the former,
observations in two subjects with the Rh null
phenotype, carriers of normally functioning RHD and
RHCE genes, demonstrate how that the RHAG gene
is involved, either by a deletion or by the substitution
of a single nucleotide (missense mutation)19,20. In other
cases there is a double mutation, again in the RHAG
gene, with normal sequences and transcripts of RHD
and RHCE 21.
In the Rhnull phenotype caused by an amorph gene,
the anomaly found in two unrelated individuals
without the RHD gene, but with normal transcription
and function of the RHAG and CD47 genes, was
two mutations of the RHCE gene (substitution of a
guanine nucleotide by thymine or substitution of the
thymine-cytosine-adenosine sequence by cytosine):
the effect of these mutations was to create a shorter
protein, organised in 10 rather than the usual 12
domains22. In other cases the abnormalities were
double mutations causing a vast deletion of the only
RHCE gene present in D-negative subjects23.
The alterations in the red cell membrane proteins
that form part of the Rh complex translate, in the
null phenotype, into a defect in the rheological
properties of the cell, causing premature cell
destruction in the circulation and thus all the
symptoms of a more or less compensated, chronic
haemolytic syndrome.
The characteristic signs of such a situation are:
the presence of stomatocytes and spherocytes with
increased osmotic fragility, abnormal transport of
cations across the cell membrane and anomalous
organisation of phospholipids in the membrane itself,
together with the known biohumoural alterations
secondary to red cell destruction1,2.
24
La funzione di tutto il complesso della "Rh protein
family" non è stata ancora sufficientemente chiarita
e sono necessari ulteriori studi per accertare se l'intero
complesso svolga un ruolo nel trasporto degli ioni
NH4 o di altri cationi attraverso la membrana, come
suggerito da osservazioni in campo animale. È stata
anche avanzata l'ipotesi che i polipeptidi Rh possano
essere coinvolti nel mantenimento della simmetria dei
fosfolipidi sulla membrana agendo come enzimi
("flippasi" e "floppasi") nello scambio dei fosfolipidi
(flip-flop) tra gli strati interno ed esterno della
membrana3, 12.
Per quanto riguarda il meccanismo di formazione
del fenotipo Rhnull, è ampiamente noto che esso è
duplice. Mentre in alcuni soggetti è dovuto all'azione
di un gene regolatore o soppressore situato su un
locus diverso da quello dei geni che codificano per
le proteine Rh (vedi avanti), in altri, invece, è
riconducibile alla presenza di un gene amorfo situato
sullo stesso locus RH.
Le anomalie dei geni responsabili riscontrate in
queste due situazioni sono differenti. Per quanto
riguarda la prima, vi sono osservazioni, compiute in
due soggetti con il fenotipo Rh null, portatori di geni
RHD ed RHCE normalmente funzionanti, che
dimostrano come sia coinvolto il gene RHAG per la
presenza di una delezione o di una sostituzione di un
singolo nucleotide (mutazione missense)19,20. In altre
osservazioni esiste una doppia mutazione, sempre
del gene RHAG, con normali sequenze e trascritti
dei geni RHD ed RHCE21.
Nel fenotipo Rhnull da gene amorfo l'anomalia
riscontrata in due individui, non consanguinei, privi
del gene RHD, con normale trascrizione e funzione
dei geni RHAG e CD47, era costituita da due
mutazioni del gene RHCE (sostituzione del nucleotide
guanina con timina o sostituzione della sequenza
timina-citosina-adenina con citosina): l'effetto di
queste mutazioni era la creazione di una proteina più
corta, organizzata in 10 anziché negli usuali 12
domini22. In altri casi, invece, le anomalie riscontrate
erano costituite da doppie mutazioni che
comportavano una vasta delezione nell'unico gene
RHCE presente in soggetti D-negativi23. Le alterazioni
delle proteine della membrana eritrocitaria, che
entrano a far parte del complesso Rh, si traducono,
nel fenotipo null, in un difetto delle proprietà
reologiche della cellula, tali da provocare una sua
precoce distruzione in circolo, con tutto il quadro
sintomatologico di una sindrome emolitica più o
The Rhmod, phenotype, which is even rarer than
the preceding phenotype, shows marked depression
of all the Rh system antigens.
The defect seems to be controlled by an
autosomal gene with a suppressive effect, which
segregates independently of the Rh ones, in analogy
to what occurs with the regulatory-type Rh null
phenotype.
Some studies indicate that the genetic
abnormalities in the Rhmod phenotype are also caused
by single nucleotide exchanges, which induce modest
mutations in the RHAG gene, while the Rh
polypeptide is normal19. The abnormality was in the
RHAG gene also in the family most recently studied
by Huang et al24.
Subjects with the Rh mod phenotype have an
obvious, although not marked, decreased
expression of all their Rh antigens and their
haematological and clinical pictures are essentially
similar to those of Rhnull subjects.
Indeed, all people with Rh-deficiency syndrome
have the same morphological changes in the blood
and a condition of chronic haemolysis, which
although not usually severe, can, in some cases,
necessitate splenectomy1, 2.
The Kell system and the Ko (Kellnull)
and McLeod phenotypes
The antigenic determinants of the Kell system (22
have been identified certainly so far, and there are 3
others that are probable) are associated with a
membrane protein complex formed of two
glycoproteins named Kell and XK, joined to each
other by a covalent bond which some Authors
consider as a subunit of a single protein molecule25.
The former is a type II glycoprotein formed by
732 aminoacids with a molecular weight of 93
kilodalton; the latter is made up of 444 aminoacids
and, according to the most recent determinations,
has a molecular weight of 50.9 kilodalton26.
The two glycoproteins are coded for by two
different genes: the KEL gene on the long arm of
chromosome 7 in position q33 codes for the former
protein, while the gene for the production of XK
(the XK gene) is located on the short arm of
chromosome X in position p21 (and is, therefore,
X-linked)25, 26.
The XK glycoprotein carries the Kx antigen and
is very similar to the Rh protein, in that is formed of
meno compensata, ad andamento cronico. I segni
tipici di questa situazione sono: la presenza di emazie
stomatocitiche e sferocitiche con un aumento della
loro fragilità osmotica, anormale trasporto dei cationi
attraverso la membrana cellulare e un'organizzazione
abnorme dei fosfolipidi nella membrana stessa,
insieme con le note alterazioni bioumorali
dell'eritrodistruzione1,2.
Il fenotipo Rhmod, di frequenza ancora più rara
rispetto al precedente, è caratterizzato da una marcata
depressione di tutti gli antigeni del sistema Rh. Il
difetto appare controllato da un gene autosomico
ad
azione
soppressiva,
che
segrega
indipendentemente da quelli Rh, in analogia con
quanto avviene nel fenotipo Rhnull di tipo regolatore.
Da alcuni studi risulta che anche nel fenotipo
Rhmod le anomalie geniche sono costituite da singoli
scambi nucleotidici, che inducono modeste
mutazioni a livello del gene RHAG mentre il
polipeptide Rh risulta normale19. Anche in una famiglia
studiata più recentemente da Huang et al24 il gene
anomalo era l'RHAG.
I soggetti con il fenotipo Rhmod dimostrano una
evidente, anche se non elevata, diminuzione
dell'espressività antigenica di ogni determinante Rh
posseduto e un quadro ematologico e clinico
sostanzialmente simile a quello del Rhnull. Tutti i
soggetti affetti dalla Rh-deficiency syndrome
presentano, infatti, le stesse alterazioni morfologiche
delle emazie e una condizione di iperemolisi cronica,
di solito non grave, ma che, peraltro, in certi casi,
può richiedere la splenectomia1, 2.
Il sistema Kell ed i fenotipi Ko (Kellnull) e McLeod
I deteminanti antigenici del sistema Kell
(attualmente se ne conoscono 22 sicuri e 3 probabili)
sono associati ad un complesso proteico della
membrana formato da due glicoproteine, denominate
rispettivamente Kell ed XK, tra loro riunite da un
legame covalente, che alcuni Autori considerano
come subunità di una singola molecola proteica25.
La prima è una glicoproteina di tipo II formata
da 732 amminoacidi con un peso molecolare di 93
kilodalton; la seconda di 444 amminoacidi e, secondo
le determinazioni più recenti, con un peso molecolare
di 50,9 kilodalton26.
