LA VACCINAZIONE ORALE IN ACQUACOLTURA

LA VACCINAZIONE ORALE IN ACQUACOLTURA
VISMARA D. & GIORGETTI G.
Dipartimento di Ittiopatologia, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie,
Via della Roggia 92, 33030 Basaldella di Campoformido (UD), Italy
Riassunto
La vaccinazione è uno dei più importanti mezzi di controllo delle malattie diffusive in acquacoltura.
Diversi sono i metodi di somministrazione dei vaccini ma la via orale è sicuramente la più pratica,
permette la vaccinazione di pesci di tutte le taglie e non necessita di manipolazione del pesce evitando
momenti stressanti. Attualmente presenta dei limiti elevati in quanto non è in grado di stimolare buoni
livelli di protezione particolarmente nelle trote immunizzate con questa tecnica. Il presente lavoro
riporta i diversi studi compiuti al fine di superare tali limiti, studi orientati sulla possibilità di utilizzo di
vaccini "protetti" nell'alimento, sull'impiego di frazioni antigeniche quali i lipopolisaccaridi e i
polisaccaridi, gli immunostimolanti e adiuvanti e sulla possibilità di modificare le diverse fasi dei
processi digestivi.
Introduzione
Uno degli ostacoli allo sviluppo degli allevamenti ittici è l'insorgenza di malattie legate a fattori
ambientali sfavorevoli e ad agenti biologici.
Questi ultimi hanno assunto tale importanza da stimolare ricerche continue che hanno portato allo
sviluppo di misure preventive contro le più importanti malattie diffusive.
Come per le patologie degli animali omeotermi, le misure di controllo si basano su interventi zootecnici
(igiene e miglioramento genetico), profilassi sanitaria, trattamenti terapeutici e immunoprofilassi.
Nelle aree dove una malattia non è endemica è possibile combattere l'agente eziologico mediante
misure di polizia veterinaria. La maggioranza dei Paesi adottano questa politica così che le importazioni
e il movimento di pesce vivo e di uova viene accompagnato da certificato sanitario. All'eventuale
insorgenza di malattia in un'area indenne il controllo della diffusione si basa sulla eliminazione della
partita infetta e sulla disinfezione degli allevamenti. Tale politica richiede alti livelli di vigilanza
certificazione e cooperazione tra gli allevamenti e le autorità responsabili.
Allo stato attuale, in queste aree il rischio che allevamenti si infettino è comunque alto e una politica
basata su abbattimento/disinfezione può diventare molto costosa e a volte inefficace, se non nel caso di
una ampia bonifica sanitaria che porti al risanamento di aree rilevanti.
Per le malattie batteriche, i focolai possono essere controllati da chemioterapici ma ciò può risultare
insufficiente. In questi casi, quando una malattia è endemica, la vaccinazione diventa indispensabile.
In effetti il trattamento di malattie in atto con prodotti antimicrobici ha giocato e continuerà a giocare
un ruolo importante. Eppure bisogna sempre considerare che:
1) non esistono trattamenti efficaci contro le malattie virali;
2) i risultati ottenuti con l'uso di chemioterapici e disinfettanti contro le malattie batteriche sono per lo
più temporanei cosicché i trattamenti devono essere ripetuti più volte, non assicurando, comunque la
completa eradicazione della malattia;
3) stanno assumendo un ruolo sempre più preoccupante fenomeni di resistenza agli antibiotici da parte
di specie batteriche.
Inoltre l'uso di chemioterapici costituisce un problema connesso con la salute pubblica tra cui la
presenza di residui di farmaci nelle carni e gli effetti sull'ambiente, considerando tra le altre cose il
rischio potenziale di un trasferimento di antibiotico resistenza da batteri patogeni per gli animali a
batteri patogeni per l'uomo (Brisinello e Ceschia, 1988).
Generalità sulla vaccinazione
Dal 1976 ad oggi, in Europa, sono autorizzati e commercializzati diversi vaccini in acquacoltura.
