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ITTIOPATOLOGIA, 2012, 9: 139-149
Farmaci nei mangimi impiegati in acquacoltura:
valutazione della sicurezza nell’uso di ossitetraciclina
Drugs used in aquaculture feed: safety assessment
in the use of oxytetracycline
Valentina Ciccotelli1*, Paola Brizio1, Antonia Concetta Elia2,
Ambrosius Josef Martin Dörr2, Marilena Gili1, Laura Gasco3,
Marino Prearo1, Maria Cesarina Abete1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta, Via Bologna 148 10154 Torino; 2 Dipartimento di Biologia Cellulare e Ambientale, Via Elce di sotto, 8 - 06123 Perugia;
3
Dipartimento di Scienze Zootecniche, Via L. da Vinci, 44 -10095 Grugliasco (TO).
__________________________________________
RIASSUNTO – L’Ossitetraciclina cloridrato (OTC) appartiene alla classe delle Tetracicline ed è uno dei
farmaci più utilizzati per il trattamento di infezioni batteriche nei pesci. OTC è scarsamente assorbita quando
viene somministrata con il cibo, perché forma complessi con gli ioni metallici presenti nei mangimi. Quando
la dose somministrata è troppo alta, è però possibile riscontrarne residui negli alimenti, che possono causare
effetti immunodepressivi e resistenza batterica. Lo scopo di questo lavoro è simulare il trattamento
farmacologico con OTC, contaminando i mangimi da livelli terapeutici adatti per la specie Cyprinus carpio a
dosi più elevate, per ottenere dati relativi al carry-over nel muscolo. 160 esemplari di carpa sono stati
suddivisi in 8 vasche alimentate con un flusso continuo di acqua di lago e acclimatati per 5 giorni. I pesci
sono stati alimentati per 10 giorni con mangime medicato, l'antibiotico è stato somministrato all’1,5% bw/day
alle dosi di 75 (dose d'impiego), 150 e 300 mg/kg di peso corporeo. Prima della somministrazione sono stati
campionati casualmente 8 esemplari; 6 pesci per vasca sono stati campionati al termine dei 10 giorni di
somministrazione e a 5 e 10 giorni dopo il trattamento. È stato prelevato il muscolo per la determinazione
della concentrazione dell'antibiotico mediante un metodo in cromatografia ad alte prestazioni accoppiata ad
un detector a fotodiodi (HPLC-DAD).
SUMMARY - Oxytetracycline hydrochloride (OTC) belongs to the Tetracyclines class and it is one of the
most widely used drugs for the treatment of bacterial infections in fish. OTC is poorly absorbed when
administered with food, because it forms complexes with metal ions present in feed. However when the
administered dose is too high, it is possible to find residues in food, which can cause immunosuppressive
effects and bacterial resistance. The aim of this work is to simulate the pharmacological treatment with OTC,
contaminating the feed from therapeutic levels, suitable for the species Cyprinus carpio to higher doses, to
obtain data relating to carry-over in muscle and liver. 160 carps has been divided into 8 pools with a
continuous flow of lake water and acclimated for 5 days. The fish were fed for 10 days with medicated feed,
the antibiotic was administered to 1.5% bw day at doses of 75 (recommended dose), 150 and 300 mg/kg of
body weight. Before administration 8 specimens were randomly sampled, other 6 fish per tank were sampled
at the end of the 10 days of dosing and 5 and 10 days after the end of treatment. The muscle was collected for
the antibiotic determination using an high performance liquid chromatography with diode array detector
(HPLC-DAD) method .
Key words: Oxytetracycline; Cyprinus carpio; HPLC-DAD; Aquaculture feed.
_______________________________
∗ Corresponding Author: c/o Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte Liguria e Valle d’Aosta;
via Bologna 148 - 10154 Torino. Tel.: 011-26861; Fax: 011-2487770; E-mail: [email protected].
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INTRODUZIONE
Le tetracicline, isolate tra il 1940 ed il 1950 da diverse specie del genere
Streptomyces, si annoverano tra gli antibiotici batteriostatici più comunemente
usati; sono infatti caratterizzate da un ampio spettro d'azione, che si concretizza
nell'attività contro una vasta gamma di batteri aerobi ed anaerobi Gram-positivi e
Gram-negativi (compresi Spirochete, Actinomyces, Ricketsia e Mycoplasma),
presentano una tossicità contenuta e costi moderati. L'ossitetraciclina cloridrato
(Figura 1) è l'antibiotico appartenente a questa classe che ha visto il più antico e
vasto impiego in acquacoltura e il cui assorbimento è stato pertanto largamente
studiato; in generale, dal punto di vista tossicologico, presenta un ampio margine
di sicurezza in quanto ben tollerata, ma sono stati riscontrati effetti
immunosoppressivi nella carpa (Grondel et al., 1989), danni a livello epatico
(Bruno, 1989) e ritardi nell’accrescimento, soprattutto in pesci molto giovani.