Le due glicoproteine sono codificate da due geni
diversi: il gene KEL localizzato sul braccio lungo
del cromosoma 7 in posizione q33 codifica per la
25
GL Molaro, G Reali
domains (in this case 10) which cross the membrane.
In contrast, the Kell protein is essentially extracellular
and is bound to the XK glycoprotein by a single
sulphydrilic bond in the fifth loop of this latter protein.
The common phenotypes of the Kell system
depend on the interaction between these two genes.
The XK membrane glycoprotein acts as a substrate
on which the various autosomal genes of the KEL
locus act to produce the various antigens of the
system26, 27.
The biological function of the Kell and XK
transmembrane proteins has not yet been defined
with certainty.
It is thought that the former, because of its
homology with the family of zinc-dependent
endopeptidases and particularly with endothelin-3converting enzyme, is a peptidase26 (it is considered
as an enzyme whose substrate has not been
identified3).
The XK protein, on the other hand, has structural
characteristics similar to those of proteins involved
in transport across the cell membrane: this protein is
thought to transport a neurotransmitter into nerve
cells together with Na+ and Cl- ions. The aminoacid
sequence of the molecule is similar to that of a
transporter of Na+-dependent glutamates27,28.
The observation that the Kell glycoprotein is
present in erythroid progenitor cells has led to the
supposition that it may have an important role in
early stages of erythropoiesis30.
The fact that patients with McLeod's syndrome
(see later) and those with autosomal recessive
chorea-neuroacanthocytosis both have the same
neurological disturbances, including chorea,
suggests that the two conditions have the same
pathogenetic base, associated with a deficit in a
mammalian neurotransmitter31, 32.
There are two "defective" phenotypes of the
system: the K o (or Kell null ) phenotype and the
"McLeod" phenotype. These have many similarities
(even if only from the aspect of serological reactions)
with the analogous "defective" Rh phenotypes, in
the sense that the immunohaematological
characteristics of Ko resemble those of Rhnull and
McLeod those of Rhmod. Subjects with the Ko (Kellnull)
phenotype do not have particular clinical symptoms
or morphofunctional changes of the RBCs despite
almost completely lacking all the antigens of the
system.
They are, however, exposed to the risk of
26
prima, mentre il gene per la produzione della XK (il
gene XK) è situato sul braccio corto del cromosoma
X in posizione p21 (è, cioè, X-linked)25, 26.
La glicoproteina XK porta l'antigene Kx ed è assai
simile alla proteina Rh, in quanto formata da domini
(in questo caso in numero di 10) che attraversano la
membrana. La proteina Kell, al contrario, è
essenzialmente extracellulare ed è legata alla
glicoproteina XK tramite un singolo legame
sulfidrilico a livello del quinto occhiello (loop) di
quest'ultima proteina.
I comuni fenotipi del sistema Kell dipendono
dall'interazione fra questi due geni. La glicoproteina
di membrana XK funge da substrato sul quale
agiscono i diversi geni autosomici del locus KEL
per la produzione dei vari antigeni del sistema26, 27.
La funzione biologica delle proteine integrali di
membrana Kell ed XK non è stata ancora definita
con sicurezza. Si ritiene che la prima, per la sua
omologia con la famiglia delle endopeptidasi zincodipendenti e particolarmente con l'enzima endothelin3-converting enzyme, sia una peptidasi 26 (è
considerata come un enzima ancora in cerca di un
substrato3). La proteina XK, invece, possiede le
caratteristiche strutturali simili a quelle delle proteine
di trasporto attraverso la membrana: ciò fa ritenere
che essa serva a trasportare un neurotrasmettitore
nelle cellule nervose assieme agli ioni Na+ e Cl-. La
sequenza amminoacidica della molecola è simile a
quella di un trasportatore di glutamati Na + dipendente27,28. L'osservazione che la glicoproteina
Kell è presente sui progenitori della serie cellulare
eritroide fa supporre che possa avere un ruolo
importante nelle fasi precoci dell'eritropoiesi30.
La presenza degli stessi disturbi neurologici, fra i
quali in particolare la corea, sia nei pazienti con la
sindrome di McLeod (vedi avanti) che in quelli affetti
dalla corea-neuroacantocitosi autosomica recessiva
conduce ad avanzare l'ipotesi che siano entrambe
forme morbose con una comune patogenesi, legata
ad un deficit di un neurotrasmettitore nei mammiferi31,
32
.
Due sono i fenotipi "difettivi" nel sistema: il
fenotipo Ko (o Kellnull) e il fenotipo "McLeod", con
molte somiglianze (peraltro, soltanto dal punto di
vista delle reazioni sieroIogiche ) con gli analoghi
fenotipi "difettivi" Rh, nel senso che Ko ricalca le
caratteristiche immunoematologiche dell'Rhnull e il
McLeod quelle dell'Rhmod. I soggetti con il fenotipo
Ko (Kellnull) non presentano particolari sintomi clinici
possible alloimmunisation against red cells after
transfusions and/or pregnancies, because of the
formation of an anti-Ku (anti-K5) antibody that reacts
strongly with the erythocytes of all the common Kell
phenotypes.
The Ku (K5) antigen is, in fact, the basic substrate
on which the genes act to give rise to all the different
phenotypes of the system.
The genetic anomalies found in Kellnull subjects
are heterogeneous: some cases have a nonsense
mutation33, others have different types of genetic
DNA mutation34.
The situation, particularly the clinical picture, of
subjects with the McLeod phenotype is very
different: all are male, since this anomaly affects an
X-linked gene. The genetic background is
heterogeneous and includes deletions and other
molecular mutations of RNA splicing3,26,35,36.
These individuals have marked depression of the
antigens of the Kell system and a total absence of
the Kx antigen (as mentioned before, coded for by
the XK gene); this antigen is found normally on red
blood cells, but also on cells of many other tissues,
included granulocytes.
Alterations in the XK gene lead to McLeod's
syndrome, which is characterized by a set of
haematological, neurological and muscular
alterations.
Acanthocytosis and excessive haemolysis are
typical and produce the associated blood-chemistry
profile and marked splenomegaly.
As already mentioned, neurological disorders,
with early decrease or loss of tendinous reflexes and
the appearance of dystonic and choreiform
movements, are frequent.
The muscle involvement is manifested by high
serum levels of muscle creatinine kinases and
carbonic anhydrase III and the late onset of a slowly
progressive myopathy2.
Some subjects with McLeod's syndrome also
manifest a particular condition during infancy, known
as X-linked chronic granulomatosis disease (CGD).
This is a chronic disease which develops when the
product of the XK gene is absent not only from the
RBCs but also from the granulocytes (type II CGD).
A variant of this disorder is that in which the XK
glycoproteins are absent from the RBCs but not from
the granulocytes (type I CGD).
The association between McLeod's syndrome
and CGD is explained by remembering the physical
né alterazioni morfologiche e funzionali delle emazie,
pur essendo queste totalmente prive di tutti gli antigeni
del sistema. Sono, tuttavia, esposti al rischio di
un'eventuale alloimmunizzazione antieritrocitaria
dopo terapie trasfusionali e/o gravidanze, per la
formazione di un anticorpo anti-Ku (anti-K5) che
reagisce potentemente verso le emazie di tutti i
comuni fenotipi Kell. L'antigene Ku (K5) rappresenta,
infatti, la sostanza di base, su cui agiscono i geni per
dare origine a tutti i differenti fenotipi del sistema.
Eterogenee sono le anomalie genetiche riscontrate
nei soggetti Kellnull: in alcuni soggetti una mutazione
nonsense33, mutazioni di diversa natura del DNA
genico in altri34.
Ben diversa, soprattutto per gli aspetti clinici, è
la condizione dei portatori del fenotipo McLeod, tutti
di sesso maschile, trattandosi di soggetti la cui
anomalia colpisce un gene X-linked. Il suo
background genetico è eterogeneo e comprende
delezioni o differenti mutazioni molecolari a carico
dell'RNA splicing 3,26,35,36 . Sono individui che
presentano una marcata depressione degli antigeni
del sistema Kell ed una totale assenza del prodotto
dell'antigene Kx (codificato, ripetiamo, dal gene XK)
antigene rinvenibile non soltanto nei globuli rossi,
ma anche sulle cellule di molti altri tessuti
dell'organismo, fra cui i granulociti.
Le alterazioni del gene XK portano alla comparsa
della sindrome McLeod, caratterizzata da un insieme
di alterazioni ematologiche, neurologiche e muscolari.