Il primo è stato il vaccino contro la malattia della Bocca Rossa seguito dai vaccini contro la Vibri osi e
la Foruncolosi (Ellis, 1988).
Tutti e tre sono inattivati con la formalina. I vaccini per la Bocca Rossa e la Vibriosi sono molto
efficaci, mentre quello per la Foruncolosi offre una protezione non elevata che si pensa sia dovuta alla
stimolazione di meccanismi di difesa aspecifici (Ellis, 1988).
L'inattivazione dei microrganismi nei vaccini spenti può avvenire mediante trattamenti chimici o fisici,
La formalina agisce sui gruppi amino e amide delle proteine e sugli aminogruppi non legati all'idrogeno
delle basi puriniche e pirimidiniche degli acidi nucleici, formando legami crociati che conservano
l'integrità strutturale dei determinanti antigenici (Austin, 1984).
Altri prodotti chimici utilizzati per l'inattivazione di microrganismi che presentano nella loro membrana
dei lipidi, sono il cloroformio e il fenolo.
Anche l'idrossido di sodio a pH 9,5 è stato impiegato per l'inattivazione di batteri in vaccini
sperimentali.
L'uccisione di microrganismi denaturando le proteine col calore o mediante l' ossidazione dei lipidi,
spesso comporta la distruzione di determinanti antigenici importanti per lo sviluppo di una immunità
protettiva.
I vaccini attenuati richiedono dosi di inoculo più basse rispetto a quelli spenti e spesso stimolano un più
alto titolo anticorpale,
L'esposizione di microrganismi a concentrazioni subletali di agenti chimici o il trattamento con calore
non elevato sono vecchi metodi per ridurre la virulenza del batterio.
Mezzi più comunemente impiegati sono la coltura in terreni o a temperature sfavorevoli.
I virus vengono attenuati da passaggi ripetuti in colture tissutali o adattati in ospiti non abituali.
Strategie alternative includono vaccini subunitari e peptidi sintetici.
Entrambe queste tecniche richiedono la conoscenza dei determinanti antigenici che stimolano una
risposta protettiva (Stoskopf, 1993).
Nel caso di vaccini subunitari il tratto di DNA che codifica per il determinante antigenico che interessa
è trasferito in un batterio, un fungo o un'altra cellula che codifica per quella specifica proteina.
Quando i vaccini sono costituiti da peptidi sintetici conoscendo la sequenza degli epitopi protettivi di
una proteina questi possono essere sintetizzati.
Così i due metodi possono comunque essere utilizzati la realizzazione di un vaccino.
Fattori che condizionano l'esito della vaccinazione
Diversi fattori possono influire sulla risposta immunitaria: fattori intrinseci (età, stato di salute del
pesce, specie ittica) e fattori estrinseci (dose dell'antigene, modalità di somministrazione, presenza di
adiuvanti, tempera- tura dell'acqua).
Fattori intrinseci
La risposta immunitaria è più intensa e duratura quanto maggiore è l'età del pesce. Nel caso dei
salmonidi la risposta immunitaria permane per circa 120 giorni in animali di un grammo, per circa 180
giorni in animali di due grammi, mentre per avannotti di quattro grammi o più permane almeno un
anno (Brown, 1993).
E' noto che lo stress porta ad un abbassamento delle difese immunitarie. La risposta ad uno stress
induce delle reazioni fisiologiche comportamentali che possono aiutare il pesce ad adattarsi a nuove
situazioni, ma se lo stress è grave o prolungato nel tempo può portare ad un crollo del sistema
immunitario per un conseguente aumento di determinati ormoni, in primo luogo dei corticosteroidi, i
quali agiscono a livello di risposta immunitaria deprimendola (Ellis, 1988; Stoskopf, 1993).
La stagione e la temperatura sono aspetti dell'ambiente che possono interessare la risposta immunitaria
e che possono essere rilevanti per decidere quando vaccinare un pesce.
Molti studi hanno dimostrato che la risposta immunitaria di un pesce, sia essa cellulo mediata o
umorale, è più lenta ad instaurarsi a basse temperature.
