il ruolo del gene b-raf nella diagnostica del tumore papillare della

IL RUOLO DEL GENE B-RAF NELLA DIAGNOSTICA
DEL TUMORE PAPILLARE DELLA TIROIDE
CARMINE RINALDI1, PAOLA RINALDI1, LUIGI ASCIONE1, MICHELE GENTILE1, VINCENZO VAGLIANO1,
VALERIA BOZZAOTRA1, GIUSEPPE SORVILLO2, ANTONIO FASCIONE2, MARIA CHIARA FASCIONE2,
GIOVANNA SALZILLO2, GIANLUCA RUSSO RAUCCI2, GIOVANNA SAPIO2, MARTINA DANZI4,
RAFFAELE GLORIA4, GIUSEPPE DI BENEDETTO3
1
Laboratorio di Biologia Molecolare P.O. Marcianise A.S.L. Caserta
2 Laboratorio di Patologia Clinica P.O. Marcianise A.S.L. Caserta
3 Laboratorio di Anatomia Patologica P.O. Aversa A.S.L. Caserta
4 Laboratorio di Patologia Clinica P.O. Aversa A.S.L. Caserta
Abstract
Using fine needle aspirate (FNAB) is the most effective way to distinguish a benign from a malignant thyroid
nodule, although in 8-20% of cases, the technique is inconclusive. The aim of our study was to assess whether
the search for BRAF V600E mutation could improve the diagnosis of nodules with indeterminate FNAB (TIR3).
We report the results of a study on a selected group of 16 indeterminate FNAB of a total of 124 samples, 14 of
which identified as suspicious cytology follicular TIR3 and 2 suspicious papillary TiR4. The cellular material
recovered by centrifugation was used to extract the DNA required for detection of the V600E BRAF gene
mutation by using an ARMS technique. The mutation was found in one of the 14 samples TIR3, typed
histologically as papillary carcinoma follicular variant, and one of the two samples TiR4 result of papillary
carcinoma on histology. For the remaining samples that were negative for BRAF V600E, histology confirmed the
benign lesion, except in one case identified as follicular carcinoma. Although this preliminary work, we believe
that the first data obtained are an incentive to continue the study to a better selection of patients for surgical
treatment.
Introduzione
Il carcinoma papillifero (PTC) è di gran lunga il più
frequente carcinoma tiroideo (circa 80% dei casi).
La sua frequenza è superiore nelle donne di 2-6 volte rispetto agli uomini. Dal punto di vista strutturale
è caratterizzato da una tipica architettura papillare
(Fig. 1) costituita da cellule con caratteristiche alterazioni nucleari a vetro smerigliato (Fig. 2). Molto
spesso i PTC sono multifocali e tendono a metastatizzare ai linfonodi regionali. Diverse considerazioni
indicano nelle radiazioni il fattore di rischio più importante. Infatti, un’alta incidenza del tumore si è
avuta tra i sopravvissuti alle bombe atomiche di Hiroshima e Nagasaki e recentemente, tra i bambini
della Bielorussia e dell’Ucraina a seguito del disastro
Figura 2. Ematossilina-eosina. Caratteristiche inclusioni nucleari
a vetro smerigliato in cancro papillare della tiroide.
di Chernobyl. L’aspirato mediante ago sottile
Figura 1. Ematossilina-eosina. Sezione istologica di cancro
papillare.
42
Figura 3. May-Grunwald Giemsa. Aspirato mediante ago sottile
(FNAB) caratteristiche inclusioni nucleari in elementi cellulari di
carcinoma papillare.
Figura 4. Schema struttura gene B-RAF.
(FNAB) rappresenta (Cohen et al, 2004; Ippolito et
al, 2004; Miller et al, 2004) il sistema più efficace
per distinguere un nodulo tiroideo benigno da uno
maligno (Fig. 3).
Purtroppo nell’8-20% dei casi la tecnica risulta inconclusiva. Scopo del nostro lavoro è stato quello di
valutare se la ricerca della mutazione B-RAF V600E
(Kimura et al, 2003; Xu X et al, 2003; Baloch et al,
2004; Sapio et al, 2006; Fagin Ja, 2004 ) potesse migliorare la diagnosi di noduli con FNAB indeterminato (TIR3).
Il gene B-RAF (Fig. 4) è un proto oncogene localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7 in posizione
q34. Esso è costituito da 18 esoni che danno origine
ad una serin/treonin chinasi appartenente alla famiglia delle proteine RAF insieme a A-RAF e C-RAF.
La mutazione (Davies et al.), dovuta alla transversione T --> A al nucleotide 1799 nell’esone 15 del gene,
è responsabile dell’origine dell’oncogene B-RAF
V600E e della trasformazione neoplastica dell’epitelio tiroideo tipica del PTC.
Materiali e metodi
Si riportano i risultati relativi ad uno studio che ha
previsto la ricerca della mutazione B-RAF V600E su
di un gruppo di 124 agoaspirati mediante ago sottile
(F-NAB) tiroidei. Il materiale cellulare, recuperato
mediante centrifugazione, è stato utilizzato per
estrarre il DNA con metodica di SALTING-OUT
modificata.
La ricerca dela mutazione è stata condotta con tecnica ARMS (Amplification Refractory Mutation Sy-
stem) utilizzando primers le cui sequenze sono riprodotte nella Tab. 1.
