Attività antiossidante/pro-ossidante di molecole naturali

Transcript

M. Berrettini - Attività antiossidante/pro-ossidante di molecole naturali
Introduzione
Antiossidanti e pro ossidanti
Una serie di sostanze derivanti dalla dieta come polifenoli,
carotenoidi sono stati ampiamente riferiti come antiossidanti. Comunque
stanno aumentando le evidenze sperimentali in vitro che indicano come
alcune di queste sostanze possono in certe condizioni esercitare anche
proprietà pro-ossidanti [1-3].
Al momento non sembrano esserci evidenze sperimentali che
supportino un effetto proossidante, per esempio dei carotenoidi, in vivo o
se ci sono esse sono rare. Un certo numero di fattori possono influenzare
il comportamento di un composto (es. la concentrazione, la
localizzazione
nella
cellula,
l’interazione
con
specie
reattive
dell’ossigeno e con altri antiossidanti, ecc.) e possono risultare in
alterazioni della sua efficacia antiossidante.
Come può l’attività di un composto antiossidante prodursi?
•
A seguito di interazione con ROS (o RNS), una molecola di un
composto antiossidante è ossidata e/o spezzata a generare prodotti
che a loro volta posseggono differente, possibilmente deleteria,
Pag 1 di 49
attività in sistemi biologici.
•
La presenza di alte concentrazioni di composti potrebbe
(dipendendo dalla loro struttura) alterare le proprietà di una
membrana
biologica
e
variare
(incrementandola)
la
sua
permeabilità a tossine o radicali liberi.
•
L’interazione con ROS potrebbe risultare nella formazione di un
radicale per cui esso stesso inizia ulteriore lipoperossidazione.
Pag 2 di 49
Tannini
L'impatto di attività umane nell'ambiente è un crescente ed attuale
problema. Vi sono molti composti chimici dannosi che si dissolvono in
acqua. Polifenoli naturali come i tannini, che si trovano in vari tessuti di
piante, possono essere anche trovati nell'ambiente acquatico. Gli
organismi acquatici sono quindi esposti a questi composti, che possono
produrre alterazioni morfologiche e cambiare certi processi fisiologici
nei loro organi. Il monitoraggio di modificazioni di vari parametri
biochimici a livello di specie individuali di organismi può essere utile
per identificare e delineare l'impatto dei polluttanti [4].
I tannini rappresentano un gruppo altamente eterogeneo di
polifenoli solubili in acqua divisi in tannini condensati, che sono
oligomeri legati C-C di catechine o leucoantocianidine, e tannini
idrolizzabili, che sono esteri di monosaccaridi con acido gallico od
oligomeri di acido gallico [5]. Gli acidi tannico, ellagico e gallico usati
in questo studio appartengono ai tannini idrolizzabili. Essi sono
sintetizzati da una ampia varietà di piante ed alberi [6]: si trovano nel
legno, nella corteccia, foglie, frutti e in varie resine vegetali (galles)
Questi composti ampiamente distribuiti nell'ambiente sono tossici
Pag 3 di 49
quando consumati in grande quantità [7, 8]. I tannini portano benefici
alla salute con la loro attività antimutagenica ed anticarcinogenica, ma
essi possono essere coinvolti nella formazione di cancro ed avere attività
epatotossica [9]. L'attività carcinogenica dell'acido tannico è ben
conosciuta, così come l'attività antimutagenica, anticarcinogenica ed
antimicrobica. L'acido tannico causa tumori in animali da esperimento ed
esso è listato come carcinogenico nella categoria I della “Occupational
Safety and Health Administration” (OSHA) [10]. Comunque ancora
poco si sa sulla capacità dei tannini di indurre mutazione al DNA. Il
verificarsi di alcuni tipi di cancro non si correla necessariamente ai soli
tannini: è possibile che altri fattori o molecole associate con i tannini
possano agire ed indurre carcinogenesi in presenza di altri carcinogeni
[11]. L'attività antimicrobica dei tannini è stata ben documentata [12,
13]. I tannini nel mondo vegetale servono come un naturale meccanismo
di difesa contro le infezioni microbiche [14]. Patogeni acquatici di pesci
come Aeromonas hydrophila, A. Sobria, E.tarda, E.coli e P. fluorescens
sono inibiti dai tannini [15].
In teoria i tannini servono come regolatori naturali della
popolazione microbica in differenti habitat, compresi gli ambienti
acquatici, controllando le malattie dei pesci e la produzione di offPag 4 di 49
flavours in acquacoltura. Differenti attività biologiche e farmacologiche
sono state riportate per erbe medicali che contengono questi composti
polifenolici. Vi è possibilità che una particolare attività non sia dovuta ai
soli tannini, ma piuttosto a componenti ad essi associati.
Essi possono agire sia come antiossidanti che come pro-ossidanti,
dipendendo questo dalla concentrazione e dalla fonte dei radicali. È noto
che certi polifenoli si possono legare al DNA e questa interazione può
causare degradazione del DNA attraverso generazione del radicale
idrossilico (OH.). Molte sostanze chimiche descritte come antimutageni
possono anche agire come co-mutageni. In molti casi, se un composto è
antimutagenico o mutagenico dipende non soltanto dalla sua natura
chimica, ma anche dal locus studiato e se il polifenolo è presente prima,
durante o dopo esposizione al mutagene relativo [16]. È stato riportato
che alcuni polifenoli inducevano DNA strand cleavage in presenza di
Cu+2 o Fe
+3
[17]. Considerando le quantità di questi ioni metallici nelle
cellule o la loro presenza nell'ambiente, vi è probabilità della formazione
di specie radicaliche reattive dalla combinazione di polifenoli e ROS.