OH
N (C H3)2
C H3
H
OH
HO
C O N H2
OH
OH
O
OH
O
Figura 1 – Struttura chimica dell’ossitetraciclina.
Figure 1 – Chemical structure of oxytetracycline.
Studi di farmacocinetica nelle specie ittiche (della Rocca et al., 2004) hanno
evidenziato come l'ossitetraciclina sia scarsamente assorbita dai mangimi
medicati, ad esempio la sua biodisponibilità nella trota iridea è dell’8%, mentre
nel salmone atlantico (acqua salata) è minore del 2%. L'assorbimento di tale
farmaco è limitato fortemente dalla sua natura chimica di agente chelante, capace
di formare legami con ioni Ca+2 e Mg+2, presenti sia nell’alimento sia
fisiologicamente nell’ambiente intestinale del pesce (Cravedi et al., 1987), i quali
non riescono ad attraversare le membrane lipidiche.
Altri lavori mostrano come l'assorbimento della molecola dipenda fortemente
dal valore di pH a livello enterico e dalla temperatura dell'acqua.
Per quanto concerne le tetracicline, nessun processo biotrasformativo nelle
specie ittiche è stato riportato in letteratura, pertanto non stupisce il fatto che una
parte considerevole del quantitativo somministrato per via orale (40-73% nelle
specie eurialine) si ritrovi immodificata nelle feci. E' stato inoltre evidenziato che
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anche la fase di eliminazione e di conseguenza il tempo di sospensione sono
influenzati dalla temperatura dell'acqua. L'ossitetraciclina interferisce sulla sintesi
proteica del batterio per legame alla subunità ribosomiale minore 30S, impedendo
il legame dell’aminoacil-tRNA al complesso m-RNA ribosomiale. Sempre più
frequentemente si verificano fenomeni di resistenza dei patogeni verso questa
classe di farmaci, attribuiti frequentemente a plasmidi codificanti per fenomeni di
resistenza multipla. Tuttavia questo fenomeno pare ridimensionarsi dopo una
sospensione nell'utilizzo delle molecole.
L'uso di queste sostanze costituisce un serio problema dal punto di vista della
sicurezza alimentare poiché possono residuare nella carne, soprattutto se non
vengono rispettati i corretti tempi di sospensione. In questi casi possono
intossicare direttamente il soggetto assuntore o causarne reazioni allergiche,
qualora si tratti di un individuo particolarmente sensibile. Inoltre basse dosi di
antibiotico assunte inconsapevolmente per lunghi periodi possono portare a
farmacoresistenza.
Per tali motivi è importante studiare la farmacocinetica e l'eliminazione dei
residui dell'ossitetraciclina in pesci d'allevamento per determinare i giusti dosaggi
di somministrazione, stabilire i migliori intervalli di sospensione e minimizzarne
l'impatto ambientale.
La dose solitamente impiegata, addizionata all'alimento, è di 75 mg/kg bw
(7,5 g/kg di mangime somministrato in ragione dell'1% della biomassa) per circa
7 giorni, seguita da un periodo di sospensione di 30 giorni; l'Allegato 1 del
Regolamento (CEE) n. 2377/90 del Consiglio, che definisce una procedura
comunitaria per la determinazione dei limiti massimi di residui di medicinali
veterinari negli alimenti di origine animale, stabilisce come limite massimo
residuale nel muscolo di pesce (MRL) 100 µg/kg.
MATERIALI E METODI
La sperimentazione è stata condotta presso il centro Ittiogenico del Lago
Trasimeno (Sant’Arcangelo - PG). 160 esemplari di carpa sono stati suddivisi in 8
vasche a flusso continuo di acqua proveniente dal lago e acclimatati per 5 giorni. I
pesci sono stati quindi alimentati per 10 giorni con mangimi medicati prodotti
sperimentalmente presso l’Università degli Studi di Torino, Facoltà di Agraria,
Dipartimento di Scienze Zootecniche (Carmagnola - TO). L’antibiotico è stato
somministrato all’1,5% bw day-1, alle dosi di 75 (dose raccomandata), 150 e 300
mg/kg di peso corporeo. I pesci a cui è stato somministrato lo stesso mangime, ma
senza antibiotico, sono stati usati come controllo.