In generale i migliori risultati sono stati ottenuti alle temperature normali estive, tenendo presente la
specie del pesce in esame ovvero se di acqua fredda, temperata o calda. Temperature più basse del
normale range fisiologico per quella specie di pesce (es. meno di 6°C per una trota o di 12°C per una
carpa) possono quindi deprimere la risposta immunitaria (Ellis, 1988).
Molti sistemi fisiologici hanno attività ritmiche su basi giornaliere, mensili o annuali. Ci sono prove che
indicano che il sistema immunitario del pesce può essere depresso relativamente a certi periodi
stagionali non legati unicamente alle basse temperature. La trota iridea allevata a 18°C tutto l'anno
sviluppa un più basso titolo anticorpale nei confronti di Aeromonas salmonicida quando viene
immunizzata prima dell'inverno rispetto a trote vaccinate prima della primavera (Zeeman, 1986; Ellis,
1988).
Fattori estrinseci
Molti fattori legati alla natura del vaccino o al metodo di vaccinazione condizionano la risposta
immunitaria.
Sebbene il livello della produzione di anticorpi nella risposta immunitaria primaria sia condizionato
entro certi limiti dalla dose dell'antigene, per l'induzione della memoria immunologica, un ruolo
fondamentale è svolto dalla natura dell' antigene.
Eritrociti di pecora in una carpa inducono una memoria immunologica più efficace quando iniettati a
medie o a basse dosi, sebbene sia più lenta a svilupparsi in quest'ultimo caso.
Diversamente lo sviluppo di una memoria immunitaria in una carpa nei confronti di Aeromonas hydrofila
iniettata per via intramuscolare è direttamente correlata con la dose dell'antigene e basse dosi inducono
solo la formazione di una debole memoria.
Molto importante è la forma nella quale un vaccino viene somministrato. Generalmente, antigeni
proteici solubili richiedono la contemporanea somministrazione di adiuvanti per stimolare la
produzione di anticorpi e comunque l'immunogenicità di un antigene varia tra specie e specie di pesce
(Ellis, 1988).
I principali metodi per la somministrazione dei vaccini sono: per iniezione, per nebulizzazione, per via
orale o per immersione.
La tecnica per iniezione per via intraperitoneale determina la produzione di alti titoli anticorpali nei
confronti di diversi batteri e virus. Gli svantaggi però sono molteplici ed in particolare la manipolazione
degli animali, la ridotta capacità operativa, l'alta incidenza di mano d'opera.
La via orale è una tecnica molto semplice, ideale per gli allevamenti ma spesso di scarsa efficacia, a
causa del processo di denaturazione subito dalle proteine antigeniche a livello digerente. Per la
vaccinazione di un gran numero di pesci l'immersione è la via migliore allo stato attuale delle
conoscenze e per le risposte immunitarie ottenute (McLean e Ash, 1990). Talvolta la vaccinazione per
immersione può essere preceduta da una immersione disidratante in soluzione iperosmotica al fine di
ottenere un assorbimento più intenso della soluzione vaccinale. I livelli di immunizzazione ottenibili
sono interessanti.
Un metodo alternativo all'immersione è la nebulizzazione. Questo metodo richiede attrezzature
complesse, ma assicura per alcune specie (trota iridea) un buon assorbimento ed una resa quantitativa
ottimale del vaccino (Ellis, 1988).
Adiuvanti
Sono sostanze che amplificano la risposta immunitaria con meccanismi di azione diversi e in molti casi
non ben conosciuti.
Alcuni possono essere somministrati solo per iniezione altri possono essere usati per immersione o per
via orale, tuttavia alcuni dei più efficaci, spesso usati nelle prove sperimentali, non possono essere
commercializzati in quanto causano reazioni locali violente e altri effetti collaterali (Ellis, 1988;
Stoskopf, 1993).
Immunostimolanti
Sono sostanze che hanno la capacità di aumentare la resistenza alle malattie infettive, stimolando
meccanismi di difesa specifica, particolarmente la fagocitosi.