Questo tipo di reazioni possono indurre perossidazione lipidica e DNA
strand breaks. Questi risultati indicano che gli acidi fenolici possono
avere un'attività pro-ossidante incrementando il livello di ioni ferrosi e
Pag 5 di 49
ferrici liberi nelle cellula ed in questa via generare radicale superossido
ed idrossilico [18].
Vi è anche la possibilità che i tannini formino chelati con molti ioni,
e questo contribuisce ad aumentare la loro tossicità.
Pag 6 di 49
Eritrocita di trota come modello di studio per lo stress
ossidativo
I pesci, come tutti i vertebrati eccezion fatta per i mammiferi, hanno
eritrociti nucleati, che variano ampiamente in forma e grandezza da una
specie all'altra. Dentro la stessa specie, modificazioni a livello della
struttura cellulare avvengono durante la loro vita e questi cambiamenti
possono essere considerati come modificazioni indotte da condizioni
ambientali e processi connessi con l'età. Contrariamente a mammiferi ed
uccelli, negli eritrociti di pesci vi è una molteplicità di componenti
emoglobinici che dipende dal fatto che le emoglobine debbono
provvedere ossigeno per differenti scopi, domanda metabolica e
l'operazione della ghiandola gasogena (organo idrostatico dell'animale).
Nel caso dell'eritrocita di trota Salmo irideus, vi sono quattro differenti
componenti emoglobinici e sono stati chiamati in accordo alla loro
mobilità anionica HbI, HbII, HbIII e HbIV [19]. Le proprietà di legame
con l'ossigeno di HbI e HbII sono caratterizzate dalla presenza di
interazioni omotropiche e dalla completa insensitività a protoni e fosfati
organici. Al contrario HbIV (circa il 60% del pigmento totale) mostra
una marcata dipendenza di affinità e cooperatività dal pH e dai fosfati
Pag 7 di 49
organici. La principale funzione di HbI è di assicurare il livello base di
O2 ai tessuti, provvedendo un normale supporto di ossigeno durante
l'emergenza. Il ruolo di HbIV è di rilasciare O2 contro alte pressioni
idrostatiche nella swim bladder (ghiandola gasogena ).
Una caratteristica peculiare delle emoglobine di pesce è
rappresentata dalla loro velocità di autossidazione: esse sono meno
stabili rispetto all'emoglobina umana sia come proteine purificate che
nella cellula intera [20]
L'esposizione di eritrociti di trota sospesi in un mezzo isotonico
nell'aria porta all'autossidazione dell'emoglobina e poi all'emolisi; il
processo emolitico è caratterizzato dalla presenza di una lunga fase lag
[21]. La velocità di ossidazione dell'emoglobina e l'emolisi sono
entrambi fortemente dipendenti dal pH e dalla temperatura. Variando
opportunamente questi due parametri è possibile seguire in vitro l'evento
emolitico anche in un tempo relativamente breve ed investigare l'effetto
di diversi polluttanti su questo processo.
Pag 8 di 49
Scopo della tesi
In questo studio alcuni tannini (Acido Gallico, Ellagico e Tannico)
sono stati impiegati per valutare il loro possibile ruolo protettivo nel
mitigare il danno ossidativo in eritrociti di trota sottoposti a stress
ossidativo. L'attività antiossidante di questi composti è stata studiata
usando la tecnica di Chemiluminescenza con Lucigenina e Luminol
come probes chemiluminogenici, la possibile capacità antiossidante di
questi composti è stata monitorata in un sistema biologico costituito da
eritrociti di trota esposti a stress ossidativo indotto termicamente e dalla
variazione di pH. A 35°C e pH 6.3 queste cellule nucleate vanno
incontro all'emolisi in un tempo relativamente breve: questo fenomeno è
in parte dovuto alla formazione di radicale superossido ed anche alla
inattivazione
della
glutatione
perossidasi
(enzima
deputato
a
metabolizzare H2O2 ed eventuali perossidi lipidici) che sono entrambi
una diretta conseguenza dell'ossidazione dell'emoglobina [22, 23]. Per
queste ragioni i globuli rossi di trota sono uno strumento eccellente per
studiare gli effetti dello stress ossidativo a livello della membrana in un
tempo di osservazione relativamente breve. L'influenza dei diversi
tannini (Gallico, Ellagico e Tannico) è stata valutata misurando il grado
Pag 9 di 49
di emolisi. Inoltre è stato studiato l'effetto di questi composti sullo stato
redox dei componenti emoglobinici HbI e HbIV.
Infine, poiché i globuli rossi di trota sono nucleati, abbiamo
determinato l'effetto dei tannini sotto studio sullo stato del DNA, in
presenza ed in assenza di condizioni di stress ossidativo: il livello del
danno al DNA è stato stimato mediante la tecnica del “Comet assay”.