Tipico è il reperto di un'acantocitosi delle emazie
che si accompagna a uno stato di iperemolisi, con
relativo quadro ematochimico e ad una spiccata
splenomegalia. Frequente è anche la comparsa di
disturbi neurologici con una precoce diminuzione
od assenza dei riflessi tendinei e l'apparizione di
movimenti distonici e coreiformi, come già
menzionato. I disturbi a carico del sistema muscolare
sono rappresentati da un elevato livello nel siero degli
enzimi muscolari creatininchinasi e anidrasi carbonica
III e dalla comparsa tardiva di una miopatia
lentamente progressiva2.
Alcuni soggetti portatori della sindrome McLeod
presentano anche una particolare malattia dell'età
infantile, nota come granulomatosi cronica legata al
sesso (chronic granulomatosis disease X-linked o
CGD). È una malattia cronica che si sviluppa quando
il prodotto del gene XK è assente non soltanto sulle
emazie, ma anche sui granulociti (CGD di tipo II).
Una variante di questa forma morbosa è quella in
27
GL Molaro, G Reali
vicinity of the two genes, both X-linked, responsible
for the diseases. Furthermore, abnormal RNA
splicing may also involve the genes for retinitis
pigmentosa and Duchenne's muscular dystrophy,
situated in nearby loci on the X chromosome2, 27, 29.
The Glycophorins and the MNS and Gerbich
systems, with the Leach phenotype
The antigens of the MNS and Gerbich blood
group systems are associated with four
glycoproteins of the red cell membrane, namely GPA,
GPB, GPC and GPD. The 43 currently recognised
antigens of the MN system are associated with GPA,
the S,s antigens (and presumably U) with GPB, while
those of the Gerbich system are associated with GPC
and GPD18, 37.
GPA and GPB, characterised by a high degree
of structural homology, are coded for by two
different, but strongly linked genes, GYPA and
GYPB, located on the long arm of chromosome 4,
in position q28-q31. In contrast, GPC and GPD are
transcribed by a single gene, GYPC, not related to
the genes for the previous two glycophorins, which
maps on the long arm of chromosome 2, in position
q14-q21. The synthesis of one and/or the other
glycophorin is apparently controlled by a mechanism
of alternative splicing of the GYPC mRNA37.
The distinctive features of the glycophorins are a
long extracellular domain, a high degree of
glycosylation and a strong negative charge due to
the high content of sialic acid (from thus, their name
sialoglycoproteins).
It has long been considered that the primary
function of these glycoproteins is to prevent blood
aggregation, but there is still not definitive proof of
the importance of the high content of sialic acid for
this function.
Three categories of allelic phenotypic variants of
GPA and GPB are due to a partial or total deletion
of their respective genes: the complete absence of
glycophorins, the presence of abnormal glycophorins
and the formation of hybrid structures of these
proteins. Almost total deletion of the genes causes
the rare M k variant, which represents the null
phenotype of the MNS system (being characterised
by the complete absence of all the antigens of the
system, that is, M, N, S, s and U).
The total lack of GPA and GPB is not associated
with detectable clinical abnormalities, but rather with
28
cui la glicoproteina XK è assente sulle emazie ma
non sui granulociti (CGD di tipo I).
L'associazione tra la sindrome McLeod e la CGD
si spiega ricordando la vicinanza tra i geni, entrambi
X-linked, responsabili delle due malattie e non va
dimenticata la possibilità che l'anomalia genetica
dell'RNA splicing interessi anche quelli della retinite
pigmentosa e della distrofia muscolare di Duchenne,
situati in loci vicini sul cromosoma X2, 27, 29.
Le Glicoforine e i sistemi MNS e Gerbich, con
il fenotipo Leach
A quattro glicoproteine della membrana
eritrocitaria, denominate glicoforine, rispettivamente
GPA, GPB, GPC e GPD, sono associati gli antigeni
dei sistemi gruppoematici MNS e Gerbich. I 43
antigeni attualmente conosciuti del sistema MN sono
associati alle GPA, gli antigeni S, s (e
presumibilmente U) alla GPB, mentre quelli del
sistema Gerbich lo sono alle GPC e GPD18, 37. La
GPA e la GPB, caratterizzate da un alto grado di
omologia strutturale, sono codificate da due geni
diversi, ma strettamente linked, il GYPA e il GYPB,
situati sul braccio lungo del cromosoma 4, in
posizione q28-q31, a differenza di quanto avviene
per le GPC e la GPD che sono trascritte da un
unico gene, il GYPC, non correlato con quelli delle
precedenti due glicoforine e mappato sul braccio
lungo del cromosoma 2, in posizione q14-q21. La
sintesi dell'uno e/o dell'altra glicoforina si
realizzerebbe secondo un meccanismo di splicing
alternativo del GYPC mRNA37. Le caratteristiche
distintive delle glicoforine sono: un lungo dominio
extracellulare, un elevato grado di glicosilazione ed
una forte carica negativa dovuta ad un alto
contenuto di acido sialico (da cui la denominazione
di sialoglicoproteine).
Ciò conduce a ritenere che la loro prima funzione
sia di impedire l'aggregazione delle emazie, ma non
si sono ancora ottenute prove sicure dell'importanza
dell'alto contenuto dell'acido sialico per questa loro
funzione.
Tre categorie di varianti fenotipiche alleliche sono
state riscontrate a carico delle GPA e GPB dovute a
una delezione parziale o totale dei loro rispettivi geni:
la completa assenza delle glicoforine, la presenza di
glicoforine abnormi e la formazione di strutture ibride
di queste proteine. A una pressoché totale delezione
dei rispettivi geni è da riportare la rara variante Mk,
a particular serological pattern, in the sense that Mk
blood is always negative for the Wright and En
antigens, and is, thus, Wr(a-b-) and Ena-negative18.
As far as concerns the Gerbich system, it is known
that this is made up of three antigens with an
extremely high frequency (exceeding 99.9%): Ge2,
Ge3 and Ge4 (the serum that identified the first
Gerbich antigen, Ge1, is not longer available so the
frequency of this antigen cannot be estimated). The
system is completed by four other antigens (Ge5,
Ge6, Ge7 and Ge8) all with a low incidence (below
0.1%).
There are "defective" phenotypes: Yus, which
lacks the Ge2 antigen (denoted: Ge:-2,3,4) and
Gerbich, which lacks the Ge2 and Ge3 antigens
(denoted: Ge:-2-3,4).
These two phenotypes have abnormal GPC: the
Yus phenotype lacks aminoacid residues 17-35 from
the chain of 128 aminoacids and the Gerbich
phenotype lacks residues 36-63.
There is also the rare null phenotype, called the
Leach phenotype (denoted: Ge:-2-3-4). Obviously
this has complete lack of the GPC and GPD
glycophorins in the absence of abnormal or hybrid
proteins.
Subjects with the Leach phenotype have a
variable degree and severity of elliptocytosis and in
different percentages (from 20% to 60%).
This morphological abnormality reflects
alterations in the composition of the red cell
membrane cytoskeleton, characterised by a reduction
in its 4.1 and p55 proteins, which must bind with
GPC for normal red cell membrane function. These
two proteins are reduced by 25% and 98%,
respectivley3,18. It should be remembered that GPC
and GPD are also reduced, along with a deficit in
p55, in hereditary elliptocytosis due to deficiency in
protein 4.1. All the red blood cells in this condition
are transformed into elliptocytes3.
Glycophorins, and in particular GPA, have been
found to be clinically important because of their
capacity to act as cell receptors for the merozoites
of Plasmodium falciparum (at least for some
strains). Thus RBCs lacking GPA has a greater
resistance to parasitic invasion, with a clear selective
advantage in areas in which this parasite is endemic.
Nevertheless, given the rare finding of deficient
phenotypes, it seems clear that these cannot have
strongly influenced the relation between genotype
and endemic malaria.
che rappresenta il fenotipo null del sistema MNS
(caratterizzata dalla completa assenza di tutti gli
antigeni del sistema, cioè di M, N, S, s e U). La
totale carenza di GPA e GPB non si accompagna ad
anormalità cliniche rilevabili, ma, piuttosto, a situazioni
sierologiche particolari, nel senso che le emazie Mk
sono sempre negative per gli antigeni Wright ed En,
sono, cioè, Wr(a-b-) ed Ena-negative18.