Questa resistenza all'infezione non è specifica, non ha memoria ed è di breve durata. Tuttavia sono
sostanze che possono avere importanza nella profilassi delle malattie del pesce (Nikl et al., 1991;
Stoskopf, 1993).
La vaccinazione orale
Dai tempi degli esperimenti di Duff (1942) molti ricercatori hanno saggiato la possibilità di utilizzare
vaccini per via orale nei pesci di allevamento. Questa via di somministrazione è sempre stata
considerata come il miglior metodo per la vaccinazione in acquacoltura (Fryer et al., 1978; Snieszko,
1970; Amend e Johnson, 1981).
Eppure l'inclusione di vaccini nell'alimento del pesce ha sempre indotto bassi livelli di protezione
rispetto ad altri metodi come l'iniezione, l'aerosol o l'immersione (Gould et al., 1978; Amend e Johnson,
1981; Horrel, 1979, Evelyn, 1984).
L'antigene può venire distrutto durante la fase di lavorazione o stoccaggio dell'alimento, comunque è
anche possibile che venga captato meno efficacemente a livello di tratto digerente o ancora può venire
distrutto dalle secrezioni gastriche (Lillehaugh, 1989).
Johnson e Amend (1983), somministrarono antigeni di Yersinia ruckeri e Vibrio anguillarum per
immersione e per intubazione orale e anale.
Dai loro studi risultò che una unica vaccinazione per via anale stimolava una maggiore protezione sia
nei confronti di Yersinia ruckeri che nei confronti di Vibrio anguillarum.
Da ciò dedussero che l'antigene somministrato oralmente viene parzialmente inattivato dai succhi
gastrici e che è necessario studiare metodi per proteggere l'antigene durante il passaggio nel tratto
superiore dell'intestino mediante microcapsule, rivestimenti enterici, così che possa raggiungere intatto
la porzione intestinale associata al sistema linfatico. Lillehaugh (1989) sperimentò due diversi vaccini nei
confronti di Vibrio anguillarum in trote: il primo in cui l'antigene veniva protetto da un film acido
resistente, il secondo in cui l'antigene veniva incorporato in un pellet a lento rilascio. Ma entrambi i
vaccini somministrati oralmente, non furono in grado di stimolare una buona immunità. Sembra che il
vaccino protetto con il film acido resistente venisse assorbito a livello di duodeno avanzato mentre
l'altro (incorporato nel pellet a lento rilascio) attraversasse l'intero tratto digerente senza subire alcun
processo digestivo.
Come anche sostenuto da precedenti lavori (Davina et al., 1982; Rombeut et al., 1985), il fatto che
nell'esperimento di Lillehaugh (1989) il vaccino non protetto forniva una considerevole migliore
protezione rispetto agli altri due "protetti", fece pensare all' Autore che i processi digestivi che si
verificano nella parte anteriore del tratto digerente potessero essere importanti per l'assorbimento
dell'antigene.
Più tardi nel 1994 Piganelli et al., utilizzarono microsfere biodegradabili di antigene protetto in modo
tale che l'antigene potesse raggiungere il tessuto linfatico associato all'intestino (GALT) senza essere
degradato (Porter, 1985).
L'incorporazione con polimeri reattivi al pH utilizzati come materiale di rivestimento protegge
l'antigene dal pH acido dello stomaco, permettendo il suo passaggio nell' intestino intatto. All'entrata
dell' intestino, l'aumento del pH porta ad una dissoluzione del polimero e al rilascio dell'antigene al
GALT (Wong et al. 1992). I buoni risultati che si ottennero confermarono che le microsfere di antigene
rivestito erano efficienti nel provocare un titolo sierico anticorpale come quello indotto da una
somministrazione per via intraperitoneale, dunque in antitesi con il lavoro di Lillehaugh (1989). Ciò può
essere spiegato con una limitata esposizione del pesce all'antigene nell' esperimento di Lillehaugh, non
sufficiente per indurre una buona protezione per via orale in quanto più alte e più frequenti
somministrazioni sono necessarie per immunizzare attraverso questa via (McGhee et al. 1991).