Pag 10 di 49
Fig 1: i tannini studiati : Acido tannico, gallico ed ellagico,
Pag 11 di 49
Metodi
Cellule
Le cellule utilizzate in questo studio, sono state ottenute da trote del
genere salmo irideus, provenienti dal vivaio “Rossi” sito nelle vicinanze
di Sefro, mantenute in vasche con continuo ricambio di acqua
proveniente dal fiume Scarsito, avente temperatura di circa 10° C e
nutrite con mangime commerciale. Il sangue è stato prelevato dalla vena
caudale laterale di pesci di circa 200-300 g di peso ed età intorno ai due
anni e successivamente sospeso in tampone isotonico (0,1 M tampone
fosfato; 0,1 M NaCl; 0,2% citrato; 1 mM EDTA; pH 7.8) e sottoposto
alle procedure sperimentali entro le due ore, a 4°C.
Pag 12 di 49
Preparazione dei componenti emoglobinici.
I globuli rossi, ottenuti come appena descritto, vengono separati dal
plasma centrifugando la soluzione per 10 min a 1000 g, e lavandoli per
4-5 volte con la medesima soluzione.
L'emolisi si ottiene aggiungendo ai globuli rossi H2O distillata in
rapporto 3 a 1. Dopo 30 min l'emolizzato viene centrifugato e quindi
dializzato contro un tampone tris-HCI 0.1M + 0.5 mM EDTA pH 9.0.
I quattro componenti dell'emolizzato sono stati isolati con il
seguente procedimento: una soluzione di emoglobina contenente 1-1,5
g/ml dializzata in tampone tris-HCI 0.1M + 0.5 mM EDTA pH 9.0 è
passata su una colonna Sephadex DEAE A-50 (lunghezza cm 75 e
diametro cm 4), precedentemente equilibrata con lo stesso tampone.
Durante l'eluizione si produce un gradiente di pH lineare mediante il
tampone di equilibrio tris-HCI 0.1M e una soluzione KH2PO4 0.1M. La
velocità di eluizione è di 30-40 ml/h; vengono separate frazioni di 3-4 ml
ciascuna. La separazione e quindi la purezza dei componenti viene
controllata mediante elettroforesi su carta [24]. Tutte le manipolazioni
vengono effettuate a 4°C. In queste condizioni i quattro componenti
vengono eluiti dalla colonna in modo selettivo e nell'ordine della loro
Pag 13 di 49
crescente carica elettrica netta (I-II-III-IV).
Pag 14 di 49
Emolisi e formazione di meta emoglobina
Il grado di emolisi è stato determinato sia in presenza che in assenza
della quantità in desiderata di tannino 10 M. La misura del grado di
emolisi è determinata come:
100*(A/10)*(A*100%)
dove A è la densità ottica dell'emoglobina presente nel sovranatante
dopo centrifugazione della sospensione di globuli rossi e A*100% è la
densità ottica della sospensione di globuli rossi dopo completa lisi con
10 volumi di H2O distillata al tempo di incubazione 0 secondi.
Per determinare la formazione di meta emoglobina l'ossiemoglobina è stata sciolta in tampone fosfato 0,1 M, pH 7.5 ed incubata
a 35°C in presenza della concentrazione desiderata di tannini. La
velocità di formazione di meta emoglobina è stata seguita con uno
spettrofotometro CARY 219 nella regione del visibile: La completa
riduzione ed ossidazione sono state ottenute rispettivamente con
l'aggiunta di sodio ditionito e ferricianuro. L'eccesso di sodio ditionito è
stato rimosso passando la soluzione su di un colonna Sephadex® G25.
Gli esperimenti i presenza di monossido di carbonio sono stati
Pag 15 di 49
effettuati dopo esposizione della sospensione eritrocitica ossigenata ad
un debole vuoto prima (usando una pompa appropriata) e a monossido di
carbonio puro poi: il vuoto veniva applicato per pochi secondi. In questo
modo si riusciva a rimuovere una parte di O2, rendendo la formazione di
Hb-CO più facile a causa della maggiore affinità dell'emoglobina per il
CO piuttosto che per O2 (circa 250 volte).
Pag 16 di 49
La chemiluminescenza
La chemiluminescenza (CL) consiste nel rilevare la luce prodotta in
seguito ad una reazione chimica. Affinché si possa ottenere tale luce, è
necessario che il prodotto della reazione sia un composto che si trovi allo
stato “eccitato” per cui quando ritorna allo stato fondamentale rilascia
l’energia sotto forma di fotoni [25].
Gli elettroni di una molecola non eccitata si trovano normalmente
nel livello a più basso contenuto energetico, ossia quello dello stato
fondamentale. La formazione di un composto eccitato, provoca la
transizione di uno o più elettroni ad uno dei livelli vibrazionali
caratterizzati da maggiore energia. Tale stato dell’elettrone e’ instabile e
pertanto esso ritorna spontaneamente allo stato fondamentale.
Teoricamente, ogni reazione di ossidazione di una sostanza
organica può essere chemiluminescente [26]. In realtà questa
caratteristica è posseduta in misura sensibile solo da un ristretto numero
di reazioni. Affinche’ si possa parlare di reale potere luminogenico è
necessario che siano rispettate alcune condizioni fondamentali:
1) che la reazione fornisca una sufficiente energia da impiegarsi
nell’eccitazione
della
sostanza
Kcal/mole);
Pag 17 di 49
luminogenica
(40-70
2) che nel sistema di reazione sia presente una specie in grado di
passare in uno stato elettronicamente eccitato;
3) che la velocità di reazione sia tale da produrre un numero di
fotoni sufficientemente elevato da fornire un segnale
misurabile;
4) che la produzione dello stato eccitato sia favorita rispetto allo
stato fondamentale.