Immediatamente prima di iniziare la somministrazione delle diete medicate (T0)
sono stati campionati random 8 esemplari dalle vasche di sperimentazione; al
termine dei 10 giorni di somministrazione del farmaco (T10) e 5 (T5R) e 10
(T10R) giorni dopo, sono stati campionati 6 esemplari per ognuna delle vasche e
per il controllo. Sono stati rilevati i parametri morfometrici di peso ed è stato
prelevato il muscolo, su cui sono state effettuate le determinazioni chimiche.
La metodica analitica utilizzata è stata validata seguendo i criteri riportati nella
Decisione 2002/657/EC. Il Limite di Quantificazione (LOQ) è pari a 0,05 mg/kg.
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Reagenti impiegati
Standard di ossitetraciclina (Sigma-Aldrich), standard di metaciclina (SigmaAldrich), acido succinico (Sigma-Aldrich), metanolo (Sigma-Aldrich), sefarosio
(GE Healthcare Bio-Sciences AB), solfato di rame (II) (SigmaAldrich), acido
citrico (Caelo Erba), sodio idrogenofosfato (RdH), EDTA (Sigma-Aldrich), acido
cloridrico (Sigma-Aldrich), acido ossalico (RdH), acetonitrile (Sigma-Aldrich).
Pretrattamento del campione
Sono stati aggiunti 10 ml di acido succinico (0,1 M a pH 4) a 5 ± 0,1 g di
muscolo macinato, addizionando lo standard interno (metaciclina); quindi si è
proceduto con l’omogeneizzazione mediante l’omogeneizzatore a lame (Ultra
Turrax T25, Janke & Kunkel IKA-Labortechnik). Sono stati aggiunti 10 ml di
metanolo, ponendo il tutto in agitazione per 15 minuti, terminati i quali si è
proceduto a centrifugare a 4.000 rpm per 10 minuti. Si è poi trasferito il surnatante
in un’altra provetta, risospendendo il centrifugato in 10 ml di acido succinico e 10
ml di metanolo, procedendo nuovamente con l’agitazione e la centrifugazione.
Uniti i due estratti, si è posta la provetta a bagnomaria a 40°C per 30 minuti,
ponendola successivamente in frigorifero per tutta la notte: tale operazione serve
per favorire la coagulazione delle proteine che possono creare interferenze nelle
fasi successive di analisi.
Il mattino successivo si è proceduto nuovamente alla centrifugazione a 4.000
rpm per 10 minuti, trasferendo il surnatante in un’altra provetta. Si è effettuata
una diluizione 1:5 con acqua, in modo da evitare eventuali problemi di
saturazione, durante i successivi passaggi di purificazione.
Nel frattempo si sono preparate le colonnine SPE di sefarosio, condizionandole
con 6 ml di acqua. Sono caricati 3 ml di solfato di rame (II) 0,01 M , vengono
lavate con 4 ml di acqua, quindi vengono caricati i campioni. Si effettua il
lavaggio con 2 ml di acido succinico (0,1 M pH 4), 2 ml di acqua, 2 ml di
metanolo e 2 ml di acqua. Infine si eluisce con 8 ml di tampone McIlvane B
(formato da acido citrico 0,1 M, sodio idrogenofosfato 0,2 M ed EDTA).
Successivamente si procede al secondo step purificativo, che prevede l’utilizzo
di colonnine SPE a fase inversa con fase stazionaria polimerica (Strata-X 33 µm
Polimeric Sorbent, Phenomenex), caricando l’estratto ottenuto sulle colonnine,
preventivamente attivate con 5 ml di metanolo, 5 ml di acido cloridrico 1 M e 3
ml di acqua. Si lava con 5 ml di acqua e si eluisce con 6 ml di metanolo.
L’eluato viene portato a secco a 50°C in corrente d’azoto, risospendendolo in
250 µl di fase mobile.
Analisi strumentale
La tecnica strumentale adottata per questo tipo di analisi si basa sulla
cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata ad un detector a fotodiodi
(HPLC-DAD) (Agilent 1100) con campo di misura compreso tra i 190 e i 600 nm;
in questo caso viene misurata l'assorbanza a 363 nm (Figura 2).
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Figura 2 – Cromatogramma di un campione di muscolo di carpa negativo (a) e cromatogramma di un
campione fortificato a 0,10 mg/kg di ossitetraciclina e 1,00 mg/kg di metaciclina (standard interno) (b).
La lunghezza d’onda a cui è stato registrato l’assorbimento è 363 nm.
Figure 2 – Chromatogram of a carp muscle negative sample (a), and chromatogram of a sample spiked at
0.10 mg/kg of oxytetracycline and at 1.00 mg/kg of metacicline (internal standard) (b). The absorption was
detected at 363 nm.