Anche il lento rilascio dell'antigene dal pellet o le dimensioni del pellet possono ostacolare il
movimento al secondo segmento dell'intestino. Wong (1991) dimostrò che le microsfere biodegradabili
devono essere di mini- me dimensioni per essere in grado di attraversare lo sfintere pilorico ed entrare
nel tratto intestinale senza aggregarsi nello stomaco.
Oltre a questi aspetti, va considerata anche la dose dell'antigene. Nell'esperimento di Piganelli et al.
(1994) il maggior assorbimento di proteine dal tratto intestinale del pesce è stato ottenuto con la più
bassa dose di antigene.
Diversamente le dosi alta e media possono aver permesso un assorbimento maggiore dell' antigene
inducendo probabilmente uno stato di tolleranza.
Altri esperimenti furono diretti a studiare la possibilità di favorire l'assorbimento dell'antigene a livello
gastroenterico mediante appropriate manipolazioni su fattori riguardanti la digestione e l'assorbimento
stesso.
Studi di Anders (1978) riguardarono la somministrazione contemporanea di antigeni di Vibrio con un
antiacido a trote e anguille. I risultati dimostrarono come questa associazione potesse indurre una
protezione dell'antigene dieci volte più efficace rispetto alla somministrazione del solo vaccino,
indicando inoltre come la barriera gastrica rappresenti un fattore importante nel limitare l'efficacia della
vaccinazione orale.
McLean e Ash (1990) studiarono la possibilità di proteggere l'antigene mediante l'utilizzo di
un'antiproteasi, così da favorire l'assorbimento nel tratto intestinale di un antigene solubile, dopo la loro
contemporanea somministrazione ad una trota iridea. Inoltre fecero un tentativo per modificare
l'assorbimento dell'antigene usando un detergente per rimuovere lo strato di muco del tratto
gastroenterico che è dimostrato limiti l'assorbimento dell'antigene nei mammiferi (Snyder e Walker,
1987).
I risultati che ottennero evidenziarono come la somministrazione orale dell'antitripsina alla trota
contemporaneamente ad una dose standard di antigene, portava ad un aumento della concentrazione
media nei tessuti dell'antigene. Paradossalmente però, non fu registrato un aumento analogo a livello di
plasma, dato che contrasta con quelli riportati in letteratura riguardanti esperimenti simili su mammiferi.
Per quanto riguarda l'impiego di sostanze detergenti, la somministrazione contemporanea di
antitripsina, di antigene e di Mega-9 (detergente), non induceva a livello plasmatico un aumento
significativo rispetto al controllo del livello di antigene. Tuttavia una presenza positiva di quest'ultimo
fu rilevata a livello di fegato e di milza facendo ipotizzare agli Autori che queste due sostanze
(antitripsina e sostanza detergente) potessero agire sinergicamente e dimostrando la fattibilità di
aumentare l' assorbimento dell' antigene somministrato per via orale nei pesci.
Problemi potenziali di scarsa appetibilità o di perdita di antigenicità del vaccino durante la digestione,
potrebbero essere superati incorporando il vaccino in alimenti vivi, quali plancton o Artemia salina.
Kawai et al. (1989) dimostrarono che giovani ayu acquisivano una immunità protettiva nei confronti
della Vibriosi alimentandoli con Brachionus plicatilis a cui veniva assorbito antigene di Vibrio.
Nel 1993 Campbell et al. studiarono l'assorbimento di Vibrio anguillarum da parte di Artemia salina e
dalle loro prove constatarono che un avannotto di rombo che consumasse circa 1000 Artemie per
giorno non riceverebbe la dose sufficiente necessaria per la stimolazione di una buona protezione
immunitaria, anche se necessitano ulteriori studi per chiarire esattamente questo aspetto. Recenti
ricerche sono state svolte (Giorgetti 1994, comunicazione personale) incorporando antigene di Vibrio
anguillarum in Artemia salina e alimentando con questo larve di branzino, fino alle somministrazioni
stimate di 20 x 109 cellule di antigene per grammo di pesce; i risultati abbisognano di ulteriori
approfondimenti.