Per quanto riguarda il sistema Gerbich, è noto
che esso è composto di tre antigeni ad altissima
frequenza (oltre il 99,9%): il Ge2, il Ge3 e il Ge4
(così come è noto che l'odierna indisponibilità del
siero che individuò il primo antigene Gerbich, cioè il
Ge1, non consente la stima della sua frequenza). Il
sistema è completato da altri quattro antigeni (Ge5,
Ge6, Ge7 e Ge8) tutti a bassa incidenza (inferiore
allo 0,1%).
Esistono fenotipi "difettivi": più precisamente lo
Yus, che manca dell'antigene Ge2 (sigla: Ge:-2,3,4)
e il Gerbich, che manca degli antigeni Ge2 e Ge3
(sigla, Ge:-2-3,4). Questi due fenotipi presentano
GPC anomale, nel senso che il fenotipo Yus manca
dei residui amminoacidici 17-35 su una catena di 128
amminoacidi e il fenotipo Gerbich manca, invece,
dei residui 36-63.
Esiste, poi, anche il raro fenotipo null,
denominato Leach (sigla, Ge:-2-3-4). Ovviamente
questo fenotipo è caratterizzato dalla completa
mancanza delle glicoforine GPC e GPD in assenza
di proteine abnormi o ibride.
I soggetti con il fenotipo Leach presentano emazie
ellissocitiche di vario grado e in percentuali diverse
(dal 20% al 60%).
Tale anomalia morfologica riflette l'alterazione
della composizione del citoscheletro della membrana
cellulare, caratterizzata da una riduzione delle sue
proteine 4.1 e p55, che richiedono un legame con la
GPC per la normale funzione della membrana
eritrocitaria.
Le suddette due proteine sono ridotte
rispettivamente del 25% e del 98%3,18.
Va ricordato ancora che anche nell'ellissocitosi
ereditaria, dovuta alla deficienza della proteina 4.1 e
contrassegnata da una totale trasformazione delle
emazie in ellissociti, si osserva una riduzione delle
GPC e GPD, che va dal 70% al 90% assieme ad un
deficit della p55 3.
Le glicoforine, ed in modo particolare la GPA, si
sono rivelate importanti dal punto di vista clinico
dopo la dimostrazione della loro capacità di agire da
29
GL Molaro, G Reali
RBCs deficient in glycophorin B are also less
susceptible to invasion, but not to the same extent
as that with a deficit of GPA. Subjects with the Leach
phenotype show a certain level of resistance to
invasion by this plasmodium3.
As far as concerns the sialic acid, although 70%
the total quantity in the RBC is contained in the
glycophorins, the real importance of this molecule
in invasion by Plasmodium falciparum has not been
established.
As described later, not only the antigens of the
MN system are implicated in malarial invasion, but
also those of the Knops system (CR1) and band 3
with the Diego antigens, which act as possible
receptors for Plasmodium falciparum3 and, finally,
the Duffy antigens.
Glycoproteins with complement-regulating
function and the Cromer and Knops systems
Three membrane glycoproteins have the capacity
to protect cells from destruction by autologously
formed complement (C): the decay-accelerating
factor (DAF or CD55), complement receptor-1 (CR1
or CD35) and the membrane inhibitor of reactive
lysis (MIRL or CD59). Eleven antigenic determinants
of the Cromer system are associated with the DAF
(8 with high frequency, 3 with low frequency).
The five antigens of the Knops system are
associated with CR1. The number of molecules on
the membrane differs remarkably between subjects,
varying from 20 to over 80037-39. The MIRL, on the
contrary, does not have blood group antigenic
activity.
The molecules of the DAF and MIRL
glycoproteins are formed of an extracellular domain
which is "anchored" by glycosylphosphatidylinositol
(GPI) to the membrane of red cells and all cells that
come into contact with serum (blood cells, vascular
endothelium cells and cells of the epithelia of the
gastrointestinal, genito-urinary and central nervous
systems), while DAF is present in a soluble form in
the plasma3 .
The DAF glycoprotein inhibits the association
and accelerates the dissociation of C4b2a and
C3bBb, the two fragments of complement that form
C3-convertase operating in both the classical and
alternative pathways of complement.
The main function of CR1 is to fix and process
immune complexes covered with the C3b/C4b
30
recettori cellulari per i merozoiti del Plasmodium
falciparum (almeno per alcuni suoi ceppi).
Da ciò, la maggior resistenza delle emazie carenti
della GPA all'invasione del parassita, con un chiaro
vantaggio selettivo nelle aree di endemia di questo
parassita, ma, stante il raro riscontro di fenotipi
carenti, sembra evidente che essi non possano aver
influito od operato pesantemente sul rapporto tra
genotipo ed endemia malarica.
Va ricordato che anche le emazie con la deficienza
della glicoforina B sono meno suscettibili
all'invasione, ma sostanzialmente non come quelle
con il deficit della GPA, mentre i soggetti con il
fenotipo Leach dimostrano un certo grado di
resistenza all'invasione dello stesso plasmodio3.
Per quanto riguarda l'acido sialico, contenuto nelle
glicoforine per il 70% della quantità totale presente
nell'emazia, non è stato stabilito quale sia la sua reale
importanza per l'invasione del Plasmodium
falciparum.
Come vedremo più oltre, nel rapporto tra gli
antigeni gruppoematici e l'invasione da parassiti
malarici non risultano coinvolti soltanto gli antigeni
del sistema MN, ma anche quelli del sistema Knops
(CR1) e la banda 3 con gli antigeni Diego, che
agiscono da possibili recettori per il Plasmodium
falciparum3 e, infine, gli antigeni Duffy.
Le glicoproteine con funzione di regolazione
del complemento ed i sistemi Cromer e Knops
Tre glicoproteine della membrana possiedono la
capacità di proteggere la cellula dalla distruzione ad
opera del complemento (C) di formazione autologa:
il decay-accelerating factor (DAF o CD55), il
complement receptor-1 (CR1 o CD35) e il membran
inhibitor of reactive lysis (MIRL o CD59). Alla DAF
sono associati gli undici determinanti antigenici del
sistema Cromer (otto dei quali sono di alta e tre di
bassa frequenza). I cinque antigeni del sistema Knops
sono associati alla CR1 con un numero di molecole
sulla membrana che differisce notevolmente a
seconda dei soggetti, variando da 20 ad oltre 8003739
. La MIRL è, invece, priva di attività antigenica
gruppoematica.
Le molecole delle glicoproteine DAF e MIRL sono
formate da un dominio extracellulare che è "ancorato"
per mezzo del glycosilphosphatidilinositol (GPI) alla
membrana dell'eritrocita e di tutte le cellule che
vengono in contatto con il siero (da quelle ematiche,
fragments, transporting them to the liver and spleen
so that they are removed from the circulation. CD59,
which also participates in regulating the complement
cascade by inhibiting complement-mediated lysis of
blood by fixing the C8 and C9 components of
complement, seems to have an even more important
role in protecting RBCs from the action of
autologously produced complement.
The synthesis of GPI in the cells is coded for by
an X-linked gene called PIG-A, whose mutation in
somatic cells underlies paroxysmal nocturnal
haemoglobinuria (PNH). This acquired disorder of
haematopoietic stem cells is basically characterized
by chronic intravascular haemolysis, with recurrent
crises and severe disorders in some organs and
apparatuses. RBCs of patients with PNH, typically
lacking DAF and CD59, are particularly prone to
undergo lysis in in vitro tests when mixed with
acidified serum because of activation of the
alternative complement pathway.
The Cromernull (or Inab) phenotype, characterised
by a total absence of DAF, is the expression of a
punctiform mutation of the gene with formation of a
stop-codon 38 . The RBCs of carriers are not
haemolysed in in vitro tests with acidified serum,
nor do they seem to be destroyed prematurely in
vivo3. The defect underlying the Inab phenotype,
comprising various types of mutation of the DAF
gene, differs from that of PNH because in this latter
both transcription and translation of the gene are
intact and the anomaly concerns the inability to
"anchor" the protein to the membrane through the
GPI 37.
There is a phenotype lacking the main Knops
antigens (Kna, Knb, McCa, SIa); this phenotype is
named "Helgeson", after the researcher who, in
collaboration with others, described the first
antibody of the system (which reacted with almost
all the samples, except those of four unrelated
subjects, including Hegelson herself)40.
The finding that some strong antibodies of the
system were able to react, albeit very weakly, with
the RBCs of "Helgeson" phenotype, has now led
this to be considered as a depressed phenotype rather
than a null phenotype.