La colonna cromatografica prescelta è una Phenomenex LUNA C18 (250 x 3,0 5 mm) a fase inversa, a cui è accoppiata una precolonna Phenomenex Security
Guard C18 (4 x 3,0 mm), entrambe termostatate a 25°C. Le fasi mobili utilizzate
sono costituite da acido ossalico 0,01 M acquoso a pH 2,5, acetonitrile e
metanolo; il gradiente impostato è riportato nella Tabella 1. Il tempo totale della
corsa cromatografica è pari a 36 minuti, il volume di iniezione è di 30 µl.
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Temp. (min)
Flusso (mL/min)
%A
%B
%C
0
0,350
90
4
6
16
0,350
70
12
18
20
0,350
40
20
40
25
0,350
40
20
40
26
0,350
90
4
6
36
0,350
90
4
6
Tabella 1 – Gradiente cromatografico del metodo per la determinazione quantitativa dell’ossitetraciclina
nel muscolo di carpa.
Table 1 - Chromatographic gradient of the quantitative method for oxytetracycline determination in
carp muscle.
RISULTATI
Parametri morfometrici
Nei grafici sottostanti vengono visualizzate le variazioni nelle medie di
lunghezza (Grafico 1) e peso (Grafico 2) dei pesci prelevati dalle diverse vasche
ai vari tempi di campionamento.
T10
T5R
25,0
T10R
20,0
cm
15,0
10,0
5,0
0,0
A
B
C
D
E
F
G
H
Vasca
Grafico 1 – Andamento delle lunghezze medie dei pesci prelevati dalle diverse vasche ai tre tempi
di campionamento.
Graph 1 - Trend of average lengths of fish taken from different tanks to the three sampling times.
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T10
T5R
160,0
T10R
140,0
120,0
g
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
A
B
C
D
E
F
G
H
Vasca
Grafico 2 – Andamento dei pesi medi dei pesci prelevati dalle diverse vasche ai tre tempi di campionamento.
Graph 2 - Trend of average weights of fish taken from different tanks to the three sampling times.
Analisi chimiche
Sono stati elaborati i dati relativi alla curva di calibrazione in matrice, costruita
positivizzando della matrice negativa con opportuni quantitativi di ossitetraciclina
(Tabella 2); per ogni livello di concentrazione è stato ottenuto il rapporto tra l'area
dell'analita e quella dello standard interno (area ratio). Con questi dati è stata
ottenuta una retta di regressione lineare applicando il metodo dei minimi quadrati:
nella Figura 3 è riportata la retta di calibrazione con la relativa equazione ed il
coefficiente di correlazione lineare, ritenuto accettabile perché maggiore di 0,990.
Campione
Concentrazione
(mg/kg di tessuto edibile)
R1
0,05
R2
0,10
R3
0,50
R4
1,00
R5
1,52
R6
2,00
Tabella 2 – Concentrazioni di ossitetraciclina utilizzate per la costruzione della curva di calibrazione
in matrice.
Table 2 - Concentrations of oxytetracycline used for the construction of the matrix calibration curve.
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2,50
y = 1,0599x + 0,0088
Area Relativa
2,00
2
R = 0,996
1,50
1,00
0,50
0,00
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Conc. (ppm)
Figura 3 – Curva di calibrazione in matrice, con relativa equazione e coefficiente di correlazione lineare
della metodica analitica per la determinazione dell’ossitetraciclina.
Figure 3 – Calibration curve in matrix, with relative equation and square correlation coefficient
of the analytical method for oxytetracycline.
La quantificazione del residuo del farmaco nel muscolo è stata ottenuta
inserendo l’area ratio dei campioni, nell’equazione della retta di calibrazione.
Nella Tabella 3 vengono riportati i risultati ottenuti dall'analisi del muscolo di
carpa per i vari tempi di campionamento: alla fine del trattamento (T10), 5 (T5R)
e 10 (T10R) giorni dopo la sua sospensione. Sono stati sottoposti ad analisi anche
i pool dei controlli (T0), per escludere la presenza dell’antibiotico dovuta ad
eventuali contaminazioni esterne; i risultati hanno confermato l’effettiva assenza
dell’analita ricercato (Figura 2).