Idealmente ogni molecola che viene consumata in una reazione di
CL potrebbe dare luogo all’emissione di un fotone. In realtà questo
fenomeno sia realizza solo per una frazione delle molecole che
reagiscono.
Il rapporto tra le molecole reagenti ed i fotoni emessi, definisce la
resa quantica (ϕ CL) della reazione:
ϕ CL = n° di fotoni emessi/n° di molecole reagenti
I fattori che vanno ad influenzare l’efficienza quantica sono:
ϕ CH = frazione di molecole della sostanza luminogenica che
seguono la via chimica corretta (non subiscono fenomeni di quenching);
Pag 18 di 49
ϕ SE = frazione di molecole che dopo avere seguito correttamente
la reazione chimica, passano allo stato eccitato;
ϕ FL= frazione di molecole che riemette sotto forma di fotoni
l’energia assorbita.
L’efficienza quantica puo’ avere valori variabili compresi
nell’intervallo 0.1-0.01. Tale valore e’ influenzato dai componenti il
sistema di reazione e dai parametri operativi (pH, concentrazioni dei
reagenti, ecc).
Quando la resa quantica della reazione e’ bassa (ϕ
= 0.01) è
CL
necessario aggiungere un probe che, reagendo con il prodotto della
reazione, permette di rilevarla. Naturalmente tale molecola non
interferisce nel meccanismo di reazione, permette solamente di misurare
quanto prodotto si sia ottenuto nella specifica reazione.
Numerosi probes possono essere impiegati [27]; tra questi troviamo
la lucigenina (N,N-dimetil-9,9-diacridina nitrato), che in presenza di
radicali dell’ossigeno, anione superossido in particolare, viene ossidata a
N-metilacridone con emissione di luce a 440 nm [28-30]
Il luminol (5-ammino-2,3-diidro-1,4-ftalazinadione) e’ un altro
probe utile per questo scopo; la sua reattività e’ spiccata nei confronti del
Pag 19 di 49
perossido di idrogeno in presenza del quale si ossida per dare il 3amminoftalato [28].
La chemiluminescenza amplificata è stata utilizzata per valutare
l’attività antiossidante dei tannini consistente nell’attività scavenger nei
confronti dell’anione superossido prodotto dal sistema xantina/xantina
ossidasi. Per tale determinazione e’ stata usata la lucigenina (probe
chemiluminescente sensibile all’O2.-) e la CL e’ stata misurata con un
Auto Lumat LB 953 della Berhold.
Condizioni sperimentali del saggio con la xantina: 50 M di
xantina, 0.9 U/ml di xantina ossidasi, 150 M lucigenina in tampone
TRIS a pH 8, a cui erano aggiunte diverse quantità di disciolti in etanolo
(1% max). La reazione è stata iniziata iniettando xantina ossidasi ad una
concentrazione finale di 50 M, ed e’ stata seguita per 60 secondi ed i
risultati sono stati espressi in colpi per secondo (cps).
Per le prove con il luminol la concentrazione del probe era 10-5 M
in tampione CAPS 0.1 M a pH 10: la reazione veniva iniziata iniettando
H2O2 ad una concentrazione finale di 50 mM, anche in questo caso i
tannini erano sciolti in etanolo.
Pag 20 di 49
Comet assay
Il Comet Assay (gel elettroforesi su singola cellula – SCGE) è una
tecnica utilizzata per misurare il danno al DNA su cellula individuale,
semplice e sensibile [31, 32]. Il test è stato introdotto da Ostling e
Johanson [31] e consiste nell’includere le cellule in agarosio low melting
0.7% su di un vetrino da microscopia; successivamente esse vengono
sottoposte a lisi ed elettroforesi ed osservate in microscopia a
fluorescenza per valutare l’entità del danno al DNA. Durante
l’elettroforesi, i frammenti di DNA migrano più velocemente del DNA
integro verso l’anodo; la misura di tale migrazione dal nucleo cellulare
(la “testa”) e la risultante “coda”, costituita dai frammenti di DNA,
rappresenta un efficace metodo di quantizzazione del danno.
L’immagine osservata al microscopio a fluorescenza, è simile ad una
cometa, da cui il nome del test. L’intensità di fluorescenza della coda
rispetto alla testa, dà informazioni riguardo il numero delle rotture sui
filamenti di DNA. Come coloranti fluorescenti si utilizzano bromuro di
etidio e bromuro di propidio
In passato, come indice di danno al DNA, ci si riferiva alla
“lunghezza della coda” [33,34], ma attualmente, grazie all’analisi
Pag 21 di 49
computerizzata dell’immagine, è possibile tenere conto di molte altre
caratteristiche che possono descrivere il danno in maniera più esauriente.
Il “momento della coda” è considerato il migliore indice di danno
[32,35,36] e deriva dall’integrazione del valore della lunghezza della
coda con quello dell’intensità di fluorescenza della coda; esso tiene
conto sia della misura della migrazione del più piccolo frammento di
DNA corrispondente alla coda della cometa, sia del numero di frammenti
rappresentati dall’intensità di fluorescenza del DNA nella coda. Una
definizione più precisa del “momento della coda” è quella di “momento
torsionale della coda”, cioè la distanza tra il centro di posizione della
testa ed il centro di gravità della coda [32].