No important clinical conditions have been
reported in association with this phenotype, but a
possible selective advantage of the SI(a-) phenotype
in respect of red cell invasion by Plasmodium
falciparum should be mentioned18.
a quelle dell'endotelio vascolare e degli epiteli dei
sistemi gastrointestinale, genito-urinario e nervoso
centrale), mentre nel plasma la DAF è presente in
forma solubile3 .
La glicoproteina DAF inibisce l'associazione ed
accelera la dissociazione del C4b2a e del C3bBb, le
due frazioni del C che formano la C3-convertasi
operante sia nella via classica che alterna del C. La
funzione principale della CR1 è di fissare e
processare gli immunocomplessi ricoperti dalle
frazioni C3b/C4b, trasportandoli al fegato e alla milza
al fine di rimuoverli dal circolo.
La CD59, che pure partecipa alla regolazione della
cascata del C inibendo la lisi delle emazie
complemento-mediata tramite la fissazione delle
frazioni C8 e del C9 del C, sembra avere un ruolo
ancora più importante nella protezione delle emazie
dall'azione del C di origine autologa.
La sintesi del GPI nelle cellule è codificata da
un gene X-linked denominato PIG-A la cui
mutazione nelle cellule somatiche è alla base
dell'emoglobinuria parossistica notturna (EPN), un
disordine acquisito delle cellule staminali
emopoietiche, fondamentalmente caratterizzato da
uno condizione di iperemolisi intravascolare
cronica, con crisi ricorrenti e gravi disturbi a carico
di alcuni organi ed apparati. Le emazie dei pazienti
affetti da EPN, tipicamente carenti della DAF e della
CD59, presentano la particolarità di andare incontro
a lisi, se nei test in vitro sono messe in contatto
con siero acidificato, tramite l'attivazione della via
alterna del C.
Il fenotipo Cromer null (o Inab), caratterizzato da
una totale assenza del DAF, è l'espressione di una
mutazione puntiforme del gene con formazione di
stop-codon38. Le emazie dei portatori non vengono
emolizzate nei test in vitro con il siero acidificato né
dimostrano di essere distrutte prematuramente in
vivo3. II difetto alla base del fenotipo Inab, costituito
da mutazioni di varia natura del gene DAF, differisce
da quello dell'EPN per il fatto che in questa sia la
trascrizione che la traduzione del gene risultano intatte
e l'anomalia riguarda invece l'incapacità di "ancorare"
la proteina alla membrana tramite il GPI37. È stato
descritto un fenotipo carente dei principali antigeni
Knops (Kn a , Kn b , McC a , SI a ) denominato
"Helgeson", dalla ricercatrice che descrisse, in
collaborazione con altri, il primo anticorpo del sistema
(che reagiva con la quasi totalità dei campioni
cimentati, tolti quelli di quattro soggetti non correlati,
31
GL Molaro, G Reali
Band 3 and the Diego system
Band 3, like GPA, is one of the most important
transmembrane proteins of the red blood cell
membrane: there are about one million copies of each
per cell41,42.
As already mentioned, numerous antigens of the
MN blood group system (43 have been recognised
so far) and the T and Pr antigenic determinants are
associated with GPA; the 19 known antigens of band
3 are part of the Diego blood group system18.
The functional role of band 3 is not yet well
understood. Based on studies in mice in which band
3 was inactivated (knockout mice), it was
hypothesised that band 3 has a role as a "chaperon",
essential for the expression of GPA on the surface
of red blood cells.
This hypothesis does not, however, seem to be
valid in humans in whom band 3 has been
demonstrated to have a function in transporting
anions across the cell membrane. Indeed it seems to
act particularly as an antiporter for the exchange of
H 2CO 3 with Cl - ions, in order to prevent the
accumulation of carbonic acid in the erythrocytes
and to release it into the blood from where it is then
eliminated in the form of CO 2. One definitely
important function of band 3 is to maintain the
integrity and shape of the RBCs, through its binding
with the cytoskeletal protein, ankyrin, and bands 4.2
and 4.1. Some mutations in the gene coding for band
3 and, thus, for the Diego determinants (the AE1
gene, that is Anion Exchange protein) are, in fact,
associated with morphological changes in the RBC.
Indeed, the approximately 20% of patients with
hereditary spherocytosis with various mutations of
the gene for band 3 and an absence or decrease of
the above mentioned membrane proteins, have the
same red cell morphological abnormalities.
Band 3 has also been attributed a role in the
removal of senescent RBCs. Old red cells undergo
changes in the terminal stages of their life cycle,
developing autoantigens that expose them to the
action of auto-antibodies formed in response to the
antigenic stimulation that they themselves have
provided. There are no reports of a total absence of
band 3 or of subjects with a Diegonull phenotype,
but there are observations that an anomaly of the
band 3 gene, consisting in a deletion of 27 base pairs,
prevents its transcribed protein (abnormal, because
it lacks at least nine aminoacids) from functioning as
32
fra cui la studiosa stessa)40. La constatazione che
alcuni potenti anticorpi del sistema erano in grado
di reagire, sia pur molto debolmente con le emazie
di fenotipo "Helgeson" ha indirizzato a considerarlo
come un fenotipo depresso piuttosto che un
fenotipo null. Non vengono segnalate alterazioni
cliniche importanti connesse con questo fenotipo,
ma va attirata l'attenzione sul possibile vantaggio
selettivo del fenotipo SI(a-) nei riguardi
dell'invasione eritrocitaria da parte del Plasmodium
falciparum 18.
La banda 3 ed il sistema Diego
La banda 3 è tra le più importanti proteine integrali
della membrana eritrocitaria, così come lo è la GPA:
ciascuna è presente con circa un milione di copie
per cellula41,42. Come già ricordato, alla GPA sono
associati i numerosi antigeni del sistema
gruppoematico MN (43 sono quelli attualmente
conosciuti) ed i determinanti antigenici T e Pr; i 19
antigeni noti della banda 3 fanno parte del sistema
gruppoematico Diego18.
Il ruolo funzionale della banda 3 non è stato
ancora ben definito. Sulla base di studi condotti in
topi nei quali la suddetta banda era stata inattivata
(knockout mice) si è ipotizzato che essa possieda
una funzione di "chaperon" essenziale per
l'espressione della GPA sulla superficie dell'emazia.
L'ipotesi non sembra essere valida in campo umano,
mentre è stata invece dimostrata la sua funzione di
trasporto di anioni attraverso la membrana, attività
che si estrinseca, in particolare, come antiporter per
lo scambio dell'H2CO3 con gli ioni Cl- onde impedire
l'accumulo dell'acido carbonico nelle emazie e
liberarlo nel sangue per essere, poi, eliminato come
CO 2.
Una funzione, certamente importante, della banda
3 è di mantenere l'integrità e la forma dell'emazia
attraverso la sua interazione con il citoscheletro, che
si estrinseca legandosi alle sue proteine e
precisamente all'anchirina e alle bande 4.2 e 4.1.
Alcune mutazioni del gene che codifica per la banda
3 e, quindi, per i determinanti Diego (gene AE1, cioè
Anion Exchange protein) si associano, infatti, alla
comparsa di alterazioni morfologiche dell'emazia e
la conferma di questa azione è data dal fatto che nel
20% circa dei pazienti affetti da sferocitosi ereditaria,
portatori di diverse mutazioni del gene per la banda
3 con assenza o diminuzione delle suddette proteine
an antiporter: subjects with this condition have
ovalocytosis together with resistance to malaria,
but without particular clinical disorders. They are
considered to be heterozygous carriers of a
genetic abnormality manifested by the appearance
of the so-called Southeast Asian Ovalocytosis 42,43.
The homozygous form of this anomaly is
considered fatal 44, but the report of a neonate with
severe
dyserythropoietic
anaemia,
erythroblastosis, poikilocytosis, hydrops, and
total absence of band 3, who was kept alive by
continuous transfusion therapy and daily
administration of sodium bicarbonate, suggests
that the total absence of band 3 is compatible
with life provided suitably intensive treatment is
given3. Confirmation of the organic and functional
alterations associated with total absence of band
3 have come from observations in animals (bovine
studies) 45 .
The Colton system and the Coltonnull phenotype
The antigenic determinants of this system are Coa,
and Cob. A third antigen, named Co3, is present in
the RBCs of all individuals except those with the
Coltonnull or Co(a-b-) phenotype.