Livello di
Campione Somministrazione
(mg/kg)
Concentrazione media (mg/kg)
T10
T5R
T10R
0,00
ND
ND
ND
B
0,00
ND
ND
ND
C
75,00
0,29 ± 0,05
0,16 ± 0,03
0,07 ± 0,01
D
75,00
0,30 ± 0,05
0,14 ± 0,03
0,07 ± 0,01
A
E
150,00
0,53 ± 0,10
0,21 ± 0,04
0,11 ± 0,02
F
150,00
0,70 ± 0,13
0,25 ± 0,05
0,12 ± 0,02
G
300,00
1,15 ± 0,14
0,52 ± 0,09
0,21 ± 0,04
H
300,00
1,06 ± 0,13
0,42 ± 0,08
0,21 ± 0,04
Tabella 3 – Accumulo medio di ossitetraciclina (mg/kg) nel muscolo di carpa per vasca ai tre tempi di
campionamento, accompagnato dal relativo valore di incertezza estesa.
Table 3 - Average accumulation of oxytetracycline (mg/kg) in the carpe muscle of carp for each bath to the
three sampling times, with the relative value of expanded uncertainty.
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La Figura 4 presenta un’ipotesi di cinetica di eliminazione del farmaco in
funzione del tempo, al variare della concentrazione di ossitetraciclina
somministrata.
1,50
1,40
Trattamento 75 ppm_C
1,30
Trattamento 75 ppm_D
1,20
Trattamento 150 ppm_E
1,10
Trattamento 150 ppm_F
Conc. (mg/kg)
1,00
Trattamento 300 ppm_G
0,90
Trattamento 300 ppm_H
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
10
12
14
16
18
20
Tempi (gg)
Figura 4 – Ipotesi di cinetica di eliminazione dell’ossitetraciclina.
Figure 4 – Hypothesis of oxytetracycline elimination kinetics.
DISCUSSIONI E CONCLUSIONI
Gli antibiotici vengono somministrati ai pesci mediante mangime medicato per
combattere o prevenire infezioni indotte dai principali agenti eziologici presenti
negli allevamenti ittici. Tuttavia, in letteratura, le informazioni sulle conseguenze
della somministrazione in profilassi di queste sostanze sull’accrescimento delle
specie ittiche sono poche e alquanto discordanti (Rijkers et al., 1980; Rawles et
al., 1997; Toften & Jobling, 1997; Sanchez-Martínez et al., 2008). Ad esempio,
l’ossitetraciclina somministrata mediante dieta per 11 settimane alla
concentrazione di 50 mg/kg bw ha causato un aumento in peso della specie ittica
Ictalurus punctatus (Sanchez-Martìnez et al., 2008), mentre non è stato
evidenziato alcun effetto sulla performance di accrescimento per la stessa specie
ittica trattata con 8,4, 16,8, 33,5 mg di OTC/kg dieta per 8 settimane (Rawles et
al., 1997). Al contrario, l’antibiotico ha causato una riduzione dell’accrescimento
del salmerino alpino Salvelinus alpinus (L.) trattato con 20 g OTC/kg di dieta per
6 settimane (Toften & Jobling, 1997) e di Cyprinus carpio trattato con iniezione
intraperitoneale di 60 o 180 mg/kg OTC (Rijkers et al., 1980).
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Nel presente studio, la somministrazione dell’antibiotico, mediante mangime
medicato, non ha determinato un evidente accrescimento dei pesci trattati; infatti
le variazioni di peso riscontrate nei pesci trattati rispetto ai propri controlli non
sono statisticamente significative.
È stato inoltre verificato l’accumulo di questo farmaco nel muscolo della carpa.
Dopo 10 giorni di trattamento alle dosi raccomandate il valore medio nel tessuto
edibile si attesta sui 295 µg/kg, valore circa 3 volte superiore a quanto stabilito
dall’Allegato 1 del Regolamento (CEE) n. 2377/90 del Consiglio, pari a 100
µg/kg. Tuttavia nei pesci prelevati 5 e 10 giorni dopo la sospensione del
trattamento farmacologico si sono riscontrate concentrazioni medie
rispettivamente di 150 e 70 µg/kg. Considerando che già dopo 10 giorni dalla fine
del trattamento nel muscolo si trova una concentrazione nettamente inferiore al
limite massimo residuale consentito e che, comunemente, in allevamento, si
applica un tempo di sospensione medio di circa 30 giorni, l’atteggiamento degli
allevatori risulta sufficientemente cautelativo.
Lo studio dell’accumulo a dosi superiori a quelle consentite dalla normativa
vigente evidenzia una relazione di proporzionalità tra quanto somministrato e
quanto accumulato nel muscolo. La cinetica di eliminazione dell’esogeno dalla
matrice risulta, invece, indipendente dal livello accumulato in partenza,
assumendoun andamento comune per i 3 livelli di trattamento adottati.
RINGRAZIAMENTI
Lavoro effettuato con fondi di Ricerca Corrente del Ministero della Salute.
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