Oltre a diverse ricerche sulla possibilità di proteggere l'antigene dalla degradazione a livello di apparato
digerente, notevoli sforzi sono stati compiuti per studiare la possibilità di aumentare la risposta
immunitaria mediante l'utilizzo di immunomodulatori.
È noto da tempo che gli immunomodulatori possono essere utilizzati per stimolare meccanismi di
difesa dei mammiferi (Fenichel e Chirigon, 1984).
Olivier et al. (1985) furono i primi a dimostrare nel salmone che l'efficacia di un vaccino somministrato
per iniezione nei confronti di Aeromonas salmonicida veniva aumentata includendo un preparato, ovvero
cellule morte di Mycobacterium butrycum, noto per la sua capacità di incrementare la risposta immunitaria
cellulo mediata.
Kitao e Yoshida (1986) aumentarono nella trota iridea la resistenza specifica nei confronti di
Aeromonas salmonicida con un peptide sintetico, somministrato senza l'antigene.
Altri recenti studi hanno provato che la risposta immunitaria può essere stimolata nei pesci usando
diversi altri immunomodulatori: un estratto di tunicato (Davis e Hayesaka, 1984), levamisole (Siwicki,
1987) e il β 1,3 glucano (Yano et al., 1989, 1991; Robertsen et al., 1990).
Nikl et al. (1991) saggiarono l'influenza di sette immunostimolanti sulla risposta immunitaria di coho
salmon nei confronti di Aeromonas salmonicida. Tre delle sette sostanze impiegate (VitaStim- Taito VST),
Lentinan e cellule di Renibacterium salmoninarum RSB diedero dei buoni risultati in quanto aggiunte
all'antigene somministrato per via intraperitoneale provocarono un significativo aumento nel livello di
protezione contro l'agente eziologico della Foruncolosi, superiore a quello osservato con la
somministrazione del solo antigene.
L'azione di queste sostanze sembra essere legata alla loro capacità di stimolare la componente
macrofagica del sistema immunitario (Sugawara et al, , 1984, Yano et al" 1989), di determinare un
aumento dell'attivazione della via alternativa del complemento, tutti meccanismi che inducono una
immunità di ampio spettro, Lentinan è ottenuto dal corpo fruttifero di un fungo, mentre il VST deriva
dal micelio di Schizophyllum comune, può essere prodotto in grandi quantità e a bassi costi; è inoltre
chimicamente ben definito e se dovesse essere efficace per via orale, la sua stabilità al calore (135°C)
(Yanaki et al., 1985) gli permetterebbe di resistere alle alte temperature utilizzate per incorporarlo
nell'alimento pellettato del pesce.
Nel 1993 Nickl et al. studiarono la possibilità di somministrare il VST non più per iniezione come nel
precedente studio, ma mediante vie più pratiche e meno stressanti, e cioè per via orale o per
immersione.
I risultati della ricerca confermarono che la somministrazione per via orale del glucano ha
effettivamente valore per il controllo delle malattie almeno per quanto riguarda la Foruncolosi.
Bibliografia
AGIUS C., HORNE M.T. & W ARD P.D. (1983). Immunization ofrainbow trout, Salmo gairdneri
Richardson, against Vibriosis: comparison of an extract antigen with whole cell bacterins by oral and
intraperitoneal routes. J. Fish Dis., 6: 129-134.
AMEND D.F. & JOHNSON K.A. (1981). Current status and future needs of Vibrio anguillarum
bacterins. Developments in Biological Standardization. Symposium on Fish Biologics: Serodiagnosis and
Vaccines 49: 403-417.
ANDERS E. (1978). Versuche zur oralen Immunisierung von Regenbogenforellen and Aalen gegen
Vibrio anguillarum. Fischerei-For- schung Wissenschaftliche Scriftenreihe, 16: 59-60.
AUSTIN B. (1984). The future ofbacterial fish vaccines. Vaccine, 2: 249-254.