The glycoprotein carrying the Colton antigens,
named aquaporin-1 (AQP-1) and coded for by
the AQP-1 gene, is part of a family of proteins
with channels for the selective passage of water
across the cell membrane. Of the cell membrane
glycoproteins it is the one that is expressed on
the cells of the greatest number of tissues other
than RBCs (it is highly expressed in the kidney,
choroid plexus and in various epithelia and
endothelia).
There are acquired and congenital forms of the
Co(a-b) phenotype, associated with monosomy of
chromosome 7 or with congenital dyserythropoietic
anaemia46.
There have also been four unrelated subjects
identified with the Coltonnull, phenotype: three had
an absence or very severe reduction of AQP-1,
together with a decreased erythrocyte osmotic
permeability to water, and a variant of the AQP-1
gene, without apparent clinical disorders; the fourth
suffered from a form of congenital
dyserythropoietic anaemia with a level of AQP-1
less than 10% of the normal and greatly reduced
osmotic permeability3.
di membrana, si riscontrano le stesse anomalie
morfologiche eritrocitarie.
Alla banda 3 è stato attribuito un ruolo anche
nella rimozione delle emazie senescenti, che vanno
incontro ad alterazioni nelle fasi terminali del loro
ciclo vitale, con formazione di autoantigeni,
esponendole così all'azione di autoanticorpi formati
in risposta ad una stimolazione antigenica da esse
esercitata.
Mancano segnalazioni di una totale deficienza
della banda 3 e di soggetti con un fenotipo
Diegonull, ma esistono osservazioni che dimostrano
come un'anomalia del suo gene, consistente in una
delezione di 27 paia di basi, impedisca al suo
trascritto proteico, anomalo perché privo di nove
amminoacidi, di funzionare come antiporter: I
soggetti con questa condizione presentano
un'ovalocitosi delle emazie assieme ad una
resistenza all'invasione malarica, ma senza
particolari disturbi clinici. Essi vengono considerati
come portatori, allo stato eterozigote, di una
anomalia genica che si estrinseca con la comparsa
della cosiddetta Southeast Asian Ovalocytosis42,43.
La forma omozigote di tale anomalia viene
considerata letale44, ma la segnalazione di un neonato
con grave anemia diseritropoietica, eritroblastosi,
poichilocitosi eritrocitaria, idrope, totale assenza
della Banda 3, mantenuto in vita mediante una
continua terapia trasfusionale di supporto e
somministrazione giornaliera di bicarbonato di
sodio, fa ritenere che la totale assenza della banda
3 sia compatibile con la vita, purché venga
impiegato un adeguato intensivo trattamento
medico3. Una conferma delle alterazioni organiche
e funzionali associate ad una totale mancanza della
banda 3 viene da osservazioni in campo animale
(bovini)45.
Il sistema Colton ed il fenotipo Coltonnull
I determinanti antigenici di questo sistema sono
il Coa, il Cob. Un terzo antigene, denominato Co3, è
presente sulle emazie di tutti gli individui ad eccezione
di quelle con il fenotipo Coltonnull o Co(a-b-).
La glicoproteina, portatrice degli antigeni Colton,
denominata acquaporina-1 (AQP-1) e codificata dal
gene AQP-1, fa parte della famiglia delle proteine
con canali per il passaggio selettivo dell'acqua
attraverso la membrana cellulare. Tra le glicoproteine
delle membrane cellulari è quella che, oltre che sulle
33
GL Molaro, G Reali
The Kidd system and the Jk(a-b-) phenotype
The Kidd glycoprotein, associated with the three
antigenic determinants of the system, Jka, Jkb and
Jk3, is present on all RBCs with the exception of in
those rare, unrelated subjects who have the Kiddnull
or Jk(a-b-) phenotype.
There are two types of Kiddnull phenotype: one
caused by homozygosity for the amorph gene Jk
(carried on the JK locus, on the long arm of
chromosome 18, in position q11.1-q11.2) and one
due to the action of a dominant inhibitory gene, called
In(Jk), definitely carried on a different locus than
that of the JK (even though its exact site has not yet
been identified).
Gene analysis has shown that the "amorph" null
phenotype is the result of a mutation in RNA
splicing 47 . Although this is an extremely rare
phenotype in most populations, its frequency in
Polynesians is one in 400 subjects.
The red blood cells of a subject with the Kiddnull
phenotype are resistant to osmotic lysis when placed
in a 2M urea solution, but this characteristic does
not seem to cause clinically significant disorders.
In fact, the Kidd glycoprotein seems identical to
the urea transporter named HUT11.
Its physiological function is, therefore, to ensure
rapid transport of urea across the red cell membrane:
this would prevent contraction of the RBCs during
its passage through the urea-rich environment of the
renal medulla and at the same time, prevent urea being
carried out of the kidneys3.
The Duffy system and the Fy(a-b-) phenotype
The allelic genes which, in the overwhelming
majority of subjects of European and Asian origin,
underlie the Duffy system, are Fya and Fyb: these
genes code for the Fya and Fyb antigenic determinants
and are hence responsible for the three classic
phenotypes: Fy(a+b-), Fy(a+b+) and Fy(a-b+).
In the Black African population there is a third
allele, Fy, which does not produce the two
abovementioned antigens.
Homozygosity for this gene produces a fourth
phenotype, Fy(a-b-), which is found in almost 100%
of Black West Africans and in about 68% of Black
Americans. The Fy allele is identical to Fyb, with the
removal of the mutation of a single nucleotide base
within the site a gene named GATA-1 binding: this
34
emazie, è espressa sulle cellule del maggior numero
di tessuti (nel rene in maniera elevata, nel plesso
coroideo e in vari epiteli ed endoteli).
Si conoscono forme acquisite e anche forme
congenite del fenotipo Co(a-b-), associate ad una
monosomia del cromosoma 7 o ad un'anemia
diseritropoietica congenita 46 . Sono stati altresì
osservati quattro soggetti con il fenotipo
Colton null,senza legami di parentela tra loro: tre
dimostravano un'assenza o un'estrema riduzione
dell'AQP-1, assieme ad una diminuzione della
permeabilità osmotica all'acqua nelle emazie, e la
presenza di una variante del gene AQP-1,senza,
peraltro, presentare apparenti segni di disturbi clinici;
il quarto soffriva di una forma di anemia
diseritropoietica congenita con un livello dell'AQP1 meno del 10% del normale e una permeabilità
osmotica molto ridotta3.
Il sistema Kidd ed il fenotipo Jk(a-b-)
La glicoproteina Kidd, cui sono associati i tre
determinanti antigenici del sistema, Jka, Jkb e Jk3, è
presente in tutte le emazie ad eccezione di quelle di
rari soggetti non correlati, portatori del fenotipo
Kiddnull o Jk(a-b-). Esistono due tipi di fenotipo Kidd
minus-minus: uno determinato dallo stato di
omozigosi per il gene amorfo Jk (portato sul locus
JK, sistemato sul braccio lungo del cromosoma 18,
in posizione q11.1-q11.2) e uno dovuto all'azione di
un gene inibitore dominante, designato In(Jk) e
portato sicuramente su un locus diverso da JK (anche
se l'esatta sistemazione cromosomica non è stata
ancora individuata).
L'analisi genetica ha dimostrato che il fenotipo
null "amorfo" è il prodotto di una mutazione
dell'RNA splicing47. Se nella maggior parte delle
popolazioni si tratta di un fenotipo estremamente
raro, esso è presente nella Polinesia con una
frequenza di 1 su 400 soggetti. Le emazie de fenotipo
Kiddnull dimostrano una resistenza alla lisi osmotica
quando sono poste in una soluzione di urea 2M, ma
non risulta che tale caratteristica provochi disturbi
clinicamente significativi.
Infatti, la glicoproteina Kidd si è dimostrata del
tutto sovrapponibile al trasportatore di urea
denominato HUT11.La sua funzione fisiologica è,
quindi, quella di assicurare un trasporto rapido
dell'urea attraverso la membrana eritrocitaria:
consentirebbe di prevenire il restringimento delle
mutation abolishes transcription of the Fy antigen
on RBCs, but not on cells of other tissues.
The erythrocytes of all three common phenotypes
of the system, with the exception of the Fy(a-b-)
phenotype, also express the Fy3 antigenic
determinant.
This antigen is defined by an antibody formed,
as a result of transfusion and/or gestational
immunisation, by rare non-African carriers of the
Fy(a-b-) phenotype.