Allo scopo 100ng di DNA sono stati sottoposti a 35
cicli di amplificazione utilizzando una mix di reazione contenente, in 50ul finali, 10mMol TRIS-HCL
pH-8.3, KCl 50 mMol, dNTPs 200uMol, MgCl2 1,5
mMol, primers 25pmoli ciascuno, Taq Polymerase
(Euroclone 5UI/ul) 1,5 UI. I risultati sono riprodotti
nella Fig. 5 e sono stati confermati mediante sequenziamento genico della regione esonica contenete
la mutazione. Allo scopo è stata utilizzata la tecnica
di Sanger con l’impiego del Kit Big Dye Terminator
1
2
3
4
5
6
Figura 5. ETF gel di agarosio 2% + ETB
Lines 1-2: campione NEGATIVO per mutazione B-RAF V600E
Lines 3-4: carcinoma papillare tiroideo B-RAF V600E positivo
Lines 5-6: carcinoma papillare variante follicolare mista
Tab 1. Sequenze primers utilizzati per la PCR-ARMS
REV-COMMON
5’- ggC CAA AAT TTA ATC AgT ggA – 3’
FW-NORMALE
5’- gTg ATT TTg gTg TAg CTA CAg T- 3’
FW-MUTATO
5’- gTg ATT TTg gTg TAg CTA CAg A- 3’
43
Tab. 2. Correlazione tra classificazione citologica e mutazione B-RAF.
CITOLOGIA
CLASSIFICAZIONE
RISULTATI
MUTAZIONE B-RAF V600E
TIR 1
18 (14,5%)
NEGATIVI
TIR 2
86 (69,4%)
NEGATIVI
ASPETTI FOLLICOLARI
TIR 3
14 (11,3%)
1 POSITIVO/13 NEGATIVI
SOSPETTO PER MALIGNITÀ
TIR 4
2 (1,6%)
1 POSITIVO/1 NEGATIVO
POSITIVO PER MALIGNITÀ
TIR 5
4 (3,2%)
2 POSITIVI/2 NEGATIVI
124
124
NON DIAGNOSTICO
(Cluster Tireociti < 7)
NON NEOPLASTICO
(Gozzo nodulare – Tiroidite)
TOTALE
v1.1 Cycle sequencing – Applied Biosystems e lettura su analizzatore AB Prism 310 Genetic Analyzer
Applied Biosystem.
Risultati e commenti
Nella tabella 2 sono riprodotti i risultati relativi alla
correlazione tra classificazione citologica e ricerca
della mutazione. La mutazione B-RAF V600E, risultata assente in tutti i campioni classificati TIR1 e
TIR2, è stata invece, riscontrata in uno dei 14 campioni TIR3, tipizzato istologicamente come carcinoma papillare variante follicolare mista, ed in uno dei
2 campioni TIR4, risultato all’esame istologico carcinoma papillare (Fig. 5).
Per tutti i rimanenti TIR3 e TIR4 l’analisi istologica
ha confermato la benignità della lesione (10 adenomi
follicolari, 1 adenoma follicolare atipico e 2 gozzi
adenomatosi) tranne che in un caso risultato carcinoma follicolare. Da questi dati si ricava che la percentuale di malignità, risultata per la sola diagnostica citologica del 3,2% (4 positivi su 124 totali), sale
al 4,8% (6 positivi su 124 totali) abbinando la ricerca della mutazione di B-RAF V600E.
Conclusioni
Pur trattandosi di un lavoro preliminare, riteniamo
che i primi dati ottenuti siano di stimolo a proseguire lo studio soprattutto allo scopo di ottimizzare la
selezione dei pazienti tiroidei da inviare al trattamento chirurgico, questo grazie soprattutto alla
standardizzazione della tecnica di prelievo del campione che ha sempre fornito materiale cellulare idoneo sia per l’analisi citologica che per l’indagine biomolecolare.
Bibliografia
Baloch ZW, LiVoisi VA. Fine-needle aspiration of
thyroid nodules; past, present, and future. Endocrine
Pratice 2004; 10:234-41.
44
Cohen Y, Rosenbaum E, Clark DP et al.
Mutational analysis of BRAF in fine needle
aspiration biopsies of the thyroid: a potential
application for the preoperative assessment of the
thyroid nodules. Clinical Cancer Research 2004;
10:2761-5.
Davies H, Bignell GR, Cox C et al. Mutations of the
BRAF gene in human cancer. Nature 2002; 417:94954.
Fagin JA. Challenging dogma in thyroid cancer
molecular genetics-role of RET/PTC and BRAF in
tumor initiation. Journal of Clinical Endocrinology
and Metabolism 2004; 89: 4272-9.
Ippolito AM, De Laurentiis M, La Rosa GL et al.
Neural network analysys for evaluating cancer risk
in thyroid nodules with an indeterminate diagnosis
at aspiration cytology; identification of a low-risk
subgroup. Thyroid 2004; 14:1065-71.
Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z et al. High
prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer:
genetic evidence for constitutive activation of the
RET/PTC RAS-BRAF signalling pathway in
papillary thyroid carcinoma. Cancer Research 2003;
63: 1454-7.
Miller B, Burkey S, Lindberg G et al. Prevalence of
malignancy within cytologically indeterminate
thyroid nodules. American Journal of Surgery 2004;
188: 459-62.
Sapio MR, Posca D, Troncone G et al. Detection of
BRAF mutation in thyroid papillary carcinomas by
mutant allele-specific PCR amplification (MASA).
European Journal of Endocrinology 2006; 154:3418.
Xu X, Quiros RM, Gattuso P et al. High prevalence
of BRAF gene mutation in papillary thyroid
carcinomas and thyroid tumor cell lines. Cancer
Research 2003; 63:4561-7.
Pervenuto il 29/09/2011