BRISINELLO W. & CESCHIA G. (1988). La vaccinazione nelle specie ittiche. La Vibriosi e la Bocca
Rossa nei pesci. Fatro Divisione Acquacoltura,21-26.
CAMPBELL R., ADAMS A., TATNER M.F., CHAIR M. & SORGELOOS P. (1993). Uptake of
Vibrio anguillarum vaccine by Artemia salina as a potential oral delivery system to fish fry. Fish Shellfish Immunol,
3: 451-459.
DAVINA J.H.M., PARMENTIER H.K. & TIMMERMANS L.P.M. (1982). Effect of oral vaccination
of Vibrio bacterin on the intestine of cyprinid fish. Develop. Comp. Immunol, Suppl. 2: 157-166.
DAVIS J.F. & HAYASAKA S.S. (1984). The enhancement ofresistance ofthe American eel, Anguilla
rostrata Le Seuer, to the pathogenic bacterium, Aeromonas hydrophila, by an extract from the tunicate,
Ecterinascidia turbinata. J. Fish Dis., 7: 311-316.
DEC C., ANGELIDIS P. & BAUDIN LAURENCIN F. (1990). Effects of oral vaccination against
vibriosis in turbot, Scophthalmus maximus (L.), and sea bass, Dicentrarchus labrax (L.). J. Fish Dis., 13: 369376.
DUFF D.C.B. (1942). The oral immunization oftrout against Bacterium salmonicida.-J. Immunol." 44: 8794. ELLIS A.E. (1988a). Current aspects offish vaccination. Dis. Aquat. Org., 4: 159-164. ELLIS A.E.
(1988b). Fish Vaccination. Academic Press, London.
EVELYN T.P.T. (1984). Immunization against pathogenic Vibriosis. In: Symposium on Fish Vaccination,
(P. de Kinkelin & C. Michel, eds.), O.I.E., Paris, pp. 121-150.
FENICHEL R.L. & CHIRIGOS M.A. (1984). Immune ModulationAgents and their Mechanisms. Marcel
Dekker, New York.
FRYER J.L., NELSON J.S. & GARRISON (1978). Immunization of salmonids for control of
vibriosis. Mar. Fish. Rev., 40:20-23.
GOULD R. W., O'LEARY P.J., GARRISON R.L., ROHOVEC J.S. & FRYER J.L. (1978). Spray
vaccination: a method for immunization of fish. Fish Pathol., 13: 63-68.
HJELTNES B., ANDERSEN K. & ELLINGSEN H.M. (1989). Vaccination against Vibrio salmonicida.
The effect of different routes of administration and of revaccination. Aquaculture , 83: 1-6.
JOHNSON K.A. & AMEND D.F. (1983). Efficacy of Vibrio anguillarum and Yersina ruckeri bacterins
applied by oral and anal intubation of salmonids.-J. Fish Dis. 6: 473-476.
KAWAI K., Y AMAMOTO S. & KUSUDA R. (1989). Plankton-mediated oral delivery of Vibrio
anguillarum vaccine to juvenile Ayu. Nip- pon Suisan Gakkaishi, 55: 35-40.
KITAO T. & YOSHIDA Y. (1986). Effect of an immunopotentiator on Aeromonas salmonicida infection
in rainbow trOUt (Salmo gaird- neri). Vet. Immun. Immunopathol., 10: 287-296.
LILLEHAUGH A. (1989). Oral immunization of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, against
Vibriosis with vaccines protected against digestive degradation. J. Fish Dis. ,12: 579-584.
MCGHEE J .R., MESTECKY J., DERZBAUGH M. T., ELDRIGE J. H., HIRASA w A & KIYONO
H. (1991). The mucosal immune system: from fundamental concepts to vaccine development. Vaccine,
10: 75-89.
McLEAN E. & ASH R. (1990) Modified uptake of protein antigen horseradish peroxidase (HRP),
following oral delivery to rainbow trOUt, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture, 87: 373-379.
NIKL L., ALBRIGHT L.J. & EVELYN T.P.T. (1991). Influence of seven immunostimulants on the
immune response of coho salmon to Aeromonas salmonicida. Dis. Aquat. Org. ,12: 7-12.