Studies of the region coding for the Duffy antigens
in three subjects with the Fy(a-b-) phenotype showed
that there were nonsense mutations or a deletion in
the fourteenth pair of bases which had led to the
formation of a stop codon.
The Duffy locus (denoted: FY) is located on the
long arm of chromosome 1, in position q22-q23,
very close to the centromere. This same
chromosome also carries the RH locus, which could
explain the known interactions between the two
systems18.
The Duffy glycoprotein is known as the Duffy
Antigen Receptor for Chemokines (DARC) because
of its function as a cell receptor for a variety of
pro-inflammatory cytokines: as such, it has the
capacity to activate and recruit leucocytes, thus
becoming involved in many cell interaction
processes. DARC fixes a variety of chemokines,
including interleukin-8 (IL-8), RANTES (Regulated
on activation normal T expressed and secreted),
and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1).
Indeed, the molecular structure of DARC is similar
to that of the receptors belonging to one of the
largest families of glycoproteins in mammals, which
have the capacity to bind to many different
ligands48.
The real and specific function of DARC does,
however, remain unknown.
Given its widespread presence on tissue cells
(vascular endothelium of various organs, renal and
pulmonary epithelium) it is thought that DARC acts
as a receptor for eliminating mediators of
inflammation and that Duffy-positive red blood cells
have a "scavenger" function, removing unwanted
chemokines.
The importance of this function must, however,
by limited considering that the absence of DARC
from the RBCs of most Africans, carriers of the
Fy(a-b-) phenotype, is not accompanied by
recognised clinical disturbances. This implies that
emazie durante il loro passaggio nell'ambiente ad alta
concentrazione di urea della zona midollare del rene
e nello stesso tempo di evitare il trasporto dell'urea
al di fuori del rene stesso3.
Il sistema Duffy ed il fenotipo Fy(a-b-)
I geni alleli, che nella stragrande maggioranza dei
soggetti di origine europea ed asiatica stanno alla
base del sistema Duffy, sono il Fya e Fyb: questi geni
codificano per i determinanti antigenici Fya e Fyb e
condizionano, conseguentemente, la comparsa dei
tre classici fenotipi: Fy(a+b-), Fy(a+b+) e Fy(a-b+).
Nella popolazione negra africana è presente un
terzo allele il Fy che non produce i due suddetti
antigeni. Una condizione di omozigosi per questo
gene produce un quarto fenotipo il Fy(a-b-), che si
riscontra nella popolazione negra dell'Africa
occidentale con una frequenza vicina al 100% dei
soggetti e nel 68% dei negri americani. L'allele Fy è
identico al Fyb, tolta la mutazione di una singola base
nucleotidica entro il sito del gene denominato binding
GATA-1: mutazione che abolisce la capacità di
trascrizione dell'antigene Fy a livello eritrocitario, ma
non sulle cellule di altri tessuti.
Sulle emazie di tutti e tre i comuni fenotipi del
sistema, ad eccezione di quelle con il fenotipo
Fy(a-b-), viene espresso anche il determinante
antigenico Fy3 definito da un anticorpo formato, per
immunizzazione trasfusionale e/o gravidica, dai rari
individui non Africani portatori del fenotipo
Fy(a-b). In tre soggetti con il fenotipo Fy(a-b-),
che avevano prodotto un anticorpo anti-Fy3, lo
studio della regione codificante per gli antigeni Duffy
ha dimostrato l'esistenza di mutazioni nonsense o di
una delezione a livello del quattordicesimo paio di
basi che ha portato alla formazione di uno stop codon.
Il locus Duffy (sigla: FY) è situato sul braccio
lungo del cromosoma 1, in posizione q22-q23, molto
vicino al centromero, cioè sullo stesso cromosoma
che porta il locus RH, il che può dare conto delle
note interazioni esistenti fra questi due sistemi18.
La glicoproteina Duffy è nota con la
denominazione di Duffy Antigen Receptor for
Chemokines (DARC) per la sua funzione di recettore
cellulare comune a una varietà di citochine proinfiammatorie: come tale, possiede la capacità di
attivare e reclutare i leucociti, venendo così coinvolta
in molti processi di interazione cellulare. Fra le diverse
chemochine fissate dalla DARC vi sono
35
GL Molaro, G Reali
this particular function of DARC is of only relative
importance3.
It has been demonstrated, on the other hand, that
DARC acts as a cell receptor essential for the
merozoites of Plasmodium vivax, responsible for
tertian malaria. In normal conditions the gene coding
for its production contains a GATA-1 site, called
DARC promoter region, responsible for the
transcription of this glycoprotein in the cell
membrane.
The lack of DARC transcription in Fy(a-b-)
subjects is due to a punctiform mutation in the socalled promoter region of the gene, so the receptor
is not formed on blood cells, but its production on
cells of other tissues is not affected49.
A high percentage of Africans have the Fy(a-b-)
phenotype, and the fact that their blood, lacking
DARC, is refractory to invasion by malarial parasites
is a selective advantage in areas in which there is
widespread diffusion of Plasmodium vivax;
nevertheless, it should be remembered that this
protection is not active against other species of
malarial parasite48.
The glycoproteins that regulate complement
and the Lutheran and LW systems
The red cell membrane carries numerous
glycoproteins that are characterised by an
extracellular domain formed of a different number
of sequences homologous to the variable (V) or
constant (C) part of immunoglobulins.
There are at least five glycoproteins in this
"superfamily" (IgSF): two of them are associated
with antigenic determinants of the Lutheran and
Landsteiner-Wiener (LW) blood group systems.
Of the other IgSF, only CD147 is associated
with the Oka antigen, while the other two, CD47
and CD58 (LFA-3) do not appear to be linked to
particular red cell antigens3,18,50.
The Lutheran system comprises at least 18
antigenic determinants: in reality the numbering has
reached 20, but two (Lu10 and Lu15) have been
cancelled.
Four of the Lutheran determinants are coded for
by allelic genes: Lua-Lub; Lu6-Lu9; Lu8-Lu14 and
Lu18 (or Aua)-Lu19 (or Aub)50.
The Lutheran glycoproteins are not only
expressed in RBCs in two isomeric forms with
molecular weights of 85 and 78 kilodaltons, but are
36
l'interleuchina-8 (IL-8), le RANTES (Regulated on
activation normal T expressed and secreted), la
monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) e altre.
La struttura molecolare della DARC è, infatti, simile
a quella dei recettori appartenenti ad una delle più
grandi famiglie di glicoproteine nei mammiferi, che
possiedono la capacità di fissare molti differenti
ligandi48.
Rimane però ancora ignota quale sia la sua reale
e specifica importanza funzionale. Si è ritenuto che,
data la sua ampia diffusione nelle cellule dei tessuti
(l'endotelio vascolare di vari organi, gli epiteli del
rene e del polmone), la DARC agisca da recettore
per eliminare i mediatori dell'infiammazione e che le
emazie Duffy-positive abbiano una funzione di
"spazzino" per la rimozione delle chemochine
indesiderate. L'importanza di tale funzione, peraltro,
deve essere limitata, se si considera che la sua
assenza nelle emazie della maggior parte della
popolazione africana, portatrice del fenotipo Fy(ab-), non si accompagna alla segnalazione di disturbi
clinici associati a tale anomalia. Da ciò, la deduzione
che l'importanza di tale funzione della DARC sia solo
relativa3.
È stato dimostrato, invece, che la DARC funge
da recettore cellulare essenziale per i merozoiti del
Plasmodium vivax, responsabile della malaria terzana.
In condizioni normali nel gene che ne codifica la
produzione esiste un sito GATA-1, denominato DARC
promoter region, dal quale dipende la trascrizione di
questa glicoproteina nella membrana cellulare. Nei
soggetti Fy(a-b-) la sua mancata trascrizione è dovuta
ad una mutazione puntiforme nella suddetta regione
promoter del gene, con conseguente mancata
formazione del recettore sulle emazie, senza però
interferire con la produzione della DARC sulle cellule
di altri tessuti49.
La refrattarietà delle emazie prive della DARC
all'invasione del parassita malarico presentata dagli
Africani, portatori in elevata percentuale del fenotipo
Fy(a-b-), costituisce pertanto un vantaggio selettivo
nelle zone a maggior diffusione del Plasmodium vivax,
ma va ricordato che tale protezione non vale per altre
specie del parassita malarico48.