Il vantaggio nell’utilizzo del momento della coda come indice di
danno, sta nel fatto che un solo valore rappresenta sia l’ammontare del
DNA danneggiato, sia la distanza di migrazione del materiale genetico.
Pag 22 di 49
Fig. 2 Comet Assay
Pag 23 di 49
Procedura sperimentale del “comet assay”:
Si stratifica circa 1 ml di una soluzione di Agarosio normal melting
all’1% su dei vetrini per microscopio, precedentemente lavati con
etanolo e fiammati, allo scopo di favorirne l’adesione del successivo
strato, costituito da 75 l di Agarosio normal melting 0,5%, il quale
viene coperto con un vetrino copri oggetto e lasciato in frigo a
solidificare per 10 minuti. Successivamente, si rimuove il copri oggetto e
si stratificano le cellule, sospese in 65 l di Agarosio low melting 0,7%,
si ricopre nuovamente il vetrino con il coprioggetto e si ripone in frigo
per altri 10 minuti. Trascorso questo tempo, si stratificano altri 75l di
Agarosio normal melting 0,7%, si copre ancora con il coprioggetto e si
fa solidificare il nuovo strato in frigo per altri 10 minuti. Infine, dopo la
rimozione del coprioggetto, i vetrini vengono immersi in una soluzione
di lisi costituita da n-lauril sarcosinato di sodio 1%, 2.5 M NaCl, 100
mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 10, 1% Triton-X 100 e 10%
DMSO per un’ora a 4°C al buio per permettere la lisi delle cellule, lo
srotolamento del DNA e la precipitazione delle proteine.
Dopo tale trattamento, viene eseguita l’elettroforesi in tampone
alcalino (1 mM Na2EDTA, 300 mM NaOH) applicando un potenziale di
Pag 24 di 49
25 V, aggiustando la corrente a 300 mA per 20 minuti. Dopo
l’elettroforesi, i vetrini vengono lavati con tampone Tris-HCl 0.4 M pH
7.5 per rimuovere i detergenti e neutralizzare l’eccesso di alcali.
I vetrini vengono poi colorati con 100 l di bromuro di etidio (2 
g/ml), coperti con un vetrino coprioggetto ed analizzati al microscopio
entro le successive 48 ore. L’analisi del danno al DNA, viene condotta
su un numero statisticamente rilevante di cellule (150 per campione,
scelte a caso), usando un microscopio Axioskop 2 plus (Carl Zeiss,
Germany), avente un filtro di eccitazione di 515-560 nm.
Un obbiettivo ad immersione Ax20 e’ usato con un oculare per
proiettare l’immagine della cometa su una camera CCD altamente
sensibile. L’immagine viene acquisita dal software “Metasystem”
(Althussheim, Germany), che ne calcola il profilo delle intensità
integrate per ciascuna cellula, dei componenti della cometa (la testa e la
coda) e ne valuta i parametri derivati. Tali parametri includono la
lunghezza della coda, l’intensità della coda ed il momento della coda.
Pag 25 di 49
Risultati
In questo studio, l'attività antiossidante di differenti tannini è stata
determinata “in vitro” per mezzo di tecniche di chemiluminescenza
utilizzando come probes amplificanti luminol e lucigenina che sono
sensibili rispettivamente all'H2O2 e all'anione superossido (O2-). L'acido
tannico ed ellagico (Fig 3) mostravano un grosso effetto riducendo il
segnale dovuto alla chemiluminescenza dell'H2O2- luminol.
Pag 26 di 49
Inibizione (%) del segnale di chemiluminescenza
generato dal sistema luminol/H2O2
100
90
Iinibizione del segnale di CL (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
µM
Fig. 3 - Inibizione (%) del segnale di chemiluminescenza generato dal sistema
luminol/H2O2. La chemiluminescenza (CL) è stata misurata in presenza di 10-5 M
luminol e diverse concentrazioni di tannini disciolti in etanolo. La reazione viene
iniziata iniettando H2O2 alla concentrazione finale di 50mM in tampone CAPS 0.1M
pH 10. I valori dell’inibizione si riferiscono alle altezze dei picchi. I dati riportati
come medie dei valori ± Deviazione Standard, si riferiscono ad almeno tre
esperimenti.
● acido ellagico; ■ acido tannico.
Pag 27 di 49
Il 50% percento dell'inibizione del segnale si osservava quando il
processo era seguito in presenza di tannini ad una concentrazione minore
di 0.2 M.
Non è stato possibile seguire questo processo in presenza di acido
gallico perché esso influenzava in maniera negativa gli spettri
producendo un segnale di fondo molto elevato.
Anche l'attività scavenger dei tre tannini verso l'anione superossido
prodotto dal sistema xantina/ xantina ossidasi è stata valutata (Fig 4).
Pag 28 di 49
Inibizione (%) del segnale di chemiluminescenza del sistema
xantina/xantina ossidasi + lucigenina
100
90
80
Inibizione segnale di CL (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
300
[µ M]
Fig. 4 - Inibizione (%) del segnale di chemiluminescenza del sistema
xantina/xantina ossidasi + lucigenina in presenza di
diverse concentazione di
tannini, Trolox e Tempo. La chemiluminescenza è stata misurata in presenza 0.9
U/ml xantina ossidasi e 150 M di lucigenina; la reazione viene iniziata
aggiungendo xantina alla concentrazione di 50 mM in tampone Tris 50mM pH 8.0. I
valori delle inibizioni si riferiscono alle altezze dei picchi.