NIKL L., EVELYN T.P.T. & ALBRIGHT L.J. (1993). Trials with an orally and immersionadministered B 1,3 glucan as an immunoprophylactic against Aeromonas salmonicida injuvenile chinook
salmon Oncorhynchus tschawytscha. Dis.Aquat. Org., 17: 191-196.
OLIVIER G., EVELYN T.P.T. & LALIER R. (1985). Immunity to Aeromonas salmonicida in coho
salmon (Oncorhynchus kisutch) induced by modified Freund's complete adjuvant: its non-specific nature
and the probable role of macrophages in the phenomenon. Dev. Comp.Immunol., 9: 419-432.
PIGANELLI J.D., ZHANG J.A., CHRISTENSEN J.M. & KAATARI S.L. (1994). Enteric coated
microspheres as an oral method for antigen delivery to salmonids. Fish Shellfish Immunol., 4: 179-188.
PORTER S. C. (1985). Coating of pharmaceutical dosage forms. In: Remington's Pharmaceutical Sciences.
The Philadelphia College of Pharmacy and Science, pp. 16-33.
ROBERTSEN B., RORSTAD G., ENGSTAD R. & RAA J. (1990). Enhancement ofnon-specific
disease resistance in Atlantic salmon, Salmo salar L., by a glucan from Saccharomyces cerevisiae cell wall. J.
Fish Dis., 13: 391-400.
ROMBOUT J.H.W., LAMERS C.H.J., HELFRICH M.H., DEKKER A. & TAVERNE-THIELE J.J.
(1985). Uptake and transport of intact macromolecules in the intestinal epithelium of carp (Cyprinus
carpio L.) and the possible immunological implications. CelI Tiss. Res., 239: 519-530.
SIWICKI A. (1987). Immunomodulating activity of levamisole in carp spawners Cyprinus carpio L. J. Fish
Biol., 31 (Suppl. A): 245- 246.
SNIEZKO S.F. (1970). Immunization offish: a review. J. Wildlife Dis., 6:24-30.
SNYDER J.D. & W ALKER W.A. (1987). Structure and function of intestinal mucin: developmental
aspects. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 82: 351-356.
STOSKOPF M.K. (1993). Fish Medicine. W.B. Saunders Company.
SUGAWARA I., LEE K.C. & WONG M. (1984). Schizophyllan (SPG) -treated macrophages and antitumour activities against syngeneic and allogeneic tumour cells. I. Characteristics of SPG-treated
macrophages. Cancer. Immun. Immunotherap., 16: 137-144.
VIGNEULLE M. & BAUDIN LAURENCIN F. (1991). Uptake of Vibrio anguillarum bacterin in the
posterior intestine of rainbow trout (On- corhynchus mykiss), sea bass (Dicentrarchus labrax) and turbot
(Scophthalmus maximus) after oral administration or anal intubation. Dis. Aquati. Organ., 11: 85-92.
WONG G., KAA1TARI S.L. & CHRISTENSEN J.M. (1992). Effectiveness of an oral enteric coated
Vibrio vaccine for use in salmonid fish. ImmunoIInvest., 21: 353-364.
YANAKI T., TABATA K. & KOJIMA T. (1985). Melting behaviour of a triple helical polysaccharide
Schizophyllan in aqueous solution. Carbohyd. Polymers, 5: 275-283.
YANO T., MANGINDAAN R.E.P. & MATSUYAMA H. (1989). Enhancement of the resistance of
carp Cyprinus carpio to experimental Edwardsiella tarda infection, by some B 1,3 glucans. Nippon Suisan
Gakkaishi ,55: 1815-1819.
YANO T., MATSUTAMA H. & MANGINDAAN E. P. (1991). Polysaccharide-induced protection of
carp, Cyprinus carpio L., against bacterial infection. J. Fish Dis., 14: 577-582.
ZEEMAN M.G. (1986). Modulation ofthe immune response in fish. Vet. Immunol. Immunopathol., 12:
235-241.