Le glicoproteine che regolano il complemento
e i sistemi Lutheran e LW
Sulla membrana dell'eritrocita vi sono numerose
glicoproteine contrassegnate dalla presenza di un
also widely distributed in numerous tissues and
organs (foetal liver, placenta and others).
Their molecular structure is similar to that of the
adhesion proteins of human and animal cells,
including neoplastic ones51.
Their specific ligand is laminin, which is the major
component of the basal membranes of cells.
Since the capacity of RBCs to fix laminin is
correlated with the expression of the Lutheran
antigens, it is considered that the glycoproteins of
this system are involved in adherence of erythrocytes
to endothelial cells of blood vessels and, thus, that
they have a role in the vascular occlusion that
characterises some disorders (for example
drepanocytic anaemia).
These glycoproteins are also thought to play a
role in the late stages of erythropoiesis, again through
a mechanism involving interaction with laminin3.
The rare null phenotype of the Lutheran system,
that is Lu(a-b-), has a triple genetic background.
The first is due to a dominant gene, called In(Lu),
which prevents the normal expression of the Lutheran
antigens and is not associated with the LU gene, but
is carried on a different locus.
The expression of other red cell antigens,
including P 1 and i, is suppressed (or strongly
depressed) in carriers of this phenotype.
The members of two families with Lu(a-b-)
phenotype due to this mechanism formation had
acanthocytosis and poikilocytosis, together with
a reduced amount of receptor for concanavalin
and altered electrolyte metabolism.
It should be remembered that the term InLu has
been considered inappropriate and an alternate
nomenclature to substitute it has been proposed:
SYN-IB (SYN: synthesis)18.
The other two mechanisms forming the
Lutherannull phenotype are the homozygous presence
of an amorph recessive gene Lu at the LU locus
and that of a recessive, X-linked gene50.
The LW blood group system is serologically
associated with the D antigen of the Rh system, as
demonstrated by the facts that the expression of LW
antigen is higher in RhD-positive RBCs than it is in
RhD-negative RBCs and that subjects with the Rhnull
phenotype are also LWnull phenotype. However, the
observation of a subject with the extremely rare
phenotype LWnull, LW(a-b-ab-) who had normal Rh
antigens demonstrates that the two systems are coded
for by genes at different loci18.
dominio extracellulare, formato da un differente
numero di sequenze omologhe a quelle della parte
variabile (V) o costante (C) delle immunoglobuline.
Almeno cinque sono le glicoproteine che
compongono questa "superfamiglia" (IgSF): due di
esse si associano ai determinanti antigenici dei sistemi
gruppoematici Lutheran e Landsteiner-Wiener (LW).
Delle altre glicoproteine IgSF, solo la CD147 è
associata all'antigene Oka, mentre le restanti due, la
CD47 e la CD58 (LFA-3) non risulta che siano
collegate a particolari determinanti antigenici
eritrocitari3,18,50.
Il sistema Lutheran è formato da almeno 18
deteminanti antigenici: in realtà la nomenclatura
numerica ne contempla 20, ma due (Lu10 e Lu15)
sono stati cassati. Fra i determinanti Lutheran, quattro
sono codificati da geni alleli: Lua-Lub; Lu6-Lu9; Lu8Lu14 ed Lu18 (o Au a )-Lu19 (o Au b ) 50 . Le
glicoproteine Lutheran sono espresse non soltanto
sulle emazie con due forme isomere di peso
molecolare di 85 e 78 kilodalton, ma sono
ampiamente distribuite anche in numerosi tessuti ed
organi (fegato fetale, placenta e altri) con una struttura
molecolare simile a quella delle proteine di adesione
delle cellule umane e degli animali, comprese quelle
neoplastiche51. Il loro ligando specifico è la laminina,
che è il maggiore componente delle membrane basali
delle cellule.
Poiché la capacità delle emazie di fissare la
laminina è correlata all'espressione degli antigeni
Lutheran, si ritiene che le glicoproteine di questo
sistema siano coinvolte nell'aderenza dell'eritrocita
alle cellule all'endotelio dei vasi sanguigni e abbiano,
quindi, un ruolo nei processi di occlusione vascolare
caratteristici di alcune forme morbose (per esempio,
nell'anemia drepanocitica). Tali glicoproteine
avrebbero un ruolo anche nelle fasi più tardive
dell'eritropoiesi, sempre attraverso il meccanismo
dell'interazione con la laminina3. Il raro fenotipo null
del sistema Lutheran, cioè il Lu(a-b-), presenta la
caratteristica di avere un triplice background genetico.
Il primo è quello dovuto ad un gene dominante
denominato In(Lu), che impedisce la normale
espressione degli antigeni Lutheran e non è associato
al gene LU, ma è portato da un locus differente. Nei
portatori di questo fenotipo risultano soppressi (o
fortemente depressi) altri antigeni eritrocitari fra i quali
il P1 e l'i. Nei membri di due famiglie con il fenotipo
Lu(a-b-) riconducibile a questo meccanismo di
formazione, è stata osservata la presenza di una
37
GL Molaro, G Reali
It has been shown that this phenotype is produced
by the deletion of 10 nucleotides of the LW gene52,
although the anomaly does not seem to be associated
with any specific pathology3.
About 30% of the aminoacid sequence of the
LW glycoprotein is the same as that of the intercellular
adhesion molecules (ICAM), which have been
identified on various white cell lines.
More precisely, the LW glycoprotein is ICAM-4
and its specific ligand is the CD11/CD18 integrin.
An interaction between ICAM and integrins would
be a phenomenon of considerable importance,
particularly during immune processes, because it
would ensure adhesion between cells of the immune
system (in particular the T lymphocytes) and
dendritic cells, with their specific role of antigen
presentation.
The exact physiological function of the LW
glycoproteins in the RBCs does, however, remain
unknown. One peculiarity of the LW system is the
transitory loss of its antigens which has been
observed in pregnant women and in subjects with
malignancies of the haematologic system and of other
tissues: this phenomenon could be indicative of an
underlying immunological disorder3.
38
acantocitosi e di una poichilocitosi delle emazie,
assieme ad una riduzione del recettore per la
concanavalina e a un alterato metabolismo degli
elettroliti. Va ricordato che il termine InLu è stato
considerato non appropriato ed è stata avanzata la
proposta di sostituirlo con quello di SYN-IB (SYN:
synthesis)18.
Le altre due modalità di formazione del fenotipo
Lutherannull sono, rispettivamente, quella dovuta alla
presenza di un gene recessivo amorfo Lu al locus
LU in forma omozigote e quella di un gene X-linked,
recessivo50.
Per quanto riguarda il sistema gruppoematico LW
la sua caratteristica è di essere sierologicamente
associato all'antigene D del sistema Rh, come è
dimostrato dal fatto che nelle emazie RhD-positive
l'espressione degli antigeni LW è più elevata di quella
delle emazie RhD-negative e che i soggetti con fenotipo
Rhnull risultano essere anche LWnull, ma l'osservazione
di un soggetto con il rarissimo fenotipo LWnull, LW(ab-ab-) che possedeva normali antigeni Rh, dimostra
che i due sistemi sono codificati da geni portati su loci
differenti18. È dimostrato che questo fenotipo è il
prodotto di una delezione di 10 nucleotidi del gene
LW52, ma è, peraltro, un'anomalia che non si associa a
specifiche patologie3.
La sequenza degli amminoacidi della glicoproteina
LW è per il 30% circa simile a quella delle molecole
di adesione intercellulari, le cosiddette ICAM, che
sono dimostrabili sulle diverse linee cellulari
leucocitarie. Più precisamente, la glicoproteina LW
è l'ICAM-4 ed il suo specifico ligando è l'integrina
CD11/CD18. L'interazione tra le ICAM e le integrine
sarebbe un fenomeno di notevole importanza,
soprattutto nel corso dei processi immunitari, perché
assicura l'adesione tra le cellule del sistema immune
(in particolare, i linfociti T) e le cellule dendritiche,
con il compito specifico di presentazione
dell'antigene.
La precisa funzione fisiologica delle glicoproteine
LW sulle emazie rimane, però, ancora sconosciuta.
Una particolarità del sistema LW è il fenomeno di
una perdita transitoria dei suoi antigeni che è stata
osservata in donne in corso di gravidanza e in soggetti
affetti da neoplasie ematologiche e di altri tessuti:
una situazione che potrebbe essere indicativa di un
sottostante disordine immunologico3.
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