● acido ellagico; ▲acido gallico; ■ acido tannico; ♦ Trolox; o Tempo.
Pag 29 di 49
Tutti e tre i tannini erano capaci di ridurre il livello di
chemiluminescenza dovuta al sistema O2--lucigenina. La IC50 (la
concentrazione di composto capace di ridurre al 50% il picco di
chemiluminescenza) era ottenuto con 5 M per l'acido tannico e gallico
mentre essa era ottenuta con 20uM di acido ellagico.
Nella stessa figura viene riportata l'attività scavenger di Tempo e
Trolox, che agiscono come analoghi della SOD, ma che presentano
attività minore: comunque non è chiaro se questo sia dovuto alla loro
abilità di funzionare da scavenger del radicale superossido o all'attività
inibitoria sulla xantina ossidasi [37].
Pag 30 di 49
Successivamente abbiamo investigato l'influenza di questi tannini
sul processo emolitico in eritrociti di trota, sospesi in tampone isotonico
pH 6.3 ed incubati a 35°C. Il processo è stato seguito sia con eritrociti
saturati con monossido di carbonio (CO) che con cellule esposte all'aria.
I risultati sono riportati nelle figure 5 e 6 che seguono.
Pag 31 di 49
100
% emolisi
75
50
25
0
0
50
100
150
200
250
300
tempo(min)
Fig. 5 - Emolisi di una sospensione di globuli rossi di trota esposti all’aria ed
incubati in tampone isotonico pH 6.3 alla temperatura di 35°C ed in presenza di 10
M dei diversi tannini disciolti in etanolo. I dati, riportati come valori medi ± S.D.,
si riferiscono ad almeno tre replicati esperimenti
 controllo; ● acido ellagico; ▲acido gallico; ■ acido tannico.
Pag 32 di 49
100
% emolisi
75
50
25
0
0
50
100
150
200
250
300
tempo(min)
Fig. 6 - Emolisi di una sospensione di globuli rossi di trota esposti a monossido
di carbonio ed incubati in tampone isotonico pH 6.3 alla temperatura di 35°C ed in
presenza di 10µM dei diversi tannini disciolti in etanolo. I dati, riportati come valori
medi ± S.D., si riferiscono ad almeno tre replicati esperimenti
♦ controllo; ● acido ellagico; ▲acido gallico; ■ acido tannico.
Pag 33 di 49
Nella tabella 1 che segue è riportato il t1/2 dell'emolisi ricavato dalle
precedenti figure: t1/2 indica il tempo necessario per avere il 50% di
emolisi di una sospensione contenente 2*106 RBCs/ml in presenza ed in
assenza di 10 M di tannino.
Controllo
Acido Tannico
Acido Gallico
Acido Ellagico
Con CO
246 ± 11
222 ± 9
245 ± 13
260 ± 13
min (%)
-9.8
-0.4
+5.7
Pag 34 di 49
t1/2
Senza CO
176 ± 10
154 ± 8.5
180 ± 9.5
190 ± 12
min (%)
-12.5
+2.3
+8
La presenza di acido tannico incrementa in maniera simile l'emolisi,
sia in assenza che in presenza di CO (p<0.05): le differenze per gli altri
due tannini non sono risultate statisticamente significative.
Abbiamo inoltre studiato l'influenza di questi composti sulla
stabilità di HbI e HbIV, andando ad indagare la formazione di meta
emoglobina.
Pag 35 di 49
Fig. 7 - Formazione di met-HbI ottenuta incubando HbI (1mg/ml) a 25°C in
Tris 50mM + EDTA 0.1mM pH 7.8 in presenza di 1µM acido tannico, ellagico e
gallico
Pag 36 di 49
Nella figura 7 è possibile osservare come la formazione di meta
emoglobina sia decisamente più pronunciata per l'acido tannico, mentre
non si osservano differenze significative per acido gallico ed ellagico
rispetto ai controlli.
Per quanto riguarda HbIV i risultati sono in fig. 8
Pag 37 di 49
35
30
Formazione di met-HbIV (%)
25
20
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
tempo (min)
Fig. 8 - Formazione di met-HbIV ottenuta incubando HbIV(1mg/ml) a 25°C in
Tris 50mM + EDTA 0.1mM pH 7.8 in presenza di 1µM acido tannico, ellagico e
gallico
Pag 38 di 49
In questo caso l'acido tannico non ha l'effetto visto prima, mentre
l'acido ellagico sembra avere un'effetto più marcato.
Utilizzando la tecnica del “Comet Assay”, infine, abbiamo valutato
l'effetto che i tre tannini hanno sullo stato del DNA nucleare
dell'eritrocita di trota, come da fig. 9 seguente:
Pag 39 di 49
3.00
Controllo pH=7.8
H2O2 5uM
acido tannico
acido ellagico
acido gallico
2.50
Tail Moment (a.u.)
2.00
1.50
***
***
*
1.00
*
0.50
***
*
**
***
0.00
Controllo pH=7.8
H2O2 5uM
10
30
60
100
µM
Fig. 9 - Effetto di acido tannico, gallico ed ellagico sul DNA di eritrociti di
trota. Il parametro “tail moment’ si riferisce ai valori del comet ottenuti dopo 1 h di
incubazione in tampone isotonico pH 7.8 a t=4°C in assenza (controllo) o in
presenza di 10, 30, 60, 100 µM tannini e 5 µM H2O2
I dati, riportati come valori medi ±S.E., si riferiscono ad almeno tre
esperimenti, tre vetrini/campione, 150 letture/campione. ∗P < 0.05; ∗∗P < 0.01,
∗∗∗P <0.001.
Pag 40 di 49
La fig 9 mostra i valori di Tail Moment (TM) di eritrociti trattati per
1 ora a 4°C e pH 7.8 (condizioni di non stress) con differenti
concentrazioni di tannini (0, 10, 30, 60, 100 M). Il danno al DNA
prodotto dalla presenza di 5 M H2O2 è usato come riferimento. È bene
puntualizzare che l'incubazione della sospensione eritrocitica per 1 ora a
4°C e pH 7.8 non è associata con la formazione di meta emoglobina e
quindi a condizioni di stress ossidativo. La presenza di 100 M di acido
tannico produceva un danno al DNA della stessa entità di quello prodotto
dalla presenza di 5 M di H2O2; acido gallico dava lo stesso danno al
DNA alla concentrazione di 10 M. L'acido ellagico alla concentrazione
di 100 M non aveva effetto genotossico significativo. A più basse
concentrazioni esso diminuiva significativamente il tail moment.
Sono state infine eseguite prove di protezione dal danno ossidativo,
come mostrato in figura 10
Pag 41 di 49
Controllo pH=7.8
Stress
Stress + acido tannico
Stress + acido ellagico
Stress + acido gallico
3.00
2.50
Tail Moment (a.u.)
2.00
**
1.50
***
***
***
***
1.00
***
***
***
***
0.50
0.00
Controllo pH=7.8
Stress
1
5
10
30
µM
Fig. 10 - Effetto di acido tannico, gallico ed ellagico sul DNA di eritrociti di
trota. Il parametro “tail moment’ si riferisce ai valori del comet ottenuti dopo 1 h di
incubazione in tampone isotonico pH 6.3 a T=35°C in assenza (controllo) o in
presenza di 1, 5, 10, 30 µM tannini.
I dati, riportati come valori medi ±S.E., si riferiscono ad almeno tre
esperimenti, tre vetrini/campione, 150 letture/campione. ∗P < 0.05; ∗∗P < 0.01,
∗∗∗P <0.001.
Pag 42 di 49
L'incubazione degli eritrociti di trota per 1 ora a 35°C e pH 6.3
(condizione di stress ossidativo dovuta alla formazione di meta
emoglobina) induceva danno ossidativo al DNA (è bene notare che, per
quanto visto con gli esperimenti sull'emolisi dopo 1 ora siamo ancora
lontani dall'evento emolitico). La presenza di 1, 5, 10 e 30 M di acido
tannico riduceva il grado di danno al DNA rispetto al campione senza
tannini. L'acido ellagico proteggeva il DNA quando esso era addizionato
fino alla concentrazione di 10 M, ma esso era inefficace alla
concentrazione di 30 M. L'acido gallico esercitava il suo effetto
protettivo solo a basse concentrazioni (1 e 5 M).
Pag 43 di 49
Discussione
I risultati qui presentati e riguardanti l’effetto di tre differenti
tannini (ac. tannico, ellagico e gallico) sull’emolisi di eritrociti di trota
sono in parte sorprendenti poiché i polifenoli aventi attività antiossidante
potevano proteggere nei confronti dell’emolisi ossidativa di queste
cellule. Si sa che l’evento emolitico, definito operazionalmente del
rilascio di emoglobina nel sovranatante di una sospensione di globuli
rossi, è un fenomeno determinato dalla convergenza di più di un tipo di
danno biochimico. La velocità dell’emolisi si correla con la formazione
di meta-Hb; una differenza nella velocità di emolisi tra i globuli rossi
saturati con CO e quelli all’aria (O2) è evidente nelle nostre condizioni
sperimentali (t1/2 è 246±11 min in presenza di CO e 176±10 min in aria
senza CO). Durante questi periodi di incubazione la maggior parte
dell’ossiemoglobina si trasforma in meta-Hb; d'altra parte: globuli con
emoglobina saturata con monossido di carbonio presentano solo piccole
tracce di meta-Hb. Gli esperimenti effettuati con eritrociti saturati con
CO, che si lega e stabilizza l’Hb prevenendo quindi l’ossidazione,
mostrano che l’effetto accelerante dell’acido tannico sulla velocità di
emolisi è indipendente agli effetti correlati alla formazione di meta-Hb.
Pag 44 di 49
Il “comet assay” è stato usato per studiare l’effetto dei polifenoli
sotto studio sullo stato del DNA. I risultati ottenuti indicano chiaramente
che questi composti possono agire in differente maniera, dipendente da
entrambi, concentrazione e tipo di tannino.
I sistemi qui riportati mostrano che il DNA è danneggiato in
presenza di 100 M di acido tannico e gallico quando l’esperimento è
seguito in assenza di condizioni di stress (pH 7.8 e t = 4°C). È stato
riportato che radicali dell’ossigeno possono essere generati dalla
reazione della struttura fenolica in presenza di ossigeno [13], ed è ben
stabilito che il DNA è suscettibile al danno indotto dai radicali liberi
[40].
Gli esperimenti di Kirby [38] e Feldman e Sambandam [39] hanno
dimostrato che gli effetti pro-ossidanti dei tannini possono essere dovuti
in parte alla formazione di pro-ossidanti intermedi o prodotti finali
durante la loro biotrasformazione. E’ bene ricordare che alcuni estratti di
legname hanno proprietà genotossiche e mutageniche. Le persone che
lavorano in fabbriche di legname sono esposte a queste sostanze.
Studi di Palus et al. [41] hanno rilevato che il livello di danno al
DNA era significativamente più alto rispetto ai controlli. Quanto sopra
Pag 45 di 49
suggerisce che l’esposizione occasionale a polveri di legno potrebbe
provocare effetti genotossici. Questa potrebbe essere una ragione del
perché alcuni tannini contribuiscono ad indurre danni al DNA di tipo
strand breaks nel nostro studio.
Il “comet assay” non necessariamente predice il potenziale
mutagenico dei tannini, comunque la genotossicità di tannini può essere
modulata in combinazione con altri agenti che danneggiano il DNA e
che sono presenti nell’ambiente. Una possibile spiegazione per il danno
al DNA da parte dei tannini è basata sull’ipotesi che questi fenoli ed i
loro relativi composti possano indurre perossidazione lipidica attraverso
la formazione di specie radicaliche, che contribuiscono all’alterazione di
funzioni cellulari, al danno genotossico ed all'iniziazione di tumori.
Comunque non è chiaro come i substrati polifenolici siano adsorbiti
dal tratto gastrointestinale e possano contribuire a queste azioni
biologiche [42]. Szymusiak et al. [43] hanno riportato che gli
antiossidanti polifenoli possono anche agire come ossidanti. Un simile
fenomeno è stato osservato da Sahu e Gray [44] che hanno notato come i
radicali idrossiliciderivati da questi composti potessero iniziare la
perossidazione dei lipidi ossidati della membrana nucleare, causando
DNA strand breaks in nuclei isolati di fegato di ratto. È stato suggerito
Pag 46 di 49
che specie radicaliche prodotte vicino al DNA potrebbero indurre strand
breaks diretti sito-specifico, che sono insensibili agli scavengers di
radicali. D’altra parte l’effetto benefico dei tannini, es. la capacità di
agire come antimutageni potrebbe essere dovuto alla loro capacità di
agire da scavengers delle specie reattive dell’ossigeno. I risultati del
nostro studio mostrano che a basse concentrazioni, i tannini sono capaci
di proteggere verso il DNA breakage, mentre ad alte concentrazioni essi
dovrebbero essere genotossici. Da notare che la presenza di 10 M di
acido tannico ha un effetto protettivo sul danno ossidativo al DNA nel
primo (1 ora) periodo di incubazione; d’altra parte, a tempi più lunghi di
incubazione questo composto accelera l’evento emolitico.
In conclusione, i tannini sembrano essere una sorta di arma a
doppio taglio.
Da una parte essi apportano beneficio alla salute poiché presentano
attività chemopreventive verso la carcinogenesi e la mutagenesi, ma,
d’altra parte, essi possono essere coinvolti nella formazione del cancro,
epatotossici o attività antinutrizionale. Vi è anche possibilità che i
composti attivi responsabili per l’iniziazione carcinogenica non siano i
soli tannini, ma piuttosto i componenti associati ai tannini.
Pag 47 di 49
A questo stadio è difficile determinare quale sia l’esatto
meccanismo molecolare responsabile per i differenti effetti mostrati dai
tannini sotto studio. Ulteriori studi sistematici sono necessari per
valutare il potenziale uso dei tannini come sostanze benefiche per la
salute umana.
Visto che piccole quantità del giusto tipo di tannino possono avere
un effetto benefico, mentre grandi quantità possono causare attività
carcinogeniche, sarà importante determinare la corretta dose del giusto
tipo di tannino per promuovere uno stato di salute ottimale.
Pag 48 di 49
Indice generale
Introduzione...............................................................................................1
Antiossidanti e pro ossidanti................................................................. 1
Tannini.................................................................................................. 3
Eritrocita di trota come modello di studio per lo stress ossidativo....... 7
Scopo della tesi..........................................................................................9
Metodi..................................................................................................... 12
Cellule................................................................................................. 12
Preparazione dei componenti emoglobinici........................................ 13
Emolisi e formazione di meta emoglobina..........................................15
La chemiluminescenza........................................................................ 17
Comet assay.........................................................................................21
Procedura sperimentale del “comet assay”:........................................ 24
Risultati................................................................................................... 26
Discussione..............................................................................................44
Pag 49 di 49

Attività antiossidante/pro-ossidante di molecole naturali

Transcript

Documenti analoghi

comune di forte dei marmi comune di forte dei marmi

Abstract - CRA-FLC

BANDO FSA 2014 Comune di TOMBOLO E` indetto il

8 settembre 2010 Il Gazzettino di Treviso

BLUETANN PRO - Scheda TecnicaBlueTANN Pro è una selezione

questionario di soddisfazione dei clienti

PAIAGALLO Vigna La Villa Barolo DOCG

LAZZARITO Vigna La Delizia Barolo DOCG

ELCATAN RP